JPS5810080B2 - ２，５−ジケトグルコン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はアスコルビン酸の製造のための中間体として
有用である２・５−ジケトグルコン酸の製造方法に関す
る。

２・５−ジケトグルコン酸の溶液を選択的に還元して２
−ケトグロン酸とし、これをアスコルビン酸に転化する
。

２・５−ジケトグルコン酸の還元は、米国特許第４１５
９９９０号に開示されたようにして水素化はう素アルカ
リ金属による還元あるいは米国特許第３９２２１９４号
、第３９５９０７６号および第３９６３５７４号等に記
載された発酵による還元によって行うことができる。

２・５−ジケトグルコン酸はたとえば米国特許第３６５
４３１６号に記載されたように酸の存在下加熱すること
によってコメン酸を製造スる際の中間体としても有用で
ある。

従来、２・５−ジケトグルコン酸はアセトバクター・メ
ラノゲヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎｏｇ
ｅｎｕｍ）、アセトバクター・オーランチウム（Ａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｍ） 、グル０ノ
アセトバクター°ルビジノスス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）、グルコ
ノアセトバクター・リクイファシェンス（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ １ｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ
） およびシュードモナス・セサミ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｓｅｓａｍｉ）のような種々の異なる細菌によ
って生成された。

しかし、これらの微生物を使用することは工業上満足の
いくものではない。

というのは２・５−ジケトグルコン酸の収量が比較的低
く、発酵時間が長く、培養副産物として茶色又は黄茶色
の色素が大量に生成して所望の２・５−ジケトグルコン
酸の純度が低下するからである。

米国特許第３７９０４４４号は２・５−ジケトグルコン
酸をアセトバククー・フラブム （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｇｕｍ）ＡＴＣＣＮ
Ｏ，２１４０９と呼ばれる新種によって茶色の顔料なし
に生成する方法に関する。

１９７９年９月２８日に出願された米国特許出願第７９
６６８号はグルコース含有培地中でアセトバクター・セ
リヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）の
好気培養によって顔料生成することなく２・５−ジケト
グルコン酸を良好な収量で生成することに関する。

総量の約２．５ないし約２０型量／容量％のグルコース
を使用できるが、培地中の初期グルコース濃度が約１５
％より犬であると微生物には耐えがたいことがわかった
。

したがって、グルコースは初期濃度約１０ないし１５重
量／容量％で発酵を行ない、その後、発酵の工程中でさ
らにグルコースを少しずつ加えることによってのみ総量
が約１５型量／容量％を越えることが許されるが、いか
なる時も培地中のグルコース濃度が約１５型量／容量％
を越えることはない。

したがって、従来２・５−ジケトグルコン酸の総濃度す
なわち生成能力は発酵培地に使用できる比較的低い当初
グルコース濃度に限定されてきた３上述の如く、２・５
−ジケトグルコン酸の製造のために他の微生物を使用す
る方法の生産性は発酵培地において比較的低い初期グル
コース濃度を必要とすることによって制限されている。

約１５型量／容量％、特に２０％より高い初期グルコー
ス濃度が２・５−ジケトグルコン酸製造用微生物によっ
て耐えられ、資化されている方法により充分な生産性増
大がもたらされ、操業上の充分な経済性がもたらされる
ことは明らかである５そのような方法はまた、発酵の途
中にグルコースをさらに少量ずつ加えることによって生
産性を高める場合に生じる発酵培地の汚染の可能性を避
けることができる。

この発明によれば、発酵培地中２０ないし約３０型量／
容量％の初期グルコース濃度でも、少くとも０．０４重
量％（培地中のＤ−グルコースの量にもとづいて）のコ
リンが培地に添加されればアセトバクター・セリマス（
Ａｃｅｊｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）によって利
用でき、２・５−ジケトグルコン酸の製造を行なえるこ
とがわかった。

さらに詳細には、この発明は、初期濃度約２０ないし約
３０型量／容量％のＤ−グルコースおよび培地中のＤ−
グルコースの量にもとづいて約０．４重量％のコリンを
含有する発酵培地中でアセトバクター°セリヌス（Ａｃ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）を好気的に増殖
させることによって発酵培地中に２・５−ジケトグルコ
ン酸を高濃度で生成させる方法に関する。

