KR101721605B1 - 신규한 국내형 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 - Google Patents

신규한 국내형 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant S. aureus) K12S0375 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP), 이를 이용한 소독 물질의 스크리닝 방법, 상기 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 균주는 전장 유전체 분석이 완료되었으며, 국내 특이적 시퀀스 타입인 ST692로서, 소독제, 특히 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드가 포함된 소독제에 강한 내성이 있다. 따라서 본 발명의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 소독제에 높은 내성을 갖는 메티실린-내성 황색포도상구균을 살균할 수 있는 새로운 소독제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있으며, 상기 소독제 스크리닝에 사용 가능한 표준 균주로 활용할 수 있다.

Description

신규한 국내형 메티실린-내성 황색포도상구균 균주{Novel domestic-type methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains}
본 발명은 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant S. aureus) K12S0375 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP), 이를 이용한 소독 물질의 스크리닝 방법, 상기 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
1940년도에 페니실린이 처음 임상에 도입된 당시에는 대부분의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 페니실린 감수성이 있었으나, 1941년도부터 출현한 페니실린 내성은 급속히 증가하여 1950년대에는 이미 60% 이상의 황색포도상구균이 페니실린 내성을 보유하였다. 이를 치료하기 위하여 개발된 메티실린(methicillin)이 1960년도에 도입되었으나 1961년도부터 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant S. aureus)이 출현하기 시작했다.
메티실린-내성 황색포도상구균은 전 세계 각지의 병원에서 가장 중요한 병원감염균으로 자리잡고 있다. 특히 한국, 일본, 대만, 홍콩, 싱가포르, 스리랑카 및 일부 미국 병원에서는 병원에서 분리되는 황색포도상구균의 50% 이상이 메티실린-내성 황색포도상구균인 것으로 보고되고 있다. 국내 병원의 메티실린-내성 황색포도상구균 발생율은 1996년에 국내 15개 병원에서 전향적으로 시행한 연구의 결과 83.7%인 것으로 나타났다. 1997년부터 2006년까지 다기관 연구를 통하여 보고된 메티실린-내성 황색포도상구균의 빈도는 64~72%로서 국내 병원에서 가장 흔한 병원 감염의 원인균으로 확인되었다.
특히, 국내 축산 분야에서 MRSA는 가축, 축산물, 애완동물 등에서 보고되었으며, 특성조사 결과 대부분 내국인 및 외국의 가축에서 보고된 타입으로 확인되었다. 하지만 최근 우리나라에서만 특이적으로 보고되는 타입(ST692)의 메티실린-내성 황색포도상구균이 출현하고 있고, 이러한 국내 특이 타입의 메티실린-내성 황색포도상구균은 종래 지역사회 및 병원에서 유행하는 타입의 메티실린-내성 황색포도상구균에 비해 다약제 내성을 보이며, 유럽에서와 같이 축산 분야뿐만 아니라 국내 지역사회 및 병원으로 전파될 경우 항생제를 사용한 치료에 어려움이 있어 보건학적으로 큰 위험요소가 될 수 있다. 따라서, 이러한 신규 타입의 메티실린-내성 황색포도상구균의 특성을 전장유전체를 기반으로 분석하고, 상기 신규 타입 균을 효과적으로 소독할 수 있는 새로운 소독제를 개발하는데 유용하게 활용할 수 있는 표준 균주의 필요성이 제기되고 있다.
KR 10-2012-0098072 A KR 10-2012-0038698 A
Comparison of complete rpoB gene sequence typing and multi-locus sequence typing for phylogenetic analysis of Staphylococcus aureus(J. Gen. Appl.Microbiol., 59, 335?343 (2013))
본 발명자들은 국내 닭 도체에서 분리된 국내 특이적 시퀀스 타입 ST692인 메티실린 내성 황색포도상구균 균주 K12S0375 에 대한 전장 유전체 분석을 수행하여 분자유전학적 특성을 확인하고, 상기 균주의 소독제에 대한 내성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 후보물질을 본 발명의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주와 접촉시키는 단계;
2) 상기 균주의 생장을 측정하는 단계; 및
3) 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 균주와 비교하여, 후보물질을 접촉시킨 균주의 생장이 저해되는 경우, 상기 후보 물질을 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질로 결정하는 단계;를 포함하는 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은, 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물을 제공한다.
