NL8004677A

NL8004677A - Bereiding van 2,5-diketogluconzuur.

Info

Publication number: NL8004677A
Application number: NL8004677A
Authority: NL
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1979-09-28
Filing date: 1980-08-19
Publication date: 1981-03-31
Also published as: IT8024975A0; GB2058775A; ES8106758A1; AR224028A1; DD153131A5; DE3036413A1; DE3036413C2; GR70291B; DK336580A; FR2466505A1; US4316960A; IT1132791B; DK149962C; LU82804A1; SE8006764L; PT71841A; CA1140878A; MX6164E; DK149962B; CH645921A5

Description

f 4 » > &

Bereiding van 2,5-diketogluconzuur.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van 2,5-diketogluconzuur, dat bruikbaar is als een tussenprodukt bij de bereiding van ascorbinezuur. Een oplossing van 2,5 diketogluconzuur kan selectief gereduceerd worden tot 2-keto-5 gulonzuur, dat kan worden omgezet in ascorbinezuur. De reductie van 2,5-diketogluconzuur kan worden uitgevoerd door reductie met een alkalimetaalboorhydride, zoals beschreven in Amerikaans octrooi-schrift 4.159.990, of door een fermentatieve reductie zoals bijvoorbeeld beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.922.194, 10 3.959.076 en 3.963.574.

2,5-Diketogluconzuur is ook bruikbaar als een tussenprodukt voor de bereiding van comeenzuur door verwarmen in aanwezigheid van een zuur, zoals bijvoorbeeld beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.654,316.

15 Tot nu toe is 2,5-diketogluconzuur bereid met verscheidene verschillende variëteiten van bacteriën, zoals Aceto-bacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens en Pseudomonas sesami.

Het gebruik van deze micro-organismen is echter niet bevredigend 20 vanuit een industrieel standpunt wegens betrekkelijk geringe opbrengsten aan 2,5-diketogluconzuur, betrekkelijk lange fermentatieduur en wegens de vorming van grote hoeveelheden bruine of geelbruine pigmenten als nevenprodukten van de kweek, waardoor de zuiverheid van het gewenste 2,5-diketogluconzuur wordt verminderd.

25 Amerikaans octrooischrift 3.790.444 heeft betrek king op de bereiding van 2,5-diketogluconzuur zonder bijkomend bruin pigment, met een nieuwe speciës aangeduid als Acetobacter fragum ATCC no. 21409.

Amerikaanse octrooiaanvrage serie no. 79.668 van 80 0 4677 2 28 september 1979 heeft betrekking op de bereiding van 2,5-diketo-gluconzuur in goede opbrengst zonder de vorming van gepigmenteerd materiaal door de aerobe kweek van Acetobacter cerinus in een glucose-bevattend medium. Ofschoon totale hoeveelheden glucose van S 2,5-20 gew.% gebruikt kunnen worden, is gevonden, dat de oorspronkelijke glucoseconcentraties in het medium van meer dan 15 gew.% door de micro-organismen niet worden verdragen. Derhalve kunnen totale hoeveelheden glucose van meer dein 15 gew,% alleen maar worden gebruikt door de fermentatie uit te voeren bij een oorspron-10 kelijke glucoseconcentratie van 10-15 gew.% en daarna toevoegen van aanvullende hoeveelheden glucose aan het fermentatiemedium tijdens het verloop van de fermentatie, waarbij de glucoseconcentratie in het medium op geen enkel tijdstip meer dan 15 gew.% bedraagt. Zodoende werden tot nu toe de totale concentraties of produktiever-15 mogens van 2,5-diketogluconzuur beperkt door de betrekkelijk geringe oorspronkelijke glucoseconcentratie die gebruikt kan worden in het fermentatiemedium. De produktiviteit van processen die gebruik maken van andere micro-organismen voor de bereiding van 2,5-diketogluconzuur, zoals hierboven beschreven, is ook beperkt door de noodzaak 20 om betrekkelijk geringe oorspronkelijke glucoseconcentraties in het fermentatiemedium te gebruiken.

