KR101327552B1 - 메치실린 내성 황색포도상구균(ＭＲＳＡ)에 대한 항균효과가 있는 박테리오신 ｌａｃｔｉｃｉｎ ＫＣ24 및 이를 생산하는 김치유래의 신규한 유산균 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＫＣ24 - Google Patents

Abstract

본 발명은 김치 유래의 메치오닌 내성 MRSA 균주에 뛰어난 항균 효과가 있는 신규로 분리·동정한 유산균주를 개시하며, 상기 유산균주로부터 분리·정제한 분자량 3.5 kDa의 항균활성 박테리오신 lacticin KC24의 각종 효소, pH 및 열 안정성 등 이화학적 파라메타를 개시한다.

Description

메치실린 내성 황색포도상구균(ＭＲＳＡ)에 대한 항균효과가 있는 박테리오신 ｌａｃｔｉｃｉｎ ＫＣ24 및 이를 생산하는 김치유래의 신규한 유산균 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＫＣ24{An antibacterial substance of lacticin KC24 against MRSA and a novel Lactococcus lactis KC24 producing of the same isolated from Kimchi}

본 발명은 김치에서 분리한 신규한 유산균에 관한 것으로 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대한 항균활성이 뛰어난 박테리오신 lacticin KC24에 관한 것이다.

페니실린은 1940년 초기 영국에서 처음 개발된 후, 다양한 항생제가 세균성 감염 질환의 치료제로 널리 개발되어 사용되었다. 그러나, 이러한 다양한 항생제의 사용으로 대부분의 세균성 감염 질환이 해결하여 왔지만, 한편 세균의 내성 획득과 항생제의 오·남용 등으로 병원균의 항생제 내성이 문제시 되기에 이르렀다. 작금에도 다양한 항생제에 내성을 갖는 병원성 세균의 출현으로 질병 치료의 어려움과 내성균의 확산으로 2차적인 사회 경제적 손실 등 또 다른 문제점이 대두되고 있다. 특히, 메치실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)은 mecA gene을 갖고 있으며, 이 gene에 의해 대부분의 β-lactams 항생제에 내성을 가지게 되는 것으로 알려져 있다(Hackbath et al., 1994; Niemeyer et al., 1996; Martins and Cunha, 2007). MRSA 감염의 치료에는 mupirocin, chlohexidine gluconate, rifampicin, doxycycline이 주로 사용되고 있으나(Simor et al., 2007), 이러한 항생제들의 내성도 증가되고 있는 실정이며, 위에 부담을 주는 등의 부작용으로 인해 사용 또한 제한적이다(Crum et al., 2006). 그러므로, 비 항생제 또는 복합제제의 제조 및 사용과 같은 방법들이 시도되고 있는 실정이다. 유산균에 의한 MRSA 치료 사례는 일본에서 공지된 바 있으며(Alvarez-Olmoz and Oberherman, 2001), Lactobacillus acidophilus CL1285와 Lactobacillus casei LBC80R의 혼합 균주에 의한 99% 저해효과가 보고되었다(Karska-Wysocki et al., 2010). 태국에서는 흙으로부터 분리한 Bacillus pumilis WAPB4에 의해 생산되는 pumilicin 4는 MRSA에 대해 bactericidal한 효과를 보였다고 한다(Aunpad and Na-Bangchang, 2007). MRSA에 관한 특허 사례로는 황금 추출물(특허 2003-0012821), 키토산 올리고당 착화합물과 생약추출물(특허 2002-0066118), 프로바이오틱 균주인 Bacillus amyloliquefaciens Ｋ317(특허 10-2008-0083840), 여성 비뇨기에서 얻은 웨이셀라균(특허 10-0629397) 등이 공지되어 있다. 그러나, 현재까지 김치유래 유산균 중에서 MRSA에 대해 뛰어난 항균효과는 보고된 바가 없다.

