CN101104644A - 多糖亚硒酸酯的制法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种多糖亚硒酸酯的制法及其应用，属于硒化多糖技术领域，其特征是本质上由多糖或糖复合物和硒化试剂反应制得；硒化试剂为卤氧化硒或者含有卤氧硒结构的化合物；硒化试剂与多糖中羟基基团的投料摩尔比为1∶0.1－20。本发明还包括多糖亚硒酸酯在制备抗癌药物和抗氧化药物中的应用。本发明不再通过亚硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基团，而是硒化试剂与糖单元的羟基发生反应，生成多糖亚硒酸酯，产品得率和质量均比其它的方法高，含硒量也远大于现有技术。

Description

多糖亚硒酸酯的制法及其应用

技术领域

本发明属于硒化多糖技术领域，具体涉及一种多糖亚硒酸酯的制法及其应用。

背景技术

多糖类是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，具有抗感染、免疫促进、肿瘤防治、病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面功能和生物活性。影响多糖生物学活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和多糖分子的高级结构，其中多糖主链的糖单元组成、糖苷键类型均直接决定多糖的活性，多糖支链的类型、聚合度、支链在多糖链上的分布及其取代度决定了多糖的活性大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多糖的活性紧密相关。为提高多糖的生物活性，多糖的分子修饰和结构改造具有重要意义。近年来，有关多糖的分子修饰研究已大有进展。利用糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团运用化学方法进行修饰，有可能提高多糖的活性。修饰的方法很多，有硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、双基团衍生化等。

硒元素是生命活动的必需元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，这说明了硒与人体健康的直接关系。多糖具有多种生理功能，与抗衰老、防治癌症等密切有关。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。

随着生活水平的提高，各个保健食品公司、医药公司开发的富硒食品、富硒药品已成为了热潮。近年来关于富硒的产品和专利也出现了许多。如公开号：CN1038454A，硒化卡拉胶的制法。该方法是以硒粉为原料，用硝酸将其溶解制备成浓度为0.5-1.0mg/ml的硒液，在将其加入到浓度为0.5-5％的卡拉胶中，再加入Kappa-角叉菜胶或Lambda角叉菜胶溶胶溶液，进行硒化反应，在经过乙醇沉析后得到粗品硒化卡拉胶。该方法制备的硒化卡拉胶，硒含量较低，并且在制备方法上使用硒粉和浓硝酸可以生成如硒化氢等有毒的负产物。专利公开号CN1069495，专利名称为硒多糖其制造方法。该方法通过发酵制备富硒酵母，再经过分离提取，加碱匀浆、中和、浓缩、乙醇沉淀等制成。该方法制备繁琐，得到的硒含量也很低。而多糖亚硒酸酯的制备是通过亚硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基团实现(CN1288899A)，导致多糖亚硒酸酯的硒含量除了受反应条件限制，还受多糖硫酸酯的硫酸酯基团含量控制，导致这一方法制备多糖亚硒酸酯的硒含量偏低，其最大硒含量为12.5％

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种多糖亚硒酸酯的制法，将硒化试剂与在糖单元的羟基直接发生反应，而不用通过取代硫酸酯基团，制备的多糖亚硒酸酯的最高硒含量可达45％。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种多糖亚硒酸酯的制法，其特征是本质上由多糖或糖复合物和硒化试剂反应制得。

所述的硒化试剂为卤氧化硒，化学式为：SeOX₂，X为氟、氯、溴中的一种；或者硒化试剂为含有卤氧硒结构的化合物，化学式为：-SeOX，X为氟、氯、溴中的一种；硒化试剂与多糖中羟基基团的投料摩尔比为1∶O.1-20。

所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步骤：

(1)硒化反应：将多糖、硒化试剂加入吡啶中，在-15-110℃下，反应0.1-100小时，然后加入水，反应液自然升温/降温至室温；

(2)沉淀：按反应液的1-10倍体积量将沉淀剂加入反应液，搅拌，过滤，然后用沉淀剂洗涤滤出物，将滤出物干燥；将滤出物溶解，用NaOH溶液调节溶液pH为7～8，再加入沉淀剂，过滤，然后用沉淀剂洗涤滤出物，将产物干燥；沉淀剂是乙醇、甲醇、丙酮中的一种或其中几种的任意比例混合物；

