KR20100089394A

KR20100089394A - 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20100089394A
Application number: KR1020090008613A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김윤철; 김석; 김동렬; 손동환; 김성연
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 삼광생명과학 주식회사
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2009-02-03
Publication date: 2010-08-12

Abstract

본 발명은 젖소 유방염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 생체에 부작용이 없는 무독성 및 무잔류성의 제제로서, 유방염 원인균에 대한 뛰어난 항균 효과 및 원유 중 체세포 수 감소효과를 나타내므로, 젖소 유방염의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 동물사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

오배자, 항균, 젖소 유방염

Description

오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising the extract of Galla Rhois as an active ingredient for preventing and treating dairy cattle mastitis}

본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물 및 동물사료 첨가제에 관한 것이다.

[문헌 1] Bradley et al. 2002. Bovine Mastitis: An Evolving Disease. Vet. J. 164: 116-128.

[문헌 2] Seegers et al. 2003. Production effects related to mastitis and mastitis economics in dairy cattle herds. Vet. Res. 34: 475-491.

[문헌 3] 한국경제TV, 2006년5월 기사

[문헌 4] 축산신문, 2005년12월7일 기사

[문헌 5] Watts et al. 1988. Etiological agents of bovine mastitis. Vet. Microbiol. 16: 41-66.

[문헌 6] Sader et al. 2006. Daptomycin bactericidal activity and correlation between disk and broth microdilution method results in testing of Staphylococcus aureus strains with decreased susceptibility to vancomycin. Antimicrob. Agents. Chemother. 50: 2330-2336.

[문헌 7] Choi et al. 2005. Soluble CD44 Is cytotoxic to trabecular meshwork and retinal ganglion cells in vitro. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46: 214-222.

[문헌 8] 문 등. 1998. 젖소 유방염에 대한 키토산의 효능에 관한 연구. 대한 수의학회지. 38(1): 71-76.

[문헌 9] Cowan et al. 1974. Manual for the identification of medical bacteria. 2nd 45-50. Cambridge University press. London.

[문헌 10] 국립수의과학 검역원, 질병관리본부 질병 통계자료, 2006년

[문헌 11] 한국 공개특허 제1999-44796호

[문헌 12] 한국 공개특허 제1995-2769호

[문헌 13] 한국 공개특허 제2003-84223호

[문헌 14] 한국 공개특허 제2003-79185호

[문헌 15] 한국 공개특허 제2003-39152호

[문헌 16] 한국 공개특허 제1997-68997호

[문헌 17] 정보섭 외, 향약대사전, pp.380-384, 영림사, 1998

젖소의 유방염은 자연계에 널리 분포되어 있는 세균이나 곰팡이가 젖소 유방 속에 침입하여 염증을 일으키는 병으로 젖소 질병 중 가장 많이 발생하며, 우유 중에 세균 및 체세포수가 증가하여 유질이 저하되고 유량감소, 치료비 지출 등 경제적 손실이 매우 큰 젖소 질병이다. 특히 국내 유우에서 발생되는 유방염은 생유의 위생, 생산자의 경제적 손실, 국민의 영양학적 면에서도 나쁜 영향을 초래하기 때문에 이에 대한 대책마련이 시급한 실정이다.

유방염의 종류는 크게 임상형 유방염, 준임상형 유방염 그리고 만성 유방염으로 나눌 수 있다. 임상형 유방염은 원유 내에 침전물 등이 눈에 보이는, 즉 육안으로 식별할 수 있는 유방염으로 약 5.5%의 젖소가 감염돼 있다. 유방이 붓고 열이 나며 통증 및 유방기능 장애를 일으키고, 유즙 변화가 육안으로 쉽게 구별되는 상태로서 화농되면 우유와 함께 고름이 섞여 나오기도 한다. 임상형 유방염은 3가지로 나눠질 수 있다. 심급성 유방염, 급성 유방염 그리고 아급성 유방염으로 나누어진다.