発酵培地中での初期グルコース濃度は好ましくは約２５
ないし３０重量／容量％である。

増殖は好ましくは２５〜３０℃、ｐＨ約５〜６で行なわ
れる。

好適菌株はアセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）すなわちアセトバクター°
セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）
ＩＦ０３２６３および３２６６である。

２・５−ジケトグルコン酸は本発明の方法において有意
量の顔料の生成なしに比較的短い発酵時間で良好な収量
で製造される。

アセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｃｅｒｉｎｕｓ）ＩＦ０３２６２（ＡＴＣＣ１２０３）
、ＩＦＯ３２６３、ＩＦＯ３２６４、ＩＦ０３２６５、
ＩＦＯ３２６６、ＩＦＯ３２６７、ＩＦＯ３２６８およ
びＩＦＯ３２６９は１９５４年から自由に分譲されてお
り、本発明の方法において２・５−ジケトグルコン酸製
造に使用できる。

特に好適な菌株はＩＦＯ３２６３および３２６６である
。

これらの微生物を通常の方法、たとえばＸ線または紫外
線照射、ナイトロジエンマスタード等による処理によっ
て生ぜしめた変異株も本発明の方法で使用でき、本明細
書および特許請求の範囲に包含させ得る。

アセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｃｅｒｉｎｕｓ）に主たる炭素源がＤ−グルコースであ
る培地中で培養される。

従来の発酵技術に従い、発酵培地は窒素源、カリウム、
燐およびマグネシラム源も含有する。

本明細書において゛発酵培地′とは上記化合物を含有す
る培地に限定される。

この発明においてアセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）を使用する場合、ペ
プトンまたは肉エキスのような高価な有機窒素源を使用
する必要はない。

窒素源は尿素、あるいは硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等の塩のような無機窒素源
を通常発酵培地１リットル当り約０．１１ないし２グの
量で使用し、ニコチン酸が生育因子として添加されてい
るときは一般に発酵培地１リットル当り約０．２ないし
１０ｍ９の量使用することによって経済的に提供できる
。

カリウム、マグネシウムおよび燐はリン酸カリウム、リ
ン酸アンモニウム、硫酸マグネシウム等の塩を一般に発
酵培地の１リットル当り約０．１ないし約１１の量で添
加することによって容易に提供できる。

しかし発酵培地の組成を相当変化させることができる。

他の適当な培地は当業者には明らかであろうし、本発明
の方法は上述の培地または実施例中の培地に限定される
ものではない。

本発明によれば発酵培地は以前可能であったより高い初
期濃度のＤ−グルコースを含有し、発酵に使用される微
生物に悪影響を及ぼすことはない。

特に、この発明の方法に使用される発酵培地中の初期Ｄ
−グルコース濃度は約２０ないし約３０型量／容量％、
特に約２５ないし３０重量／容量％である。

所望ならば、Ｄ−グルコースはセレロース（Ｄ−グルコ
ース−水和物）として添加できる。

発酵培地中のそのような高濃度グルコースに耐えて資化
し得るアセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ ｃａｒｉｎｕｓ）のために少くとも約０．０４重
量％（発酵培地中の当初Ｄ−グルコース量にもとづいて
）のコリンを発酵培地に添加することが必要である。

所望ならば、比較的高レベルのコリン、たとえば発酵培
地中当初り一グルコース濃度にもとづいてたとえば約０
．０５重量％のコリンを使用することができるが、約０
．１重量％より大量のコリンを使用しても何ら利点はな
い。

約０．０４ないし約０．０６重量％のコリンが一般的に
好ましい。

コリンは遊離塩基でも塩でも塩なく、たとえばコリンク
ロリド、重炭酸コリン、クエン酸コリン、グルコン酸コ
リン等の塩である。

コリンクロリドが好ましい。

本発明において限定されたコリン濃度はコリン塩基とし
て計算されたものである。

所望ならば発酵培地にコーンスチープリカーを添加する
ことによって必要なコリンの一部を提供できる。

ビタミンおよびミネラル源として発酵培地に使用される
コーンスチープリカーは一般にコーンメチ−プリカー１
？当り約０．５〜３ｍｇのコリンを含んでいる。

しかし、コーンスチープリカーは着色体を含有するので
発酵培地１リットル当り約５１以下のコーンスチープリ
カーを使用するに限り、５１より多く添加すると２・５
−ジケトグルコン酸の回収および精製が困難になる。