본 발명은, 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 균주는 전장 유전체 분석이 완료되었으며, 국내 특이적 시퀀스 타입인 ST692로서, 소독제, 특히 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드가 포함된 소독제에 강한 내성이 있다. 따라서 본 발명의 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 소독제에 높은 내성을 갖는 메티실린-내성 황색포도상구균을 살균할 수 있는 새로운 소독제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있으며, 상기 소독제 스크리닝에 사용 가능한 표준 균주로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 ST692 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP) 와 NCIB에 등록되어 있는 황색포도상구균의 연관관계를 전장유전체 정보를 기반으로 비교하여 분석한 계통도를 간략히 나타낸 도이다.
본 발명은 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA)에 대한 소독 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어, “메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)”은 황색포도상구균 중 항생물질인 메티실린에 저항성을 나타내는 세균을 말하며, 메티실린 내성의 본질은 염색체 상에 외래유전자(mecA)가 삽입되는 것에 있다. 메티실린-내성 황색포도상구균은 보통 건강한 사람에게는 무해하나, 수술 후의 환자 등 면역력이 떨어져 있는 사람에게는 감염되기 쉽고, 새로운 원내감염이나 기회성 감염을 일으킨다.
본 발명에서 용어, “소독제” 또는 “소독 물질”은 병원성 세균을 사멸시키기 위해 인체의 피부, 점막의 표면이나 기구, 환경의 소독을 목적으로 사용하는 화학물질로서, 메티실린-내성 황색포도상구균의 살균을 목적으로 하는 화학물질일 수 있다.
본 발명에서 용어, “내성”은 세균이 화학물질에 대하여 가지는 저항 현상으로서, 세균이 각종 약제에 대하여 저항성이 강한 균주로 변했을 때 상기 세균은 내성을 가졌다고 한다.
본 발명에서 용어, “소독제에 대한 내성”은 세균이 소독제에 대하여 저항성이 강한 균주로 변한 것을 의미하며, 메티실린-내성 황색포도상구균 균주가 소독제에 의해 세균이 사멸하거나 성장이 저해되지 않는 상태를 갖는 것을 말한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA) 균주는 전장 유전체 분석이 완료되었으며, 국내 특이적 시퀀스 타입인 ST692로서, 소독제, 특히 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드가 포함된 소독제에 강한 내성이 있다. 따라서 본 발명의 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 소독제에 높은 내성을 갖는 메티실린-내성 황색포도상구균을 살균할 수 있는 새로운 소독제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있으며, 상기 소독제 스크리닝에 사용 가능한 표준 균주로 활용할 수 있다.
이에 본 발명은 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 제공한다.
본 발명의 메티실린-내성 황색 포도상구균 균주는 소독제에 강한 내성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소독제는 바람직하게는 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, “4급 암모늄염”은 질소원자에 4개의 탄화수소기가 결합하여 생긴 제4급 암모늄 이온의 염을 말하며, 소독제에 포함될 수 있고, 바람직하게는 (CH3)4 N+Cl-일 수 있다.
상기 (CH3)4 N+Cl-를 포함하는 소독제는 농도와 조성에 따라 다양하게 명명되어 사용될 수 있으며, 본 발명의 소독제의 바람직한 예로서 상표명이 각각 팜닥터, 팜세이프, 파콤에이, 팜프로, 뉴파고슬, 라이프라인(LIF)인 소독제를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 라이프라인(LIF)일 수 있다.
본 발명에서 용어, “복합 알데히드”는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, “라이프라인”은 상표명이 라이프라인인, (주)고려비엔피에서 제조된 소독제를 말하며, 복합 소독약계열로 분류되며, 소독력을 높이기 위해 글루타르알데히드 및 포름알데히드를 포함한 복합 알데히드에 4급 암모늄염으로 알킬벤질다이메틸암모늄 클로라이드를 추가한 조성물을 유효성분으로 하는 소독제이다.
