Procédé de production de l'acide 2,5-
dicétogluconique La présente invention concerne la préparation de l'acide 2,5-dicétogluconique, qui est utile comme composé intermédiaire pour la production de l'aride ascorbique. Une solution d'acide 2,5-dicétogluconique peut être réduite sélectivement en acide 2-cétogulonique que l'on peut convertir en acide ascorbique. La réduction de l'acide 2,5dicétogluconique peut être effectuée par réduction avec un borohydrure de métal alcalin, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 4 159 990, ou par réduction par fermentation comme décrit, par exemple, dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3 922 194, N[deg.] 3 959 076 et
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utile comme composé intermédiaire pour la préparation de l'acide coménique par chauffage en présence d'un acide, comme décrit, par exemple, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3 654 316.
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été produit par plusieurs espèces différentes de bactéries telles qu'Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens et Pseudomonas sesami. Toutefois, l'utilisation de ces micro-organismes n'est pas satisfaisante du point de vue industriel à cause des rendements relativement faibles en acide 2,5-dicétogluconique, de la longueur relative des durées de fermentation et de la production de grandes quantités de pigments bruns ou brun-jaune comme sous-produits de la culture, ce qui réduit la pureté de l'acide 2,5dicétogluconique désiré.
Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3 790 444 concerne la production d'acide 2,5-dicétogluconique, sans la formation simultanée de pigment brun, par une espèce nouvelle appelée Acetobacter fraqum ATCC N[deg.] 21 409.
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N[deg.] 79 668 déposée le 28 Septembre 1979 concerne un procédé de production d'acide 2,5-dicétogluconique donnant de bons rendements sans la formation de matière pigmentée, par propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu contenant du glucose. Bien qu'on puisse utiliser des quantités totales de glucose allant d'environ 2,5 à environ
20 % (poids/volume), on a trouvé que des concentrations initiales en glucose de plus d'environ 15 % dans le milieu ne pouvaient pas être tolérées par les micro-organismes.
Par conséquent, des quantités totales de glucose supérieures à environ 15 % (en poids/volume) peuvent seules être utilisées par conduite de la fermentation à une concentration initiale en glucose d'environ 10 à 15 % (en poids/volume) et par des additions subséquentes de glucose au milieu fermentescible au cours de la fermentation, la concentration en glucose dans le milieu ne dépassant jamais environ 15 % (en poids/volume). C'est pourquoi, jusqu'à présent, les concentrations totales ou
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été limitées par la concentration initiale relativement faible en glucose que l'on peut utiliser dans le milieu de fermentation. La productivité de procédés utilisant d'autres micro-organismes pour la préparation de l'acide 2,5dicétogluconique, comme décrit ci-dessus, est également limitée par la nécessité d'utiliser une concentration initiale relativement faible en glucose dans le milieu de fermentation.
Il est évident qu'un procédé dans lequel des concentrations initiales en glucose de plus d'environ 15 %
(en poids/volume), notamment des concentrations dépassant
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organismes pour la préparation de l'acide 2,5-dicéto-
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de production et permettrait de réaliser des économies substantielles de mise en oeuvre. Un tel procédé éviterait également l'éventualité d'une contamination du milieu de fermentation, qui peut exister lorsque les capacités de production sont élevées par l'introduction de quantités additionnelles de glucose au cours de la fermentation.
Conformément à la présente invention, on vient de découvrir que des concentrations initiales en glucose supérieures à 20 % et pouvant aller jusqu'à environ 30 % (en poids/volume) dans un milieu de fermentation peuvent être utilisées par le micro-organisme Acetobacter cerinus pour la production de l'acide 2,5-dicétogluconique lorsqu'on ajoute au moins environ 0,04 % en poids de choline au milieu de fermentation, sur la base de la quantité de D-glucose contenue dans ce milieu.
Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé de production d'acide 2,5dicétogluconique en fortes concentrations dans le milieu de fermentation par propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu de fermentation contenant du D-glucose à une concentration initiale supérieure à environ 20 % et pouvant aller jusqu'à environ 30 % (en poids/volume) et de la choline en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de quantité de D-glucose contenue dans le milieu. La concentration initiale en glucose dans le milieu de fermentation est de préférence égale à environ 25-30 % (en poids/volume) . La propagation est de préférence conduite à une température de 25 à 30[deg.]C et à un pH d'environ 5 à 6. Les souches préférées d'Acetobacter cerinus sont Acetobacter cerinus IFO 3263 et IFO 3266. L'acide 2,5-dicétogluconique
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présente invention sans formation de quantités notables de matières pigmentées et en des périodes de fermentation relativement courtes. Plusieurs souches d'Acetobacter cerinus telles que IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 et IFO 3269 sont accessibles au public et peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention pour la préparation de l'acide 2,5dicétogluconique. Des souches particulièrement appréciées sont les souches IFO 3263 et IFO 3266. Il y a lieu de remarquer que des mutants de ces micro-organismes produits par des méthodes classiques, par exemple par irradiation aux rayons X ou à la lumière ultraviolette, traitement avec des moutardes azotées, etc., sont également utiles dans le procédé de l'invention et sont compris dans son cadre.
L'espèce Acetobacter cerinus est cultivé dans un milieu dont la source principale de carbone est le D-glucose. Il y a lieu de remarquer que, conformément à la pratique classique de fermentation, le milieu fermentescible contient également des sources d'azote, de potassium, de phosphore et de magnésium. L'expression "milieu fermentescible" utilisée dans le présent mémoire désigne un milieu contenant ces composés. Lorsqu'on utilise les micro-organismes de l'espèce Acetobacter cerinus dans le procédé de l'invention, il n'est pas nécessaire de recourir à des sources coûteuses d'azote organique telles que la peptone ou l'extrait de viande.
L'azote peut être produit de façon économique par l'utilisation d'urée ou de sources inorganiques d'azote, par exemple le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium ou des sels similaires, généralement en quantités allant d'environ 0,1 à 2 g/1 de milieu fermentescible, lorsque de l'acide nicotinique est aussi ajouté comme facteur de croissance, généralement en une quantité d'environ 0,2 à 10 mg/1 de milieu fermentescible. Le potassium, le magnésium et le phosphore sont aisément introduits par l'addition de sels tels que le phosphate de potassium, le phosphate d'ammonium, le sulfate de magnésium ou des sels similaires, généralement en quantités d'environ
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considérable de la composition du milieu fermentescible est toutefois possible. D'autres milieux convenables sont évidents pour l'homme de l'art et le procédé de l'invention ne doit nullement être limité à l'utilisation des milieux particuliers définis ci-dessus et dans les exemples qui suivent. Conformément au procédé de l'invention, le milieu fermentescible contient du D-glucose à des concentrations initiales plus fortes que cela n'a été possible jusqu'à présent sans effet nuisible sur le micro-organisme utilisé
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concentration initiale en D-glucose dans le milieu fermentescible utilisé dans le procédé de l'invention se situe dans une plage de plus d'environ 20 % à un maximum d'environ 30 % (poids/volume), notamment d'environ 25 à 30 %
(poids/volume). Le cas échéant, du D-glucose peut être ajouté sous la forme de cérélose (monohydrate de D-glucose).
Pour que les micro-organismes de l'espèce Acetobacter cerinus soient capables de tolérer et d'utiliser d'aussi fortes concentrations en glucose dans le milieu.
fermentescible, il est nécessaire d'ajouter de la choline à ce milieu en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de la quantité initiale de D-glucose dans le milieu fermentescible. Le cas échéant, on peut utiliser des proportions relativement grandes de choline, par exemple environ 0,5 % en poids sur la base de la concentration initiale en D-glucose dans le milieu fermentescible, bien qu'il y ait peu d'avantage à utiliser plus d'environ 0,1 % en poids de choline, et on préfère généralement une proportion de choline d'environ 0,04 à environ 0,06 % en poids. La choline peut être ajoutée soit sous la forme de la base libre, soit sous la forme d'un sel, par exemple le chlorure de choline, le bicarbonate de choline, le citrate de choline, le gluconate de choline ou des sels similaires. Le chlorure de choline constitue un sel apprécié.