したがって、所望ならば、発酵に必要なコリンの少量供
給源としてのみコーンスチーブリカーを使用すべきで、
残り部分のコリンは上述のコリン塩基又は塩を添加すべ
きである。

一般に約２０℃〜３５℃１好ましくは２５℃〜３０℃、
より好ましくは約２８℃前後の温度で発酵を行う。

培地の初期ｐＨは約３．５〜７．５、好ましくは約５〜
６である。

発酵の間ｐＨはこの範囲好ましくは約５．５に維持する
のが好ましい。

たとえばアルカリ金属水酸化物、好ましくは水酸化ナト
リウム溶液の添加によって維持する。

別法として、アルカリ金属炭酸塩またはアルカリ土金属
炭酸塩、好ましくは炭酸カルシウムをｐＨコントロール
に使用でき、所望のｐＨを与えるに充分量；一般に約２
０〜３０ｆ／１００グのグルコースをオートクレーブ後
培地に加える。

２・５−ジケトグルコン酸がそのような発酵培地中でナ
トリウム又はカルシウム塩のような相当するアルカリ金
属又はアルカリ士金属塩の形で生成され、そのような塩
は本明細書中では２・５−ジケトグルコン酸”なる用語
で包含せしめていることが理解されよう。

接種後；発酵培地を攪拌器等で攪拌し、好ましくは１分
間当り発酵ブロス／容量部当り約０．５〜１容量部の速
度で通気する。

もし望むならば、さらにグルコースを発酵工程中に加え
て発酵に使用されたグルコースのいくらかを置換して発
酵ブロス中に得られた２・５−ジケトグルコン酸の全潰
１度を増大せしめることができる。

所望の収量が得られるまで発酵を続行する。

たとえばアセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｔａｃ
ｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ３２６３または３２６
６を使用すると発酵時間は約４０〜５０時間でＤ−グル
コ−スにもとづいて約９０〜９５％の収率で２・５−ジ
ケトグルコン酸を生産する。

しかし、微生物の特定菌株、発酵培地中のグルコース濃
度および培養温度に依って多少反応時間と収量が変化す
るであろう。

下記機作に限定されるとは限らないが、グルコースから
２・５−ジケトグルコン酸への変換は下記式によって進
行すると信じられている。

中間体である２−ケトグルコン酸および５−ケトグルコ
ン酸ならびに２・５−ジケトグルコン酸はワットマンＮ
ｏ、１および＆４紙およびメチルエチルケトン：アセト
ン：ギ酸：水（８０：６：２：１２）の溶媒系を使用し
てペーパークロマトグラフィーによって分離できる。

これらの酸のスポットは１％硝酸を含有する０、２％Ｏ
−フェニレンジアミンエタノール溶液を噴霧し、約７０
℃に加熱することによって位置がわかる。

（５−ケトグルコン酸−青；２−ケトグルコン酸−黄色
：２・５−ジケトグルコン酸−緑色）。

高速液体クロマトグラフィーも使用できる。

上記方法を使用することによって発酵の進行が追跡でき
る。

２・５−ジケトグルコン酸は当業者に既知の従来方法に
よって最終発酵ブロスから分離回収できる。

たとえば、発酵ブロスを沢過し、水性涙液のｐＨを塩酸
のような鉱酸の添加によって約２〜２．５に調節し、溶
液を濃縮し、低級アルキルアルコール、好ましくはエタ
ノール又はメタノールを添加する。

静置すれば２・５−ジケトグルコン酸がカルシウム又は
ナトリウム塩の形で溶液から固体の形で析出する。

２・５−ジケトグルコン酸は希鉱酸で処理し、スルホン
酸樹脂、たとえばダウエックス５０（ダウケミカルカン
パニー）のようなカチオン交換樹脂によって処理するこ
とにより上記塩から得ることができる。

所望ならば、発酵ブロスを、米国特許第 ３９２２１９４号、第３９５９０７６号、第３９６３５
７４号に記載されているように発酵により還元して形成
した２・５−ジケトグルコン酸を他の所望の酸に転化で
きる。

別法として、ＦＡされた発酵ブロスを、米国特許第４１
５９９９０号に記載されたように水素化はう素アルカリ
金属との反応により２・５−ジケトグルコン酸を２−ケ
トグルコン酸含荷溶液に還元するのに適当な反応溶液と
して使用できる。

