KR102242579B1

KR102242579B1 - 항생제 내성유전자의 발현량을 조절하여 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR102242579B1
Application number: KR1020190061308A
Authority: KR
Inventors: 이영섭; 이대영; 김금숙; 공룡; 최두진; 이재원; 이상혁
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2021-04-21
Also published as: KR20200135668A

Abstract

본 발명은 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 병용 투여하여 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus)의 베타-락탐 (beta-lactam)계 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이는 항생제 내성 황색포도상구균의 항균 상승 효과를 가지기 때문에 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하고, 인체 부작용이 적은 항균제에 적용될 수 있으며, 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용될 수 있다.

Description

항생제 내성유전자의 발현량을 조절하여 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법 {Methods for increasing the antimicrobial effect of antibiotic resistant Staphylococcus aureus by controlling the expression level of antibiotic resistance gene}

본 발명은 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 병용 투여하여 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus)의 베타-락탐 (beta-lactam)계 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

자연계에 널리 분포되어 있는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus)은 세계적으로 널리 알려진 식중독균 중의 하나로, 황금색 색소를 생성하고 용혈성을 가지며 응고효소 (coagulase)를 생성하는 종으로, 화농성질환이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴, 패혈증 등을 일으키는 병원성 높은 대표적인 유해세균으로 알려져 있다 (Kim SK et al., The Journalof the Korean Society for Microbiology, 28:251, 1993).

황색포도상구균은 일반적으로 환경에 대한 저항성이 강하여 건강한 성인의 비강, 피부, 구강 등에서도 존재하고 동물의 상처부위를 통한 전염이나 식품의 생산과정, 제조 공정 등의 여러 단계를 거치면서 식품 유통망을 타고 짧은 시간에 전국적으로 전파될 수 있으며, 전파된 황색포도상구균은 사람에게 전이되어 또 다른 매개체가 될 수 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균을 억제하기 위하여 사람과 동물의 질병 치료와 예방에 항생제를 사용하고 있으나, 황색포도상구균에 의한 식중독 발생률은 노로 바이러스와 살모넬라, 병원성 대장균과 함께 꾸준히 높은 수치를 나타내고 있으며 매년 발생이 증가되고 있다 (Lee JH et al., Korean Journal for Food Science of Animal Resources,30:410, 2010).

더욱이 항생제 오남용 등의 원인으로, 최근 미국이나 네덜란드 등의 국가에서는 식품과 관련한 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillinresistant S. aureus; MRSA)의 오염이 보고되고 있으며 1996년에는 반코마이신 (vancomycin)에 대하여 저하된 감수성을 나타내는 황색포도상구균이 일본에서 발견된 이후, 여러 나라에서 반코마이신 내성 황색포도상구균 (vancomycin-resistant S.aureus; VRSA)가 나타나기 시작하면서 슈퍼박테리아로 불리기 시작하였다 (Kang TY et al., Journal of Life Science, 2:190, 2010).

MRSA와 VRSA 같은 슈퍼박테리아는 출현 이후 지역사회에 빠르게 증가되고 광범위하게 노출되어있어 그 심각성이 점차 높아지고 있으며, 일반 황색포도상구균과 달리 옥사실린 (oxacillin), 세팔로스포린 (cephalosporin), 암피실린 (ampicillin), 나프실린 (nafcillin) 등과 같은 베타-락탐 (β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드 (aminoglycoside) 및 마크로라이드 (macrolides) 계열의 항생제에 대해서도 내성을 지니고 있는 균주로 발전되어 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.

오늘날, 우리나라는 인구 고령화와 웰빙(Well-being)이라는 건강 지향적 트렌드가 자리하면서, 채식위주의 음식문화와 맞물려 가공하지 않는 신선식품으로의 이용이 증가되고 있으나 유통 및 저장과정에서 황색포도상구균 등의 유해미생물 증식에 의해 발생하기 쉬운 오염을 억제하거나 식품으로 전파되는 유해 미생물의 내성 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그 중 공중보건학 측면에서 황색포도상구균의 내성수준은 매우 심각한 문제로 보고되고 있다 (Kim KM et al., Korean Journal of Nosocomial Infection Control, 11:79, 2006).