Het zal duidelijk zijn, dat een werkwijze waarin de oorspronkelijke glucoeeconcentraties hoger dan 15 gew.%, in het bijzonder meer dan 20 gew.% bedragen, en die door de micro-organismen 25 voor de bereiding van 2,5-diketogluconzuur worden verdragen en gebruikt, een aanzienlijke verhoging van het produktievermogen verschaffen en leiden tot aanmerkelijke produktiebesparingen. Een dergelijke werkwijze vermijdt ook de mogelijkheid van verontreiniging van het fermentatiemedium, die zou kunnen optreden, wanneer het 30 produktievermogen wordt verhoogd door toevoegen van aanvullende hoeveelheden glucose tijdens het verloop van de fermentatie.

In overeenstemming met de uitvinding is nu gevonden, dat oorspronkelijke glucoseconcentraties van meer dan 20 gew.% tot ongeveer 30 gew.% in een fermentatiemedium gebruikt kunnen wor-35 den door het micro-organisme Acetobacter cerinus voor de bereiding 8004677 3 * .

van 2,5-diketogluconzuur, wanneer tenminste 0,04 gew.% choline, betrokken op de hoeveelheid D-glucose in het medium, aan het fermen— tatiemedium wordt toegevoegd. Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding een werkwijze voor de bereiding van 2,5-diketogluconzuur 5 in hoge concentraties in het fermentatiemedium door aëroob kweken van Acetobacter cerinus in een fermentatiemedium dat D-glucose bevat in oorspronkelijke concentratie van meer dan 20 gew.% tot ongeveer 30 gew,% en choline in een hoeveelheid van tenminste 0,04 gew.%, betrokken op de hoeveelheid D-glucose in het medium. De oorspronke-10 lijke glucoseconcentratie in het medium bedraagt bij voorkeur 25-30 gew.%. Het kweken wordt bij voorkeur uitgevoerd bij een temperatuur van 25-30° C, en bij voorkeur bij een pH van 5-6. Voorkeursstammen zijn Acetobacter cerinus of Acetobacter cerinus IFP 3263 en 1F0 3266.

2,5-Diketogluconzuur wordt met de werkwijze vol-15 gens de uitvinding in goede opbrengst bereid zonder de vorming van significante hoeveelheden gepigmenteerd materiaal en in een betrekkelijk korte fermentatieduur. Een aantal stammen van Acetobacter cerinus, met inbegrip van IFO 3262 (ATCC 12303) IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 en IFO 3269 zijn publiek 20 verkrijgbaar en kunnen bij de werkwijze volgens de uitvinding worden gebruikt voor het bereiden van 2,5-diketogluconzuur. Stammen waaraan in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven zijn IFO 3263 en IFO 3266.

Het zal duidelijk zijn, dat mutanten van deze micro-organismen die gevormd zijn volgens gebruikelijke methoden, bijvoorbeeld door 25 bestralen met röntgenstralen of ultraviolet licht, behandeling met stikstof mosterd of dergelijke ook bruikbaar zijn bij de werkwijze volgens de uitvinding en deel uitmaken van de uitvinding.