La concentration en choline, telle qu'elle est définie dans le présent mémoire, est exprimée en choline base. Une petite partie de la choline nécessaire peut être introduite, le cas échéant, par
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fermentescible. L'extrait soluble de mais, qui a été utilisé dans des milieux fermentescibles comme source de vitamines et de sels minéraux, ne renferme généralement qu'environ 0,5 à 3 mg de choline par gramme d'extrait. Toutefois, on n'utilise ordinairement pas plus d'environ 5 g d'extrait soluble de mais par litre de milieu fermentescible, attendu que l'extrait soluble de mais contient des corps colorés et que l'addition de plus d'environ 5 g de cet extrait par litre de milieu fermentescible rend plus difficiles l'isolement et la
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conséquent, l'extrait soluble de mais ne peut être utilisé, le cas échéant, que comme source d'une petite proportion de la choline nécessaire à la fermentation et le reste de la quantité désirée de choline est ajouté au milieu fermentescible sous la forme de choline base ou d'un sel de ce composé, comme décrit ci-dessus.
La fermentation est généralement conduite à une
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notamment à environ 28[deg.]C. Le pH initial d'un milieu de culture se situe dans la plage d'environ 3,5 à 7,5, de préférence d'environ 5 à 6. Au cours de la fermentation, le pH est avantageusement maintenu dans cette plage, de préférence à environ 5,5, par exemple par l'addition d'un hydroxyde de métal alcalin, de préférence une solution d'hydroxyde de sodium. A titre de variante, un carbonate de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux, de préférence le carbonate de calcium, peut être utilisé pour ajuster le pH et on l'ajoute à cette fin lorsqu'on effectue l'appoint après l'autoclavage, en une quantité suffisante pour ajuster le pH désiré, généralement en quantité d'environ 20 à 30 g/100 g de glucose.
Il y a lieu de remarquer que l'acide 2,5-dicétogluconique est produit dans de tels milieux fermentescibles sous la forme des sels correspondants de métaux alcalins ou alcalino-terreux tels que les sels de sodium ou de calcium et que ces sels sont couverts par le terme "acide 2,5-dicétogluconique" utilisé dans le présent mémoire.
Après l'inoculation, le milieu fermentescible est agité par exemple à l'aide d'un agitateur mécanique et
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par volume de bouillon fermentescible par minute. Le cas échéant, on peut ajouter encore du glucose au cours de la fermentation pour en remplacer une partie de celui qui a été utilisé dans la fermentation, de manière à accroître ainsi la concentration totale en acide 2,5-dicétogluconique obtenu dans le bouillon.
La fermentation est poursuivie jusqu'à ce que le rendement désiré ait été obtenu. Par exemple, lorsqu'on utilise Acetobacter cerinus IFO 3263 ou 3266, un temps de
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d'environ 90 à 95 % d'acide 2,S-dicétogluconique sur la base du D-glucose. Toutefois, on doit s'attendre à une certaine variation des durées de réaction et des rendements selon la souche particulière du micro-organisme, la concentration en glucose dans le milieu fermentescible et la température de la culture.
Bien qu'on ne désire pas se limiter au mécanisme suivant, on suppose que la transformation du glucose en acide 2,5-di.cétogluconique s'effectue d'après le mécanisme suivant :
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gluconique.
