DD248143B1 - Verfahren zur herstellung von produktionsgemischen mit 1,4-androstadien-3,17-dion sowie 4-androsten-3,17-dion - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobielle Transformation von Sterolen. Beide Verbindungen, als Intermediärverbindungen des Sterolabbaues bekannt, sind Schlüsselprodukte für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Durch bekannte Synthesen können die Produkte sowohl in die pharmazeutisch wertvollen Derivate der Androstan- und Pregnan-als auch der Estranreihe mit einem großen Anwendungsbereich überführt werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit vorzugsweise in der pharmazeutischen Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß Sterole, wie z. B. Cholesterol, Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol und Ergosterol, durch Mikroorganismen aus zahlreichen Gattungen, wie z. B. Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Pseudomonas, Protaminobacter, Serratia, Streptomyces und insbesondere Mycobacterium neben anderen Stoffen über die Intermediärprodukte 4-Androsten-3,17-dion (im folgenden kurz AD genannt) und 1,4-Androstadien-3,17-dion (im folgenden kurz ADD genannt) abgebaut werden können. Diese Produkte werden im Fermentationsmedium nur dann angereichert, wenn keine 9-a-Hydroxylierung erfolgt bzw. wenn sowohl 1 (2)-Dehydrierung als auch 9-a-Hydroxylierung nicht stattfinden kann. Dies wird

unter anderem dadurch erreicht, daß Mikroorganismus-Mutantenstämme mit Defekten in den genannten enzymatischen Leistungen zur Fermentation verwendet werden (siehe z.B. die Patentschriften JP 79 73191 oder JP 80148083). Die ersten unter Verwendung von Enzymdefektmutanten arbeitenden Verfahren zur Herstellung von AD (siehe Patentschrift US 3759791) mit Mycobacterium spec. NRRL B-3805/1/ bzw. von ADD (siehe Patentschrift US 3684857) mit Mycobacterium spec. NRRL B-3683/1/ aus Sterolen offenbaren bei Einsatz von 1 g Sitosterol/I sowie einer Fermentationszeit von 186 Stunden bis 216 Stunden Ausbeuten von 43% der Theorie AD bzw. 40% der Theorie ADD, bezogen auf den Anteil des bei der Fermentation umgewandelten Sitosterols. In der Patentschrift EP 8214 werden 30 g Sitosterol/I während einer Fermentationszeit von nunmehr 336 Stunden bei Einsatz des Stammes Mycobacterium fortuitum CBS 313,79 zu einer nicht genannten Menge AD mit geringem Anteil ADD transformiert. Mit Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 bzw. Mycobacterium phlei NRRL B-8154 (siehe Patentschrift US 4243654) wird aus 30g Sitosterol/I eine ebenfalls nicht genannte Menge von AD/ADD-Gemisch erhalten. Den bisher bekannten Verfahren haftet also der Mangel an, daß die Effektivität, bedingt durch niedrigen Steroleinsatz und/oder lange Fermentationszeiten bei gleichzeitig niedrigen Ausbeuten, zu gering ist.

Auch verschiedene Zusätze wie Glyceride (siehe Patentschrift JP 54138192) oder Eigelb (siehe Patentschrift JP 8608794) zum Fermentationsmedium führten bisher nicht zu einer wesentlichen Verbesserung der Effektivität der Verfahren. So werden beispielsweise unter Zusatz von 10g/l Trockeneigelb zum Fermentationsmedium mit Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 in 168 Stunden Fermentationszeit 15g Cholesterol mit einer Ausbeute von 27Gew.-% an ADD umgesetzt. Ein weiterer gemeinsamer Nachteil der genannten und anderer aus der Literatur bekannter Verfahren (man vergleiche etwa Patentschrift JP 80111 796) ist in der Notwendigkeit der Abtrennung der Fermentationsprodukte von nicht umgesetztem Sitosterol zu sehen, da bei einer Extraktion der Fermentationsbrühe sowohl Substrat als auch Produkte im Extrakt enthalten sind. Eine erste Lösung zur Überwindung dieser Schwierigkeit fanden M. Aoki et al. (siehe Patentschrift JP 7757161, Kokai), die unpolare Adsorber vom XAD-Typ nach Beendigung der Fermentation zusetzten und damit die gebildeten Produkte selektiv abtrennen konnten. Durch diesen Nachfolgeschritt konnte die Effektivität der eigentlichen Fermentation jedoch nicht positiv beeinflußt werden.