これらの反応において生成された２−ケトグルコン酸は
たとえばそのメチルエステルを塩基の存在下に加熱する
等の既知の方法によりアスコルビン酸に容易に転化され
る。

下記実施例は本発明を説明するものであって本発明を限
定するものではない。

例１ 下記水性種母培地を調製した・ １リツトルの培地を含有する振とうフラスコを３０分間
１２１℃で加熱（オートクレーブ）した。

栄養寒天斜面培地（２０ｍｌの滅菌水性懸濁液のうちの
５ｍ１）から得られたアセトバクター・セリヌス（Ａｃ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ３２６３
をフラスコに添加し、これをロータリーンエイカーで約
２８℃で約２４時間振とうした。

冷却した培地のｐＨは５．０であった。

１０容量／容量％の種母を提供するに充分な培養物の少
量を下記生産培地２リツトルを含有する４リツトルの攪
拌された発酵槽に加えた。

１７００ｒｐｍで攪拌し、１容量／１容量のブロス／分
の速度で通気しながら２８℃で発酵を行なった。

２０％水酸化ナトリウム溶液を添加することによってｐ
Ｈを５．５に維持した。

４８時間の発酵後２・５−ジケトグルコン酸をナトリウ
ム塩として収率９５％で得た。

例２ 下記種母培地を調製した： １リツトルの培地を含有する振とうフラスコを１２１℃
で３０分加熱（オートクレーブ）した。

栄養寒天斜面培地から得たアセトバクター・セリヌス（
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＩＦ０３２
６３の細胞（２０ｍｌの滅菌水性懸濁液のうち５ｍ１）
をフラスコに加え、これをロータリーシェイカーで糺２
８℃で約２４時間振とうした。

冷却された培地のｐＨは５．０であった。

１０容量／容量％の種母を提供するに充分な培養物の少
量を下記培地２リツトルを含有する４リツトルの攪拌さ
れた発酵槽に加えた： 第二段階は１７００ｒｐｍで攪拌し１．０容量／ブロス
１容量／分の速度で通気しながら２８℃で行なった。

ｐＨは２０％水酸化ナトリウム溶液の添加によって５．
５に維持した。

２０時間後、１０容量／容量％の種母を提供するに充分
な培養物の少量を６リツトルの下記生産培地を含有する
１４リツトルの攪拌された発酵槽に加えたニ ア５０ｒｐｍで攪拌し１．０容量／ブロス１容量／分の
速度で通気しながら２８℃で発酵を行なった。

２０％水酸化ナトリウム溶液を添加することによつてｐ
Ｈを５．５に維持した。

６５〜７０時間の発酵後２・５−ジケトグルコン酸をナ
トリウム塩として９５％の収率で得た。

例３ 例１の方法に従い、アセトバクター・セリヌス（Ａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＩＦ０３２６２゜
３２６４．３２６５．３２６６．３２６７゜３２６８お
よび３２６９を各々試験した。

各場合発酵生成物は２・５−ジケトグルコン酸を５０％
を越える収率で含み、転化されない２−ケトグルコン酸
および５−ケトグルコン酸中間体もいく分含んでいた。

これらのアセトバクター・セリヌス菌株を使用する場合
、もつと長時間発酵を続ければより高収率で所望の２・
５−ジケトグルコン酸が得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 初期濃度約２０ないし約３０型量／容量％のＤ−グ
   ルコースおよび該Ｄ−グルコースの初期量にもとづいて
   少くとも約０．０４重量％のコリンを含有する発酵培地
   中でアセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
   ｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）を好気的に増殖させることからな
   る２・５−ジグトグルコン酸の製造方法。 ２ Ｄ−グルコースの初期濃度が約２５ないし３０重量
   ／容量％である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 培地が約０．０４ないし０．１重量％のコリンを含
   有している特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 増殖が約２５℃ないし３０℃の温度で行なわれる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 増殖がｐＨ約５ないし６で行なわれる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ６ ｐＨが水酸化ナトリウムの添加によって維持される
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 培地が約０．０４ないし０．１重量％のコリンを含
   有し、増殖が約２５℃ないし３０℃の温度およびｐＨ約
   ５ないし６で行なわれる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ８ アセトバクター°セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
   ｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）がＩＦＯ３２６３菌株である特許
   請求の範囲第１項または第７項記載の方法。 ９ アセトバクター・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
   ｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）がＩＦＯ３２６６である特許請求
   の範囲第１項または第７項記載の方法。