한편, 박테리오신(bacteriocin)은 다양한 종류의 미생물이 생산하는 단백질 또는 펩타이드계 항균 물질로서 일반적으로 특정 생육 환경에서 박테리오신 생산균과 다르거나 혹은 비슷한 미생물들의 생육을 저해할 목적으로 분비되는 것으로 알려져 있다. 박테리오신은 인체에 섭취되면 소화기관 내에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로 장내 유익균에 영향을 주지 않고, 잔류성이 없는데다 pH와 열에 대한 안정성이 높아 식품 등의 천연 보존제로서 유용하다. 특히 유산균이 생산하는 박테리오신은 유산균이 GRAS(generally regarded as safe)한 미생물이므로, 안전하다는 인식에 따라 박테리오신 관련 연구들 중 유산균 유래의 박테리오신에 대한 연구들이 많이 이루어지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 김치유래 Lactococcus lactis KC24에 의해 생산되는 lacticin KC24의 MRSA 세균에 대한 항균활성 및 작용 기작을 확인하고, 나아가 상기 박테리오신의 이화학적 특성을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 MRSA 항균활성이 뛰어난 유산균주를 분리동정하고, 그로부터 항생물질을 분리정제한 후 효소 안정성, pH, 열 안정성 등을 확인 검증하므로서 달성하였다.

본 발명은 메치실린 MRSA 균주에 항균활성이 있는 신규한 유산균주를 제공하는 효과가 있으며 상기 균주로부터 항균효과가 뛰어난 박테리오신 lacticin KC24를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 신규한 김치유래의 Lactococcus lactis KC24균주의 phylogenetic tree이다.
도 2는 본 발명 박테리오신 lacticin KC24의 메치실린 내성 MRSA 균주에 대한 항균활성을 보인 그래프이다.
도 3은 본 발명 박테리오신 lacticin KC24의 MRSA 균주에 대한 항균활성, 500 AU/mL 첨가 시(b) 및 첨가하지 않을 시(a)의 작용기작을 보인 scanning electronic microscopy(SEM)를 보인 것이다.

본 발명은 김치로부터 MRSA 항균활성균주를 분리·동정하는 단계와; 항균효과를 검증하는 단계와; 상기 균주로부터 항균활성물질을 분리·정제하는 단계와; 상기 항균활성물질의 이화학적 특성을 규명하는 단계로 구성된다.

1. 공시균주 및 사용배지

김치로부터 항균효과를 나타내는 유산균을 분리하고 이를 lactobacilli MRS medium(Difco Laboratories, USA)에 배양하고, 이를 보존하기 위해 20% glycerol을 첨가하여 최종 농도가 10% 되도록 한 후, -70℃ deep freezer에서 보존하였다. 본 발명의 사용된 indicator 균주들은 [표 1]에 나타내었으며, 본 발명에서 사용된 상기 모든 균주들은 tryptic soy broth(TSB, Difco) 배지에서 각각 최적 생육온도에서 배양하였다.

김치에서 indicator 균주들에 대해 저해환을 형성하는 유산균을 일차적으로 분리하고 이들 분리된 균주들의 배양액을 얻은 후 원심분리하여 배양상등액을 수득한 다음 pH를 6.5로 조정한 것에 대해 indicator 균주들에 대한 항균활성을 조사하여 KC24균주를 확보하였다.

2. KC24 균주의 분리 및 동정

가정에서 담은 김치들을 수집하고 멸균수에 희석하여 항균효과를 나타내는 유산균을 분리하기 위해 lactobacilli MRS medium(Difco)에 triple agar layer method를 이용하여 분리하였다. 스크리닝을 위해 사용된 indicator균으로 Bacillus cereus KCCM 11341, Staphylococcus aureus KCCM 32395, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Micrococcus flavus KCCM 10240를 이용하였다. 또, 분리한 KC24 균주의 동정을 위해 API 50 CHL System(BioMerieux Co., France)과 16S rDNA 서열분석을 수행하였다.

항균 활성을 갖는 물질을 생산하는 유산균 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 50 CHL system 으로 당 발효 및 이용성을 확인, 제조사의 지침에 따라 동정한 결과(표 2), KC24 균주는 99.8%의 유의성으로 Lactococcus lactis로 확인되었다. 정확한 동정을 위해서 수행한 16S rDNA 분석 결과, 99% 유의성으로 Lactococcus lactis로 동정되었다(도 1). 따라서, 분리균주 KC24를 Lactococcus lactis KC24로 명명하였으며, 이 유산균이 생산된 박테리오신은 잠정적으로 lacticin KC24로 명명하였다. 본 발명 상기 김치 유래의 신규한 유산균주는 국제미생물기탁기관(KCCM)에 2010. 12. 29자로 기탁번호 KCCM 11159P로 기탁되었다.

