CS215140B2

CS215140B2 - Method of making the 2,5-diketoglucon acid

Info

Publication number: CS215140B2
Application number: CS806448A
Authority: CS
Inventors: Donald A Kita; Dennis M Fenton
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1979-09-28
Filing date: 1979-09-24
Publication date: 1982-07-30
Also published as: AU6276180A; BE885419A; AU519340B2; ZA805980B; JPS5810080B2; JPS5658492A

Abstract

Způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny aerobní kultivací Acetobacter cerinus v prostředí obsahujícím glukózu, při němž se jako glukózy použije D-glukózy, která je přítomná v počáteční koncentraci od 20 do 30 θ/o kmotnost/objem, s výhodou od 25 do 30 % hlmoťnost/ohjem, přičemž fermentační prostředí obsahuje rovněž cholin v množství od 0,04 do 0,5 % hmotnostního, vztaženo na počáteční množství D-glukózy v tomto prostředí. Vyráběná kyselina je užitečná jako meziprodukt pro přípravu kyseliny asfcorbové.Process for preparing 2,5-diketogluconic acid aerobic cultivation of Acetobacter cerinus in a glucose-containing environment in which it is D-glucose is used as glucose present at an initial concentration of 20 to 30 θ / o weight / volume, preferably from 25 to 30% fatness / yield, with fermentation the environment also contains choline in an amount from 0.04 to 0.5 wt the initial amount of D-glucose in this environment. The acid produced is useful as an intermediate for the preparation of ascorbic acid.

Description

Vynález se týká způsobu výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny, která je užitečná jako meziprodukt pro přípravu kyseliny askorbové. Roztok 2,5-diketoglukonové kyseliny je možno selektivně redukovat na 2-ketogulonoivou kyselinu, kterou lze převést na kyselinu askorbovou. Redukci 2,5-dlketoglukonové kyseliny je možno uskutečnit působením borohydridu alkalického kovu, jak je popsáno v americkém patentu č. 4 159 990, nebo fermentativní redukcí, jak je popsáno například v amerických patentech číslo 3 922 194, 3 959 076 a 3 963 574.The invention relates to a process for the preparation of 2,5-diketogluconic acid which is useful as an intermediate for the preparation of ascorbic acid. The 2,5-diketogluconic acid solution can be selectively reduced to 2-ketogulonoic acid, which can be converted to ascorbic acid. The reduction of 2,5-dlketogluconic acid may be accomplished by treatment with an alkali metal borohydride as described in U.S. Patent No. 4,159,990, or by fermentative reduction as described, for example, in U.S. Patent Nos. 3,922,194, 3,959,076 and 3,963,574. .

2,5-Diketoglukonová kyselina je rovněž užitečná jako meziprodukt pro přípravu komenové kyseliny záhřevem v přítomnosti kyseliny, jak je popsáno například v americkém patentu č. 3 654 316.2,5-Diketogluconic acid is also useful as an intermediate for the preparation of comenoic acid by heating in the presence of an acid, as described, for example, in U.S. Patent 3,654,316.

Až dosud byla 2,5-diketoglukonová kyselina vyráběna za použití několika různých druhů bakterií, jako jsou Acetoibacteir melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, GlUconoacetobaicter liquifaciens a Pseudomonas sesami. Použití těchto mikroorganismů však neuspokojuje z průmyslového hlediska, protože je spojeno s poměrně nízkými výtěžky 2,5-diketoglukonové kyseliny, poměrně dlouhými fenmentačními časy a se vznikem velkých množství hnědě nebo žlutohnědě zbarvených látek jako vedlejších produktů kultivace, jež snižují čistotu žádané 2,5-diketoglukonové kyseliny.To date, 2,5-diketogluconic acid has been produced using several different types of bacteria, such as Acetoibacteir melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, GlUconoacetobaicter liquifaciens and Pseudomonas sesami. However, the use of these microorganisms is not satisfactory from an industrial point of view because it is associated with relatively low yields of 2,5-diketogluconic acid, relatively long fenmentation times and the formation of large amounts of brown or yellow-brown colored byproducts which reduce the purity of the desired 2,5- diketogluconic acid.

Americký patent č. 3 790 444 popisuje výrobu 2,5-diketoglukonové kyseliny neprovázenou. tvorbou hnědého pigmentu za použití nového druhu mikroorganismu, označeného jako Acetobacter fragum ATCC číslo 21 409.U.S. Patent No. 3,790,444 discloses the production of 2,5-diketogluconic acid unaccompanied. formation of a brown pigment using a new species of microorganism designated as Acetobacter fragum ATCC No. 21 409.