De Acetobacter cerinus wordt gekweekt in een medium waarvan de hoofd koolstofbron D-glucose is. Het zal duidelijk 30 zijn, dat in overeenstemming met gebruikelijke fermentatiepraktijk, het fermentatiemedium ook bronnen bevat voor stikstof, kalium, fosfor en magnesium. De uitdrukking "fermentatiemedium" in de beschrijving en de conclusies beoogt een medium te definiëren dat dergelijke verbindingen bevat. Bij gebruiken van de Acetobacter cerinus 35 micro-organismen bij de werkwijze volgens de uitvinding is het niet 80 0 4 67 7 4 noodzakelijk om kostbare organische stikstofbronnen, zoals pepton of vleesextract te gebruiken. De stikstof kan economisch worden verschaft door het gebruik van ureum of anorganische stikstofbronnen, zoals ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat, ammoniumfosfaat of derge-5 lijke zouten, in het algemeen in een hoeveelheid van 0,1-2 g/1 fer-mentatiemedium, indien nicotinezuur ook als een groeifactor wordt toegevoegd, in het algemeen in een hoeveelheid van 0,2-10 mg/1 fermentatiemedium. Het kalium, magnesium en de fosfor worden gemakkelijk verschaft door het toevoegen van zouten, zoals kaliumfosfaat, 10 ammoniumfosfaat, magnesiumsulfaat of dergelijke zouten, in het algemeen in een hoeveelheid van 0,1-1 g/1 fermentatiemedium. Aanzienlijke variaties in de samenstelling van het fermentatiemedium is echter mogelijk. Andere geschikte media liggen voor de vakman voor de hand en de werkwijze volgens de uitvinding wordt niet beperkt 15 door het gebruik van de hierboven en in de voorbeelden beschreven bepaalde media. In overeenstemming met de uitvinding bevat het fer-mentatiemediura D-glucose in een oorspronkelijke concentratie, die hoger is dan tot nu toe mogelijk was zonder schadelijke werking op de bij de fermentatie gebruikte micro-organismen. In het bijzonder 20 ligt de bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikte oorspronkelijke D-glucoseconcentratie in het fermentatiemedium in het traject van 20 gew.% tot ongeveer 30 gew.%, meer in het bijzonder 25-30 gew.%. Desgewenst kan D-glucose worden toegevoegd als cerelose (D-glucose monohydraat).

25 Om er voor te zorgen dat de Acetobacter cerlnus micro-organismen in staat zijn dergelijke hoge glucoseconcentraties in het fermentatiemedium te verdragen en te gebruiken, is het noodzakelijk om choline aan het fermentatiemedium toe te voegen in een hoeveelheid van tenminste 0,04 gew.%, betrokken op de oorspronke-30 lijke hoeveelheid D-glucose in het fermentatiemedium. Desgewenst kunnen betrekkelijk hoge gehalten choline, bijvoorbeeld 0,5 gew.%, betrokken op de oorspronkelijke D-glucoseconcentratie in het fermentatiemedium, worden gebruikt, ofschoon het weinig voordeel biedt om meer dan 0,1 gew.% choline te gebruiken en in het algemeen ver-35 dient het de voorkeur 0,04-0,06 gew.% choline te gebruiken. Choline 8004677 5 kan ofwel als vrije base of als een zout, bijvoorbeeld als choline-chloride, cholinebicarbonaat, cholinecitraat, cholinegluconaat of een dergelijk zout, worden toegevoegd. Als zout wordt de voorkeur gegeven aan cholinechloride. De cholineconcentratie ift de beschrij-5 ving en conclusies wordt gedefinieerd als berekend als choline base. Een klein deel van het benodigde choline kan desgewenst worden verschaft door het toevoegen van malsweekvloeistof aan het fermentatiemedium. Malsweekvloeistof, die gebruikt is in fermentatiemedia als een bron voor vitaminen en mineralen, bevat in het algemeen slechts 10 0,5-3 mg choline per g malsweekvloeistof. Gewoonlijk wordt echter niet meer dam 5 g malsweekvloeistof gebruikt per liter fermentatie-medium, omdat malsweekvloeistof kleurstoffen bevat en de toevoeging van meer dan 5 g malsweekvloeistof per liter fermentatiemedium het terugwinnen en zuiveren van het 2,5-diketogluconzuur moeilijker 15 maakt. Derhalve kan desgewenst malsweekvloeistof alleen maar worden gebruikt als een bron vam een klein gedeelte van het benodigde choline voor de fermentatie en de rest van de benodigde hoeveelheid choline wordt toegevoegd aan het fermentatiemedium als choline base of een zout daarvan, zoals hierboven beschreven.