준임상형 유방염은 유방염에 감염되어 있으나 축주의 눈에 육안적으로는 확인될 수 없는 상태를 말하며, 유즙을 캘리포니아 유방염 진단법(CMT) 등의 야외진단방법이나 유즙의 세균 배양 등 실험실 진단에 의해서만 판정할 수 있다. 임상형 유방염보다 15~40 배나 발생율이 높으며, 대부분 임상형으로 진행된다. 이러한 준임상형 유방염을 치료하지 않은 채 방치하면 임상형으로 돌변할 가능성이 높으며, 평소에도 산유량 감소와 유질 저하 등의 커다란 경제적 손실을 가져온다. 유방염 방제를 위해서는 이러한 준임상형 유방염을 집중적으로 검색, 치료 및 예방 관리를 하여야 하며, 집중적인 관심과 노력에 의해서 근절 또는 감소시킴으로써 유질 향상, 유량 증대 등 근본적인 경제적 이익을 가져올 수 있는 것이다.

만성 유방염으로 염증 경과가 수개월 지속하거나, 다음 비유기까지 지속되는 상태를 말한다. 유방조직 내에 흉터가 생겨 유방의 형태와 크기가 변화되기도 하며 산유량 감소를 동반한다. 세균이 잠복하고 있다가 스트레스, 건강상태에 따라 발병한다. 치료를 하면 쉽게 회복되는 듯하나 곧 재발하는 특징이 있어 치료가 어렵다.

마지막으로 비특이성 유방염(무균성 유방염)으로 병원균을 분리할 수 없는 유방염으로 임상형 또는 준임상형으로 발생하며 착유기기의 점검 등 예방하는 것이 최선이다. 이중 한국은 임상형과 준임상형이 5.5%와 30.2%로 선진국의 2배에서 3배 정도 되는 것으로 사료된다.

젖소의 유방염으로 인한 전 세계적 손실 규모는 매년 약 35조원에 이르고(Bradley et al., 2002; Seegers et al. 2003) 미국에서 는 약 2조원, 영국에서는 2,700억원 이상의 경제적 손실을 야기하며(한국 경제 TV 2006년 5월 기사), 국내도 1,132억원 이상의 경제적 손실을 일으키는 심각한 질병중 하나이다(축산신문 2005년 12월 7일자 기사).

유우에 있어서의 유방염은 낙농 산업에 있어 가장 치명적인 질병이며 다양한 원인으로 발병한다. 유방염의 원인균은 크게 세균성, 곰팡이성, 세균성으로 구분되는데, Watts의 보고(Watts et al. 1988)에 의하면 137종 이상의 미생물이 유방염과 관련되어 있음을 보고하였다. 주요 원인체로서는, 1) 세균성으로 스텝필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스텝필로코코스 에피덜미티이스(S. epidermitidis), 스트렙토코코스(Streptococcus spp.), 브루셀라(Brucella), 엑티노마이시스 피오진스(Actinomyces pyogenes), 펩토코코스 인도리커스(Peptococcus indolicus), 미호기성 그람양성구균, 대장균, 렙토스피라 브루셀라(Leptospira, Brucella)균, 결핵균 및 마이코플라스마(Mycoplasma) 등; 2) 바이러스(virus)성으로 소 파라인플루엔자(Parainfluenza) 3, 보바인 헤르페스바이러스(bovine herpesvirus) 2, 벡시니아(vaccinia), 카우팍스(cowpox), 수도카우팍스(pseudocowpox), 베시쿠랄 스토마티스(vesicular stomatitis) 및 구제역(foot-and-mouth disease) 등; 3) 곰팡이성으로 효모(yeast), 칸디디듐(Candididum spp.) 및 페니실리움(Penicillium spp.) 등이 관여한다.