또한, 현재 축산에 사용되는 많은 항생제의 경우 내성률이 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 현재 축산에서 항생제는 주로 사료 첨가제로 또는 육계의 경우 7일에서 10일 사이에 정기적으로 클리닝 (Cleaning) 목적으로 사용된다. 보고에 의하면 전국 도축장에 온 소, 돼지, 닭에게 서 분리한 살모넬라, 장내구균 따위의 식중독균의 항생제 내성률을 조사한 결과 닭 분변에서 나온 대장균은 퀴놀론계 항생제에 57%를 웃도는 내성률을 보였다. 이와 같이 현재 축산에 사용되고 항생제는 대부분 세균들이 내성을 지니고 있어 축산에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제 개발이 시급하다.

최근에는 유통 및 저장 중 오염 및 품질저하를 방지하기 위하여 가열 처리나 레토르 등의 물리적 방법과 식품보존제 등의 화학합성물질을 첨가하는 방법 등이 널리 이용되고 있으나, 영양성분 파괴, 품질저하 및 독소잔류 등의 건강에 대한 안전성 문제가 제기되고 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균에 대한 새로운 항균물질의 개발이 시급히 요구되고 있으며, 전통적으로 감염질환의 치료에 사용되어 온 약용식물을 바탕으로 알칼로이드 (alkaloid), 플라보노이드 (flavonoid), 테르페노이드 (terpenoid), 페놀성 화합물 (phenolic compound), 퀴논 (quinone), 휘발유 (volatile oil) 등의 2차 대사산물 또는 그 유도체들이 후보물질로 활발히 진행되고 있다 (Kim NY et al., Journal of Life Science, 20:589, 2010).

한편, 하수오(Polygonum multiflorum)는 한국 각지의 산야에 야생하므로 전국 어디서나 재배할 수 있으며, 하수오 뿌리는 안트라퀴논(anthraquinone)류를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 항생제 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)에 대한 항균활성을 가지는 하수오 뿌리 유래의 레인 (rhein; RHE) 및 항생제 옥사실린 (oxacillin; OX)이 각각 단독으로 투여된 경우보다 레인과 옥사실린을 병용 투여 하는경우 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였다.

더욱 구체적으로는 항생제 내성 황색포도상구균 16종을 대상으로 레인과 항생제의 항균 효능을 측정한 결과 레인은 62.5μg/mL에서, 항생제 옥사실린은 내성으로 인해 1000μg/mL의 고농도에서 효과를 보였다. 반면에, 옥사실린과 레인을 함께 사용한 경우에서는 옥사실린은 최대 1/16, 레인은 최대 1/4까지 사용량이 줄어든 것으로 나타나 레인과 옥사실린을 병용하여 사용함으로써 용량 대비 효능은 커지고 부작용은 억제되는 효과를 보이는 것을 확인하였다.

대한민국등록특허 제10-1392808호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 병용 투여하여 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus)의 베타-락탐 (beta-lactam)계 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, 항생제 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)의 항균 효과를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 항균효과가 매우 우수한 본 발명을 적용한 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 의약품, 화장품, 건강기능성 식품 및 동물 사료를 제공하는데 다른 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 In vitro 상에서 a) 레인 및 옥사실린을 병용 투여하는 단계 및 b) 황색포도상구균의 항생제 내성유전자의 발현량을 감소시키는 단계를 포함하는, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 레인은 25 내지 65 ㎍/mL의 농도로 포함되며, 상기 a) 단계의 옥사실린은 10 내지 35 ㎍/mL의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 항생제 내성유전자는 mec 또는 bla인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 mec 유전자는 mecA, mecI 및 mecR1 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 bla 유전자는 blaZ, blaI 및 blaR1 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법들 중 어느 하나 이상으로 제조된, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균용 약학적 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법들 중 어느 하나 이상으로 제조된, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균용 화장품일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법들 중 어느 하나 이상으로 제조된, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균용 건강기능식품일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법들 중 어느 하나 이상으로 제조된, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균용 동물 사료일 수 있다.