Belgický patent č. 872 095 popisuje přípravu 2,5-diketoglukonové kyseliny v dobrých výtěžcích a bez tvorby barevných příměsí aerobní kultivací Acetobacter cerinus v prostředí obsahujícím glukózu. I když je možno použít celková množství glukózy, pohybující se zhruba od 2,5 do 20 % (hmotnost/objem), bylo zjištěno, že mikroorganismy nesnášejí počáteční koncentraci glukózy v prostředí vyšší než cca 15 %. V souhlase s tím je tedy možno celková množství glukózy vyšší než cca 15 % (hrnotnost/objemj použít při provádění fenmentace pouze tak, že se použije počáteční koncentrace glukózy zhruba od 10 do 15 % (hmotnost/ /objem) a v průběhu fenmentace se do fermentačního prostředí přidávají další podíly glukózy tak, aby v žádném okamžiku nepřesáhla koncentrace glukózy v prostředí hodnotu cca 15 % (hmotnost/objem). V souhlase s tím tedy až dosud byly souhrnné koncentrace nebo· výrobní kapacity 2,5-diketoglukonové kyseliny limitovány poměrně nízkou počáteční koncentrací glukózy, kterou bylo možno ve fermentačním prostředí použít. Produktivita způsobů výrobyBelgian Patent No. 872,095 describes the preparation of 2,5-diketogluconic acid in good yields and without the formation of color impurities by aerobic cultivation of Acetobacter cerinus in a glucose-containing medium. Although total amounts of glucose ranging from about 2.5 to 20% (w / v) can be used, it has been found that microorganisms do not tolerate an initial glucose concentration in the environment of greater than about 15%. Accordingly, total glucose levels of greater than about 15% (weight / volume) can only be used in the phenmentation by using an initial glucose concentration of about 10 to 15% (w / v) and additions of glucose to the fermentation broth so that the concentration of glucose in the environment does not exceed about 15% (w / v) at any given time, so that up to now the aggregate concentrations or production capacity of 2,5-diketogluconic acid has been limited by a relatively low the initial glucose concentration that could be used in the fermentation medium

2,5-dikeitogluikohové kyseliny za použití jiných mikroorganismů, jak bylo popsáno výše, je rovněž omezena nutností použití poměrně nízké počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí.2,5-dikeitogluicacic acid using other microorganisms as described above is also limited by the need to use a relatively low initial glucose concentration in the fermentation broth.

Je pochopitelné, že způsob, při němž by mikroorganismy mohly snést a pro výrobuIt is understandable that a method in which microorganisms could tolerate and for production

2,5-diketoglukonové kyseliny využít počáteční koncentrace glukózy vyšší než cca 15 proč. (hmotnost/objem), zejména nad 20%, by znamenal podstatné zvýšení výrobní kapacity a měl by za následek podstatné zvýšení ekonomičnosti postupu. Takovýto způsob by rovněž vyloučil možnost kontaminace fermentačního prostředí, k němuž může dojít v případě, že se produkční kapacita zvyšuje přidáváním dalších podílů glukózy v průběhu fenmentace.2,5-diketogluconic acid utilize an initial glucose concentration higher than about 15 why. (weight / volume), in particular above 20%, would entail a substantial increase in production capacity and would result in a substantial increase in the economy of the process. Such a method would also eliminate the possibility of contamination of the fermentation environment, which may occur if the production capacity is increased by adding additional portions of glucose during the phenmentation.

V souladu s vynálezem bylo nyní zjištěno, že mikroorganismus Acetobacter cerinus může pro výrobu 2,5-diketoglukonové kyseliny využít počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí pohybující se nad 20 o/o a až do cca 30 % (hmotnost/objem) v případě, že se do fermentačního prostředí přidá alelspoň 0,04 % hmotnostního cholinu, vztaženo· na množství D-glukózy v prostředí. Vynález zejména popisuje způsob výroby 2,5-diketoglukonové kyseliny ve vysokých koncentracích aerobní kultivací Acetobacter cerinus ve fermentačním prostředí obsahujícím D-glukózu v počáteční koncentraci nad 20 % a do 30 % (hmotnost/objeimj a cholin v množství 0,04 až 0,5 % hmotnostního, vztaženo na množství D-glukózy v prostředí. Počáteční koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí se s výhodou pohybuje od 25 do 30 % (hmotnost/ /objeimj. Kultivace se s výhodou provádí při teplotě 25 až 30 °C, výhodně při pH v rozmezí od 5 do 6. Výhodnými kmeny mikroorganismů jsou Acetobacter cerinus nebo Acetobacter cerinus IFO 3263 a IFO 3266.In accordance with the invention, it has now been found that the microorganism Acetobacter cerinus can utilize an initial glucose concentration in the fermentation medium of above 20 o / o and up to about 30% (w / v) in the production of 2,5-diketogluconic acid when at least 0.04% by weight of choline based on the amount of D-glucose in the medium is added to the fermentation broth. In particular, the invention provides a process for the production of 2,5-diketogluconic acid at high concentrations by aerobic cultivation of Acetobacter cerinus in a fermentation medium containing D-glucose at an initial concentration above 20% and up to 30% (w / v and choline in amounts of 0.04 to 0.5) The initial glucose concentration in the fermentation broth is preferably from 25 to 30% (w / v). The cultivation is preferably carried out at a temperature of 25 to 30 ° C, preferably at a pH in the fermentation broth. Preferred strains of microorganisms are Acetobacter cerinus or Acetobacter cerinus IFO 3263 and IFO 3266.