3. KC24 균주의 항균효과 검증

본 발명에 따라 분리된 KC24 균주의 박테리오신 활성을 측정하기 위하여 spot-on-lawn assay를 사용하였다. 액체배지에 indicator 균주들을 각각 접종하여 배양하고, 이 배양액을 각각 따로 준비된 0.75% soft agar에 100 μL씩 접종, 혼합한 후 plate에 overlay후 건조시킨 후, 배양상등액 및 농축액을 5, 10, 20 μL씩 loading한 후, 배양하여 항균 활성을 확인하였다.

Lacticin KC24를 대상으로 하여 식품부패 및 병원성균에 대한 항균범위를 측정한 결과, lacticin KC24는 대부분의 그람양성균에 대해 항균효과를 나타내었다. 그러나, 다른 그람양성균의 박테리오신의 특성처럼 그람음성균인 Escherichia coli ATCC 10536, Escherichia coli O157, Salmonella enteritidis KCCM 12021 등의 균주에 대해서는 전혀 항균활성을 보이지 않았다(표 1 참조). 특히, 주목할 사항으로는 MRSA 균으로 등록 되어져 있는 표준 균주인 Staphylococcus aureus KCCM 40510, Staphylococcus aureus KCCM 40511, Staphylococcus aureus KCCM 40512에 대한 항균효과를 확인할 수 있었다.

4. 황산암모늄 침전을 통한 부분정제

본 발명에 따라 분리된 KC24 균주를 lactobacilli MRS배지에 접종하여 37℃, 24시간 배양한 후 원심분리하여 배양상등액을 얻었다. 황산암모늄을 포화농도 60%가 되도록 천천히 넣어주고, 포화 농도가 된 후에도 추가적으로 2시간 더 저어주었다. 황산암모늄 용액을 12,000 rpm, 20 분간 원심분리 후, 침전물을 회수하여, 이를 100 mM potassium phosphate buffer로 녹인 후, 이를 다시 투석막(3,500 Da, Spectrum Co., USA)에 넣어서 24시간 투석시켜 항균성물질을 얻고 이를 lacticin KC24로 명명하였다.

5. 효소에 대한 민감성 실험

KC24 균주에 의해 생산되는 항균성 물질 lacticin KC24의 효소에 대한 민감성을 확인하기 위해 황산암모늄 농축액을 protease IX, protease XIII, protease XIV, proteinase K, α-chymotrypsin, trypsin 등의 효소를 최종 농도 1 mg/mL가 되게 하여, 37℃, 1시간 반응 시킨 후, 효소에 대한 민감성을 확인하였다. 이때 indicator 균주는 MRSA인 Staphylococcus aureus KCCM 40510를 사용하였다.

6. 열, pH 에 대한 안정성 실험

또, 분리균주가 생산하는 박테리오신 lacticin KC24의 열, pH에 대한 안정성을 확인하기 위해, 열은 50, 60, 70, 80, 90, 100℃에서 각각 30분 간 반응시키고, 또한 autoclave 조건에서도 반응시켜 확인하였다. pH는 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9로 만든 완충용액에 4℃, 4시간 반응시킨 후, 각각의 항균 활성을 확인하여 안정성을 실험하였다. 이때, indicator 균주는 Micrococcus flavus KCCM 10240을 사용하였다.