본 발명에 따르면 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 병용 투여하여 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 베타-락탐 (beta-lactam)계 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 적용하여 항균 상승 효과를 가지면서, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하고, 인체 부작용이 적은 의약제품, 의약품, 화장품, 건강기능식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 단독 또는 병용 투여시 황색포도상구균 내성유전자인 mecA, mecI 및 mecR1의 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동하여 나타낸 도이다.
도 2는 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 단독 또는 병용 투여시 황색포도상구균 내성유전자인 blaZ, blaI 및 blaR1의 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동하여 나타낸 도이다.
도 3은 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 단독 또는 병용 투여시 황색포도상구균 내성유전자인 (가) mecA, (나) mecI 및 (다) mecR1의 발현정도를 수치로 나타낸 도이다.
도 4는 레인 (Rhein; RHE) 및 옥사실린 (Oxacillin; OX)을 단독 또는 병용 투여시 황색포도상구균 내성유전자인 (가) blaZ, (나) blaI 및 (다) blaR1의 발현정도를 수치로 나타낸 도이다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

상술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 항생제는 대부분의 균들이 내성을 지니고 있기 때문에 의약품, 식품뿐만 아니라, 축산분야에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.

본 발명은 레인 및 옥사실린을 병용 투여하여 황생포도상구균의 항생제 내성 유전자의 발현량을 감소 시킴으로써 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법을 통해 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이러한 방법을 통해 제조된 인체 부작용이 적고, 항균효과가 우수한 항균 조성물을 제공할 수 있다.

먼저, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법을 설명한다.

본 발명은 In vitro 상에서, a) 레인 및 옥사실린을 병용 투여하는 단계 및 b) 황색포도상구균의 항생제 내성유전자의 발현량을 감소시키는 단계를 포함하는, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레인은 하수오 (Pleuropterus multiflorus TURCZ.)의 뿌리 유래일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 레인을 옥사실린과 병용 투여시 레인 단독 사용시의 황색포도상구균을 억제하는 최소 억제농도 보다 현저히 적은 양의 레인으로도 항균 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.

먼저, 상기 유효성분 중 레인에 대하여 설명하도록 한다.

또한, 상기 레인은 하수오로부터 추출할 수 있는 공지된 방법을 사용하여 추출될 수 있으며, 일예로 메탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물 중에서 어느 하나의 용매로 추출될 수 있다.

상기 레인의 화학식은 아래와 같다.

[화학식]

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 레인은 25 내지 65 ㎍/mL의 농도로 포함되며, 상기 a) 단계의 옥사실린은 10 내지 35 ㎍/mL의 농도로 포함될 수 있다.

상기 레인은 단독사용시 황색포도상구균을 억제하는 최소억제농도가 존재하며, 본 발명은 상기 레인과 옥사실린을 함께 사용함에 따라서 상기 레인을 단독사용시 최소억제농도보다 현저히 적은 양으로 사용하여도 매우 우수한 항균효과를 발현할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 레인 및 옥사실린을 병용 투여 하는 경우 레인을 단독 사용시 보다 황색포도상구균의 항생제 내성유전자인 mecA, mecI 및 mecR1의 유전자 발현량이 감소 되는 것을 확인 할 수 있다 (도 3 참조).

더욱 구체적으로는, 옥사실린을 병용 투여시 레인의 농도가 31.25 ㎍/mL인 경우 보다 62.5 ㎍/mL인 경우에서 항생제 내성 유전자인 mecA, mecI 및 mecR1의 유전자 발현량이 감소 되어 MRSA균주에 대한 항균활성이 더욱 향상된 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 레인 및 옥사실린을 병용 투여 하는 경우 레인을 단독 사용시 보다 황색포도상구균의 항생제 내성유전자인 blaZ, blaI 및 blaR1의 유전자 발현량이 감소 되는 것을 확인 할 수 있다 (도 4 참조).