Les acides 2-cétogluconique et 5-cétogluconique intermédiaires et l'acide 2,5-dicétogluconique peuvent être séparés par chromatographie sur papier "Whatman" N[deg.] 1 et N[deg.] 4 en utilisant comme mélange de solvants un mélange de méthyléthylcétone, d'acétone, d'acide formique et d'eau dans la proportion de 80:6:2:12. Les taches des excises sont: mises en évidence par pulvérisation d'une solution éthanolique à 0,2 % de o-phénylènediamine contenant 1 % d'acide nitrique et chauffage à environ 70[deg.]C (acide 5-cétogluconique-bleu ;
acide 2-cétogluconique-jaune ; acide 2,5-dicétogluconiquevert). On peut aussi utiliser la chromatographie en phase liquide sous haute pression. En utilisant les méthodes cidessus, on peut suivre la progression de la fermentation.
L'acide 2,5-dicétogluconique peut être séparé et recueilli dans le bouillon final de fermentation par toute opération classique connue de l'homme de l'art. Par exemple, le bouillon de fermentation peut être filtré, le pH du filtrat aqueux peut être ajusté à environ 2-2,5 par addition d'un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, puis la solution peut être concentrée et additionnée d'un alcool alkylique inférieur, de préférence l'éthanol ou le méthanol. Au repos, l'acide 2,5-dicétogluconique, sous la forme de son sel de calcium ou de sodium, se sépare de la solution sous la forme d'une matière solide.
L'acide 2,5-dicétogluconique peut être obtenu à partir du sel par traitement avec un acide minéral dilué, suivi par exemple d'un traitement avec une résine d'échange cationique telle qu'une résine acide sulfonique, par exemple la résine "Dowex 50"
(Dow Chemical Company).
Le cas échéant, le bouillon de fermentation peut être traité en vue de transformer l'acide 2,5-dicétogluconique formé en d'autres produits désirés, par exemple par réduction par fermentation en acide 2-cétogluconique comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3 922 194, N[deg.] 3 959 076 ou N[deg.] 3 963 574. A titre de variante, le bouillon de fermentation filtré peut être utilisé comme solution réactionnelle convenable pour réduire l'acide 2,5-dicétog luconique en une solution contenant de l'acide 2-cétogulonique par réaction avec un borohydrure de métal alcalin comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 4 159 990.
L'acide 2-cétogulonique produit dans ces réactions est facilement transformé en acide ascorbique par des moyens connus dans l'art antérieur, par exemple par chauffage de son ester méthylique en présence d'une base.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants. Toutefois, il a lieu de remarquer que l'invention n'est pas limitée aux détails particuliers donnés dans ces exemples.
Exemple 1
On prépare le milieu aqueux d'inoculation suivant :
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Un ballon d'agitation par secousses contenant 1 litre de milieu est autoclave pendant 30 minutes à 121[deg.]C. Des cellules d'Acetobacter cerinus IFO 3263 provenant d'une culture inclinée sur gélose nutritive (5 ml de suspension aqueuse stérile d'un volume de 20 ml) sont ajoutées au ballon qui est ensuite agité par secousses sur une secoueuse rotative à environ 28[deg.]C pendant environ 24 heures. Le pH du milieu refroidi est égal à 5,0.
Une portion aliquote de la culture, suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume, est ajoutée à un fermentateur de 4 litres sous agitation, contenant 2 litres du milieu de production suivant :
Ingrédient
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On conduit la fermentation à 28[deg.]C sous agitation à 1700 tr/min et avec aération à une vitesse de
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5,5 par addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde de sodium. L'acide 2,5-dicétogluconique est obtenu sous la forme du sel de sodium en un rendement de 95 % après une durée de fermentation de 48 heures.
Exemple 2
On prépare l'inoculum aqueux suivant :
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Un ballon d'agitation par secousses contenant 1 litre de milieu est autoclave pendant 30 minutes à 121[deg.]C. Des cellules d'Acetobacter cerinus IFO 3263 venant d'une culture inclinée sur gélose nutritive (5 ml d'une suspension aqueuse stérile de 20 ml) sont ajoutées au ballon qui est ensuite agité par secousses sur une secoueuse rotative à environ 28[deg.]C pendant environ 24 heures. Le pH du milieu refroidi est égal à 5,0.