2,5-Diketoglukonová kyselina se způsobem podle vynálezu vyrábí v dobrých výtěžcích bez vzniku významnějších množství zbarvených látek a při poměrně krátké fermentační době. Obecně dostupná je řada kmetnů Acetobacter cerinus, včetně IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 a IFO 3269, a všechny tyto kmeny je možno použít při práci způsobem podle vynálezu k výrobě 2,5-dikeitoglukonové kyseliny. Zvlášť výhodnými kmeny jsou IFO 3263 a IFO 3266. Je třeba zdůraznit, že mutanty těchto mikroorganismů, vyrobené běžnými metodami, jako ozářením rentgenovými paprsky nebo ultrafialovými paprsky, působením derivátů dichlordiethylsulfidu apod., je možno rovněž použít při práci způsobem podle vynálezu a tyto mutanty do rožsahu vynálezu také spadají.The 2,5-diketogluconic acid is produced by the process according to the invention in good yields without producing significant amounts of colored substances and at a relatively short fermentation time. A variety of Acetobacter cerinus strains are generally available, including IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268, and IFO 3269, all of which strains can be used in the method of the invention for the production of 2,5-dikeitogluconic acid. Particularly preferred strains are IFO 3263 and IFO 3266. It should be emphasized that mutants of these microorganisms produced by conventional methods such as X-ray or ultraviolet radiation, dichlorodiethylsulfide derivatives and the like can also be used in the process of the invention and these mutants can be used. They are also within the scope of the invention.

Acetobacter cerinus se kultivuje v prostředí, v němž hlavním zdrojem uhlíku je D-glukóza. Je pochopitelné, že v souladu s běžnou praxí při fermentacích obsahuje toto fermentační prostředí rovněž zdroje du215140 siku, draslíku, fosforu a hořčíku. Výraz „fermentační prostředí“ v tomto textu tedy definuje prostředí obsahující takovéto sloučeniny. Při použití mikroorganismů druhu Acetobacter cerinus při práci způsobem podle vynálezu není nutno používat drahých organických zdrojů dusíku, jako jsou pepton nebo masový výluh. Dusík je možno· ekonomicky dodat použitím močoviny nebo anorganických zdrojů dusíku, jako jsou síran amonný, dusičnan amonný, fosforečnan amonný nebo podobné soli, obecně v množství zhruba od 0,1 g do 2 g na litr fermentačního prostředí. V případě, že se rovněž používá nikotinová kyselina jako růstový faktor, přidává se obecně v množství zhruba od 0,2 do 10 mg na litr fermentačního prostředí. Obsah draslíku, hořčíku a fosforu je možno snadno· zajistit přidáním solí, jako fosforečnanu draselného, fosforečnanu amonnéhc, síranu hořečnatého a podobných solí, obecně v množství zhruba od 0,1 do 1 g na litr fermentačnlho prostředí. Co se týče složení fermentačního prostředí, jsou pochopitelně možné značné odchylky. Odborníkům jsou běžně známá další vhodná prostředí a vynález není nijak omezen pouze na použití shora popsaného konkrétního prostředí nebo na použití prostředí popsaných v příkladech provedení.Acetobacter cerinus is cultivated in an environment in which D-glucose is the main source of carbon. It is understood that, in accordance with conventional fermentation practice, this fermentation medium also contains sources of du215140 si, potassium, phosphorus, and magnesium. Thus, the term "fermentation broth" defines an environment containing such compounds. When microorganisms of the species Acetobacter cerinus are used in the process according to the invention, it is not necessary to use expensive organic sources of nitrogen, such as peptone or meat liquor. Nitrogen can be economically supplied using urea or inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate or the like, generally in an amount of about 0.1 g to 2 g per liter of fermentation broth. When nicotinic acid is also used as a growth factor, it is generally added in an amount of about 0.2 to 10 mg per liter of fermentation broth. The potassium, magnesium and phosphorus contents are readily assured by the addition of salts such as potassium phosphate, ammonium phosphate, magnesium sulfate and the like, generally in an amount of about 0.1 to 1 g per liter of fermentation broth. Of course, considerable variations in the composition of the fermentation broth are possible. Other suitable environments are well known to those skilled in the art and the invention is not limited to the use of the particular environment described above or to the environments described in the examples.