Die von I. Sauerbaum et al. (1. Europ. Kongr. f. Biotechno!., Interlaken, 1978) beschriebene Fermentation von Sitosterol mit Mycobacterium spec. NRRL B-3683 in Gegenwart von Styren-Divinylbenzen-Copolymeren (XAD 2) als unpolaren Adsorber, in der 10g Sitosterol/I in 96 Stunden zu 80% der Theorie zu einem Gemisch aus ADD und AD umgewandelt werden, ist als die bisher effektivste Lösung anzusehen. Dabei entsteht AD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 16g/m³ h, ADD von etwa 41 g/m³. Die Berechnung der Raum-Zeit-Ausbeuten erfolgte als (g) gebildetes ADD bzw. AD pro (m³) Fermentationsbrühe und Fermentationsstunden (h) ohne Berücksichtigung der Fermentor-Umrüstzeiten. Diesem Verfahren haften wenigstens folgende Nachteile an:

AD entsteht nur als Nebenprodukt. Die Ausbeute an AD kann auch in Gegenwart von XAD 2 als Adsorber nicht über25Gew.-%, bezogen auf eingesetztes Sitosterol, gesteigert werden.

— Andererseits beträgt unter der Bedingung, die zu den besten Ausbeuten führt (Zusatz von 7g/ITween 20 als nichtionisches

TensidPolyethylenglycolsorbitanfettsäureester), der Anteil AD„am Produktgemisch ADD/AD etwa 30% und kann auch durch Verringerung der Tensidkonzentration selbst unter Inkaufnahme einer Abnahme der Gesamtausbeuten nicht unter etwa 20% gesenkt werden.

- Das in der Fermentation entstehende Gemisch ADD/AD in den angegebenen Konzentrationsverhältnissen kann nur durch

aufwendige Reinigungsoperationen und damit unter Einschaltung zusätzlicher Verfahrensschritte getrennt werden. Von diesen Autoren wurde darüber hinaus der Einsatz von polaren Adsorbern des XAD-Strukturtyps bei der mikrobiellen Transformation von Sterolen mit Nocardia spec. M29 untersucht (siehe Europ. J. Appl. Mikrobiol.2, 243 1976). Nach ihrer Aussage führt eine derartige Verfahrensmodifikation jedoch direkt zu einer Minderung der Ausbeute an ADD bzw. AD.

Ziel der Erfindung

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Produktgemischen mit 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) und 4-Androsten-3,17-dion (AD) durch mikrobielle Transformation von Sterolen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Produktgemischen mit ADD und AD als Hauptkomponenten aus Sterolen zu beschreiben, in dem nach weitgehend einheitlicher Technologie sowohl ADD/AD-Gemische mit einem ADD-Anteil von mindestens 88Gew.-% als auch reines AD jeweils bei hohem Steroldurchsatz, kurzen Fermentationszeiten und guten Gesamtausbeuten erhalten werden

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:

Sterole wie Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stigmasterol bzw. Ergosterol oder Gemische dieser Sterole werden in Form einer Sterol-Tensid-Präparation eingesetzt, so daß die Konzentration an Sterol 1 g/l bis 50g/l beträgt, und mit Bakterien der Gattung Mycobacterium fermentiert. Die Sterol-Tensid-Präparationen werden entweder nach an sich bekannten Verfahren (Lyophilisierung bzw. Vermählen, beispielsweise in Korundmühlen) oder nach dem in einer früheren Anmeldung beschriebenen Sprühtrocknungsverfahren gewonnen (zu den erfindungsgemäß eingesetzten Tensiden siehe unten).

Als Mikroorganismen werden vorzugsweise Bakterienstämme aus der Art Mycobacterium vaccae eingesetzt. Es wird fermentiert in Medien, die Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glycerol, Glucose, Saccharose, Stärke und/oder Melasse usw., und Stickstoffquellen, wie beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff, Ammoniumsalze, Maisquellwasser, Pflanzenmehle und/oder andere komplexe Medienbestandteile (wie z. B. Fleischextrakt, Hydrolysate usw.) sowie Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten. Die Fermentation erstreckt sich über 24 Stunden bis 192 Stunden und wird bei 20⁰C bis 45°C bei pH-Werten im Bereich von pH6bispH8 unter aeroben Bedingungen in Rührfermentoren oder in Fermentoren, die nachdem

