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"Procédé de production d'une préparation enzymatique".
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La présente invention concerne la préparation d'un enzyma d'isomérisation du glucose, dit ci-après glucose-isomérase, un procédé de production de la préparation enzymatique, et un procédé d'isomérisation du glucose en fructose en utilisant la préparation enzymatique.
Plus spécialement, la présente invention fournit une prépa ration enzymatique de glucose-isomérase dans laquelle une partiel au moins de l'enzyme de glucose-isomérase est d'origine extracell lulaire.
On obtient la préparation enzymatique de glucose - isomérase en développant, dans un milieu de culture contenant une source ! de carbone appropriée, un microorganisme du genre Streptomyces pouvant produire la préparation enzymatique et en laissant la préparation enzymatique de glucose-isomérase se former au moyen du microorganisme.
L'invention fournit en outre en particulier un procédé do préparation de lévulose par isomérisation du glucose, qui consis. te à produire une préparation enzymatique de glucose-isomérase ayant une activité enzymatique d'origine extracellulaire en déve loppant dans un milieu de culture contenant une source de carbone appropriée un microorganisme du genre Streptomyces qui est capable de produire la préparation enzymatique, et à soumettre le glucose à l'action de la préparation enzymatique.
L'isomérisation du glucose par l'action d'une solution alcaline est connue depuis longtemps. On a utilisé pour isomériser le glu cose des catalyseurs tels que l'hydroxyde de sodium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de calcium, des carbonates alcalinoterreux, des échangeurs d'ions alcalins, l'ammoniac, la pyridine etc. Cependant, les rendements en fructose ainsi formé s'élèvent à environ 20 à 30 % au maximum, ce qui rend le procédé extrême- ment peu intéressant du point de vue industriel. On peut encore isoler le fructose du mélange réactionnel, si on le désire, avec grande difficulté seulement et avec des pertes considérables, ce qui rend le procédé d'ensemble encore moins réalisable industriellement.
Dans des essais tendant à améliorer le procédé ci-dessus, on a proposé un certain nombre de procédés d'isomérisation du glucose impliquant l'action d'enzymes. Ces procédés proposés.se sont révélés inacceptables du point de vue industriel pour une ou plusieurs des raisons suivantes, à savoir un faible rendement
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un ordre de réaction lent, la difficulté d'obtenir la préparation enzymatique voulue, l'inaptitude à récupérer d'une manière efficace le composent fructose, si on le désire, etc. En particulier, les procédés de ce type utilisant des enzymes ont tous impliqué l'utilisation de systèmes enzymatiques sensiblement intracellu- lairea. C'est-à-dire que le milieu de culture utilisé ne contient l'enzyme que dans la oellulo de l'organisme ou y adhérant.
Bien que les cellules puissent être rompues artificiellement pour produire une source enzymatique extracellulaire, par exemple en les désagrégeant aveo un désagrégateur sonique ou supersonique, ce stade supplémentaire prend du temps ot est parfois difficile à réaliser, et aboutit à des prix de production d'en- . semble matériellement accrus du procédé d'isomérisation.
Compte tenu de ce qui précède, il serait extrêmement avantageux de produire une préparation enzymatique de glucose-isomérase qui présente un fort degré d'activité enzymatique extracellulaire. Si l'on pouvait obtenir ce type d'activité directement sans avoir recours au stade supplémentaire fastidieux de rupture des cellules, cette découverte constituerait un progrès matériel dans la technique. Il est très préférable qu'une préparation enzymatique présente un fort degré d'activité enzymatique extracellulaire pour un certain nombre d'autres raisons.
Par exemple, il est généralement établi que les enzymes intracellulaires agissent plus lentement dans leur rôle particulier, en comparaison de la classe extracellulaire. Les matières enzymatiques extracellulaires sont généralement considérées comme étant plus actives à la fois pour obtenir un plus fort degré d'isomérisation et de réaliser ce pourcentage de rendement élevé en sensiblement moins de temps en comparaison du cas où l'on utilise les sources intracellulaires. Un fait encore plus important est qu'il existe théoriquement une moindre limitation à la quantité d'enzyme extracellulaire qu'un organisme peut produire.