Une portion aliquote de la culture suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume est ajoutée à un fermentateur de 4 litres équipé d'un agitateur et contenant 2 litres du milieu suivant :
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Le second stade est conduit à 28 [deg.]C sous agitation à 1700 tr/min et avec aération à une vitesse de
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5,5 par addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde de sodium.
Au bout de 20 heures, on ajoute une portion aliquote de culture suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume à un fermentateur sous agitation, de
14 litres de capacité, contenant 6 litres du milieu de production suivant :
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On conduit la fermentation à 28[deg.]C en agitant à
750 tr/min et en introduisant de l'air à une vitesse de 1,0 volume/volume de bouillon par minute. On maintient le pH à 5,5 par l'addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde de sodium. L'acide 2,5-dicétogluconique sous la
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après une durée de fermentation de 6570 heures.
Exemple 3
En suivant le mode opératoire de l'exemple 1, on teste des souches IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 et
3269 d'Acetobacter cerinus. Dans chaque cas, le produit de fermentation contient de l'acide 2,5-dicétogluconique en un rendement supérieur à 50 %, en même temps qu'un peu d'acide 2-cétogluconique et d'acide 5-cétogluconique intermédiaires non transformés. On peut obtenir de plus forts rendements en l'acide 2,5-dicétogluconique désiré en utilisant de plus longues durées de fermentation lorsqu'on choisit d'utiliser ces souches d'Acetobacter cerinus.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'acide 2,5-dicétcgluconique, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu de fermentation contenant du D-glucose à une concentration initiale supérieure à environ 20 % et allant jusqu'à environ
30 % (poids/volume) et de la choline en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de la quantité initiale de D-glucose contenue dans ledit milieu.
2,5- acid production process
The present invention relates to the preparation of 2,5-diketogluconic acid, which is useful as an intermediate compound for the production of ascorbic aride. A 2,5-diketogluconic acid solution can be selectively reduced to 2-ketogulonic acid which can be converted to ascorbic acid. The reduction of 2,5-diketogluconic acid can be carried out by reduction with an alkali metal borohydride, as described in United States patent N [deg.] 4,159,990, or by reduction by fermentation as described, for example, in United States patents N [deg.] 3,922,194, N [deg.] 3,959,076 and
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useful as an intermediate compound for the preparation of comenic acid by heating in the presence of an acid, as described, for example, in United States patent N [deg.] 3,654,316.
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was produced by several different species of bacteria such as Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens and Pseudomonas sesami. However, the use of these microorganisms is not satisfactory from an industrial point of view because of the relatively low yields of 2,5-diketogluconic acid, the relative length of the fermentation times and the production of large quantities of brown or yellow-brown pigments as culture by-products, which reduces the purity of the desired 2,5-diketogluconic acid.
United States patent N [deg.] 3,790,444 relates to the production of 2,5-diketogluconic acid, without the simultaneous formation of brown pigment, by a new species called Acetobacter fraqum ATCC N [deg.] 21,409.
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N [deg.] 79,668 filed on September 28, 1979 relates to a process for the production of 2,5-diketogluconic acid giving good yields without the formation of pigmented material, by aerobic propagation of Acetobacter cerinus in a medium containing glucose. Although total amounts of glucose can range from about 2.5 to about
20% (weight / volume), it was found that initial glucose concentrations of more than about 15% in the medium could not be tolerated by microorganisms.
Therefore, total amounts of glucose greater than about 15% (w / v) can only be used by conducting the fermentation to an initial glucose concentration of about 10-15% (w / v) and by subsequent additions of glucose to the fermentable medium during fermentation, the concentration of glucose in the medium never exceeding about 15% (w / v). This is why, up to now, the total concentrations or
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were limited by the relatively low initial glucose concentration that can be used in the fermentation medium. The productivity of processes using other microorganisms for the preparation of 2,5-diketogluconic acid, as described above, is also limited by the need to use a relatively low initial glucose concentration in the fermentation medium.