또한 본 발명은 수탁번호 : KCTC 12633BP 로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375의 유전자 분석을 통해, 균주에 포함되어 있는 다양한 유전자를 분석하였다. 따라서 중금속 내성 유전자, 항생제 내성 유전자, 세포 부착 유전자, 독소 유전자, 분비 효소 유전자, 숙주 면역 회피 유전자 및 물질 분비 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어, “국내 특이적 시퀀스 타입인 ST692 균주”는 국내 도계장의 닭 시료에서 분리된 메티실린-내성 황색포도상구균으로서, 다른 타입의 황색포도상구균(NCBI에 등재된 황색포도상구균)과 계통관계를 분석한 결과, 단독의 계통을 나타내는 우리나라 특이적 시퀀스 타입인 ST692 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 의미한다.
본 발명에서 용어, “중금속 내성 유전자”는 중금속에 대한 내성을 숙주에 부여하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 구리와 카드뮴에 대한 내성을 메티실린-내성 황색포도상구균에 부여하는 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 copA 및 cadD일 수 있다.
본 발명에서 용어, “항생제 내성 유전자”는 항생제에 대한 내성을 숙주에 부여하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 아미노글리코시드계, β-락탐, 플루오로퀴놀론계, 마크로라이드계, 테트라사이클린에 대한 내성을 메티실린-내성 황색포도상구균에 부여하는 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 blaZ, mecA, aadE, norA, tetS, tet38, tetL 및 ermB일 수 있다.
본 발명에서 용어, “세포 부착 유전자”는 세포가 다른 세포 또는 다른 물질에 달라붙는 데에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 spa, icaC, icaA, ebpS, vwb, clfB, fnbA, sdrC, sdrE, fib, atl, eap, efb, icaR, icaB 및 sdrH일 수 있다.
본 발명에서 용어, “독소 유전자”는 각종 독소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 lukF-PV, SExo, hld, SEntP, SEnt-like, set5, set11, hlb, set13, set12, set3, sal, lukE, hlgC, eta, hla, hlgA, lukS-PV, hlgB 및 set19일 수 있다.
본 발명에서 용어, “분비 효소 유전자”는 각종 분비 효소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 hysA1, splC, sspB2, sspB, lip, geh, sspC, nuc, splA, splE, splF 및 sspA일 수 있다.
본 발명에서 용어, “숙주 면역 회피 유전자”는 숙주의 면역 감시를 회피하여 세균 또는 기타 세포가 증식하는 것에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 MRSA에서 식세포 파괴에 관여하는 다핵 백혈구나 대식세포를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 cap5E, cap5I, cap5F, capG, cap5P, cap5J, cap5K, cap5O, isb, cap5D, cap5M, cap5H, capA, cap5A, cap5B, capB, cap5C, capC, cap5L, cap5N 및 capD일 수 있다.
본 발명에서 용어, “물질 분비 유전자”는 각종 물질을 분비하는 것에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 essB, esaB, esxA, esaC, esaA, esxB, essC 및 essA일 수 있다.
또한, 본 발명은 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 소독 물질의 스크리닝 방법은,
1) 후보물질을 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주와 접촉시키는 단계;
2) 상기 균주의 생장을 측정하는 단계; 및
3) 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 균주와 비교하여, 후보물질을 접촉시킨 균주의 생장이 저해되는 경우, 상기 후보 물질을 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질로 결정하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 후보물질은 병원성 세균을 사멸시키기 위해 인체의 피부, 점막의 표면이나 기구, 환경의 소독을 목적으로 사용하는 화학물질일 수 있고, 바람직하게는 메티실린-내성 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있는 화학물질일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 균주의 생장을 측정하는 것은 단계 1)의 후보물질을 처리한 후 일정시간 경과 후 생존한 균주의 수를 측정하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 생존한 메티실린-내성 황색포도상구균의 수를 측정하는 것일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 3)의 소독 물질을 결정하는 것은 단계 1)에서 후보물질을 접촉시킨 경우, 후보물질을 접촉시키지 않은 경우에 비해 단계 2)에서 측정한 생존한 균주의 수가 현저히 적어 상기 후보물질을 병원성 세균을 사멸시키는 효과가 있는 소독 물질로 결정하는 것을 의미하며, 바람직하게는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질로 결정하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 수탁번호 : KCTC 12633BP으로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 수탁번호 : KCTC 12633BP으로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 포함하는 소독 물질 개발용 키트를 제공한다.