국내의 브루셀라(Brucella) 감염증은 1955년 유우에서 최초로 보고된 이후 소수의 발병예가 보고되었으나 2000년대 초반부터 점차 증가하기 시작하여 2006년에는 유우 및 한우에서 20,000건 이상, 인체에서 200건 이상 보고되어 국민건강의 위협은 물론, 막대한 경제적 손실을 야기하고 있다(2006년 국립수의과학 검역원, 질병관리본부 질병 통계 자료).

특히, B. abortus 균은 젖소에서 유방염을 유발하는 중요 세균 중 하나이지만, 세포내에서 증식하며 발병을 일으키기는 중요 인수공통 전염병의 원인체로서 인체감염의 경우 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 등으로 인하여 치료방법에 대한 개선이 시급한 실 정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되는 심각한 질병이다. 감염축의 경우 특별한 치료 방법이 없으며, 국내에서는 양성축 도살(test and slaughter) 방법이 사용되어 2006년 한해에만 1,700억원 이상(2006년 국회보고)의 막대한 경제적 손실을 일으키고 있다.

유방염이 발생되는 이외의 원인으로는 유방의 비정상적인 해부구조, 비위생적인 사육환경, 불균형한 영양공급, 체내 대사 및 호르몬 등 생리적 이상, 분만 및 건유기의 비위생적인 사양관리, 비위생적인 착유기 사용 및 사용오류, 착유 위생관리 불량 등이다. 특히, 모든 원인에 있어 환경으로부터의 유방염 감염이야말로 가장 중요한 오염원이 된다. 따라서 위생적 유방의 세척, 유방 표면부 관리, 착유후 유두공 소독 등은 유방염의 예방을 위해서 취해야 할 중요한 요소이다.

현재 유방염의 치료 방법은 확립되어 있지 못하며, 원인균의 항생제 감수성을 통한 항생제 요법과 대증적 요법을 병행하여 실시하고 있으나, 예후는 아주 불량한 실정이다. 2003년 기준으로 연간 1400톤 이상의 항생제가 가축의 질병치료예방뿐만 아니라 성장촉진 목적에 과도하게 사용되고 있어, 항생제 오남용, 축산물 내 항생제 잔류(일반적으로 5일 이상 납유할 수 없는 휴약기간 있음), 국민보건 위해 증가 등 심각한 문제를 초래하고 있다. 최근 항생제를 대체하기 위한 연구가 다각도로 진행되고 있다.

최근에는 세계적으로 젖소 유방염 치료제의 개발을 위하여 천연물질을 이용한 유방염 예방 및 치료제 개발을 추진하고 있다. 국내에서도 천연물질을 이용한 특허출원 및 등록된 천연물질로는 키토산 또는 키토산 올리고당을 유효성분으로 하는 젖소의 유방염 예방 및 치료제(한국 공개특허 제1999-44796호), 그레이프프루트 종자 추출물을 원료로 한 젖소의 유방염 에방 치료용 배합물 및 그의 연고상 제제(한국 공개특허 제1995-2769호), 상황버섯 추출물을 함유하는 가축의 유방염질환 치료용 약학적 조성물(한국 공개특허 제2003-84223호), 국화류 유래의 추출물을 이용한 임산부와 젖소의 유방염 치료제 제조 방법 및 그의 응용성(한국 공개특허 제2003-79185호), 비파나무 잎 추출물을 이용한 젖소 유방염의 예방 치료제 및 그 방법(한국 공개특허 제2003-39152호), 소 등의 가축의 유방염 치료 방법 및 유방용 오존 주입장치(한국 공개특허 제1997-68997호) 등이 알려져 있다.