1 Nach JP 105289 (Kokai) wurden diese Mycobacterium spec.-Stämme später als Mycobacterium vaccae klassifiziert.

Air-Lift-Prinzip arbeiten, ζ. B. in Schlaufenreaktoren, durchgeführt. Dem Fermentationsansatz setzt man von Beginn an oder nach einem Zeitintervall bis zu 48 Stunden in an sich bekannter Weise (vgl. Patentschrift DD 232167) einen Adsorber vom Typeines organischen Polymeres, der neben aromatischen Gruppen polare Gruppen enthält, in einer Menge von 2g/l bis 200g/l zu. Der Adsorber wird nach beendeter Fermentation durch an sich bekannte Trennmethoden wie Filtration, Zentrifugation oder Separation von der ausfermentierten Kulturlösung einschließlich Biomasse und gegebenenfalls nicht umgesetztem Sterol abgetrennt (s. a. Patentschrift DD 127455). Anschließend wird das am Adsorber befindliche Produktgemisch durch Behandeln mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Methanol, eluiert und das Roheluat durch an sich bekannte Verfahrensschritte, vorzugsweise durch Umkristallisation, von Nebenprodukten gereinigt.

Die verfahrensgemäß einzusetzenden Adsorbentien enthalten vorzugsweise Acrylsäureester-Monomereneinheiten (siehe detaillierter weiter unten in dieser Erfindungsbeschreibung); sie können hergestellt werden, indem die entsprechenden Monomeren zusammen mit anderen bifunktionellen Monomeren (wie Styren oder.Ethylstyren) mit polyfunktionellen Monomeren (wie Divinylbenzen) unter Bedingungen «!polymerisiert werden, die zu einer porösen Struktur des Polymeren führen.

Die verwendeten Adsorber enthalten also gleichzeitig sowohl aromatische Gruppierungen als auch Acrylsäurederivat-Gruppen. Überraschenderweise sind polare Adsorber dieses Typs in der angegebenen technischen Aufgabe hinsichtlich der Stimulation der Fermentation sowohl in Richtung hoher Gesamtausbeuten als auch in Richtung einer Beeinflussung des erwünschten ADD/AD-Produktverhältnissesden bekannten Adsorbertypen (XAD1 bis 12),die entweder ausschließlich aufVinylaromaten- oder ausschließlich auf Acrylsäureester-Basis hergestellt werden, überlegen.

Weiter wurde gefunden, daß durch Anwendung von Sterolpräparationen mitTensiden sowohl aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid (PEO-PPOJ-Blockcopolymeren mit einem Anteil von 30% bis 70% Polypropylenglycol und mit Molekulargewichten von 1000 bis 3500, im folgenden Tenside der Gruppe A genannt, als auch aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Adduktedes N,N"-Tetra-(oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins mit Molekulargewichten des Polypropylenglycols um 1400 bis 2000, im folgenden Tenside der Gruppe B genannt, in Fermentationen gemeinsam mit den genannten Adsorbern neben einer weiteren Erhöhung der Fermentationsausbeuten auch der Anteil des jeweiligen Nebenproduktes des Produktpaares ADD/AD zurückgedrängt werden kann. Der erwähnte besondere Vorteil des Verfahrens ist insofern überraschend, als bisher durch Tenside zwar die Gesamtausbeute erhöht, nicht aber eine selektive Wirkung erzeugt werden konnte

Das Verfahren wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt:

a) Impfkultur

Für die Fermentation zu ADD (mit einer geringen Beimengung von AD) wird vorzugsweise Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 oder eine Selektante aus NRRL-B-3683 verwendet (eine der Selektanten ist in der Kulturensammlung des ZIMET unter der RegistriemummerlMETSK113 hinterlegt worden).

Für die Fermentation zu AD wird vorzugsweise Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 oder gleichfalls eine Selektante aus NRRL B-3805 benutzt (eine der Selektanten ist in der Kulturensammlung des ZIMET unter der Registriernummer IMET SK110 hinterlegt worden).

Die Mikroorganismen werden in Medien kultiviert, die als Kohlenstoffquellen Glycerol oder Glucose, als Stickstoffquellen beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff oder Ammoniumsalze sowie Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten.

Der pH-Wert liegt um den Neutralpunkt. Die Bebrütungstemperatur liegt im Bereich von 20⁰C bis 45⁰C; die Bebrütungsdauer beträgt 12 Stunden bis 77 Stunden.