It is evident that a process in which initial glucose concentrations of more than about 15%
(w / v), including concentrations exceeding
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organisms for the preparation of 2,5-diketo acid
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of production and would allow substantial savings in implementation. Such a process would also avoid the possibility of contamination of the fermentation medium, which can exist when production capacities are high by the introduction of additional amounts of glucose during fermentation.
In accordance with the present invention, it has just been discovered that initial glucose concentrations greater than 20% and which can go up to approximately 30% (w / v) in a fermentation medium can be used by the microorganism Acetobacter cerinus for the production of 2,5-diketogluconic acid when at least about 0.04% by weight of choline is added to the fermentation medium, based on the amount of D-glucose contained in this medium.
More particularly, the present invention provides a process for the production of 2,5-diketogluconic acid in high concentrations in the fermentation medium by aerobic propagation of Acetobacter cerinus in a fermentation medium containing D-glucose at an initial concentration greater than approximately 20 % and up to about 30% (w / v) and choline in an amount of at least about 0.04% by weight based on the amount of D-glucose contained in the medium. The initial glucose concentration in the fermentation medium is preferably about 25-30% (w / v). The propagation is preferably carried out at a temperature of 25 to 30 [deg.] C and at a pH of about 5 to 6. The preferred strains of Acetobacter cerinus are Acetobacter cerinus IFO 3263 and IFO 3266. Acid 2, 5-diketogluconic
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present invention without formation of significant quantities of pigmented materials and in relatively short fermentation periods. Several strains of Acetobacter cerinus such as IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 and IFO 3269 are publicly available and can be used in the process. invention for the preparation of 2,5diketogluconic acid. Particularly preferred strains are strains IFO 3263 and IFO 3266. It should be noted that mutants of these microorganisms produced by conventional methods, for example by irradiation with X-rays or ultraviolet light, treatment with mustards nitrogen, etc. are also useful in the process of the invention and are included within its scope.
Acetobacter cerinus is cultivated in an environment whose main source of carbon is D-glucose. It should be noted that, in accordance with conventional fermentation practice, the fermentable medium also contains sources of nitrogen, potassium, phosphorus and magnesium. The expression "fermentable medium" used in the present specification designates a medium containing these compounds. When using microorganisms of the species Acetobacter cerinus in the process of the invention, it is not necessary to resort to expensive sources of organic nitrogen such as peptone or meat extract.
Nitrogen can be produced economically by the use of urea or inorganic sources of nitrogen, for example ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium phosphate or similar salts, generally in amounts ranging from about 0.1 to 2 g / l of fermentable medium, when nicotinic acid is also added as a growth factor, generally in an amount of about 0.2 to 10 mg / l of fermentable medium. Potassium, magnesium and phosphorus are readily introduced by the addition of salts such as potassium phosphate, ammonium phosphate, magnesium sulfate or the like, generally in amounts of about
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considerable of the composition of the fermentable medium is however possible. Other suitable media are obvious to a person skilled in the art and the process of the invention should in no way be limited to the use of the specific media defined above and in the examples which follow. In accordance with the process of the invention, the fermentable medium contains D-glucose at higher initial concentrations than has hitherto been possible without any harmful effect on the microorganism used
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initial concentration of D-glucose in the fermentable medium used in the process of the invention is in a range from more than about 20% to a maximum of about 30% (weight / volume), in particular from about 25 to 30 %
(weight / volume). If necessary, D-glucose can be added in the form of cerelose (D-glucose monohydrate).
So that the micro-organisms of the species Acetobacter cerinus are able to tolerate and use such high concentrations of glucose in the medium.
fermentable, it is necessary to add choline to this medium in an amount of at least about 0.04% by weight based on the initial amount of D-glucose in the fermentable medium. If desired, relatively large proportions of choline can be used, for example about 0.5% by weight based on the initial concentration of D-glucose in the fermentable medium, although there is little benefit from use more than about 0.1% by weight of choline, and generally a proportion of choline of about 0.04 to about 0.06% by weight is preferred. Choline can be added either in the form of the free base or in the form of a salt, for example choline chloride, choline bicarbonate, choline citrate, choline gluconate or the like. Choline chloride is a popular salt.