D'autre part, la quantité d'enzyme intracellulaire présente dépend naturellement de la quantité de cellules d'organismes présentes à l'état créé biologiquement, Cependant, à l'heure actuelle, on n'a pas découvert dans la technique une préparation enzymatique de glucoseisomérase qui soit de nature entièrement extracellulaire, ou même une préparation qui présente un fort degré d'activité enzymatique extracellulaire en plus du type intracellulaire.
Compte tenu de ce qui précède, un avantage principal de
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l'invention réside dans le fait qu'elle fournit une préparation enzymatique de glucose-isomérase caractérisée par le fait qu'el- le présente un degré élevé d'activité enzymatique extracellulaire.
D'autres avantages de l'invention résident en ce qu'elle fournit un procédé de production du système enzymatique qu'on vient de décrire ; permet - dans le fait que le procédé ci-dessus/la production de l'enzyme glucose--isomérase désiré par le développement d'un microorganisme approprié dans un milieu de culture spécifique fournit un rendement élevé en enzyme, en comparaison de procédés analogues utilisant d'autres sources de carbone connues dans le milieu e culture ; - dans le fait qu'elle fournit un¯procédé d'isomérisation du glucose en fructose en utilisant la préparation enzymatique, qu'cn vient de décrire ;
- dans le fait que le procédé d'isomérisation ci-dessus peut convenir pour travailler avec de fortes concentrations de substrat de glucose, ainsi que pour fournir d'excellents rendements en fructose en une période de temps relativement ccurte ; - dans le fait que le procédé d'isomérisation du glucose peut produire du fructose en des quantités atteignant la limite théorique dictée par des considérations d'équilibre.
D'autres avantages ressortiront de la description qui va suivre.
Suivant l'invention, la Demanderesse a découvert une nouvelle préparation enzymatique de glucose-ipomérase. De façon générale, cette préparation enzymatique est une préparation enzymatique de glucose-isomérase d'origine extracellulaire. L'invention concerne également une préparation enzymatique de glucose-isomérase dérivant d'un fluide de culture présentant une proportion importante d'activité d'isoaérase cxtrecelllaire. L'invention concerne en particulier une préparation enzymatique de glucoseisomérase dérivant uniquement de la partie extracellulaire du fluide de culture- d'un organisme produisant du glucose-isomérase.
Des préparations enzymatiquea de glucose-isomérase très préférées de ce type sont dérivées de microorganismes tels que l'espèce Streptomyces venezuelae.
Par l'expression "d'origine extracellulaire", la Demanderesse veut dire que dans le fluide de culture une proportion
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importante,de l'activité du glucose-isomérase s'accumule dans le liquide entourant les cellules, à la distinction de l'activité se trouvant dans les cellules proprement dites. L'aotivité enzymatique d'origine ek-tracellulaire peut être facilement séparée de l'activité cellulaire par filtration ou -autres techniques simples. Par contre, 1'activité enzymatique d'origine intraaellu-, laire est celle qui se trouve dans les cellules. Pour libérer et accumuler cette activité, on doit rompre les membranes des cellu les par des processus de rupture physiques ou chimiques.
De façon générale, le procédé de production du système enzymatique ci-dessus consiste à développer dans un milieu de cul- ture contenant une source de carbone appropriée une certaine quantité d'un organisme qui peut produire cet enzyme, puis à laisser l'enzyme se former au moyen de l'organisme. L'organisme peut provenir d'une plante, d'un animal, ou de céréales, et peut être de nature microscopique ou macroscopique. Il est généralement très préférable que l'enzyme protéique soit produit en utilisant un microorganisme de type bactérien ou fongique.
Des éléments particulièrement préférés dans le procédé pro posé ci-dessus sont des éléments du genre Streptomyces. Les espèces particulièrement préférées dans ce genre sont Streptomyces venezuelae. et Streptomyces olivochromogenes. Des cultures d'une souche de chacun de ces organismes ont été déposées à l'Amarican Type Culture Collection, Washington, D.C.., et ajoutées à sa col lection permanente de microorganismes, On leur a attribué les dé signations suivantes : Streptomyces venazuelae : ATCC N 21113 ; Streptomyces olivochromogenes : ATCC N 21114.
La Demanderesse a découvert qu'en utilisant ces souches ou d'autres, elle pouvait obtenir un enzyme glucose-isomérase utile qui présente une activité enzymatique extracellulaire, qu'on n'avait pas obtenu jusqu'à présent en ce qui concerne ane classe d'enzyme de ce type d'activité d'isomérisation du glucose.