본 발명에서 용어, “소독 물질 개발”은 상기 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질을 개발하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질을 스크리닝 하는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 “키트”는 편리성 및 휴대성을 높이기 위해 소독물질 개발을 위한 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 각각 1회 분으로 나누어 한 용기 내에 함유하거나 또는 상이한 여러 개의 소 용기 내에 함유할 수 있다. 따라서 각 용기 내에는 배열 방법에 따라 여러 개의 소용기가 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 사용에 필요한 장비 및 각 성분의 투여 방법을 기재한 지시 자료 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 국내 특이 타입 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 분리 및 선별
2012년 국내 도계장(전남 순천시)의 닭 도체에서 MRSA ST692 타입의 포도상구균 균주인 K12S0375를 분리하였다. 보다 구체적으로, 상기 도계장의 냉동실에 보관된 닭 도체 표면을 멸균된 거즈(10x10cm)를 이용하여 닦은 다음 멸균된 봉투에 담아 실험실로 저온 배송 후, 50ml의 1% 펩톤수(peptone water)(Becton Dickinson)에 균질화한 후 1ml의 용액을 6.5%의 NaCl이 첨가된9ml의 M.H 배양액(Mueller hinton broth)에 넣어 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 상기 배양된 균액 1ml을 세폭시틴(cefoxitin)(3.5mg/l)이 첨가된 TSB 배지(Tryptic Soy Broth)에 첨가하여 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 균액을 색소생산성 MRSA 한천(Chromogenic MRSA agar)(BD GeneOhm)에 스트리킹한 후, 37℃에서 하루 동안 배양하고, 핑크색으로 자란 집락만 순수 분리한 뒤, 혈액배지에서 하루 동안 증균 배양하였다. 그 후, MRSA 특이적 PCR(16S rRNA, clfA, mecA 유전자의 유무를 확인하는 PCR) 및 전장유전체 분석을 수행하여 메티실린-내성균인지 여부를 확인하고, Maldi-Tof 및 16SrRNA 시퀀싱을 수행하여 황색포도상구균 여부를 확인하였다.
그 결과 국내 도계장의 닭 도체에서 분리한 포도상구균 균주인 K12S0375가 메티실린-내성 황색포도상구균임을 확인하였다.
실시예 2 : MRSA 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 전장 유전체 분석
상기 실시예 1에서 분리된 포도상구균 균주의 전장 유전체를 분석하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1에서 분리한 포도상구균 균주 K12S0375의 분해되지 않은 DNA를 유전자 추출 키트(Promega)를 이용하여 추출하였다.
그런 다음, 상기 균주의 MRSA 타입 분석을 위해 다좌 염기서열 타이핑(MLST typing)을 수행하였다. 상기 추출한 DNA를 Illumina MiSeq와 454 Titanium 장비를 사용하여 시퀀싱한 후, 포도상구균의 생존에 필수적인 7개의 유전자(arc, aroe, glpf, gmk, pta, tpi, yqil)의 조합으로 시퀀스 타입(ST; sequence type)을 확인하였다. 그 결과 상기 실시예 1에서 선별된 포도상구균 균주인 K12S0375의 시퀀스 타입은 ST692임을 확인하였다. 이와 같이 분리된 포도상구균 균주를 K12S0375로 명명하고, 2014년 7월 24일자로 한국생명공학연구원에 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁하였다.