오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 오배자진딧물(Aphis chinensis J. Bell)이 자상(刺傷)을 주어생긴 벌레집을 말하는데, 우리나라 각지에 분포한다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3∼7cm, 폭 2∼5cm, 두께 2mm 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 찐다. 주성분으로는 피로가롤 탄닌(pyrogallol tannin)이 50~70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산(gallic acid) 등이 있다. 약효로는 수렴, 지사, 지혈제로 설사, 가래, 당뇨, 하혈, 빈혈 등에 이용한다(정보섭 외, 향약대사전, pp.380~384, 영림사, 1998).

이에 본 발명자들은 항생체를 대체할 수 있는 무독성 및 무잔류성의 천연물질로부터 유방염 원인균 7종에 대한 항균 효과를 확인하던 중 본 발명의 오배자 추 출물이 뛰어난 항균 효과 및 원유 중 체세포 수 감소효과가 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제를 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 10 내지 50% 에탄올 혼합용매, 보다 더 바람직하게는 20 내지 40% 에탄올 혼합용매에 가용 추출한 것을 포함한다.

상기 젖소 유방염은 임상형 유방형, 준임상형 유방염, 만성유방염 또는 비특이성 유방염을 포함한다.

본원에서 정의되는 젖소 유방염 원인균은 대장균(E. coli), 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코코스 아가라티아에(S. agalactiae), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa), 트리코피톤 멘타그로피니스(Trichophyton mentagrophytes), 마이코박테리움 폴투이툼(Mycobacterium fortuitum), 브루셀라 아볼터스(Brucella abortus), 스트렙토코코스(Streptococcus spp.), 엑티노마이시스 피오진스(Actinomyces pyogenes), 펩토코코스 인도리커스(Peptococcus indolicus), 미호기성 그람양성구균, 렙토스피라 브루셀라(Leptospira, Brucella)균, 결핵균, 마이코플라스마(Mycoplasma), 소 파라인플루엔자 3(Parainfluenza 3), 보바인 헤르페스바이러스 2(bovine herpesvirus 2), 벡시니아(vaccinia), 카우팍스(cowpox), 수도카우팍스(pseudocowpox), 베시쿠랄 스토마티스(vesicular stomatitis), 효모(yeast), 칸디디듐(Candididum spp.) 및 페니실리움(Penicillium spp.)으로 구성된 군으로부터 선택된 균, 바람직하게는 대장균(E. coli), 스타필로코코스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코코스 아가라티아에(S. agalactiae), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa), 트리코피톤 멘타그로피니스(T. mentagrophytes), 마이코박테리움 폴투이툼(M. fortuitum) 및 브루셀라 아볼터스(B. abortus)으로 구성된 군으로부터 선택된 균에 의한 젖소 유방염을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 오배자 추출물은, 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 10 내지 20배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 10 내지 50% 에탄올 혼합용매, 보다 더 바람직하게는 20 내지 40% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 본 발명의 오배자 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 오배자 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 오배자 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제를 포함한다.

본 발명의 수의학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 젖소 유방염의 예방 및 개선에 유용한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 오배자 추출물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 추출물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 오배자 추출물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 추출물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 추출물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 상기 추출물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예를 들어, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예를 들어, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예를 들어, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적 으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 생체에 부작용이 없는 무독성 및 무잔류성의 제제로서, 유방염 원인균에 대한 뛰어난 항균 효과 및 원유 중 체세포 수 감소효과를 나타내므로, 젖소 유방염 발생을 최소화하여 양질의 원유와 축산물을 생산하여 생산성 향상에 크게 기여, 축산 농가 소득향상의 기회를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오배자 물 추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 오배자 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 동결건조하여 20.0 g의 오배자 물 추출물(이하 “G"라 명명함; 추출율 66.7%)을 수득하였다.

실시예 2. 오배자 에탄올 추출물의 제조

2-1. 70% 에탄올 추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 70% 수성 에탄올을 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축 (EYELA사, N-1000, 일본)하여 22.4 g의 오배자 에탄올 추출물(이하 “GE-70"이라 명명함; 추출율 74.7%)을 수득하였다.