20 De fermentatie wordt in het algemeen uitgevoerd bij een temperatuur van 20-35° C, bij voorkeur 25-30° C, liefst omstreeks 28° C. De oorspronkelijke pH van een kweekmedium ligt in het traject van 3,5-7,5, bij voorkeur 5-6. Tijdens het verloop van de fermentatie is het wenselijk dat de pH in dit traject wordt ge-25 handhaafd, bij voorkeur bij omstreeks 5,5, bij-voorbeeld door toevoeging van een alkalimetaalhydroxyde, bij voorkeur natriumhydroxyde-oplossing. In plaats daarvan kan een alkalimetaal of aardalkalime-taalcarbonaat, bij voorkeur calciumcarbonaat worden gebruikt voor het regelen van de pH en dit wordt voor dit doel toegevoegd bij 30 het aanvullen van het medium nadat dit in een autoclaaf in een voldoende hoeveelheid is behandeld om de gewenste pH te verschaffen, in het algemeen 20-30 g/100 g glucose. Het zal duidelijk zijn, dat het 2,5-diketogluconzuur in dergelijke fermentatiemedia gevormd wordt in de vorm van het overeenkomstige alkali of aardalkalimetaal-35 zout, zoals het natrium of calciumzout,en dat dergelijke zouten 80 0 4 67 7 6 vallen onder het gebruik van de uitdrukking "2,5-diketogluconzuur" in beschrijving en conclusies.

Na enten wordt het fermentatiemedium geroerd, bijvoorbeeld met een mechanische roerder, en belucht, bij voorkeur 5 met een snelheid van 0,5-1 vol. lucht per vol. fermentatiebouillon per minuut. Desgewenst kan aanvullend glucose tijdens het verloop van de fermentatie worden toegevoegd om een gedeelte van de gebruikte glucose tijdens de fermentatie te vervangen, waardoor de totale concentratie aan verkregen 2,5-diketogluconzuur in de fermentatie-10 bouillon toeneemt.

De fermentatie wordt voortgezet tot de gewenste opbrengst is verkregen. Bij gebruik van Acetobacter cerinus IPO 3263 of 3266 levert bijvoorbeeld een fermentatieduur van 40-50 uur een opbrengst van 90-95 % 2,5-diketogluconzuur, betrokken op D-glucose.

15 Enige variatie in reactieduur en opbrengst valt echter te verwachten, afhankelijk van de bepaalde stam van het micro-organisme, de glucose-concentratie in het fermentatiemedium en de kweektemperatuur.

Ofschoon wij ons niet vast wensen te leggen op een bepaalde mechanisme, nemen wij aam, dat de omzetting van glucose 20 in 2,5-diketogluconzuur verloopt langs de volgende wegen: glucose—4 2-ketogluconzuur —> 2,5-diketogluconzuur glucose —*5-ketogluconzuur —^ 2,5-diketogluconzuur. De tussenpro-dukten 2-ketogluconzuur en 5-ketogluconzuur en 2,5-diketogluconzuur zelf kunnen worden gescheiden met papier-chromatografie met gebruik-25 making van Whatman no. 1 en no. 4 papier en een oplosmiddelsysteem van methylethylketon:aceton:mierezuur:water (80:6:2:12). De zuur-vlekken worden vastgesteld door besproeien met een 0,2 %-ige o-fenyleendiamine ethanolische oplossing die 1 % salpeterzuur bevat en verwarmen op omstreeks 70° C (5-ketogluconzuur-blauw; 2-ketoglu-30 conzuur-geel; 2,5-diketogluconzuur-groen). Hogedruk-vloeistofchroma- tografie kan ook worden gebruikt. Met gebruikmaking van de bovenstaande methoden kam het verloop van de fermentatie worden gevolgd.

2,5-Diketogluconzuur kan worden afgescheiden en worden teruggewonnen uit de uiteindelijke fermentatiebouillon met 35 iedere de vakman bekende gebruikelijke methode. De fermentatie- 80 0 4 67 7 7 bouillon kan bijvoorbeeld worden gefiltreerd, de pH van het waterige filtraat worden ingesteld op 2-2,5 door toevoegen van een mineraal zuur, zoals zoutzuur, gevolgd door concentratie van de oplossing en toevoegen van een korte keten alkylalcohol, bij voorkeur ethanol 5 of methanol. Bij staan scheidt 2,5-diketogluconzuur zich in de vorm van zijn calcium of natriumzout als een vaste stof uit de oplossing af. Het 2,5-diketogluconzuur als zodanig kan uit zijn zout worden verkregen door behandeling met een verdund mineraal zuur, gevolgd door bijvoorbeeld behandeling met een kation-uitwisselingshars, 10 zoals een sulfonzure hars, bijvoorbeeld Dowex 50 (handelsmerk}.