Mit 2,5% bis 20% der so erhaltenen Submerskultur wird das Fermentationsmedium, das die gleiche oder eine andere Zusammensetzung wie die Impfkultur haben kann, beimpft.

b) Fermentation

Dem Fermentationsmedium wird feuchter Adsorber zweckmäßigerweise bereits vor der Sterilisation zugegeben; eine Zugabe bis zu 48 Stunden nach der Sterolzugabe bewirkt aber noch keinen wesentlichen Effektivitätsverlust. Als Adsorber kommen vorteilhaft Copolymerisate aus Acrylsäureester, Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen mit einer Korngröße oberhalb 0,4 mm zum Einsatz, im folgenden Adsorber vom Typ I bzw. Il genannt. Dabei ist Adsorber vom Typ I ein poröses Copolymerisat in Form kugeliger Teilchen, das durch radikalisch initiierte Polymerisation eines Gemisches von je etwa 45Gew.-% Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen und etwa 10Gew.-% Acrylsäuremethylester oder-ethylester in Suspension gewonnen wird und durch eine spezifische Oberfläche von mindestens 25OmVg sowie ein Gesamtporenvolumen von mindestens 0,4cm³/g charakterisiert wird. Adsorber vom Typ Il ist ein Copolymerisat ähnlicher Zusammensetzung, das aber eine spezifische Oberfläche von mindestens 400m²/g und ein Gesamtporenvolumen von mindestens 1,0cm³/g hat.

Die erforderliche Adsorbermenge liegt zwischen 2g bis 200g/l. Die genannte Menge ist sowohl von der Kapazität und der Adsorptionsgeschwindigkeit des ausgewählten Adsorbers als auch von der eingesetzten Sterolkonzentration und der damit zu erwartenden Produktmenge abhängig. Beispielsweise hat sich für die Fermentation von 10g/l Sitosterol die Zugabe von 80g/l Adsorber vom Typ Il als vorteilhaft erwiesen (Fall der Steroltransformation zu ADD).

Die Sterolpräparation wird als feinverteilte Suspension gemeinsam mit einem Tensid aus Gruppe A oder aus Gruppe B als Gesamtmenge (1 g/l bis 50 g/l) oder portionsweise sofort oder bis zu 48 Stunden danach oder auch kontinuierlich nach dem Beimpfen zugegeben. Eine Sterilisation der Gesamtmenge mit dem Medium ist gleichfalls möglich.

Die Fermentation kann in geeigneten Gefäßen als Schüttelkultur, in Fermentoren, die mechanisch gerührt und belüftet werden, oder in Fermentoren, die nach dem Air-Iift-Prinzip arbeiten, stattfinden. Sowohl ADD als auch AD werden am Adsorber angereichert.

Zur Herstellung von ADD kommt hierbei vorteilhaft Adsorber vom Typ Il in Gegenwart eines Tensids aus der Gruppe B zum Einsatz. So wurden Raum-Zeit-Ausbeuten von bis zu 74g ADD/m³. h neben 7,3g AD/m³ h und 7,5 g 1,4-C₂₂-Alkohol/m³ · h erzielt.

Zur AD-Herstellung wird vorteilhaft mit Adsorber vom Typ I in Gegenwart eines Tensids aus der Gruppe A fermentiert. In dieser Adsorber-Tensid-Kombination wurden so Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 68g reines AD/m³ · h erreicht.

Die Prozeßkontrolle erfolgt durch bekannte analytische Verfahren, z.B. sowohl durch HPLC-, GC-, DC-Bestimmung der durch Butylacetat aus dem Fermentationsmedium extrahierten Sterole als auch durch GC-, HPLC- oder DC-Bestimmung der vom Adsorber eluierten Produkte. Hierzu wird eine Probe aus dem Fermentationsansatz entnommen, der Adsorber gegebenenfalls durch Sieben abgetrennt, mit Wasser von anhaftenden Bakterien und Mediumbestandteilen gewaschen und nutschenfeucht ausgewogen. Eine definierte Menge wird mit 80-bis 100%igem wäßrigem Methanol eluiert. Durch HPLC-, GC-oder DC-Trennung, gekoppelt mit UV-Messung, kann das Produktgemisch, das vorwiegend aus ADD und/oder AD sowie den entsprechenden C₂₂-Alkoholen (21-Hydroxy-20-methyl-4-pregnen-3-on und/oder 21 -Hydroxy^O-methyl-M-pregnadien-S-on) als Nebenprodukten besteht, quantitativ analysiert werden.

c) Chemische Aufarbeitung

Bei Fermentationen zur Herstellung von AD wird der vom Fermentationsmedium abgetrennte und gewaschene Adsorber vorzugsweise in eine Säule überfuhrt und mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit 80%igem Methanol, eluiert.

