CS215140B2 - Způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny - Google Patents

Abstract

Způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny aerobní kultivací Acetobacter cerinus v prostředí obsahujícím glukózu, při němž se jako glukózy použije D-glukózy, která je přítomná v počáteční koncentraci od 20 do 30 θ/o kmotnost/objem, s výhodou od 25 do 30 % hlmoťnost/ohjem, přičemž fermentační prostředí obsahuje rovněž cholin v množství od 0,04 do 0,5 % hmotnostního, vztaženo na počáteční množství D-glukózy v tomto prostředí. Vyráběná kyselina je užitečná jako meziprodukt pro přípravu kyseliny asfcorbové.

Description

Vynález se týká způsobu výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny, která je užitečná jako meziprodukt pro přípravu kyseliny askorbové. Roztok 2,5-diketoglukonové kyseliny je možno selektivně redukovat na 2-ketogulonoivou kyselinu, kterou lze převést na kyselinu askorbovou. Redukci 2,5-dlketoglukonové kyseliny je možno uskutečnit působením borohydridu alkalického kovu, jak je popsáno v americkém patentu č. 4 159 990, nebo fermentativní redukcí, jak je popsáno například v amerických patentech číslo 3 922 194, 3 959 076 a 3 963 574.

2,5-Diketoglukonová kyselina je rovněž užitečná jako meziprodukt pro přípravu komenové kyseliny záhřevem v přítomnosti kyseliny, jak je popsáno například v americkém patentu č. 3 654 316.

Až dosud byla 2,5-diketoglukonová kyselina vyráběna za použití několika různých druhů bakterií, jako jsou Acetoibacteir melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, GlUconoacetobaicter liquifaciens a Pseudomonas sesami. Použití těchto mikroorganismů však neuspokojuje z průmyslového hlediska, protože je spojeno s poměrně nízkými výtěžky 2,5-diketoglukonové kyseliny, poměrně dlouhými fenmentačními časy a se vznikem velkých množství hnědě nebo žlutohnědě zbarvených látek jako vedlejších produktů kultivace, jež snižují čistotu žádané 2,5-diketoglukonové kyseliny.

Americký patent č. 3 790 444 popisuje výrobu 2,5-diketoglukonové kyseliny neprovázenou. tvorbou hnědého pigmentu za použití nového druhu mikroorganismu, označeného jako Acetobacter fragum ATCC číslo 21 409.

Belgický patent č. 872 095 popisuje přípravu 2,5-diketoglukonové kyseliny v dobrých výtěžcích a bez tvorby barevných příměsí aerobní kultivací Acetobacter cerinus v prostředí obsahujícím glukózu. I když je možno použít celková množství glukózy, pohybující se zhruba od 2,5 do 20 % (hmotnost/objem), bylo zjištěno, že mikroorganismy nesnášejí počáteční koncentraci glukózy v prostředí vyšší než cca 15 %. V souhlase s tím je tedy možno celková množství glukózy vyšší než cca 15 % (hrnotnost/objemj použít při provádění fenmentace pouze tak, že se použije počáteční koncentrace glukózy zhruba od 10 do 15 % (hmotnost/ /objem) a v průběhu fenmentace se do fermentačního prostředí přidávají další podíly glukózy tak, aby v žádném okamžiku nepřesáhla koncentrace glukózy v prostředí hodnotu cca 15 % (hmotnost/objem). V souhlase s tím tedy až dosud byly souhrnné koncentrace nebo· výrobní kapacity 2,5-diketoglukonové kyseliny limitovány poměrně nízkou počáteční koncentrací glukózy, kterou bylo možno ve fermentačním prostředí použít. Produktivita způsobů výroby

2,5-dikeitogluikohové kyseliny za použití jiných mikroorganismů, jak bylo popsáno výše, je rovněž omezena nutností použití poměrně nízké počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí.

Je pochopitelné, že způsob, při němž by mikroorganismy mohly snést a pro výrobu

2,5-diketoglukonové kyseliny využít počáteční koncentrace glukózy vyšší než cca 15 proč. (hmotnost/objem), zejména nad 20%, by znamenal podstatné zvýšení výrobní kapacity a měl by za následek podstatné zvýšení ekonomičnosti postupu. Takovýto způsob by rovněž vyloučil možnost kontaminace fermentačního prostředí, k němuž může dojít v případě, že se produkční kapacita zvyšuje přidáváním dalších podílů glukózy v průběhu fenmentace.