2-2. 30% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 30% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 30% 에탄올 추출물(이하 “GE-30"이라 명명함; 추출율 67.9%)을 수득하였다.

2-3. 50% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 50% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 50% 에탄올 추출물(이하 “GE-50"이라 명명함; 추출율 69.7%)을 수득하였다.

2-4. 100% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 100% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 100% 에탄올 추출물(이하 “GE-100"이라 명명함; 추출율 53.3%)을 수득하였다.

실시예 3. 연고제의 제조

GE30 분말 100g과 70% 에탄올 100g 의 비율로 녹인 후, 마개를 밀봉하여 4시간정도 sonication 시킨다. 고압증기 멸균한 PEG400과 PEG4000을 식기 전에 4:1 비율로 혼합하고, 첨가제(메틸 파라벤 1.6g/kg, 프로필파라벤 0.4g/kg)를 넣어 기제혼합액을 제조하고, 주약(GE30-에탄올 용액) 30g을 기제혼합액 1kg에 넣어 잘 섞어준다. 상온에서 식힌 후 용기에 담는다.

참고예 1. 공시균주 및 배양

본 실험에 사용한 균주는 Escherichia coli DH 5a, Staphylococcus aureus(ATCC 29213), Streptococcus agalactiae(ATCC 27956), Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853), Trichophyton mentagrophytes(KCCM 60446), Mycobacterium fortuitum G-B-14-14-2, Brucella abortus 544를 국립수의과학 검역원과 한국미생물보존센타로부터 분양받아 공시하였다. 균주의 배양을 위하여 사용된 배지는 LB broth, LB agar, TSA, PDA, Middlebrook 7H9 broth, Brucella agar, Brucella broth를 사용하였고, 배양 온도는 균주에 따라 37℃, 32℃에서 24시간, 96시간 정치 및 진탕배양(shaking incubating)을 통하여 배양하였다.

실험예 1. 균의 감수성 시험

상기 실시예 2-2에서 수득한 GE-30에 대한 균의 감수성 시험을 수행하기 위하여 디스크 분산 테스트(Disk diffusion test)를 문헌(Sader et al. 2006)의 방법을 참조 및 응용하여 실험을 수행하였다.

멸균된 디스크(Disk)에 GE-30를 멸균 증류수에 완전히 녹인 다음 디스크당 GE-30을 0, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg, 10 mg의 농도로 시험에 사용하였다. 디스크 분산 테스트(Disk diffusion test)를 위하여 상기 참고예 1에서 배양된 세균(세균수 3-5x10⁹ CFU)들을 각각 준비된 플레이트 아가(plate agar)에 도말을 하였고 준비된 GE-30 디스크를 배지위에 올려놓은 후, 각 균에 따라 24시간에서 96시간 배양한 후 각 균의 감수성을 확인 하였다.

실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이, GE-30 10 mg에서 1 mg 사이의 농도에서 GE-30 확산에 의한 균의 사멸효과 인정되었으며, 각각 100 ㎍, 10 ㎍ 및 1 ㎍의 농 도에서는 GE-30 확산에 의한 균의 사멸효과는 인정되지 않았다. 따라서, GE-30의 직접적 살균작용에 의해 그람양성균, 그람 음성균, 항산성균 및 곰팡이 등 유방염 원인균에 대한 살균효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

실험예 2. MIC 시험

상기 실시예 2-2에서 수득한 GE-30에 대한 균의 MIC(minimum inhibitory concentration)을 측정하기 위하여 문헌(Sader et al. 2006)의 방법을 참조 및 응용하여 실험을 수행하였다.

간단히 설명하면, GE-30를 96웰-마이크로플레이트(96well-microplate)에 최초 농도 1 mg/ml로 액체배지에 희석한 후 2진 희석을 실시하여 2¹¹까지 희석을 하였고(2 mg/ml), 희석된 GE-30에 각 균을(세균수 3-5x10⁵ CFU) 첨가한 후 각 균에 따라 24시간에서 96시간 배양한 후 균의 증식여부를 확인하여 각 균의 MIC를 측정하였다. MIC는 마이크로플레이트(microplate)의 흡광도를 측정하여 설정하였다.