L'invention concerne également d'une façon générale un procédé de préparation de fructose par isomérisation du glucose. Les stades impliqués consistent, sous cet aspect de l'invention, à produire l'enzyme glucose-isomérase extracellulaire, puis à soumettre le glucose à l'action de ia préparation enzymatique.
On prépare l'enzyme voulu de la façon habituelle. On utilise un inoeulum préparé par exemple eu? une plaque inclinée d'agar agar pour inoculer un ballon contenant un milieu ou culture
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approprié. Ainsi, par exemple, une culture contenant une espèce Streptomyces capable de produire une préparation enzymatique extracellulaire de glucose-isomérase est utilisée pour inoculer un substrat contenant une source de carbone appropriée dans laquelle on laisse l'organisme se développer et produire l'enzyme voulu. La période d'incubation peut varier dans une large gamme suivant les microorganismes particuliers dont il s'agit, ainsi que du milieu de culture particulier utilisé. Généralement, la période d'incubation peut durer de 4 à 48 heures environ.
Dans le cas habituel, on utilise ensuite une partie aliquote ou la totalité du milieu contenant l'organisme pour inoculer un plus grand volume de milieu nutritif. On peut répéter ceci une ou plusieurs fois. La culture finale, avec ou sans processus de purification, est utilisée pour effectuer l'isomérisation du glucose en fructose.
Ainsi, on veut utiliser la totalité du milieu directement comme source de glucose-isomérase, ou on peut filtrer le milieu ou le traiter d'une autre façon. Le filtrat ou produit de centrifugation contient habituellement la préparation enzymatique extracellulaire, que l'on peut ensuite utiliser directement ou purifier davantage par un certain nombre de procédés connus. D'une façon analogue, la fraction intracellulaire, qui reste habituel- lement sous forme d'une masse cellulaire solide, peut être jetée, ou utilisée séparément dans le stade d'isomérisation du glucose.
Pour des raisons économiques, on utilise normalement 1±totalité du milieu sans autre séparation lorsqu'on effectue l'isomérisation à une grande échelle industrielle.
Dans la mise en oeuvre habituelle ie l'invention, on attribue de 20% à 60% de l'activité enzymatique totale du glucoseisomérase, ou même plus, à la source enzymatique extracellulaire.
On doit noter dans ce cas que toutes les espèces ou souches de Streptomyces ne sont pas actives pour produire une préparation enzymatique de glucose-isomérase ayant au moins une activité enzymatique extracellulaire. Cependant, l'invention n'est pas limitée à l'utilisation d'un organisme ou microorganisme particulier quelconque, à condition que l'organisme ait la faculté de produire une préparation enzymatique caractérisée par le fait qu'elle contient au moins une source enzymatique extracellulair qui a une activité dans l'isomérisation du glucose en fructose. Comme sus-mentionné, ces préparations enzymatiques ont été jusqu'à présent inconnnues en pratique.
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Dans une autre forme de réalisation de l'invention, la Demanderesse a découvert une source de carbone ou milieu nutri tif particulièrement approprié qui peut être utilisé pour produire les préparations enzymatiques sus-décrites. Cette source de carbone est un mélange dexylose et d'amidon que l'on peut utiliser comme unique source de carbone ou en combinaison avec diverses autres sources de carbone comme le mannitol, l'acide gluconique, le galactose, la glycérine, le sorbitol, le glucose et autres sources pures ou impures d'hydrates de carbone. Ainsi qu'on le verra ci-après, ce mélange de xylose et d'amidon, dans son ensemble, est meilleur comme bouillon de culture que l'un ou l'autre des deux composants sur une base de dosage égale.
Le mélange nutritif fournit en particulier une préparation enzymatique plus active que le xylose qui a été largement utilisé comme source de carbone dans la préparation d'enzyme glucose-isomérase. De nouveau, l'amidon seul comme source de carbone convient médiocrement.