Nach Einengen des Eluates im Vakuum bei 30⁰C bis 40⁰C auf etwa 10% fällt das Rohprodukt aus und kann nach Abkühlen auf etwa +5°C abfiltriert und getrocknet werden. Nach einmaliger Umkristallisation aus Methanol wird AD mit einem Reinheitsgrad von etwa 95% erhalten. Die nur in geringer Menge gebildeten Nebenprodukte ADD und C₂2-Alkohole verbleiben in der Mutterlauge.

Bei Fermentationen mit vorwiegender Bildung von ADD wird in analoger Weise das Rohprodukt gewonnen. Aus dem Rohprodukt wird durch Umkristallisation dasADD/AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von etwa 90% gewonnen.

Sowohl Adsorber vom Typ I als auch Adsorber vom Typ Il können ohne Einbuße an Ausbeute und Qualität der Produkte und ohne Beeinträchtigung des Prozesses wiederverwendet werden.

Die erfindungsgemäße Lösung hat folgende Vorteile:

Nach dem angegebenen Verfahren entsteht bei der Fermentation mit Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 in hoher Ausbeute das gewünschte Produkt AD, welches quantitativ an den eingesetzten Adsorber vom Typ I gebunden wird. Durch einfache Elution des Adsorbers und Kristallisation des AD wird dieses dann in reiner Form erhalten. Während nach der besten bisher bekannten Lösung AD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 16g/m³· h im Gemisch mit ADD entsteht, also noch durch aufwendige Reinigungsoperationen, die mit Ausbeuteverlusten verbunden sind, abgetrennt werden muß, können erfindungsgemäß Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 68g reines"AD/m³ · h erzielt werden (s. Ausführungsbeispiel 3).

Hier zeichnet sich das Verfahren gegenüber dem Stand der Technik vor allem durch eine wesentliche Steigerung der Effektivität und eine Verbesserung der Technologie aus.

Bei verfahrensgemäßer Fermentation mit Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 unter Verwendung eines Adsorbers vom Typ Il entsteht das gewünschte Produkt ADD mit einem Anteil von etwa 90 % am Gemisch der Endprodukte ADD/AD ebenfalls in hohen Ausbeuten.

Während nach Stand der Technik (beste Lösung) ADD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 41 g/m³ · h im Gemisch mit etwa 16g AD/m³· h entsteht, können erfindungsgemäß Raum-Zeit-Ausbeuten von bis zu 74g ADD/m³- h neben 7,3 g AD/m³ h und 7,5g 1,4-C₂₂-AIkOhOlZm³ · h erzielt werden (vergl. Ausführungsbei'spiel 8).

Hier zeichnet sich das Verfahren gegenüber bekannten Lösungen insbesondere durch eine erhöhte Effektivität bei gleichzeitiger wesentlicher Verbesserung der Reinheit des erzielten ADD aus.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

a) Impfkultur

Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 wird auf Schrägagar folgender Zusammensetzung 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28°C kultiviert: 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.

Mit den angeschwemmten Zellen je eines Röhrchens werden 500-ml-Stehrundkolben mit je 50 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft: 10g Glycerol, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄, 0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄, 0,2g MgSO₄-7H₂O, 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ · 7H₂O, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.

Nach48stündigem Schütteln bei 28°Cwird diese Submerskultur bei einem Impfverhältnis 1:10 zur Beimpfung weiterer Vermehrungsstufen bzw. der Fermentationsstufe verwendet.

b) Fermentation

Sechzig 500-ml-Stehrundkolben werden mit 50ml Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung beschickt und sterilisiert: 5g Glucose, 10g Hefeextrakt, 1 g K₂HPO₄,0,3g CaCO₃,1,5g (NH₄)₂HPO₄, 0,2g MgSO₄ 7H₂O,0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ · 7H₂0,60g nutschenfeuchter Adsorber vom Typ I, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.

Nach der Beimpfung mit 10% der vorher beschriebenen Impfkultur erfolgt die Zugabe von 6,5 g Sitosterol/I mit 0,5 g/l Tensid der Gruppe A und 1 g/l Silicon-Entschäumer Antaphron NM40.

Nach 96stündigem Schütteln bei 28°C wird die Fermentation durch Abtrennen und Waschen des Adsorbers mit Wasser beendet.

Der Adsorber wird mit 80%igem Methanol eluiert, das Eluat im Vakuum bei 30⁰C bis 40⁰C eingeengt.

Dabei wurden 10g kristallines Rohprodukt gewonnen, dessen Zusammensetzung aus nachstehender Tabelle zu entnehmen ist.

Durch Umkristallisation aus Methanol wurden 7,5g gaschromatographisch und dünnschichtchromatographisch reines AD erhalten.