The choline concentration, as defined herein, is expressed as choline base. A small part of the necessary choline can be introduced, if necessary, by
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fermentable. The soluble corn extract, which has been used in fermentable media as a source of vitamins and minerals, generally contains only about 0.5 to 3 mg of choline per gram of extract. However, ordinarily no more than about 5 g of corn extract is used per liter of fermentable medium, since the soluble corn extract contains colored bodies and the addition of more than about 5 g of this extract per liter of fermentable medium makes it more difficult to isolate and
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Consequently, the soluble extract of corn can only be used, if necessary, as a source of a small proportion of the choline necessary for fermentation and the rest of the desired amount of choline is added to the fermentable medium in the form of choline base or a salt of this compound, as described above.
Fermentation is generally carried out at a
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especially around 28 [deg.] C. The initial pH of a culture medium is in the range of about 3.5 to 7.5, preferably about 5 to 6. During fermentation, the pH is advantageously maintained in this range, from preferably about 5.5, for example by the addition of an alkali metal hydroxide, preferably a sodium hydroxide solution. Alternatively, an alkali metal or alkaline earth metal carbonate, preferably calcium carbonate, can be used to adjust the pH and is added for this purpose when topping up after autoclaving , in an amount sufficient to adjust the desired pH, generally in an amount of about 20 to 30 g / 100 g of glucose.
It should be noted that 2,5-diketogluconic acid is produced in such fermentable media in the form of the corresponding salts of alkali or alkaline earth metals such as sodium or calcium salts and that these salts are covered by the term "2,5-diketogluconic acid" used herein.
After inoculation, the fermentable medium is stirred for example using a mechanical stirrer and
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per volume of fermentable broth per minute. If necessary, glucose can be added during fermentation to replace part of that used in fermentation, so as to increase the total concentration of 2,5-diketogluconic acid obtained in the broth.
Fermentation is continued until the desired yield has been obtained. For example, when using Acetobacter cerinus IFO 3263 or 3266, a time of
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about 90 to 95% 2, S-diketogluconic acid based on D-glucose. However, some variation in reaction times and yields should be expected depending on the particular strain of the microorganism, the concentration of glucose in the fermentable medium, and the temperature of the culture.
Although we do not want to limit ourselves to the following mechanism, it is assumed that the transformation of glucose into 2,5-di-ketogluconic acid takes place according to the following mechanism:
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gluconic.
The intermediate 2-ketogluconic and 5-ketogluconic acids and the 2,5-diketogluconic acid can be separated by chromatography on "Whatman" paper N [deg.] 1 and N [deg.] 4 using a mixture of solvents of methyl ethyl ketone, acetone, formic acid and water in the proportion of 80: 6: 2: 12. The spots of the excises are: highlighted by spraying with an ethanolic solution at 0.2% of o-phenylenediamine containing 1% of nitric acid and heating to approximately 70 [deg.] C (5-ketogluconic-blue acid;
2-ketogluconic-yellow acid; 2,5-diketogluconic acid green). It is also possible to use liquid chromatography under high pressure. Using the above methods, one can follow the progress of the fermentation.
2,5-Diketogluconic acid can be separated and collected in the final fermentation broth by any conventional operation known to those skilled in the art. For example, the fermentation broth can be filtered, the pH of the aqueous filtrate can be adjusted to about 2-2.5 by adding a mineral acid such as hydrochloric acid, then the solution can be concentrated and added with a lower alkyl alcohol, preferably ethanol or methanol. At rest, 2,5-diketogluconic acid, in the form of its calcium or sodium salt, separates from the solution in the form of a solid matter.
2,5-Diketogluconic acid can be obtained from the salt by treatment with a dilute mineral acid, followed for example by treatment with a cation exchange resin such as a sulfonic acid resin, for example the resin " Dowex 50 "
(Dow Chemical Company).