V souladu s vynálezem bylo nyní zjištěno, že mikroorganismus Acetobacter cerinus může pro výrobu 2,5-diketoglukonové kyseliny využít počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí pohybující se nad 20 o/o a až do cca 30 % (hmotnost/objem) v případě, že se do fermentačního prostředí přidá alelspoň 0,04 % hmotnostního cholinu, vztaženo· na množství D-glukózy v prostředí. Vynález zejména popisuje způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny ve vysokých koncentracích aerobní kultivací Acetobacter cerinus ve fermentačním prostředí obsahujícím D-glukózu v počáteční koncentraci nad 20 % a do 30 % (hmotnost/objeimj a cholin v množství 0,04 až 0,5 % hmotnostního, vztaženo na množství D-glukózy v prostředí. Počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí se s výhodou pohybuje od 25 do 30 % (hmotnost/ /objeimj. Kultivace se s výhodou provádí při teplotě 25 až 30 °C, výhodně při pH v rozmezí od 5 do 6. Výhodnými kmeny mikroorganismů jsou Acetobacter cerinus nebo Acetobacter cerinus IFO 3263 a IFO 3266.

2,5-Diketoglukonová kyselina se způsobem podle vynálezu vyrábí v dobrých výtěžcích bez vzniku významnějších množství zbarvených látek a při poměrně krátké fermentační době. Obecně dostupná je řada kmetnů Acetobacter cerinus, včetně IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 a IFO 3269, a všechny tyto kmeny je možno použít při práci způsobem podle vynálezu k výrobě 2,5-dikeitoglukonové kyseliny. Zvlášť výhodnými kmeny jsou IFO 3263 a IFO 3266. Je třeba zdůraznit, že mutanty těchto mikroorganismů, vyrobené běžnými metodami, jako ozářením rentgenovými paprsky nebo ultrafialovými paprsky, působením derivátů dichlordiethylsulfidu apod., je možno rovněž použít při práci způsobem podle vynálezu a tyto mutanty do rožsahu vynálezu také spadají.

Acetobacter cerinus se kultivuje v prostředí, v němž hlavním zdrojem uhlíku je D-glukóza. Je pochopitelné, že v souladu s běžnou praxí při fermentacích obsahuje toto fermentační prostředí rovněž zdroje du215140 siku, draslíku, fosforu a hořčíku. Výraz „fermentační prostředí“ v tomto textu tedy definuje prostředí obsahující takovéto sloučeniny. Při použití mikroorganismů druhu Acetobacter cerinus při práci způsobem podle vynálezu není nutno používat drahých organických zdrojů dusíku, jako jsou pepton nebo masový výluh. Dusík je možno· ekonomicky dodat použitím močoviny nebo anorganických zdrojů dusíku, jako jsou síran amonný, dusičnan amonný, fosforečnan amonný nebo podobné soli, obecně v množství zhruba od 0,1 g do 2 g na litr fermentačního prostředí. V případě, že se rovněž používá nikotinová kyselina jako růstový faktor, přidává se obecně v množství zhruba od 0,2 do 10 mg na litr fermentačního prostředí. Obsah draslíku, hořčíku a fosforu je možno snadno· zajistit přidáním solí, jako fosforečnanu draselného, fosforečnanu amonnéhc, síranu hořečnatého a podobných solí, obecně v množství zhruba od 0,1 do 1 g na litr fermentačnlho prostředí. Co se týče složení fermentačního prostředí, jsou pochopitelně možné značné odchylky. Odborníkům jsou běžně známá další vhodná prostředí a vynález není nijak omezen pouze na použití shora popsaného konkrétního prostředí nebo na použití prostředí popsaných v příkladech provedení.

V souhlase s vynálezem obsahuje fermentační prostředí D-glukózu ve vyšších počátečních koncentracích., než jaké byly možné dříve bez škodlivého vlivu na mikroorganismy používané při fermentaci. Konkrétně se počáteční koncentrace D-glukózy ve fermentačním prostředí používaném při práci způsobem podle vynálezu pohybuje v rozmezí nad cca 20 % a do cca 30 % (hmotnost/objeimj, zejména pak zhruba od 25 do 30 % (hmotnost/objem j. Je-li to žádoucí, lze glukózu přidávat ve formě cerelosy (monohydrát. D-glukótzyj.