Im vorliegenden Beispiel wurden folgende Ausbeuten erzielt:

Einsatz	AD	AD	Produkte	C22-Alkohol	Bemerkungen
19,5 g	g	%	ADD	g
Sitosterol	9,71	100	g	1,23
EluatCII)	8,71	89,7	0,72	0,7	Meßwerte
Rohprodukt			0,51		Meßwerte
(10g)	0,87			0,42
I.Mutterlauge			0,12		Meßwerte
(2,6g)	7,5	77,2		0
Kristallisat			0		gravimetr.
(7,5 g)	1,15			0,57+1	Wert
2. Mutterlauge			0,52	0,12++)	Meßwerte
(2,5 g)

+) гі-Нусігоху-го-теіпуІ-Д-ргедпеп-З-оп (4-C₂₂-AIkOhOl) ++) 21-Hydroxy-20-methyl-1,4-pregnadien-3-on (1,4-C₂₂-AIkOhOl)

Aus vorstehender Tabelle geht hervor, daß bei einem Ei nsatz von 6,5 gSitosterol/l 72% der Theorie an AD-Roh produkt und 54% der Theorie gaschromatographisch reines AD erhalten wurde. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute an gaschromatographisch reinem AD von 25g AD/m³ · h.

Beispiel 2

20 Rundkolben mit 50 ml Füllung wurden für die Fermentation entsprechend Beispiel 1 beschickt. Es wird Adsorber vom Typ Il in gleicher Konzentration verwendet. Nach 96stündiger Fermentation bei 28°C auf dem Rundschwingtisch wird entsprechend Beispiel 1 der Fermentationsansatz abgebrochen und aufgearbeitet. Bei einem Einsatz von 6,5g Sitosterol/I wurden 3,6g AD-Rohprodukt und 0,4g Nebenprodukte (ADD + C₂₂-Alkohole) erhalten. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute von 37,5g AD-Rohprodukt/m³ · h.

Beispiel 3

20 Rundkolben werden entsprechend Beispiel 1 für die Fermentation beschickt; folgende Veränderungen gegenüber Beispiel 1 werden vorgenommen: Adsorber vom Typ I wird in einer Konzentration von 100g/l angewendet. Außerdem werden 7,25 g Sitosterol/I sofort nach dem Beimpfen der Fermentationskultur zugegeben, weitere 7,25g Sitosterol/I 24 Stunden später. Nach 96 Stunden Fermentation und Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 wurden 6,5g AD/1,0,5g ADD/I und 1,5g C₂₂-Alkohol/I erhalten. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute von 67,7 g AD (gaschromatographisch rein)/m³ · h.

Beispiel 4

Ein Kleinfermentor vom Typ Chemap 30 mit Turbinenrührer wird mit 20I Fermentationslösung entsprechend Beispiel 1 ohne Adsorber beschickt. Für die Beimpfung (1:10) wird eine weitere Submerskultur in 2-l-lmpfflaschen mit 400 ml Füllung angelegt. Nach der Beimpfung werden 150g Sitosterol-Präparation mitTensid der Gruppe A zugegeben. Die Sitosterol-Tensidpräparation ist nach dem in unserer Anmeldung WP CO7J/2408957 beschriebenen Verfahren hergestellt worden. Die Belüftung erfolgt mit 11 Luft/l Fermentationslösung und Minute. Die Drehzahl des Rührwerkes beträgt während der ersten 6 Stunden 600 U/min, anschließend nach Zugabe von 1,2 kg Adsorber vom Typ I bis zu 120 Stunden 150 U/min. Nach der Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 wurden 49,6g Rohprodukt und 13,2g Nebenprodukte (ADD + C₂₂-AIkOhOl) erhalten. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 20,8g AD (Rohprodukt)/m³ · h.

Beispiel 5

Ausgehend von 300 ml einer 2 Tage alten Impfkultur entsprechend Beispiel 1 wird ein Air-Iift-Fermentor mit 3I Fermentationsmedium entsprechend Beispiel 1 (einschließlich Adsorbereinsatz) beimpft. Die Lufteintragsrate beträgt in den ersten 52 Stunden 10l/min und wird dann bis zum Ende der Fermentation auf 12,5 l/min eingestellt. Nach 90 Stunden bei28°C sind die eingesetzten 18,3g Sitosterol in folgende Produkte umgewandelt worden: 7,08g AD, 1,29g ADD, 1,35g 4-C₂₂-Alkohol, 1,02 g 1,4-C_M-Alkohol. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 26,2 g AD (gaschromatographisch rein)/m³ · h.