Le milieu nutritif d'amidon qui est utilisé dans la mise en oeuvre de l'invention peut provenir de toute source végétale comme par exemple le maîs, le blé, la pomme de terre, le tapioca, la riz, le sagou et les grains de sorgho. On peut également utiliser les amidons cireux. L'expression "amidon" est largement utilisée dans la présente demande et englobe les amidons non modifiés et les produits impurs, ainsi que l'amidon qui a été modifié par traitement par des acides, des bases , des enzymes ou des agents oxydants. Les amidons modifiés solubles ou partiellement solubles, les dextrines les produits prégélatinisés, et les dérivés d'amidons tels que certains produits cationiques, anioniques et non ioniques dérivant de l'amidon conviennent également dans la présente demande.
Des amidons typiques utiles dans la présente demande sont les amidons de mais et de pomme de terre.
La partie xylose de la matière peut être le xylose proprement dit ou ses formes natives qui existent dans les enveloppes de cellules de presque toutes les plantes sous la forme de xylane polymère, contenant du sucre xylose comme constituant principal. Ainsi, on peut utiliser le xylose tel qu'il existe sous forme impure dans la paille, les balles, le bois, les rafles de mais, le son de blé, etc. Habituellement, les matières ci-dessus ou autres matières sont traitées par un alcali pour extraire l'hé- micellulose des divers déchets ou pulpes utilisés comme
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milieux. Afin d'obtenir le monosaccharide xylose, on hydrolyse habituellement l'hémicellulose.
Ainsi, par le terme "xylose", tel qu'il est utilisé dans la prébente demande, la Demanderesse désignc à la fois la matière pure et les sources impures contenant cet hydrate de carbone.
Dans une forme de réalisation préférée, le mélange fournissant le carbone consiste habituellement en 25 à 75% d'amidon et en 25 à 75% dexylose en poids du mélange constituant la source de carbone. En d'autres termes, la source de carbone comprenant le xylose et l'amidon constitue habituellement 0,2 à 10% en poids du milieu de culture et le plus souvent de 0,5 à 2% en poids du milieu.
Dans une autre forme de réalisation encore de l'invention, un milieu de culture particulièrement avantageux contient également un extrait soluble du mais comme source de protéines. Cette combinaison en plus du mélange qu'on vient de décrire de xylose et d'amidon comme source de carbone, est particulièrement avantageuse. Habituellement, l'extrait soluble du mais composé divers amino-acides constitue 0,1 à 5,0% en poids, sur une base de poids total, du milieu de culture.
Pour préparer les enzymes de l'invention, il est évidenc que le milieu d'ensemencement et les milieux de développement de cellules ultérieure peuvent également contenir, en plus des sources de carbone décrites ci-dessus ou d'autres sources: une source d'azote appropriée, des sels minéraux, comme le sulfate de magnésium, le phosphate monopotassique, etc., et d'autres matières si on le désire. Habituellement, la culture, telle que cell de Streptomyces venezuelae, est effectuée à un pH compris entre 7 et 9 à une température comprise entre 20 et 40 C environ.
Là encore, le stade réel d'isomérisation, suivant la source de la préparation enzymatique, la concentration du glucose, la température, la présence ou l'absence de cofacteurs enzymatiques, etc., peut varier quant au temps nécessaire pour atteindre des rendements maximals en fructose. Dans le cas habituel, on obtient des rendements appropriés enl à 36 heures environ. Pendant ce temps , la température peut être la température ambiante, ou bien on peut la porter à 50-70 C environ. Habituellement, le pH du système de glucose soumis à l'isomérisation est maintenu à 7-9', en utilisant un système-tampon approprié, par exemple un phosphate tampon. D'autres activeurs tels que les ions magnésium ou
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manganèse peuvent également être présents.
Il est possible dans' certains cas de réduire au minimum les réactions secondaires en ajoutant des inhibiteurs tels que l'arséniate de sodium, l'arsénite de sodium et le fluorure de sodium. On remarque que l'aoti- vité enzymatique augmente jusqu'à une valeur maximale en utilisant un cofacteur enzymatique comme le cobalt sous la forme de chlorure de cobalt.
Le glucose lui-même est habituellement présent sous forme de solution concentrée. On a observé d'excellente résultats lors que la concentration du glucose est 0,5 à 5,0 molaire. Il est évident que l'on peut isomériser des sources plus diluées de glu cose, ainsi que des solutions même sursaturées.
Les exemples suivante sont donnés à titre illustratif, mais non limitatit, de l'invention. Toutes les parties et tous pourcentages sont exprimés en poids, sauf indication contraire.