Aby mikroorganismy druhu Acetobacter cerinus mohly tak vysoké koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí snést a využít, je nutno k fermentačnímu prostředí přidat cholin v množství nejméně 0,04 % hmotnostního, vztaženo na počáteční množství D-glukózy ve fermentačním prostředí. Je-li to žádoucí, lze použít poměrně vysoká množství cholinu, například zhruba 0,5 % hmotnostního, vztaženo na počáteční koncentraci D-glukózy ve fermentačním prostředí, použití více než cca 0,1 % hmotnostního cholinu je však jen málo výhodné a obecně se dává přednost použití zhruba od 0,04 do 0,06 % hmotnostního. Cholin je možno přidat buď jako volnou bázi, nebo jako sůl, například jako cholinchlorid, cholinhydrogenkarbonát, cholincitrát, cholinglukonáf nebo podobnou sůl. Výhodnou solí je cholinchlorid. Koncentrace cholinu, jak se v tomto textu uvádí, se vztahuje na cholin ve formě volné báze. Malou část potřebného cholinu je možno dodat, je-li to žádoucí, přidáním kukuřičného výluhu do fermentačního prostředí. Kukuřičný výluh, který se ve fermentačních prostředích používá jako zdroj vitamínů a minerálních látek, obecně obsahuje pouze cca 0,5 až 3 mg cholinu na 1 g kukuřičného výluhu.

Obecně se však nemá používat více než cca 5 g kukuřičného výluhu na litr fermentačního prostředí, protože kukuřičný výluh obsahuje barevné látky a přídavek více než cca 5 g kukuřičného výluhu na litr fermentačního prostředí znesnadňuje izolaci a čištění 2,5-diketoglukonové kyseliny. V souhlase s tím se tedy kukuřičný výluh může použít, je-li to žádoucí, pouze jako zdroj malé části cholinu potřebného pro fermentaci, přičemž zbývající část potřebného množství cholinu se k fermentačnímu prostředí přidá, jako cholinová báze nebo její sůl, jak je popsáno výše.

Fermentace se obecně provádí při teplotě zhruba od 20 do 35 °C, s výhodou, od 25 do 30 °C, nejvýhodněji při teplotě okolo 28° Celsia. Počáteční pH kultivačního prostředí se pohybuje zhruba od 3,5 do 7,5, s výhodou zhruba od 5 do 6. V průběhu fermentace je žádoucí «držovat pH v tomto rozmezí, s výhodou na hodnotě okolo 5,5, a to· například přidáváním roztoku hydroxidu alkalického kovu, s výhodou roztoku hydroxidu sodného. Alternativně je možno k regulaci pH použít uhličitan alkalického· kovu nebo kovu alkalické zeminy, s výhodou uhličitan vápenatý, který se k tomuto účelu přidává do připraveného prostředí po reakci v autoklávu, obecně v množství zhruba od 20 do 30 g na 10 g glukózy. Je pochopitelné, že 2,5-d.iketoglukonová kyselina bude v takovémto fermentačním prostředí vznikat ve formě odpovídající soli s alkalickým kovem nebo kovetm alkalické zeminy, jako soli sodné nebo vápenaté, a že takovéto soli spadají v tomto textu rovněž do rozsahu výrazu „2,5-di'ketoglukonová kyselina“.

Po inokulaci se fermentační prostředí míchá, například mechanickým míchadlem, a větrá, s výhodou rychlostí cca 0,5 až 1 objelm vzduchu na 1 objem fermentační půdy za minutu. Je-li to žádoucí, lze během fermentace přidávat další glukózu k náhradě určitého množství glukózy spotřebovaného při fermentaci, čímž se zvýší celková koncentrace 2,5-diketoglukonové kyseliny obsažené ve fermentační půdě.

Fermentace se provádí až do dosažení žádaného výtěžku. Tak například při použití Acetobacter cerinus IFO 3263 nebo 3266 a při fermentační době cca 40 až 50 hodin vzniká 2,5-dlketoglukonová kyselina ve výtěžku cca 90 až 95 %, vztaženo na D-glukózu. Je ovšem třeba počítat s určitými odchylkami v reakčních dobách a výtěžcích, a to v závislosti na použitém km.eni mikroorganismu, na koncentraci glukózy ve fermentačním prostředí a na teplotě, při níž se kultivace provádí.