실험결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, GE-30의 유방염 원인균 및 병원성 미생물에 대한 MIC를 측정해본 결과, 그람양성 병원성균(S. aureus, S. agalactiae), 그람 음성 병원성균(E. coli, P. aeruginosa, B. abortus) 항산성균(M. fortuitum) 및 곰팡이(T. mentagrophytes)에 대하여 광범위한 균 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 상대적으로 높은 MIC 농도를 나타낸 항산성균(M. fortuitum)에 대한 효과는 다른 유방염 원인균에 비하여 미약함을 확인할 수 있었 다.

대상 균	MIC 농도 (mg/ml)
E. coli	125
S. aureus	31.25
S. agalactiae	62.5
P. aeruginosa	62.5
B. abortus	31.25
M. fortuitum	500
T. mentagrophytes	125

실험예 3. 항균효과 시험

상기 실시예 2-2에서 수득한 GE-30에 대한 항균효과를 측정하기 위하여 문헌(Sader et al. 2006)의 방법을 참조 및 응용하여 실험을 수행하였다.

간단히 설명하면, GE-30을 멸균 생리 식염수에 농도별 희석 한 후(1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍), 배양된 균(세균 수 3-5x10⁵ CFU)을 시험관에 분주하여 시간 경과별(0, 2, 4, 8시간) 균의 생존율을 확인하였으며, 최초의 균수를 대조군으로 하여 생존 균수를 백분율로 나타내었다.

실험결과, 하기 도2에 나타난 바와 같이, 곰팡이(T. mentagrophytes)를 제외한 모든 병원성 균이 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍ 농도에서 시험 전기간 동안(8시간)에 걸쳐 균증식이 억제되어 그람음성균, 그람양성균, 항산성균에 대하여 우수한 항균효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 세포독성 시험

상기 실시예 2-2에서 수득한 GE-30에 대한 세포독성을 시험하기 위하여 문헌(Choi et al. 2005)의 방법을 참조 및 응용하여 실험을 수행하였다.

RAW 264.7 세포(KCTC 28116)을 10% FBS(Fetal bovine serum; Gibco) 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco)에 배양하여, 96 마이크로웰 티슈 컬쳐 플레이트(microwell tissue culture plate)에 웰당 2-3x10⁴세포 분주하였다.

배양된 RAW 264.7 세포에 GE-30을 1, 10, 100 ㎍/ml 농도가 되도록 세포배양 배지에 첨가하여 2, 24, 48시간 배양한 후 0.05% 트리판 블루(tryphan blue) 염색을 실시하여 세포독성 시험을 수행하였다. 대조군에는 시료를 첨가하지 않은 배지에 배양된 세포를 이용하였으며, 염색 후 각 세포는 현미경(Olympus IX70)하에 검경하였으며 100개의 세포 중 트리판 블루(tryphan blue)에 염색된 세포수를 산정하였고, 3-5반복 실험을 통하여 평균값을 이용하였다.

실험결과, 하기 도3에 나타난 바와 같이, 1 ㎍ 농도에서는 48시간까지 세포독성이 인정되지 않았으며, 10 ㎍의 농도에서는 48시간 배양까지 세포독성이 대조군과 비교하여 15% 미만의 세포독성이 인정되었고, 100 ㎍ 농도에서 48시간 경과 후 약 85% 정도의 세포독성이 인정되어, 10 ㎍ 미만의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

실험예 5. 유방염 치료제의 안전성 및 유방염 치료 시험

상기 실시예 2-2에서 수득한 GE-30의 유방염에 대한 효능을 검증하기 위하여 문헌(문 등. 1998)의 방법을 참고하여 정상 젖소에서의 안전성 및 유방염 젖소에서의 치료 효능을 실험하였다.