EXEMPLE 1
Dans cet exemple, on fabrique une préparation enzymatique de glucose-isomérase extracellulaire à partir de deux espèces, à savoir S, venezuelae, ATCC N 21113 et S, olivochromogenes, ATCC N 21114, et on utilise les préparations enzymatiques pour isomériser des échantillons de glucose.
Le milieu de culture utilisé dans cet essai a la composition suivante : Xylose 0,5 g Amidon de pomme de terre solubilisé 0,5 g Peptone 1,0 g Extrait da viande 0,5 g Extrait de levure 0,25 g Chlorure de sodium 0,5 g Sulfate de magnésium 0,05 g Chlorure de cobalt 0,005 g On ajuste le pH du milieu de culture à 7,0 environ avant l'incu- bation., i
Après la stérilisation et le refroidissement jusqu'à 25 C, on inocule des échantillons de 100 ml du milieu de xylose et d'amidon ci-dessus avec les espèces qu'on vient de mentionnsr. On effectue les inoculations d'une façon spécifique en inoculant le milieu avec trois contenus de boucles de cellules provenant de plaques inclinées de xylose d'amidon et d'agar-agar.
Après une incubation de 48 heures à 28 C sur un appareil
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de secquage pour aérer la culture, on récolte les cellules en @ trifuge@@@t le milieu de culture à @0.000 tours/minute pendant 10 minutes. On lave les cellules à deux reprises avec une solution saline à 0,85 % et les met en suspension dans 5 ml d'une aolutim de phosphate tampon 0,05 molaire (pH 7,5). On traite ensuite la suspension des cellules dans un oscillateur sonique refroidi par eau pendant 20 minutes à 10 KC, puis on la centrifuge de nouveau à 12.000 tours/minute pendant 30 minutes.. On utilise le fluide surnageant sous forme d'une source brute de solution enzymatique de glucose-isomérase intracellulaire.
On prépare la solution brute de glucose-isomérase extracellulaire en relargant 50 ml d'une culture centrifugée avec du sulfate d'ammonium à une saturation de 60 %. Après centrifugatin on obtient la solution enzymatique extracellulaire partiellement purifiée en dissolvant le précipité dans 4 ml d'une solution de phosphate tampon 0,05 molaire (pH de 7,5) et en dialysant la solution contre le tampon pendant un jour à 5 C.
On effectue l'isomérisation proprement dite en préparant une solution aqueuse 1,6 molaire de glucose qui contient également du phosphate tampon 0,05 molaire, du sulfate de magnésium 0,2 molaire, et du chlorure de cobalt 0,05 molaire. On ajoute 2 ml des solutions enzymatiques sus-décrites à 2 ml de la solution de glucose.
Après une incubation de troie heures à 60 C, on retire 0,5 ml du mélange réactionnel dans 4,5 ml d'une solution d'acide perchlorique 0,5 N. La quantité de fructose formée dans la parti aliquote est déterminée par le procédé au cystéine-carbezole, comme décrit dans "J. Biol. Chem.". 192, 583 (1951). Dans cet es sai, l'intensité de couleur est développée pendant 10 minutes à 60 C après l'addition des réactifs. On lit ensuite l'intensité sur un spectrophotomètre à 560 millimicrons, et on calcule la quantité de fructose présente à partir d'étalons. Les résultats sont donnés ci-après. On calcule les activités enzymatiques pour montrer l'activité par millilitre de la liqueur de culture in@- tiale.
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TABLEAU I
EMI11.1
<tb> Mocroorganisme <SEP> Activité <SEP> du <SEP> glucose-isomérase.intra- <SEP> Activité <SEP> du <SEP> glucose-isomérase <SEP> extracellulaire <SEP> cellulaire
<tb> % <SEP> de <SEP> Fructose <SEP> mg <SEP> de <SEP> fruc- <SEP> % <SEP> de <SEP> fructo- <SEP> Fructose <SEP> mg <SEP> de <SEP> fructo- <SEP> % <SEP> de <SEP> fructose
<tb> formé, <SEP> tose <SEP> par <SEP> ml <SEP> se <SEP> parml <SEP> de <SEP> formé <SEP> se <SEP> par <SEP> ml <SEP> de <SEP> par <SEP> ml <SEP> de <SEP> lide <SEP> liqueur <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> cul <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> queur <SEP> de <SEP> culde <SEP> culture <SEP> ture <SEP> culture <SEP> ture
<tb> S. <SEP> olivochromogènes <SEP> 38,9 <SEP> 5,6 <SEP> 0,97 <SEP> 5,6 <SEP> 1,3 <SEP> 0,22
<tb> S.