Zcela nezávazně se předpokládá, že kon215140 verze glukózy na 2,5-di.ketoglukonovou kyselinu probíhá těmito sledy reakcí:

glukóza -> 2-ketoglukonová kyselina 2,5-dikefoglukonová kyselina glukóza -> 5-iketoglukonová kyselina -» 2,5-diiketoglukonová kyselina.

Intermediární 2-ketoglukonovou a 5-ketoglukonovou kyselinu a 2,,5-diketoglukonovou. kyselinu je možno oddělit papírovou chromatografii za použití chromatografického papíru Whatman č. 1 a 4 a rozpouštědlového systému methylethylketon-aceton-kyselina mrdvenčí-voda (80:6:2:12], Skvrny jednotlivých kyselin se delegují postřikem 0,2% etbanoiickým roztokem o-fenylendiamlnu, obsahujícím 1 o/_o kyseliny dusičné, a záhřevem zhruba na 70 °C (5-ketoglukonová kyselina — modré zbarvení; 2-ketoglukonová kyselina — žluté zbarvení; 2,5-diketoglukonová kyselina — zelené zbarvení]. Je možno použít rovněž vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Za použití shora uvedených metod je možno sledovat postup fermentace.

2,5-Dikeitoglnkono'vou kyselinu je možno oddělit a izolovat z výsledné fermentační půdy libovolným běžným, o sobě známým způsobem. Tak například je možno fermentační půdu zfiltrovat, hodnotu pH vodného filtrátu upravit přidáním minerální kylseliny, jako kyseliny chlorovodíkové, zhruba na až 2,5, roztok zahustit a k zbytku přidat nižší alkanol, s výhodou ethanol nebo methanol. Stáním se ze vzniklého roztoku vysráží v pevné formě 2,5-diketoglukonová kyselina jako vápenatá nebo sodná sůl; 2,5-diketogluikonovou kyselinu je možno ze soli získat působením nejprve zředěné minerální kyseliny a pak například katexu, jako sulfonované pryskyřice, například katexu Dowex 50.

Je-li to žádoucí, lze fermentační půdu příslušně zpracovávat k přeměně vzniklé 2,5-diketoglukonové kyseliny na jiné žádané produkty, například fermentativní redukcí na 2-ketogulonovou kyselinu, jak je popsáno v amerických patentech čís. 3 922 194,

959 076 nebo 3 963 574. Alternativně je možno zfiltrovanou fermentační půdu použít jako vhodný reakční roztok pro redukci 2,5-diketoglukonové kyseliny vedoucí k vzniku roztoku obsahujícího kyselinu 2-ketogulonovou. Tato· redukce se provádí reakcí s borohydridem alkalického kovu, jak je popsáno v americkém patentu č. 4 159 990; 2-ketogulonová kyselina vyrobená těmito reakcemi se snadno převede známým způsobem na kyselinu askorbovou, například záhřevem methylesteru kyseliny 2-ketogulonové v přítomnosti báze.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad 1

Připraví se toto vodné inokulační prostředí:

6ložika g/l monohydrát glukózy 25 kukuřičný výluh 5 dihydrogenfosforečnan draselný 0,5 monohydrogeinfosforečnan draselný 0,5 heptahydrát síranu hořečnatého 0,2 uhličitan vápenatý 7,0 pH 6,2.

Třepací baňka obsahující 1 litr tohoto prostředí se 30 minut zahřívá v autoklávu na 121 °C. Do baňky se vnesou buňky Acetobacter cerinus IFO 3263, vypěstované na šikmém agairu (5 ml z 20 ml sterilní vodné suspenze], a baňka se pak cca 24 hodiny třepe na rotační třepačce při teplotě zhruba 28 °C. Hodnota pH ochlazeného prostředí činí 5,0.

Příslušný podíl této kultury postačující k dosažení 10% (objem/objemj inokula se vnese do čtyřlitrové míchané fermentační nádoby, obsahující 2 litry tohoto produkčního prostředí:

složka monohydrát glukózy 225 g/l kukuřičný výluh 0,5 g/l monohydrogenfosforečnan amonný 0,5 g/l dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g/l heptahydrát síranu hořečnatého 0,5 g/l močovina 1,0 g/l cholinchlorid 100 mg/1 nikotinová kyselina 10 mg/1 pentahydrát síranu měďnatého 2,0 mg/1 protipěnové činidlo P-2000 1,0 mg/1 pH 6,0.