안전성 시험을 수행하기 위하여 정상 젖소 4두(경상대학교 부속 농장)에 상기 실시예 3에서 제조한 유방염 연고제를 분방 당 10 g을 유두 내 4일간 아침과 저녁 착유 후 주입을 하여 2주 경과 후 우유 내 체세포 수와 세균수를 측정하였다. 처음 주입 이후부터 2주간 발적, 열감, 종창, 유량 감소 유무 등의 임상증상을 관찰하였다.

우유 내 체세포 수의 측정은 채취된 분방별 원유를 멸균된 시험관에 무균적으로 채취하여 냉장 운반한 다음 Fossomatic 300(Foss Electic Co. Denmark)기기를 이용하여 체세포수를 측정하였고, 세균수의 측정과 원인체 동정은 문헌(Cowan et al. 1974)의 방법을 참고하여 수행하였다.

간단히 설명하면 원유 0.025 ml을 면양 혈액한천배지에 접종하고 37℃에서 24-48시간 배양 후 균 집락의 성상과 용혈성 및 그람 염색소견 등에 의해 일차적으로 균을 선별한 다음, catalase, coagulase, aesculin hydrolysis 반응, MacConkey 배지에서의 발육능, 황색포도상구균 베타톡신 산생능 등을 실시하였다. 세균수의 측정은 원유를 적당히 희석한 후 TSA 배지 및 플레이트 카운트 아가(plate count agar)에 도말하여 37℃에서 24-48시간 배양 후 총 균수를 측정하였다.

체세포란 우유를 생산하는 유선상피세포와 외부로부터 들어오는 미생물을 제거하여 젖소의 정상적인 면역반응에 의해 생성된 면역세포를 합한 것이며, 유방염이 발생하면 유선 조직의 염증으로 인해 원유 내에 다량의 체세포가 검출되는데, 이러한 체세포 수를 측정하여 유방염을 진단한다.

이렇게 진단된 유방염 젖소에 대해 치료효과를 규명하기 위하여 경증 유방염 젖소(체세포 20만 이상-100만 미만(경상대학교 부속 농장) 4두, 중증 유방염 젖소(체세포 100만 이상(경상대학교 부속 농장))에 분방 내 상기 실시예 3에서 제조한 유방염 연고제를 주입하고, 주입 2주 후 체세포수 및 세균수를 측정하여 치료효과를 규명하였다.

실험결과, 하기 도 4에 나타난 바와 같이, 정상 젖소에 대한 치료제의 안전성 평가 결과 정상 젖소 4두 모두에서 주입 후 2주 경과한 시점에서 체세포 수는 정상 범위 내에 있어 안전성이 입증되었고, 투입 전 세균 수 평균 약 50,000 CFU/ml가 급격히 감소하여, 2주 경과한 시점에서 5,000 CFU/ml 미만의 균이 검출되어 살균효과가 탁월한 것을 확인 할 수 있었다.

또한 하기 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 경증 및 중증 유방염 젖소에 대한 유방염 치료효과에서도, 체세포수의 경우 7두 중 5두에서 체세포 감소가 인정되었고, 세균수의 경우 7두 중 7두 모두에서 세균수의 급격한 감소가 인정되어 경증 및 중증 유방염에 치료가 탁월한 것으로 확인 되었다.

우유에서 분리한 11두의 원인체에 대한 살균효과를 분석한 결과개체별 유방염 원인체는, 도 7에서 나타난 바와 같이, 포도상구균 4두, 연쇄상구균 1두, 포도상구균과 연쇄상구균 혼합감염 4두, 대장균, 포도상구균 및 연쇄상구균 혼합감염 2두 였으며, 각 원인체에 따른 체세포수 및 세균수의 변화는, 체세포수 변화의 경우 포도상구균과 연쇄상 구균 혼합감염 1두, 대장균, 포도상구균 및 연쇄상구균 혼합감염 1두를 제외한 모든 실험군에서 체세포수가 감소됨이 확인되었고, 세균수의 경우 11두 모두에서 세균수가 감소됨이 확인되었다.