V souhlase s vynálezem obsahuje fermentační prostředí D-glukózu ve vyšších počátečních koncentracích., než jaké byly možné dříve bez škodlivého vlivu na mikroorganismy používané při fermentaci. Konkrétně se počáteční koncentrace D-glukózy ve fermentačním prostředí používaném při práci způsobem podle vynálezu pohybuje v rozmezí nad cca 20 % a do cca 30 % (hmotnost/objeimj, zejména pak zhruba od 25 do 30 % (hmotnost/objem j. Je-li to žádoucí, lze glukózu přidávat ve formě cerelosy (monohydrát. D-glukótzyj.In accordance with the invention, the fermentation broth contains D-glucose at higher initial concentrations than previously possible without adversely affecting the microorganisms used in the fermentation. In particular, the initial concentration of D-glucose in the fermentation broth used in the process of the invention is in the range above about 20% and up to about 30% (w / v), especially about 25 to 30% (w / v). if desired, glucose may be added in the form of cerellose (monohydrate. D-glucose.

Aby mikroorganismy druhu Acetobacter cerinus mohly tak vysoké koncentrace glukózy ve fermentačním prostředí snést a využít, je nutno k fermentačnímu prostředí přidat cholin v množství nejméně 0,04 % hmotnostního, vztaženo na počáteční množství D-glukózy ve fermentačním prostředí. Je-li to žádoucí, lze použít poměrně vysoká množství cholinu, například zhruba 0,5 % hmotnostního, vztaženo na počáteční koncentraci D-glukózy ve fermentačním prostředí, použití více než cca 0,1 % hmotnostního cholinu je však jen málo výhodné a obecně se dává přednost použití zhruba od 0,04 do 0,06 % hmotnostního. Cholin je možno přidat buď jako volnou bázi, nebo jako sůl, například jako cholinchlorid, cholinhydrogenkarbonát, cholincitrát, cholinglukonáf nebo podobnou sůl. Výhodnou solí je cholinchlorid. Koncentrace cholinu, jak se v tomto textu uvádí, se vztahuje na cholin ve formě volné báze. Malou část potřebného cholinu je možno dodat, je-li to žádoucí, přidáním kukuřičného výluhu do fermentačního prostředí. Kukuřičný výluh, který se ve fermentačních prostředích používá jako zdroj vitamínů a minerálních látek, obecně obsahuje pouze cca 0,5 až 3 mg cholinu na 1 g kukuřičného výluhu.In order for the microorganisms of the species Acetobacter cerinus to withstand and utilize such high glucose concentrations in the fermentation broth, choline must be added to the fermentation broth in an amount of at least 0.04% by weight, based on the initial amount of D-glucose in the fermentation broth. If desired, relatively high amounts of choline, for example about 0.5% by weight based on the initial D-glucose concentration in the fermentation broth, may be used, but the use of more than about 0.1% by weight choline is little preferred and generally preferably from about 0.04 to 0.06% by weight. Choline may be added either as the free base or as a salt, for example, as choline chloride, choline hydrogen carbonate, cholincitrate, cholingluconap, or the like. The preferred salt is choline chloride. The choline concentration as used herein refers to the free base choline. A small portion of the necessary choline can be supplied, if desired, by adding the corn liquor to the fermentation broth. Corn leach, which is used as a source of vitamins and minerals in fermentation media, generally contains only about 0.5 to 3 mg choline per 1 g of corn leach.

Obecně se však nemá používat více než cca 5 g kukuřičného výluhu na litr fermentačního prostředí, protože kukuřičný výluh obsahuje barevné látky a přídavek více než cca 5 g kukuřičného výluhu na litr fermentačního prostředí znesnadňuje izolaci a čištění 2,5-diketoglukonové kyseliny. V souhlase s tím se tedy kukuřičný výluh může použít, je-li to žádoucí, pouze jako zdroj malé části cholinu potřebného pro fermentaci, přičemž zbývající část potřebného množství cholinu se k fermentačnímu prostředí přidá, jako cholinová báze nebo její sůl, jak je popsáno výše.In general, however, no more than about 5 g of corn liquor per liter of fermentation medium should be used, as the corn liquor contains colored substances and the addition of more than about 5 g corn liquor per liter of fermentation medium makes it difficult to isolate and purify 2,5-diketogluconic acid. Accordingly, the corn steep liquor can, if desired, only be used as a source of a small portion of the choline required for fermentation, with the remainder of the required amount of choline added to the fermentation medium, such as the choline base or salt thereof, as described above. .