또한, 상기 본 발명의 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 계통관계를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 외국에서 다수 존재하는 시퀀스 타입인 ST398 황색포도상구균과 유사하지만 100% 상동성을 가지고 있지 않으며, 우리나라 특이적 시퀀스 타입인 ST692 메티실린-내성 황색포도상구균 균주임을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1에서 선별된 포도상구균 균주인 K12S0375의 게놈 주석을 수행하기 위해 다음의 프로그램을 사용하였다. 오픈 리딩 프레임(ORF; open reading frame)을 예측하기 위해 Gene Prediction(Glimmer 3.02)을, tRNA 및 rRNA을 예측하기 위해 각각 tRNASCAN-SE, HMMER with rRNA profile 프로그램을 사용하였다. 또한, 단백질로 발현 가능한 유전자를 예측하기 위해 rpsBLAST, BLASTP 프로그램을 사용하였는데, 이때 데이터베이스로 CatFam 및 Clusters of Orthologous Groups(COG), NCBI RefSeq와 SEED 데이터베이스를 사용하였다. 단백질 내부에 보존된 모티프 및 도메인 탐색을 위해 InterProScan 프로그램과 INterPro, TIGRFAM 및 Pfam의 데이터베이스를 사용하였다. 그리고, 상기 포도상구균 균주인 K12S0375의 게놈상에 존재하는 유전자의 특성을 분석하기 위해 Center for Genomic Epidemiology search를 사용하였다. 그 결과 상기 균주 K12S0375의 염기서열은 항생제 및 중금속 내성 유전자, 세포 부착 유전자, 독소 유전자, 분비 효소 유전자, 숙주 면역 회피 유전자 및 물질 분비 유전자를 포함하고 있음을 확인하였으며, 그 결과를 표 1 내지 8에 나타내었다.
Figure 112015057461159-pat00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 이종상동성 유전자를 찾기 위해 게놈을 비교하는 검색 위주의 데이터베이스인 COG(Clusters of Orthologous Groups)를 기초로 하여 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 전장 유전체상 각 유전자의 기능을 확인하였다.
Figure 112015057461159-pat00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 베타-락탐(β-lactam), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone), 매크로라이드(macrolide) 및 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 내성 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112015057461159-pat00003
표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 다양한 세포 부착 관련 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 다양한 독소 관련 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112015057461159-pat00005
표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 다양한 분비 효소 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112015057461159-pat00006
표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 다양한 숙주 면역 회피 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112015057461159-pat00007
표 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 다양한 물질 분비 관련 유전자를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112015057461159-pat00008
표 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 분리한 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)는 플라스미드 repUS5 및 repUS12를 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.
실험예 1 : 소독제 내성 확인
상기 실시예 1에서 선별된 포도상구균 균주인 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 소독제에 대한 내성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험예 1-1 : 포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 배양
포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)의 소독제에 대한 내성을 확인하기 위해 40% 글리세롤에 상기 균주를 동결 보관한 후, 상기 동결 보관된 포도상구균 균주를 MSA 배지(Manitol salt agar)에 스트리킹하였다. 그런 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, MRSA 특이적 PCR(16S rRNA, clfA, mecA 유전자의 유무를 확인하는 PCR)로 메티실린-내성 황색포도상구균인지 여부를 재확인하였으며, 그 결과 상기 과정을 통해 배양된 포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)가 메티실린-내성 황색포도상구균임을 확인하였다.
실험예 1-2 : 소독제 처리 및 소독 효과 확인
메티실린-내성 황색포도상구균 소독에 효과적이라고 알려진 복합 알데히드 및 4급 암모늄염 성분을 포함하고 있는 소독제, 라이프라인(LIF, ㈜고려비엔피)을 희석하여 상기 실험예 1-1에서 배양된 포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)에 처리하였다. 보다 구체적으로, 상기 소독제 원액 110μl와 멸균된 증류수 990μl를 섞은 후 상기 혼합액 110μl를 다시 990μl증류수에 옮기는 방식으로 희석하여 상기 소독제를 10000배까지 희석하였다. 그런 다음, 메티실린-내성 포도상구균으로 알려진 다른 시퀀스 타입의 균주(ST 72, ST59, ST 5) 및 상기 실험예 1-1에서 배양한 본 발명의 포도상구균 균주 K12S0375(수탁번호 : KCTC 12633BP)를 배양하여 0.5 맥팔랜드 스탠다드(McFarland Standard)로 탁도를 맞추어 10μl 균액을 990μl 소독제 희석액과 혼합하여 1분 동안 처리하였다. 그 후, 900μl 중화배지(D/E Neutralizing Broth, Difco)에 100μl 혼합하여 10μl를 TSA 배지(Trytic Soy Agar)에 도말하고, 37℃에서 20시간 동안 배양한 후 생존한 균주의 수를 세어 그 결과를 표 9에 나타내었다.