본 발명의 추출물을 함유하는 수의학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 연고제의 제조

GE-30 15 g

70% 에탄올 15 g

PEG 400 800 g

PEG 4000 200 g

메틸 파라벤 1.6 g

프로필 파라벤 0.4 g

상기의 성분들을 혼합하여 통상의 방법으로 연고제를 제조한다.

제제예 2. 유두삽입용 주사제의 제조

GE-50 0.7 ml

생리식염수 0.2 ml

폴리에칠렌글리콜 0.05 ml

트윈-80 0.5 ml

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 방법으로 유두삽입용 주세제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

GE-70 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 통상의 방법으로 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

GE-100 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 통상의 방법으로 액제를 제조한다.

제제예 5. 사료의 제조

GE-30 240g

부형제 (말분) 760g

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

도 1은 GE-30의 유방염 원인균(A; E. coli, B; S. aureus, C; S. agalactiae, D; P. aeruginosa, E; B. abortus, F; M. fortuitum, G; T. mentagrophytes)에 대한 디스크 분산 테스트를 나타낸 도이며,

도 2는 GE-30의 유방염 원인균(A; E. coli, B; S. aureus, C; S. agalactiae, D; P. aeruginosa, E; B. abortus, F; M. fortuitum, G; T. mentagrophytes)에 대한 항균효과를 나타낸 도이고,

도 3은 GE-30(1, 10, 100 ㎍/ml)의 RAW264.7 세포에 대한 세포독성을 나타낸 도이며,

도 4는 정상젖소에서의 유방염연고 주입 후 안전성 시험 결과를 나타낸 도이며,

도 5는 경증 유방염 젖소에서의 유방염연고 주입 후 치료 효과 결과를 나타낸 도이며,

도 6은 중증 유방염 젖소에서의 유방염연고 주입 후 치료 효과 결과를 나타낸 도이며,

도 7은 우유내 분리된 원인체 개체별 유방염연고 주입 후 치료 효과 결과를 나타낸 도이다.

Claims

오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 수의학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 추출물은 물 및 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물인 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 젖소 유방염은 임상형 유방형, 준임상형 유방염 또는 만성유방염임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 젖소 유방염 원인균은 대장균(E. coli), 스타필로코 코스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코코스 아가라티아에(S. agalactiae), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa), 트리코피톤 멘타그로피니스(Trichophyton mentagrophytes), 마이코박테리움 폴투이툼(Mycobacterium fortuitum), 브루셀라 아볼터스(Brucella abortus), 스트렙토코코스(Streptococcus spp.), 엑티노마이시스 피오진스(Actinomyces pyogenes), 펩토코코스 인도리커스(Peptococcus indolicus), 미호기성 그람양성구균, 렙토스피라 브루셀라(Leptospira, Brucella)균, 결핵균, 마이코플라스마(Mycoplasma), 소 파라인플루엔자 3(Parainfluenza 3), 보바인 헤르페스바이러스 2(bovine herpesvirus 2), 벡시니아(vaccinia), 카우팍스(cowpox), 수도카우팍스(pseudocowpox), 베시쿠랄 스토마티스(vesicular stomatitis), 효모(yeast), 칸디디듐(Candididum spp.) 및 페니실리움(Penicillium spp.)으로 구성된 군으로부터 선택된 젖소 유방염임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함함을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
오배자 추출물을 유효성분으로 포함하는 젖소 유방염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
제 7항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 동물사료 첨가제.
제 7항에 있어서, 침지, 분무 또는 혼합하여 동물 사료에 첨가함을 특징으로 하는 동물사료 첨가제.