Fermentace se obecně provádí při teplotě zhruba od 20 do 35 °C, s výhodou, od 25 do 30 °C, nejvýhodněji při teplotě okolo 28° Celsia. Počáteční pH kultivačního prostředí se pohybuje zhruba od 3,5 do 7,5, s výhodou zhruba od 5 do 6. V průběhu fermentace je žádoucí «držovat pH v tomto rozmezí, s výhodou na hodnotě okolo 5,5, a to· například přidáváním roztoku hydroxidu alkalického kovu, s výhodou roztoku hydroxidu sodného. Alternativně je možno k regulaci pH použít uhličitan alkalického· kovu nebo kovu alkalické zeminy, s výhodou uhličitan vápenatý, který se k tomuto účelu přidává do připraveného prostředí po reakci v autoklávu, obecně v množství zhruba od 20 do 30 g na 10 g glukózy. Je pochopitelné, že 2,5-d.iketoglukonová kyselina bude v takovémto fermentačním prostředí vznikat ve formě odpovídající soli s alkalickým kovem nebo kovetm alkalické zeminy, jako soli sodné nebo vápenaté, a že takovéto soli spadají v tomto textu rovněž do rozsahu výrazu „2,5-di'ketoglukonová kyselina“.The fermentation is generally carried out at a temperature of about 20 to 35 ° C, preferably 25 to 30 ° C, most preferably at about 28 ° C. The initial pH of the culture medium is from about 3.5 to 7.5, preferably from about 5 to 6. During fermentation, it is desirable to maintain the pH in this range, preferably at about 5.5, e.g. an alkali metal hydroxide solution, preferably sodium hydroxide solution. Alternatively, an alkali metal or alkaline earth metal carbonate, preferably calcium carbonate, may be used to control the pH, which is added to the prepared medium after the autoclave reaction, generally in an amount of about 20 to 30 g per 10 g glucose. It is to be understood that 2,5-diiketogluconic acid will be formed in such a fermentation environment in the form of the corresponding alkali metal or alkaline earth metal salt, such as sodium or calcium salts, and that such salts are also within the scope of the term "2 , 5-di-ketogluconic acid '.

Po inokulaci se fermentační prostředí míchá, například mechanickým míchadlem, a větrá, s výhodou rychlostí cca 0,5 až 1 objelm vzduchu na 1 objem fermentační půdy za minutu. Je-li to žádoucí, lze během fermentace přidávat další glukózu k náhradě určitého množství glukózy spotřebovaného při fermentaci, čímž se zvýší celková koncentrace 2,5-diketoglukonové kyseliny obsažené ve fermentační půdě.After inoculation, the fermentation broth is stirred, for example with a mechanical stirrer, and ventilated, preferably at a rate of about 0.5 to 1 volume of air per 1 volume of fermentation broth per minute. If desired, additional glucose may be added during fermentation to replace some of the glucose consumed in the fermentation, thereby increasing the total concentration of 2,5-diketogluconic acid contained in the fermentation broth.

Fermentace se provádí až do dosažení žádaného výtěžku. Tak například při použití Acetobacter cerinus IFO 3263 nebo 3266 a při fermentační době cca 40 až 50 hodin vzniká 2,5-dlketoglukonová kyselina ve výtěžku cca 90 až 95 %, vztaženo na D-glukózu. Je ovšem třeba počítat s určitými odchylkami v reakčních dobách a výtěžcích, a to v závislosti na použitém km.eni mikroorganismu, na koncentraci glukózy ve fermentačním prostředí a na teplotě, při níž se kultivace provádí.The fermentation is carried out until the desired yield is obtained. For example, using Acetobacter cerinus IFO 3263 or 3266 and a fermentation time of about 40 to 50 hours produces 2,5-dlketogluconic acid in a yield of about 90 to 95% based on D-glucose. However, certain variations in reaction times and yields are to be expected, depending on the microorganism strain used, the glucose concentration in the fermentation medium and the temperature at which the cultivation is carried out.

Zcela nezávazně se předpokládá, že kon215140 verze glukózy na 2,5-di.ketoglukonovou kyselinu probíhá těmito sledy reakcí:It is quite tentative that the con215140 version of the glucose to 2,5-di-ketogluconic acid proceeds as follows:

glukóza -> 2-ketoglukonová kyselina 2,5-dikefoglukonová kyselina glukóza -> 5-iketoglukonová kyselina -» 2,5-diiketoglukonová kyselina.glucose -> 2-ketogluconic acid 2,5-dicefogluconic acid glucose -> 5-iketogluconic acid - »2,5-diiketogluconic acid.