(3)按需要精制成多糖亚硒酸酯精品，将(2)中的产物溶解，透析，按需要精制成各种的多糖亚硒酸酯精品。

反应可以加入催化剂，催化剂是亚硒酸酯，化学式为：R₁OSeOOR₂，R₁，R₂为H，或C₁-C₁₀烷基；催化剂与多糖中羟基基团的投料重量比为1∶0.0001-10。

所述的多糖亚硒酸酯，其特征是物化性质如下：

(1)溶解性：能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；

(2)平均含硒量：含硒量为0.1-45％；

(3)光谱：①紫外光谱：在波长255nm附近处有特征吸收峰；

②红外光谱：在波长900cm^-1左右有中强度的伸缩振动特征吸收峰。

多糖亚硒酸酯在制备抗癌药物中的应用。

多糖亚硒酸酯在制备抗氧化药物中的应用。

本发明具有的有益效果在于：

1)本发明制备的多糖亚硒酸酯化合物的技术与其它的方法相比，不再通过亚硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基团，本发明的硒化试剂与糖单元的羟基发生反应，生成多糖亚硒酸酯，产品得率和质量均比其它的方法高。

2)利用本发明的多糖亚硒酸酯的制法，制备的多糖亚硒酸酯多糖，其最高硒含量可达45％。然而目前有文献报道：硒化多糖的最高硒含量为12.5％。

3)在分子结构中引入亚硒酸根，其中硒是正四价，硒是处于中间价态，既可以被氧化也可以被还原，因此本发明的多糖亚硒酸酯在人体内具有广泛的生理功能。

具体实施方式

实施例1  MTT法体外检测多糖亚硒酸酯抗癌药敏试验：

对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释为2.0×106个·mL-1，接种于96孔板中，每孔100μL，之后依次加入待测药物、阴性对照组、阳性对照组，并保留仅加培养基的空白组。随后在37℃、5％CO2的培养箱中连续培养24h，然后每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μL，连续培养4h。吸去上清液，每孔加入DMSO 100μL，在570nm波长处用酶标仪测吸收度(A)值。用下面的公式计算细胞增殖抑制率，并利用公式T/C(％)＝100×A_阴性/A_样品做回归计算药物的半数抑制浓度(IC50)抑制率＝(A_空白-A_给药)/A_空白

各浓度对小鼠肿瘤细胞S180、H22及人肝癌细胞株HepG2的增殖均有显著的抑制作用，且呈良好的量效关系。

实施例2  抗氧化活性研究

1.对O₂·的清除作用

含有多糖亚硒酸酯(1mg·mL^-1)pH8.2的Tris-HCl缓冲液于25℃温育20分钟后，加入0.1mol·L^-1连苯三酚的10mmol·L^-1盐酸溶液，快速摇匀，于25℃测定319nm处的吸收度，持续测定A_p。

不加多糖亚硒酸酯，同上操作处理，测定其对比吸光值A_s。测试表明吸光度A_p相对比吸光值A_s减少。

结果表明：多糖亚硒酸酯能有效地清除活性氧。

2.对羟自由基的清除作用和保护DNA的作用

采用Fenton体系，取0.2mLFeSO4-EDTA混合液(10mmol·L^-1)于试管中，加入0.5mL的DNA(10mmol·L^-1)，然后加多糖亚硒酸酯(0.8mg·mL^-1)，用磷酸缓冲液(pH 7.4，0.1mol·L^-1)定容至1.8M L，再加人0.2mLH₂O₂(10mmol·L^-1′)， 混合后置于37℃恒温水浴中反应1h，然后加人2.8％(质量百分比)三氯乙酸溶液1.0ML，1.0％(质量百分比)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0ML，混匀后置沸水浴反应15min，冷却后用在波长532nm处测吸光度A_p。