If necessary, the fermentation broth can be treated with a view to converting the 2,5-diketogluconic acid formed into other desired products, for example by reduction by fermentation to 2-ketogluconic acid as described in the US patents. United States of America N [deg.] 3,922 194, N [deg.] 3,959,076 or N [deg.] 3,963,574. Alternatively, the filtered fermentation broth can be used as a suitable reaction solution to reduce 2,5-diketog luconic acid in a solution containing 2-ketogulonic acid by reaction with an alkali metal borohydride as described in United States patent N [deg.] 4,159,990.
The 2-ketogulonic acid produced in these reactions is easily transformed into ascorbic acid by means known in the prior art, for example by heating its methyl ester in the presence of a base.
The present invention is illustrated by the following examples. However, it should be noted that the invention is not limited to the particular details given in these examples.
Example 1
The following aqueous inoculation medium is prepared:
<EMI ID = 16.1>
A shake flask containing 1 liter of medium is autoclaved for 30 minutes at 121 [deg.] C. Acetobacter cerinus IFO 3263 cells from an inclined culture on nutrient agar (5 ml of sterile aqueous suspension with a volume of 20 ml) are added to the flask which is then shaken on a rotary shaker at approximately 28 [ deg.] C for about 24 hours. The pH of the cooled medium is 5.0.
An aliquot portion of the culture, sufficient to form an inoculum at 10% by volume / volume, is added to a 4 liter fermenter with stirring, containing 2 liters of the following production medium:
Ingredient
<EMI ID = 17.1>
The fermentation is carried out at 28 [deg.] C with stirring at 1700 rpm and with aeration at a speed of
<EMI ID = 18.1>
5.5 by optional addition of a 20% solution of sodium hydroxide. 2,5-Diketogluconic acid is obtained in the form of the sodium salt in a yield of 95% after a fermentation period of 48 hours.
Example 2
The following aqueous inoculum is prepared:
<EMI ID = 19.1>
A shake flask containing 1 liter of medium is autoclaved for 30 minutes at 121 [deg.] C. Acetobacter cerinus IFO 3263 cells from an inclined culture on nutrient agar (5 ml of a sterile aqueous suspension of 20 ml) are added to the flask which is then shaken on a rotary shaker at about 28 [deg. ] C for about 24 hours. The pH of the cooled medium is 5.0.
An aliquot portion of the culture sufficient to form an inoculum at 10% by volume / volume is added to a 4 liter fermenter equipped with an agitator and containing 2 liters of the following medium:
<EMI ID = 20.1>
The second stage is carried out at 28 [deg.] C with stirring at 1700 rpm and with aeration at a speed of
<EMI ID = 21.1>
5.5 by optional addition of a 20% solution of sodium hydroxide.
After 20 hours, an aliquot of culture sufficient to form a 10% v / v inoculum is added to a stirred fermenter,
14 liters capacity, containing 6 liters of the following production medium:
<EMI ID = 22.1>
The fermentation is carried out at 28 [deg.] C while stirring
750 rpm and introducing air at a speed of 1.0 volume / volume of broth per minute. The pH is maintained at 5.5 by the optional addition of a 20% solution of sodium hydroxide. 2,5-Diketogluconic acid under the
<EMI ID = 23.1>
after a fermentation time of 6570 hours.
Example 3
Following the procedure of Example 1, IFO strains 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 and
3269 of Acetobacter cerinus. In each case, the fermentation product contains 2,5-diketogluconic acid in a yield greater than 50%, together with a little unprocessed 2-ketogluconic acid and 5-ketogluconic acid. Higher yields of the desired 2,5-diketogluconic acid can be obtained by using longer fermentation times when choosing to use these strains of Acetobacter cerinus.
CLAIMS
1. A process for the production of 2,5-dicétcgluconique acid, characterized in that it consists in carrying out the aerobic propagation of Acetobacter cerinus in a fermentation medium containing D-glucose at an initial concentration higher than approximately 20% and going up to about
30% (weight / volume) and choline in an amount of at least about 0.04% by weight based on the initial amount of D-glucose contained in said medium.