Intermediární 2-ketoglukonovou a 5-ketoglukonovou kyselinu a 2,,5-diketoglukonovou. kyselinu je možno oddělit papírovou chromatografii za použití chromatografického papíru Whatman č. 1 a 4 a rozpouštědlového systému methylethylketon-aceton-kyselina mrdvenčí-voda (80:6:2:12], Skvrny jednotlivých kyselin se delegují postřikem 0,2% etbanoiickým roztokem o-fenylendiamlnu, obsahujícím 1 o/_o kyseliny dusičné, a záhřevem zhruba na 70 °C (5-ketoglukonová kyselina — modré zbarvení; 2-ketoglukonová kyselina — žluté zbarvení; 2,5-diketoglukonová kyselina — zelené zbarvení]. Je možno použít rovněž vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Za použití shora uvedených metod je možno sledovat postup fermentace.Intermediate 2-ketogluconic acid and 5-ketogluconic acid and 2,5-diketogluconic acid. the acid can be separated by paper chromatography using Whatman No. 1 and 4 chromatography paper and a methylethylketone-acetone-formic acid-water solvent system (80: 6: 2: 12). Spots of each acid are delegated by spraying with 0.2% ethanolic solution -fenylendiamlnu containing 1 o / _o nitric acid and by heating to about 70 ° C (5-ketogluconic acid - blue coloration; 2-ketogluconic acid - yellow coloring; 2,5diketogluconic acid - green color]. It is also possible to use Using the above methods, the fermentation process can be monitored.

2,5-Dikeitoglnkono'vou kyselinu je možno oddělit a izolovat z výsledné fermentační půdy libovolným běžným, o sobě známým způsobem. Tak například je možno fermentační půdu zfiltrovat, hodnotu pH vodného filtrátu upravit přidáním minerální kylseliny, jako kyseliny chlorovodíkové, zhruba na až 2,5, roztok zahustit a k zbytku přidat nižší alkanol, s výhodou ethanol nebo methanol. Stáním se ze vzniklého roztoku vysráží v pevné formě 2,5-diketoglukonová kyselina jako vápenatá nebo sodná sůl; 2,5-diketogluikonovou kyselinu je možno ze soli získat působením nejprve zředěné minerální kyseliny a pak například katexu, jako sulfonované pryskyřice, například katexu Dowex 50.The 2,5-dikeitogenic acid can be separated and isolated from the resulting fermentation broth by any conventional method known in the art. For example, the fermentation broth may be filtered, the pH of the aqueous filtrate adjusted to about 2.5 by adding a mineral acid such as hydrochloric acid, the solution concentrated, and a lower alkanol, preferably ethanol or methanol, added to the residue. On standing, 2,5-diketogluconic acid, such as a calcium or sodium salt, precipitates in solid form; The 2,5-diketogluiconic acid can be obtained from the salt by first treating with a dilute mineral acid and then, for example, with a cation exchange resin, such as a sulfonated resin, for example with Dowex 50 cation exchange resin.

Je-li to žádoucí, lze fermentační půdu příslušně zpracovávat k přeměně vzniklé 2,5-diketoglukonové kyseliny na jiné žádané produkty, například fermentativní redukcí na 2-ketogulonovou kyselinu, jak je popsáno v amerických patentech čís. 3 922 194,If desired, the fermentation broth can be appropriately treated to convert the resulting 2,5-diketogluconic acid into other desired products, for example, by fermentative reduction to 2-ketogulonic acid, as described in U.S. Pat. 3 922 194

959 076 nebo 3 963 574. Alternativně je možno zfiltrovanou fermentační půdu použít jako vhodný reakční roztok pro redukci 2,5-diketoglukonové kyseliny vedoucí k vzniku roztoku obsahujícího kyselinu 2-ketogulonovou. Tato· redukce se provádí reakcí s borohydridem alkalického kovu, jak je popsáno v americkém patentu č. 4 159 990; 2-ketogulonová kyselina vyrobená těmito reakcemi se snadno převede známým způsobem na kyselinu askorbovou, například záhřevem methylesteru kyseliny 2-ketogulonové v přítomnosti báze.959 076 or 3 963 574. Alternatively, the filtered fermentation broth can be used as a suitable reaction solution for reducing 2,5-diketogluconic acid resulting in a solution containing 2-ketogulonic acid. This reduction is carried out by reaction with an alkali metal borohydride as described in U.S. Patent No. 4,159,990; The 2-ketogulonic acid produced by these reactions is readily converted to ascorbic acid in a known manner, for example by heating 2-ketogulonic acid methyl ester in the presence of a base.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

Příklad 1Example 1

Připraví se toto vodné inokulační prostředí:The following aqueous inoculation medium is prepared:

6ložika g/l monohydrát glukózy 25 kukuřičný výluh 5 dihydrogenfosforečnan draselný 0,5 monohydrogeinfosforečnan draselný 0,5 heptahydrát síranu hořečnatého 0,2 uhličitan vápenatý 7,0 pH 6,2.6 component g / l glucose monohydrate 25 maize extract 5 potassium dihydrogen phosphate 0.5 potassium monohydrate phosphate 0,5 magnesium sulphate heptahydrate 0,2 calcium carbonate 7,0 pH 6,2.