더욱 구체적으로는, 옥사실린을 병용 투여시 레인의 농도가 31.25 ㎍/mL인 경우 보다 62.5 ㎍/mL인 경우에서 항생제 내성 유전자인 blaZ, blaI 및 blaR1의 유전자 발현량이 감소 되어 MRSA균주에 대한 항균활성이 더욱 향상된 것을 확인할 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 식품, 화장품, 의약품에 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 보존제로 사용될 수 있고, 동물 사료에 기존 항생제 대신 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈61 (tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 시코닌의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또 는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 화장료 조성물에 활용될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 건강기능식품에 활용될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 동물사료에 활용될 수 있으며, 상기 동물사료는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

준비예1 실험 재료의 준비

본 발명에서 사용한 레인 (rhein; RHE; 4,5-dihydroxyanthraquinone -2-carboxylic acid), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 디메틸술폭시드 (dimethyl sulfoxide; DMSO), 암피실린 (ampicillin; AM) 및 옥사실린 (oxacillin; OX)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 미국)으로부터 구입 하였다. 또한, 뮬러-힌트 배지 (Mueller-Hinton broth; MH broth)와 뮬러-힌트 아가 (Mueller-Hinton agar; MH agar)는 미국의 디프코사 (Difco Laboratories)에서 구입 하여 사용하였다.

실시예1 메티실린 내성 황색포도상구균 선별 및 배양조건

레인의 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위해, 16개의 MRSA 및 1개의 메티실린 민감성 황색포도상구균(methicillin-susceptible staphylococcus aureus; MSSA, 이하'MSSA'로 표기함)을 준비하였다.

ATCC 33591 (MRSA 표준균주) 및 ATCC 25923 (MSSA 표준균주)은 각각 MRSA 및 MSSA로 두 균주 모두 ATCC (American Type Culture Collection, 미국)으로부터 구입하였으며, 임상적 메티실린 내성 황색포도상구균은 원광대학교 의과대학병원의 성형외과로부터 확보하여 사용하였다 (DHCR 균주 1 내지 15).

모든 균주는 30% 글리세롤 (glycerol)에서 -70℃에 보관하였으며, 실험에 사용하기 위해 뮬러-힌트 아가 플레이트 (MH agar plates) 및 보통 한천 배지 (nutrient agar)에서 유지시켰으며, 항균활성 측적 (antibacterial assays)은 뮬러-힌트 배지를 사용하여 수행하였다. 균주의 성장은 600nm에서 OD (optical density)값으로 혼탁도 (turbidity)를 측정하였다.

실시예2 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 최소억제 농도 측정

레인의 황색포도상구균에 대한 항균효과를 알아보기 위해 균주를 억제하는 최소 억제 농도 (Minimum inhibitory concentration; MIC)를 측정하였다.

MIC의 측정은 CLSI 가이드 라인 (Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, 2006)에 따라 수행되었으며, 황색포도상구균에 대한 레인의 최소억제농도 값은 96-웰 마이크로티터 플레이트 (96-well microtiter plates)를 이용하여 측정하였다.

실험을 수행하기 앞서, 레인은 DMSO (diluted using MH broth; v/v)를 이용하여 희석하였고 연속 희석으로 96-웰 마이크로티터 플레이트 (96-well microtiter plates)에 준비하였다. 황색포도상구균 접종물들은 0.5 McFarland standard (약 10⁸ colony-forming units(CFU)/mL)로 조정하였다. 최소억제농도 값은 37℃에서 24시간 동안 배양하여 황색포도상구균의 성장이 억제되는 가장 낮은 농도로 정의하였다.

24시간 동안 배양한 후, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)(1㎎/mL)의 20㎕를 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 육안으로 최소억제농도를 관찰하였다.

기존 항생제와의 비교를 위하여 대조군으로 암피실린 (Ampicillin) 및 옥사실린 (oxacillin)을 사용하였으며, 황색포도상구균에 대한 최소억제농도는 상기 와 같은 방법으로 수행하였다. 하기 표 1에 최소억제농도 값 측정 결과를 나타내었다.

S. aureus strain	최소억제농도; MIC (㎍/mL)
S. aureus strain	Rhein (RHE)	Ampicillin (AM)	Oxacillin (OX)
ATCC 33591	62.5	62.50	1000.00
ATCC 25923	62.5	0.97	1.95
DHCR 1	62.5	31.25	1000.00
DHCR 2	62.5	31.25	1000.00
DHCR 3	62.5	31.25	500.00
DHCR 4	62.5	31.25	1000.00
DHCR 5	125.0	31.25	1000.00
DHCR 6	250.0	31.25	500.00
DHCR 7	250.0	62.50	500.00
DHCR 8	250.0	125.00	500.00
DHCR 9	250.0	125.00	500.00
DHCR 10	125.0	62.50	500.00
DHCR 11	125.0	125.00	500.00
DHCR 12	62.5	125.00	500.00
DHCR13	250.0	125.00	500.00
DHCR 14	250.0	62.50	1000.00
DHCR 15	250.0	125.00	500.00