Beispiel 6

Ein Air-Iift-Fermentor mit 31 Medium (einschließlich Adsorber) entsprechend Beispiel 1, wobei dieGlucosekonzentration von 5 g/l auf 2,5 g/l herabgesetzt und statt Hefeextra kt1 g/l Harnstoff eingesetzt wurde, wird entsprechend Beispiel 4 mit 300 ml einer Impfkultur gemäß Beispiel 1 beimpft. Nach 96 Stunden sind folgende Produkte aus 18,3g Sitosterol/I gebildet worden :6,39 g AD, 1,35gADD, 1,59g 4-C₂₂-Alkohol, 0,33g 1,4-C₂₂-AIkOhOl. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 22,2gAD (gaschromatographisch rein)/m³ · h.

Beispiel 7

Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 wird auf Schrägagar folgender Zusammensetzung 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28°C kultiviert: 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar ad 1 000ml Aqua dest; pH7,0.

Mit den entsprechenden Zellen je eines Röhrchens werden 500-ml-Stehrundkolben mit je 50 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft: 10g Glycerol, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄, 0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄J₂HPO₄, 0,2g MgSO₄ · 7H₂O, 0,01 g FeSO₄ · 7 H₂O, 0,002g ZnSO₄ 7 H₂O, Aqua dest ad 1 000ml; pH7,0.

Nach36stündigem Schütteln bei 28°C wird diese erste Submerskultur bei einem Impfverhältnis von 1:10 zur Beimpfung einer zweiten Submerskultur verwendet, die wie die erste Submerskultur geführt wird. Nach Vereinigung von 5 Stehrundkolben der zweiten Submerskultur wird ein Laborfermentormit2,5l Nutzvolumen im Verhältnis 1:10 beimpft. Die Fermentationslösung hat

folgende Zusammensetzung: 5g Glucose, 0,125g Harnstoff, 2g KH₂PO₄, 8g K₂HPO₄, 3g (NH₄J₂SO₄, 0,2g MgSO₄ · 7H₂O, 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ · 7H₂O, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.

Der Fermentationsansatz enthält zusätzlich 80g/l nutschenfeuchten Adsorber vom Typ I. Nach der Beimpfung wird eine sterile Sitosterol-Tensid-Präparation (Tensid der Gruppe B) mit einem Gehalt an 25g Sitosterol zugegeben. Bei einer Belüftung von 0,331 Luft/l Fermentationslösung und Minute und einer Rührerdrehzahl von 450U/min werden nach 96stündiger Fermentation 12,1 g ADD, 1,6g AD und 1,9 g 1,4-C₂₂-Alkohol erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 80% der Theorie ADD/AD mit einem ADD-Anteil von 88,3% sowie 9,7 % der Theorie 1,4-C₂₂-AIkOhOl. Daraus ergibt sich eine Raum-Zeit-Ausbeute von 50,4 g ADD/m³ h.

Beispiel 8

Die Anzucht von Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 sowie die Herstellung einer Impfkultur erfolgt analog zu Beispiel 7. Zwei 500 ml-Stehrundkolben werden mit je 50 ml Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung beschickt und sterilisiert: 5g Saccharose, 7,5g Hefeextrakt, 3g (NH₄I₂SO₄,1 g KH₂PO₄,4g K₂HPO₄, 0,2g MgSO₄ · 7H₂O, 0,01 g FeSO₄ 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ · 7H₂0,120g nutschenfeuchter Adsorber vom Typ I, Aqua dest. ad 1000ml; pH 7,0.

Nach Beimpfung mit 10% der vorher beschriebenen Impfkultur erfolgt die Zugabe einer sterilen Sitosterol-Tensid-Präparation (Tensid der Gruppe B) bis zur Konzentration von 14g/l Sitosterol. Nach 96stündigem Schütteln bej 28°C wird die Fermentation durch Abtrennung und Waschen des Adsorbers mit Wasser beendet. Der Adsorber wird mit Methanol eluiert. Gaschromatographisch wurde die Bildung von 0,71 g ADD, 0,14g AD und 0,1 g C₂₂-Alkoholen nachgewiesen; das entspricht einer Ausbeute von 74,5% der Theorie ADD neben 14,5% der Theorie AD und 8,8% der Theorie C₂₂-AIkOhOIe. Daraus errechnet sich eine Raum-Zeit-Ausbeute von 74g ADD/m³ · h.