不加多糖亚硒酸酯，同上操作处理，测定其对比吸光值A_s。测试表明吸光度A_p则相对比吸光值A_s减少。

结果表明：多糖亚硒酸酯能有效地清除羟自由基，对DNA链具有良好的保护作用。

实施例3  糊精亚硒酸酯

在搅拌下，将1g糊精、0.1gCH₃OSeOOC₂H₅和25g氟氧化硒(SeOF₂)加入吡啶中，加热到100℃，反应24小时，加入水。反应液降至室温，按反应液的3倍体积量将乙醇加入反应液，搅拌；过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将滤出物干燥；将滤出物溶解，用NaOH溶液调节溶液pH为7～8，再加入乙醇，过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将产物干燥。产品透析精制。制得含硒45％的糊精亚硒酸酯。

实施例4  右旋糖酐亚硒酸酯

在-2℃搅拌下，将2g右旋糖酐、和25g氟氧化硒(SeOF₂)加入吡啶中，加热到100℃，反应90小时，加入水。反应液升至室温，按反应液的3倍体积量将乙醇加入反应液，搅拌；过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将滤出物干燥；将滤出物溶解，用NaOH溶液调节溶液pH为7～8，再加入乙醇，过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将产物干燥。产品透析精制。制得含硒40％的右旋糖酐亚硒酸酯。

实施例5  阿(拉伯)糖基木聚糖亚硒酸酯

阿(拉伯)糖基木聚糖含有吡喃型和呋喃型两种糖单元，在搅拌下，将2g阿(拉伯)糖基木聚糖、0.1gCH₃OSeOOC₂H₅和50g氯氧化硒(SeOCl₂)加入吡啶中，反应30小时，加入水。反应液升至室温，按反应液的3倍体积量将乙醇加入反应液，搅拌；过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将滤出物干燥；将滤出物溶解，用NaOH溶液调节溶液pH为7～8，再加入乙醇，过滤，然后用乙醇洗涤滤出物，将产物干燥。产品透析精制。制得含硒39％的阿(拉伯)糖基木聚糖亚硒酸酯。

Claims (9)

1.一种多糖亚硒酸酯的制法，其特征是本质上由多糖或糖复合物和硒化试剂反应制得。

2.根据权利要求1所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是硒化试剂为卤氧化硒，化学式为：SeOX₂，X为氟、氯、溴中的一种。

3.根据权利要求1所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是硒化试剂为含有卤氧硒结构的化合物，化学式为：-SeOX，X为氟、氯、溴中的一种。

4.根据权利要求1所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是硒化试剂与多糖中羟基基团的投料摩尔比为1∶0.1-20。

5.根据权利要求1所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步骤：

(1)硒化反应：将多糖、硒化试剂加入吡啶中，在-15-110℃下，反应0.1-100小时，然后加入水，反应液自然升温/降温至室温；

(2)沉淀：按反应液的1-10倍体积量将沉淀剂加入反应液，搅拌，过滤，然后用沉淀剂洗涤滤出物，将滤出物干燥；将滤出物溶解，用NaOH溶液调节溶液pH为7～8，再加入沉淀剂，过滤，然后用沉淀剂洗涤滤出物，将产物干燥；沉淀剂是乙醇、甲醇、丙酮中的一种或其中几种的任意比例混合物；

(3)按需要精制成多糖亚硒酸酯精品，将(2)中的产物溶解，透析，按需要精制成各种的多糖亚硒酸酯精品。

6.根据权利要求5所述的多糖亚硒酸酯的制法，其特征是反应可以加入催化剂，催化剂是亚硒酸酯，化学式为：R₁OSeOOR₂，R₁，R₂为H，或C₁-C₁₀烷基；催化剂与多糖中羟基基团的投料重量比为1∶0.0001-10。

7.权利要求1的一种多糖亚硒酸酯，其特征是物化性质如下：

(1)溶解性：能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有机溶剂；

(2)平均含硒量：含硒量为0.1-45％；

(3)光谱：①紫外光谱：在波长255nm附近处有特征吸收峰；

②红外光谱：在波长900cm^-1左右有中强度的伸缩振动特征吸收峰。

8.多糖亚硒酸酯在制备抗癌药物中的应用。

9.多糖亚硒酸酯在制备抗氧化药物中的应用。