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 레인의 최소억제농도는 62.5 내지 250 ㎍/mL으로 확인되었다. 대조군으로 사용한 암피실린 및 옥사실린은 MRSA에 대해서는 최소억제농도가 각각 0.97 ㎍/mL 및 1.95 ㎍/mL 로 매우 높은 항균활성을 보인 반면, 16종의 MRSA에 대해서 암피실린의 최소억제농도는 31.25 내지 125 ㎍/mL으로 항균활성이 감소되었으며, 옥사실린의 최소억제농도는 500 내지 1000 ㎍/mL으로 MRSA에 대한 항균활성이 거의 없는 것을 확인하였다.

실시예3 레인과 옥사실린의 혼합에 따른 상승효과 측정

3.1 체커보드 희석 시험 (Checkerboard dilution test)

레인 (RHE)과 옥사실린 (OX)의 시너지 효과를 측정하기 위하여 옥사실린을 MH 배지에서 혼합하고 레인으로 연속 희석 시켜, 현탁액의 농도를 1.5 × 10⁷ CFU/mL로 조정하였다. 최소억제농도 값은 37℃에서 24시간 동안 배양하여 확인하였다. 하기 표 2에 최소억제농도 값 측정 결과를 나타내었다.

S. aureus strain	레인의 MIC (㎍/mL)		옥사실린의 MIC (㎍/mL)		FICI (분할저해 농도지수)	효과 여부
S. aureus strain	레인 단독	옥사실린 혼합	옥사실린 단독	레인 혼합	FICI (분할저해 농도지수)	효과 여부
ATCC 33591	62.5	15.60	1000	125.0	0.3750	Synergistic
DHCR-1	62.5	15.60	1000	62.5	0.3125	Synergistic
DHCR-2	62.5	31.25	1000	250.0	0.7500	Partial synergy

레인 (RHE)과 옥사실린 (OX)의 조합은 MRSA 표준균주인 ATCC33591과 MRSA 균주 DHCR-1에 대해서는 시너지 효과를 보였고, DHCR-2에 대해서는 부분적인 상승효과를 보였다.

3.2 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 황색포도상구균 내성유전자 발현 정도 확인

MRSA 표준균주인 ATCC33591을 균주의 성장이 600nm에서 OD (optical density)값 0.35 내지 0.45에 도달할 때 까지 MH 배지에서 배양하였다. 그 후 배양액에 다양한 농도의 레인 및 옥사실린을 처리하고 37℃에서 20분동안 배양하였다 (도 1 및 도 2 참조).

그 후 RNA 추출은 E.Z.N.A.® bacterial RNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 미국)를 이용하였고, cDNA 합성은 Quantitact Reverse Transcription Kit를 사용하였다. PCR은 Maxime PCR PreMix (20 μL; iNtRon Biotechnology, Inc., 성남, 한국), 프라이머, cDNA 시료 및 멸균 증류수를 사용하여 수행하였다.

하기 표 3에는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 베타-락탐 (beta-lactam)계 항생제 내성 유전자 mecA, mecI, mecR1, blaZ, blaI 및 blaR1과 16s rRNA의 프라이머 서열에 관한 것이다.

프라이머	서열 (5‘ → 3’)
mecA-F	ATGAGATTAGGCATCGTTCC
mecA-R	TGGATGACAGTACCTGAGCC
mecI-F	CTGCAGAATGGGAAGTTATG
mecI-R	ACAAGTGAATTGAAACCGCC
mecR1-F	AAGCACCGTTACTATCTGCACA
mecR1-R	GAGTAAATTTTGGTCGAATGCC
blaZ-F	GATAAGAGATTTGCCTATGC
blaZ-R	GCATATGTTATTGCTTGACC
blaI-F	GCAAGTTGAAATATCTATGG
blaI-R	GAAAGGATCCATTTTCTGTACACTCTCATC
blaR1-F	CATGACAATGAAGTAGAAGC
blaR1-R	CTTATGATTCCATGACATACG
16s rRNA-F	CGTGCCTAATACATGCAAGTC
16s rRNA-R	CCGTCTTTCACTTTTGACCA

PCR후 동량의 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 (agarose gel) 전기영동을 수행하여 밴드를 통해 항생제 내성 유전자들의 유전자 발현량을 확인 할 수 있었다.