Třepací baňka obsahující 1 litr tohoto prostředí se 30 minut zahřívá v autoklávu na 121 °C. Do baňky se vnesou buňky Acetobacter cerinus IFO 3263, vypěstované na šikmém agairu (5 ml z 20 ml sterilní vodné suspenze], a baňka se pak cca 24 hodiny třepe na rotační třepačce při teplotě zhruba 28 °C. Hodnota pH ochlazeného prostředí činí 5,0.The shake flask containing 1 liter of this medium was heated in an autoclave at 121 ° C for 30 minutes. Acetobacter cerinus IFO 3263 cells grown on slanted agair (5 ml of 20 ml sterile aqueous suspension) were introduced into the flask, and the flask was shaken on a rotary shaker at about 28 ° C for about 24 hours. 0.

Příslušný podíl této kultury postačující k dosažení 10% (objem/objemj inokula se vnese do čtyřlitrové míchané fermentační nádoby, obsahující 2 litry tohoto produkčního prostředí:An appropriate proportion of this culture sufficient to reach 10% (v / v inoculum) is placed in a 4-liter stirred fermentation vessel containing 2 liters of the following production medium:

složka monohydrát glukózy 225 g/l kukuřičný výluh 0,5 g/l monohydrogenfosforečnan amonný 0,5 g/l dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g/l heptahydrát síranu hořečnatého 0,5 g/l močovina 1,0 g/l cholinchlorid 100 mg/1 nikotinová kyselina 10 mg/1 pentahydrát síranu měďnatého 2,0 mg/1 protipěnové činidlo P-2000 1,0 mg/1 pH 6,0.glucose monohydrate 225 g / l corn steep liquor 0.5 g / l ammonium monohydrogen phosphate 0.5 g / l potassium dihydrogen phosphate 1.5 g / l magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / l urea 1.0 g / l choline chloride 100 mg / 1 nicotinic acid 10 mg / l copper sulfate pentahydrate 2.0 mg / l anti-foaming agent P-2000 1.0 mg / l pH 6.0.

Fermentace se provádí při teplotě 28 °C za míchání při 1700 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním 20% hydroxidu sodného udržuje na 5,5. Po čtyřicetiosmihodinové fermentaci se ve výtěžku 95 % zíslká 2,5-diketoglukonová kyselina ve formě sodné soli.The fermentation is carried out at 28 ° C with stirring at 1700 rpm and aeration at a rate of 1.0 volume of air per 1 volume of fermentation medium per minute. The pH is maintained at 5.5 by the addition of 20% sodium hydroxide. After forty-eight hours of fermentation, 2,5-diketogluconic acid was obtained in 95% yield as the sodium salt.

Příklad 2Example 2

složka g/l monohydrát glukózy 25 kukuřičný výluh 5 dihydrogenfosforečnan draselný 0,5 monohydrogenfosforečnan draselný 0,5 heptahydrát síranu hořečnatého 0,2 uhličitan vápenatý 7,0.component g / l glucose monohydrate 25 maize extract 5 potassium dihydrogen phosphate 0,5 potassium monohydrogen phosphate 0,5 magnesium sulphate heptahydrate 0,2 calcium carbonate 7,0.

Třejpací baňka obsahující 1 litr tohoto prostředí se 30 minut zahřívá v autoklávu na 121°C. Do baňky se vnesou buňky Acetobacter cerinus IFO 3263, vypěstované na šitoméim agaru (5 ml z 20 ml sterilní vodné .susipeinze), a baňka se pak cca 24 hodiny třeipe na rotační třepačce při teplotě zhruba 28 °C. Hodnota pH ochlazeného prostředí Činí 5,0.A shake flask containing 1 liter of this medium is heated in an autoclave at 121 ° C for 30 minutes. Acetobacter cerinus IFO 3263 cells grown on shaded agar (5 ml of 20 ml sterile aqueous susipeinze) were introduced into the flask, and the flask was shaken on a rotary shaker at about 28 ° C for about 24 hours. The pH of the cooled medium is 5.0.