Figure 112015057461159-pat00009
표 9에 나타낸 바와 같이, 소독제(라이프라인)를 처리 시, 본 발명의 균주와 다른 시퀀스 타입의 MRSA인 ST72, ST59, ST5 균주의 대부분이 사멸하였으나, 시퀀스 타입이 ST692인 본 발명의 본 발명의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 K12S0375는 많은 수가 생존함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 본 발명의 메티실린-내성 황색포도상구균 ST692 타입 균주 K12S0375는 다른 균주에 비해 소독제인 라이프라인에 대한 강한 내성을 가진 균주임을 알 수 있다.
따라서 본 발명의 메티실린-내성 황색포도상구균 ST692 타입 균주 K12S0375은 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 소독제에 높은 내성을 갖는 메티실린-내성 황색포도상구균을 살균할 수 있는 새로운 소독제를 스크리닝하는데 유용하게 이용할 수 있는 균주이며, 4급 암모늄염 또는 복합 알데히드를 포함하는 소독제 내성 균주용 소독제 스크리닝에 있어서 사용할 수 있는 표준 균주로 활용할 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12633BP 20140724

Claims (12)

  1. 수탁번호 : KCTC 12633BP로 기탁된 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주는 4급 암모늄염, 글루타르알데히드 및 포름알데히드가 포함된 소독제에 내성이 있는 것을 특징으로 하는, 메티실린-내성 황색포도상구균 균주.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 소독제는 알킬벤질다이메틸암모늄 클로라이드, 글루타르알데히드 및 포름알데히드를 포함하는 소독제인 것을 특징으로 하는, 메티실린-내성 황색포도상구균 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 메티실린-내성 황색포도상구균은 국내 특이적 시퀀스 타입인 ST692 균주인 것을 특징으로 하는, 메티실린-내성 황색포도상구균 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 메티실린-내성 황색포도상구균 균주는 중금속 내성 유전자, 항생제 내성 유전자, 세포 부착 유전자, 독소 유전자, 분비 효소 유전자, 숙주 면역 회피 유전자 및 물질 분비 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 중금속 내성 유전자는 copA 및 cadD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    상기 항생제 내성 유전자는 blaZ, mecA, aadE, norA, tetS, tet38, tetL 및 ermB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    상기 세포 부착 유전자는 spa, icaC, icaA, ebpS, vwb, clfB, fnbA, sdrC, sdrE, fib, atl, eap, efb, icaR, icaB 및 sdrH로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    상기 독소 유전자는 lukF-PV, SExo, hld, SEntP, SEnt-like, set5, set11, hlb, set13, set12, set3, sal, lukE, hlgC, eta, hla, hlgA, lukS-PV, hlgB 및 set19로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    상기 분비 효소 유전자는 hysA1, splC, sspB2, sspB, lip, geh, sspC, nuc, splA, splE, splF 및 sspA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    상기 숙주 면역 회피 유전자는 cap5E, cap5I, cap5F, capG, cap5P, cap5J, cap5K, cap5O, isb, cap5D, cap5M, cap5H, capA, cap5A, cap5B, capB, cap5C, capC, cap5L, cap5N 및 capD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    또는 상기 물질 분비 유전자는 essB, esaB, esxA, esaC, esaA, esxB, essC 및 essA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자;
    로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는,
    메티실린-내성 황색포도상구균 균주.
  7. 삭제
  8. 1) 후보물질을 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주와 접촉시키는 단계;
    2) 상기 균주의 생장을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 균주와 비교하여, 후보물질을 접촉시킨 균주의 생장이 저해되는 경우, 상기 후보 물질을 4급 암모늄염, 글루타르알데히드 및 포름알데히드가 포함된 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균에 대한 소독 물질로 결정하는 단계;를 포함하는 4급 암모늄염, 글루타르알데히드 및 포름알데히드를 포함하는 소독제에 내성이 있는 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA)에 대한 소독 물질의 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 소독제는 알킬벤질다이메틸암모늄 클로라이드, 글루타르알데히드 및 포름알데히드를 포함하는 소독제인 것을 특징으로 하는, 소독 물질의 스크리닝 방법.
  11. 제1항의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 유효성분으로 포함하는 소독 물질 스크리닝용 조성물.
  12. 제1항의 메티실린-내성 황색포도상구균 균주를 유효성분으로 포함하는 소독 물질 스크리닝용 키트.
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