상기 본 발명에 따른 실험 계획에 의거, 부분정제된 박테리오신 농축액을 이용하여 protease IX, protease XIII, protease XIV, proteinase K, α-chymotrypsin, trypsin 등 각종 효소에 대한 민감성을 확인한 결과, lacticin KC24는 protease XIV에 의해서 활성을 완전히 소실하였다(표 3). 따라서, 본 발명 lacticin KC24는 단백질성 물질임이 확인되었고, 이를 통해 잠정적으로 박테리오신이라고 판단할 수 있었다. 본 발명 Lacticin KC24의 pH와 열에 대한 안정성을 검토한 결과, pH 3-7까지는 활성의 변화는 없었으나, pH 8과 pH 9에서는 2배 감소한 것을 알 수 있었다(표 4). 한편, 열 안정성은 100℃, 30분까지는 그 활성이 유지되었고, autoclave 조건에서도 활성은 2배밖에 감소되지 않았다. 이 사실을 통해 pH와 열에 매우 안정하다는 사실을 확인할 수 있었다. 기존에 밝혀져 있는 유사한 물질인 nisin은 산성에서는 안정하나, 염기적 조건에서 활성이 소실되는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명 박테리오신 lacticin KC24는 nisin 보다 좀 더 안정한 박테리오신임이 확인되었다.

7. MRSA 균주에 대한 작용기작

MRSA 균주에 대한 작용 기작을 검토하기 위해 MRSA 균주(Staphylococcus aureus KCCM 40510)에 본 발명 lacticin KC24 최종 농도 500, 250 AU/mL를 첨가하여(b), 첨가하지 않았을 경우(a)와 비교하였다. 각 시간 별로 샘플링하여 균수를 측정하였다. 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 형태 관찰을 하였다. MRSA균주에 500 AU/mL의 농도로 처리하여, 시료 전처리는 25% glutaraldehyde로 overnight하였고, 에탄올을 60-99.7%까지 각 단계 별로 처리하고 탈수하여 관찰하였다.

MRSA 균주에 대한 작용기작을 검토하기 위해 MRSA 균주에 lacticin KC24를 최종농도 500, 250 AU/mL를 첨가하여(b), 첨가하지 않았을 때(a)와 비교한 결과, 대조군 즉, 첨가하지 않았을 때에는 균수가 6 Log CFU/mL의 농도가 10시간 동안 유지된 반면에, lacticin KC24를 첨가하였을 때는 10시간 때에 2 Log CFU/mL의 농도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 따라서, MRSA 균주에 대한 작용기작은 bactericidal함을 확인할 수 있었다(도 3b).

8. Lacticin KC24 의 분자량

본 발명 Lacticin KC24의 분자량을 측정하기 위해, 16% acrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. Acrylamide gel을 만들고, ultra low size marker(Sigma, USA)와 황산암모늄 농축액을 loading 한 후, 40 mA의 전류를 흘려주었다. 전기영동 후, gel을 절단하여 한쪽은 gram staining을 하고, 한쪽은 fixing buffer에 2시간 반응시킨 후, 수세하여 petri dish에 놓고, 0.8% soft agar와 indicator를 섞은 후, overlay하여 항균효과에 따른 분자량을 측정하였다.

실험결과, 본 발명의 항균활성물질 박테리오신 lacticin KC24의 분자량은 3.5 kDa로 확인되었다.

본 발명은 김치 유래의 메치오닌 내성 MRSA 균주에 뛰어난 항균효과가 있는 신규한 유산균주를 Lactococcus lactis KC24를 제공하며, 그로부터 분리정제한 박테리오신 lacticin KC24를 제공할 뿐 아니라, 상기 항균활성물질은 분자량이 3.5 kDa의 저분자 단백질성 물질을 다양한 효소 안정성과 pH 3-7의 산성조건 및 100℃에서 30분까지도 활성 안정성을 보이므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11159P 20101229

Claims (4)

1. 탄소원 L-Arabinose와 N-Acetyl glucosamine을 이용하고 그램 음성균에는 항균활성이 없으나 MRSA 균에 항균효과를 나타내며 PH 3~9 및 100℃에서도 열안정성을 가지는 분자량 3.5kDa의 항균활성물질 박테리오신 Lacticin KC24를 생산하는 것이 특징인 김치 유래의 유산균 락토바실러스 랙티스(Lactococcus lactis) KC24(KCCM 11159P).
   
2. 삭제
3. 제 1항 기재의 유산균(KCCM 11159P) 또는 상기 유산균이 생산하는 박테리오신 Lacticin KC24를 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 항균활성 기능성 식품 조성물.
   
4. 제3항 기재의 유산균 또는 항균활성물질 박테리오신 lacticin KC24를 유효성분으로 함유하는 항생제 조성물.

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