Příslušný podíl této kultury postačující k dosažení 10% (objem/objem] inokula se vnese do čtyřlitrové míchané fermentační nádoby, obsahující 2 litry tohoto prostředí: složka (pro 2. stupeň) g/1 monohydírát glukózy 100 kukuřičný výluh 0,5 monohydrogemfosforečnan amonný 0,5 dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 heptahydíráí síranu hořečnatého 0,5 močovina 1,0 nikotinová kyselina 10 mg pentahydrát síranu měďnatého 2,0 mg cholinchlorid 500 mgAn appropriate proportion of this culture sufficient to reach 10% (v / v) of the inoculum is placed in a 4 liter stirred fermentation vessel containing 2 liters of this medium: component (for stage 2) g / 1 glucose monohydrate 100 corn extract 0.5 ammonium monohydrogen phosphate 0 1,5 potassium dihydrogen phosphate 1,5 heptahydrate of magnesium sulphate 0,5 urea 1,0 nicotinic acid 10 mg copper sulphate pentahydrate 2,0 mg choline chloride 500 mg

P-2000 0,5 ml.P-2000 0.5 ml.

Tento druhý stupeň se provádí při teplotě 28 °C za míchání při 1700 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objetou vzduchu na 1 objem prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním ,20% roztoku hydroxidu sodného udržuje na 5,5.This second stage is carried out at 28 ° C with stirring at 1700 rpm and aeration at a rate of 1.0 by volume of air per 1 volume of environment per minute. The pH is maintained at 5.5 by the addition of 20% sodium hydroxide solution.

Po 20 hodinách se příslušný podíl této kultury, postačující k dosažení 10% (objeim/objem) inokula, vnese do· čtrnáctilitrového míchaného fermentoru obsahujícího 6 1 tohoto produkčního prostředí:After 20 hours, an appropriate fraction of this culture sufficient to reach 10% (v / v) inoculum is added to a 14 liter stirred fermenter containing 6 L of the following production medium:

složka component g/i g / i monohydírát glukózy glucose monohydrate 334 334 kukuřičný výluh corn extract 0,5 0.5 toonohydrogenfoísforečnan amonný ammonium toonohydrogenphosphate 0,58 0.58 dihydrogénf oisforečnan draselný potassium dihydrogen phosphate 1,5 1.5 heptahydrát síranu hořečnatého magnesium sulfate heptahydrate 0,5 0.5 močovina urea 1,0 1.0 nikotinová kyselina nicotinic acid 10,0 mg 10.0 mg pentahydrát síranu měďnatého copper sulphate pentahydrate 2,0 mg 2.0 mg cholinchlorid choline chloride 150 mg 150 mg P-2000 P-2000 0,5 ml. 0.5 ml.

Fermentace se provádí při teplotě 28 ^;C za míchání při 750 otáčkách za minutu a za provzdušňování rychlostí 1,0 objemu vzduchu na 1 objem prostředí za minutu. Hodnota pH se přidáváním 20% roztoku hydroxidu sodného udržuje na 5,5. Po fermentaci trvající 65 až 70 hodin se ve výtěžku 95 proč. získá 2,5-diketoglukonová kyselina ve formě sodné soli.The fermentation is carried out at a temperature of 28 ^; C while stirring at 750 rpm and aerating at 1.0 air volume per minute medium. The pH is maintained at 5.5 by the addition of 20% sodium hydroxide solution. After fermentation lasting 65 to 70 hours, the yield is 95%. 2,5-diketogluconic acid is obtained as the sodium salt.

Příklad 3Example 3

Za použití postupu popsaného v příkladu se testují kmeny IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 a 3269 druhu Acetobacter cerinus. Ve všech případech činí fermentační doba 48 hodin. V každém z těchto případů obsahuje produkt fermentace 2,5-diketoglukonovou kyselinu ve výtěžku vyšším než 50 %, sípolu s určitým množstvím nezireagované intermediární 2-ketoglukonové kyseliny a 5-ketoglukonové kyseliny. Při použití těchto kmenů mikroorganismu Acetobacter cerinus je možno dosáhnout vyšších výtěžků žádané 2,5-díketoglukonové kyseliny prodloužením doby fermentace.Using the procedure described in the example, IFO strains 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 and 3269 of Acetobacter cerinus are tested. In all cases, the fermentation time is 48 hours. In each of these cases, the fermentation product contains 2,5-diketogluconic acid in a yield of more than 50%, sapol with some unreacted intermediate 2-ketogluconic acid and 5-ketogluconic acid. Using these strains of microorganism Acetobacter cerinus, higher yields of the desired 2,5-diacetogluconic acid can be achieved by prolonging the fermentation time.

Claims

A process for the production of 2,5-diketogluconic acid by aerobic cultivation of Acetobacter cerinus in a glucose-containing medium, characterized in that D-glucose is used, which is present in an initial concentration of from 20 to 30% w / v, preferably from 25 to 30%. 30% w / v, the fermentation broth also comprising choline in an amount of 0.04 to 0.5% w / w based on the initial amount of D-glucose in the broth.

2. A process according to claim 1 wherein the fermentation medium comprises choiin in an amount of from 0.04 to 0.1% by weight.