그림 1 (mecA, mecI, mecR1) 및 그림 2 (blaZ, blaI, blaR1)에서 레인 을 단독 사용한 경우보다 레인과 옥사실린을 함께 사용한 경우에서 밴드의 두께가 더 얇은 것을 통해, 해당 항생제 내성 유전자들의 발현량이 감소된 것을 알 수 있었으며, 더욱 상세하게는 레인과 옥사실린을 병용 투여하는 경우 옥사실린 31.25 ㎍/mL 및 레인 61.50 ㎍/mL의 농도에서 항생제 내성 유전자들이 가장 낮은 발현량을 나타내는 것으로 확인 되었다. 따라서 이를 통해 레인과 옥사실린을 병용 투여시 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, MRSA의 항균효과를 증가시킨다는 것을 확인 할 수 있었다.

또한 그림 3 및 그림 4의 경우, MRSA 내성 유전자에 대한 레인 (RHE)의 억제 효과를 평가하기 위해 RT-PCR을 수행 하여 유전자 발현 정도를 수치로 나타낸 도이다. 레인은 mecA / blaZ 의 발현을 용량 의존적으로 감소시켰다. 대조적으로, 유전자 발현은 옥사실린에 의해 증가되었고 레인과 옥사실린 (OX)의 조합으로 다시 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 조절 유전자 인 mecI / blaI 및 mecR1 / blaR1 의 발현은 레인과 옥사실린이 병용 투여 된 경우 용량의존적으로 감소 하였다. 이를 통해 레인과 옥사실린을 병용 투여시 항생제 내성 유전자인 mec 또는 bla의 유전자 발현을 감소 시킴으로써, 항생제 내성 황색포도상구균의 항균효과를 증가시킨다는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 실험 결과의 통계 분석은 편도 분석을 사용하여 평가되었으며, 이어서 Scheffe의 다중 비교 테스트가 수행되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 모든 계산은 SPSS 통계 23 소프트웨어 (SPSS Inc.Chicago, IL, 미국)를 사용하여 평가되었고, P <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 건강기능식품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제조예 1>

항균 조성물 200 ㎎

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B 1 0.13 ㎎

비타민 B 2 0.15 ㎎

비타민 B 6 0.5㎎

비타민 B 12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 화장료 조성물의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제조예 2>

에틸 알코올 4.00 중량%

메틸 파라벤 0.10 중량%

향 0.10 중량%

수소처리된 캐스터 오일 0.60 중량%

DL-α-토코페릴 아세테이트 0.02 중량%

글리세린 5.00 중량%

1,3-부틸렌 글리콜 3.00 중량%

하이드록시 에틸 셀룰로오스 0.20 중량%

잔탄검 0.40 중량%

E.D.T.A-2Na 0.02 중량%

피쉬-콜라겐 4.00 중량%

항균 조성물 0.5~2.0 중량%

증류수 잔량

이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 주사제의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제조예　3>

항균 조성물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 동물 사료의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제조예 4>

항균 조성물 40g

부형제(말분) 760g

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims

In vitro 상에서,
a) 레인 및 옥사실린을 병용 투여하는 단계 및
b) 황색포도상구균의 항생제 내성유전자의 발현량을 감소시키는 단계를 포함하는, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과를 증가시키는 방법에서,
상기 a) 단계의 레인은 62.5 ㎍/mL의 농도로 포함되며, 상기 a) 단계의 옥사실린은 31.25 ㎍/mL의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하고,
상기 b) 단계의 항생제 내성유전자는 mecA, mecI, mecR1, blaZ, blaI 및 blaR1인 것을 특징으로 하는, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 레인은 하수오(Pleuropterus multiflorus TURCZ.)의 뿌리 유래인 것을 특징으로 하는, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 항생제 내성 황색포도상구균은 ATCC33591 균주인 것을 특징으로 하는, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과를 증가시키는 방법.
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