Desgewenst kan de fermentatiebouillon worden verwerkt om het gevormde 2,5-diketogluconzuur om te zetten in andere gewenste produkten, bijvoorbeeld door fermentatieve reductie tot 2-ketogulonzuur, zoals beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 15 3.922.194, 3.959.076 of 3.963.574. In plaats daarvan kan de afge filtreerde fermentatiebouillon worden gebruikt als een geschikte reactie-oplossing voor de reductie van 2,5-diketogluconzuur tot een 2-ketogulonzuur bevattende oplossing door reactie met een alka-limetaalboorhydride, zoals beschreven in Amerikaans octrooischrift 20 4.159.990. Het bij deze reacties gevormde 2-ketogulonzuur wordt gemakkelijk omgezet in ascorbinezuur volgens op zichzelf bekende methoden, bijvoorbeeld door de methylester ervan in aanwezigheid van een base te verhitten.

De onderstaande voorbeelden dienen ter nadere 25 toelichting van de uitvinding.

Voorbeeld I

Het onderstaande waterige entmedium werd bereid: Bestanddeel g/1

Glucose monohydraat 25 30 Maisweekvloeistof 5 KH2P04 0,5 k2hpo4 0,5

MgS04.7H20 0,2

CaC03 7,0 35 PH 6,2 80 04 67 7 8

Een schudkolf, die 1 1 medium bevatte, werd 30 min. in een autoclaaf op 121° C verhit. Cellen van Acetobacter cerinus IPO 3263 uit een voedingsagar-schijf (5 ml van een 20 ml steriele waterige suspensie) werden aan de kolf toegevoegd, die 5 daarna op een roterende schudeend gedurende 24 uur bij 28° C werd geschud. De pH van het afgekoelde medium bedroeg 5,0.

Een monster van de kweekgroei, voldoende om een 10 vol.%-ige inoculum te verschaffen werd toegevoegd aan een 4 1 geroerde fermentator die 2 1 bevat van het volgende produktiemedium: 10 Bestanddeel

Glucose monohydraat 225 g/1

Malsweekvloeistof 0,5 g/1 (NH4)2HP04 0,5 g/1 KH2P04 1,5 g/1 15 MgS04.7H20 0,5 g/1

Ureum 1,0 g/1

Cholinechloride 100 mg/1

Nicotinezuur 10 mg/1

CuSO..5Ho0 2,0 mg/1 4 2 20 P-2000 Antlschuim 1,0 mg/1 pH 6,0

De fermentatie werd uitgevoerd bij 28° C onder roeren met een snelheid van 1700 rpm en beluchten met een snelheid van 1,0 vol. per vol. bouillon per minuut. De pH werd op 5,5 gehouden 25 door toevoegen van een 20 %-ige natriumhydroxyde-oplossing naar behoefte. 2,5-Diketogluconzuur werd als natriumzout verkregen in een opbrengst van 95 % na een fermentatieduur van 48 uur.

Voorbeeld II

Het volgende waterige inoculummedium werd bereid: 30 Bestanddeel g/1

Glucose monohydraat 25

Malsweekvloeistof 5 KH2P04 0,5 K2HP04 0,5 35 MgS04.7H20 0,2

CaC03 7,0 80 0 4 67 7 9

Een schudkolf, die 1 1 medium bevatte, werd 30 min. in een autoclaaf op 121° C verhit. Cellen van Acetobacter cerinus IFO 3263 uit een voedingsagar-schij f (5 ml van een 20 ml steriele waterige suspensie) werden aan de kolf toegevoegd, die 5 daarna op een roterende schudeend gedurende 24 uur bij 28° C werd geschud. De pH van het afgekoelde medium bedroeg 5,0.