Beispiel 9

Bei Einsatz von 50g Sitosterol sowie 350 g Adsorber vom Typ I werden unter den in Beispiel 7 beschriebenen Bedingungen, unter anderem bei Einsatz eines Tensids der Gruppe B, nach 94 Fermentationsstunden 13,8g ADD, 1,85g AD und 0,7 g 1,4-C₂₂-Alkohol erhalten; das entspricht 46% der Theorie ADD/AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von 88%.

Bei Verlängerung der Fermentationszeit auf 100 Stunden entstehen 17,7g ADD, 2,2 g AD und 1,4g 1,4-C₂₂-AIkOhOl; das sind 58% der Theorie ADD/AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von 89%.

Beispiel 10

Unter den in Beispiel 9 genannten Bedingungen werden 75% des Sitosterols unmittelbar nach der Beimpf ung und 25% des Sitosterols nach 76 Fermentationsstunden dem Fermentationsansatz zugegeben.

Nach 94 Stunden Fermentation werden 17,5g ADD, 1,7 g AD und 1,8g 1,4-C₂₂-Alkohol, das sind 57% der Theorie ADD/AD mit einem AD-Anteil von 10,3%, gefunden. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 74g ADD/m³ · h.

Eine Verlängerung der Fermentation führt nach 192 Stunden zur Bildung von 23,2g ADD, 2,2g AD und 1,7g 1,4-C₂₂-Alkohol; das sind 74% der Theorie ADD/AD-Gemisch mit einem AD-Anteil von 8,7%. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 48,4g ADD/m³ · h.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Produktgemischen mit 1,4-Androsta-dien-3,17-dion sowie 4-Androsten-3,17-dion als Hauptkomponenten durch aerobe Submersfermentation von Bakterien der Gattung Mycobacterium in Kulturmedien, die neben Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen Sterole oder Sterolgemische in Konzentrationen von 1 g/l bis 50 g/l enthalten, in Gegenwart von Tensiden bei Temperaturen im Bereich von 20°C bis 45°C für eine Dauer von 24 Stunden bis 192 Stunden bei pH-Werten zwischen pH 6,0 und pH 8,0, wobei

a) dem Ansatz von Beginn an oder bis 48 Stunden nach der Bei rppfung ein Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der neben aromatischen Gruppen polare Gruppen enthält, in einer Menge von 2g/l bis 200g/l zugesetzt,

b) dieser Adsorber aus der Kulturlösung nach Beendigung der Fermentation separiert und von ihm

c) das Produktgemisch obiger Kennzeichnung durch Elution mit organischen Lösungsmitteln abgetrennt sowie mittels an sich bekannter Teilschritte gereinigt

wird, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation

- als Adsorber ein Copolymerisat aus Acrylsäureester, Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen sowie

- als Tensid entweder ein PEO-PPO-Blockcopolymeres oder ein PEO-PPO-Addukt des N,N"-Tetra-(oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins

eingesetzt wird.

' 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorber jeweils ein Copolymerisat aus Acrylsäureethylester bzw. -methylester, aus Ethylvinylbenzen sowie aus Divinylbenzen, hergestellt durch radikalisch initiierte Polymerisation eines Gemisches von je etwa 45Gew.-% Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen sowie etwa 10Gew.-% Acrylsäuremethylester oder -ethylester, eingesetzt wird, wobei entweder die spezifische Oberfläche mindestens 250 m²/g und das Gesamtporenvolumen mindestens 0,4cm³/g (Typ I) oder die spezifische Oberfläche mindestens 400m²/g und das Gesamtporenvolumen mindestens 1,0cm³/g (Typ II) betragen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Tensid jeweils eine Verbindung

- entweder aus der Gruppe der PEO-PPO-BIockcopolymeren mit einem Polypropylenglycol-Anteil von 30% bis 70% sowie mit Molekulargewichten von 1 000 bis 3500 (Tenside der Gruppe A)

- oder aus der Gruppe der PEO-PPO-Addukte obiger Kennzeichnung mit Molekulargewichten von 1 400 bis 2000 (Tenside der Gruppe B)

eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß das jeweils eingesetzte Tensid in Form einer Steril-Präparation mit dem bereitgestellten Sterol entweder zusammen mit dem Kulturmedium autoklaviert oder zum Zeitpunkt der Hauptkultur-Beimpfung oder portionsweise in einem Zeitraum bis zu 48 Stunden oder kontinuierlich nach Beimpfung der Hauptkultur zugegeben wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation in Rührfermentoren oder in Fermentoren, die nach dem air-lift-Prinzip arbeiten, durchgeführt wird.