Fermentace se provádí při teplotě 28 °C za míchání při 1700 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním 20% hydroxidu sodného udržuje na 5,5. Po čtyřicetiosmihodinové fermentaci se ve výtěžku 95 % zíslká 2,5-diketoglukonová kyselina ve formě sodné soli.

Příklad 2

Připraví se toto vodné inokulační prostředí:

složka g/l monohydrát glukózy 25 kukuřičný výluh 5 dihydrogenfosforečnan draselný 0,5 monohydrogenfosforečnan draselný 0,5 heptahydrát síranu hořečnatého 0,2 uhličitan vápenatý 7,0.

Třejpací baňka obsahující 1 litr tohoto prostředí se 30 minut zahřívá v autoklávu na 121°C. Do baňky se vnesou buňky Acetobacter cerinus IFO 3263, vypěstované na šitoméim agaru (5 ml z 20 ml sterilní vodné .susipeinze), a baňka se pak cca 24 hodiny třeipe na rotační třepačce při teplotě zhruba 28 °C. Hodnota pH ochlazeného prostředí Činí 5,0.

Příslušný podíl této kultury postačující k dosažení 10% (objem/objem] inokula se vnese do čtyřlitrové míchané fermentační nádoby, obsahující 2 litry tohoto prostředí: složka (pro 2. stupeň) g/1 monohydírát glukózy 100 kukuřičný výluh 0,5 monohydrogemfosforečnan amonný 0,5 dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 heptahydíráí síranu hořečnatého 0,5 močovina 1,0 nikotinová kyselina 10 mg pentahydrát síranu měďnatého 2,0 mg cholinchlorid 500 mg

P-2000 0,5 ml.

Tento druhý stupeň se provádí při teplotě 28 °C za míchání při 1700 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objetou vzduchu na 1 objem prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním ,20% roztoku hydroxidu sodného udržuje na 5,5.

Po 20 hodinách se příslušný podíl této kultury, postačující k dosažení 10% (objeim/objem) inokula, vnese do· čtrnáctilitrového míchaného fermentoru obsahujícího 6 1 tohoto produkčního prostředí:

složka	g/i
monohydírát glukózy	334
kukuřičný výluh	0,5
toonohydrogenfoísforečnan amonný	0,58
dihydrogénf oisforečnan draselný	1,5
heptahydrát síranu hořečnatého	0,5
močovina	1,0
nikotinová kyselina	10,0 mg
pentahydrát síranu měďnatého	2,0 mg
cholinchlorid	150 mg
P-2000	0,5 ml.

Fermentace se provádí při teplotě 28 ^;C za míchání při 750 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objemu vzduchu na 1 objem prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním 20% roztoku hydroxidu sodného udržuje na 5,5. Po fermentaci trvající 65 až 70 hodin se ve výtěžku 95 proč. získá 2,5-diketoglukonová kyselina ve formě sodné soli.

Příklad 3

Za použití postupu popsaného v příkladu se testují kmeny IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 a 3269 druhu Acetobacter cerinus. Ve všech případech činí fermentační doba 48 hodin. V každém z těchto případů obsahuje produkt fermentace 2,5-diketoglukonovou kyselinu ve výtěžku vyšším než 50 %, sípolu s určitým množstvím nezireagované intermediární 2-ketoglukonové kyseliny a 5-ketoglukonové kyseliny. Při použití těchto kmenů mikroorganismu Acetobacter cerinus je možno dosáhnout vyšších výtěžků žádané 2,5-díketoglukonové kyseliny prodloužením doby fermentace.

Claims (2)

1. Způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny aerobní kultivací Acetobacter cerinus v prostředí obsahujícím glukčzu, vyznačující se tím, že se použije D-glukózy, která je přítomná v počáteční koncentraci od 20 do 30 % hmotnost/objem, s výhodou od 25 do 30 % hmotnost/objem, přičemž fermentační prostředí obsahuje rovněž cholín v množYNÁLEZU ství od 0,04 do 0,5 % hmotnostního, vztaženo na počáteční množství D-glukózy v tomto prostředí.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že feirmentační prostředí obsahuje choiin v množství od 0,04 do 0,1 % hmotnostního.