Een monster van de kweekgroei, voldoende om een 10 vol.%-ig inoculum te verschaffen, werd toegevoegd aan een 4 1 geroerde fermentator die 2 1 bevatte van het onderstaande medium: 10 Tweede trap inoculum g/1

Glucose monohydraat 100

Max sweekvloei stof 0,5 (NH4)2HP04 0,5 kh2po4 1,5 15 MgS04.7H20 0,5

Ureum 1,0

Nicotinezuur 10 mg

CuS04.5H20 2,0 mg

Cholinechloride 500 mg 20 P2000 0,5 ml

De tweede trap werd uitgevoerd bij 28° C onder roeren met een snelheid van 1700 rpm en beluchten met een snelheid van 1,0 vol. per vol. bouillon per minuut. De pH werd op 5,5 gehouden door toevoegen van een 20 %-ige natriumhydroxyde-oplossing naar 25 behoefte.

Na 20 uur werd een monster van de cultuurgroei, voldoende om een 10 vol.%-ig inoculum te verschaffen, toegevoegd aan een 14 1 geroerde fermentator die 6 1 bevatte van het volgende pro-duktiemedium: 30 Bestanddeel g/1

Glucose monohydraat 334

Mafsweekvloeistof 0,5 (NH4)2HP04 0,58 KH-PO. 1,5 2 4 35 MgSC>4.7H20 0,5 80 0 4 6 7 7 10

Bestanddeel g/1 ureum 1,0

Nicotinezuur 10,0 mg

CuS04.5H20 2,0 mg 5 Cholinechloride 150 mg P2000 0,5 ml

De fermentatie werd uitgevoerd bij 28° C onder roeren met een snelheid van 750 rpm en beluchten met een snelheid van 1,0 vol. per vol. bouillon per minuut. De pH werd op 5,5 gehou-10 den door toevoegen van 20 %-ige natriumhydroxyde-oplossing naar

behoefte. 2,5-Diketogluconzuur werd als het natriumzout verkregen in een opbrengst van 95 % na een fermentatieduur van 65-70 uur. Voorbeeld III

Overeenkomstig de methode van voorbeeld I werden 15 Acetobacter cerinus stammen IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 en 3269 ieder afzonderlijk onderzocht. In elk van de gevallen bevatte het fermentatieprodukt 2,5-diketogluconzuur in een opbrengst van meer dan 50 %, tezamen met wat onomgezet 2-ketogluconzuur en 5-ketogluconzuur tussenprodukt. Hogere opbrengsten van het gewenste 20 2,5-diketogluconzuur kunnen worden verkregen door een langere fer mentatieduur toe te passen, wanneer deze stammen van Acetobacter cerinus worden gebruikt.

25 80 0 4 67 7

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van 2,5-diketo-gluconzuur, met het kenmerk, dat men Acetobacter cerinus aëroob kweekt in een fermentatiemedium dat D-glucose bevat in een oorspron- 5 kelijke concentratie van meer dan 20 gew.% tot 30 gew.% en choline in een hoeveelheid van tenminste 0,04 gew.%, betrokken op de oorspronkelijke hoeveelheid D-glucose in het medium.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een oorspronkelijke concentratie aan D-glucose gebruikt van 10 25-30 gew.%.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men in het medium choline opneemt in een hoeveelheid van 0,04-0,1 gew.%.

4. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaan- 15 de conclusies, met het kenmerk, dat men het kweken uitvoert bij een temperatuur van 25-30° C.

5. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men het kweken uitvoert bij een pH van 5-6.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men de pH handhaaft door toevoegen van natriumhydroxyde.

7. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men een medium gebruikt dat choline bevat in een hoeveelheid van 0,04-0,1 gew.%, het kweken 25 uitvoert bij een temperatuur van 25-30° C en een pH van 5-6.

8. Werkwijze volgens conclusie 1 of 7, met het kenmerk, dat men als Acetobacter cerinus gebruikt de stam IPO 3263.

9. Werkwijze volgens conclusie 1 of 7, met het kenmerk, dat men als Acetobacter cerinus gebruikt de stam IPO 3266.

10. Werkwijze voor de bereiding van 2,5-diketo- gluconzuur, zoals hierin beschreven. 8004677 35