<SEP> venezuelae <SEP> 37,5 <SEP> 5,4 <SEP> 0,94 <SEP> 24,8 <SEP> 5,8 <SEP> 0.99
<tb>
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EXEMPLE2
Dans cet exemple, on étudie l'effet de la période de culture sur l'activité isomérase de S. venezuclae ATCC N 21113.
Le milieu de culture et les autres conditions sont les mêmes que décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on ajouta 10 ml d'un bouillon de préculture comme inooulum à 100 ml du mélange de culture principal. Ensuite, on récolte le filtrat de cellules et de culture au bout de 16, de 20, de 24, de 48, de ?2 et de 168 heures d'incubation, respectivement, et on l'utilise comme solutions de glucose-isomérase. Les résultats sont présentés sur le tabl@ II.
Ainsi qu'il est évident, l'activité enzymatique intracellu laire provenant de S. venezuelae présente une activité maximale au bnut de 16 heures seulement de culture, et conserve cette valeur à un taux sensiblement constant pendant 7 jours environ.
L'activité enzymatique de glucose-isomérase extracellulaire de.9venezuelae augmente progressivement et se maintient à une valeur sensiblement constante au bout de deux jours environ. Ainsi, on voit qu'une espèce très préférée de production d'enzymes eet S. venezuelae aux fins de la présente invention en raison de l'excel lente activité dans la production de quantités importantes d'activité enzymatique extracellulaire et intracellulaire.
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TABLEAU II
EMI13.1
<tb> Micro- <SEP> Durée <SEP> de <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> de <SEP> glucose- <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> de <SEP> glucose-isomérase
<tb>
EMI13.2
orsaniaae culture isomérase intracellulaire extracellulaire ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ (heures) e ruc- me de fruc- % de fruc- z de ruc- mg de fruc- % de fructose
EMI13.3
<tb> tose <SEP> formé <SEP> tose <SEP> par <SEP> ml <SEP> tose <SEP> par <SEP> tose <SEP> formé <SEP> tose <SEP> par <SEP> ml <SEP> par <SEP> ml <SEP> de <SEP> mide <SEP> milieu <SEP> de <SEP> ml <SEP> de <SEP> mi- <SEP> de <SEP> milieu <SEP> lieu <SEP> de <SEP> culture
<tb> culture <SEP> lieu <SEP> de <SEP> de <SEP> culture
<tb>
EMI13.4
-- ¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯ culture ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI13.5
<tb> S, <SEP> venazuelae <SEP> 16 <SEP> 39,3 <SEP> 5,6 <SEP> 0,98 <SEP> 7,0 <SEP> 1,6 <SEP> 0,
28
<tb> 20 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 11,0 <SEP> 2,5 <SEP> 0,44
<tb> 24 <SEP> 39,9 <SEP> 5,7 <SEP> 1,0 <SEP> 17,3 <SEP> 4,0 <SEP> 0,69
<tb>
EMI13.6
48 3ô,4 5,2 0,91 19,6 4,5 0,78
EMI13.7
<tb> 72 <SEP> 38,0 <SEP> 5,5 <SEP> 0,95 <SEP> 19,7 <SEP> 4,5 <SEP> 0,79
<tb> 168 <SEP> 38,0 <SEP> 5,5 <SEP> 0,95 <SEP> 16,0 <SEP> 3,7 <SEP> 0,64
<tb>
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EXEMPLE
Dans cet exemple, on étudie l'effet de la source de carbone sur la production des enzymes. Dans un milieu de culture, on utilise 1,0 % de xylose. Dans un autre milieu, on utilise 0,5 % de xylose et 0,5 % d'amidon de pomme de terre.
Comme on peut le voir d'après le Tableau III ci-après,.les milieux contenant de l'amidon et du xyloee provoquent une plus forte activité de formation de fructose s@ on la compare à celle des milieux de xylose, et en particulier en ce qui concerne le fait de provoquer l'activité enzymatique de glucose-isomérase intracellulaire.
TABLEAU III
EMI14.1
<tb>
<tb> Micro- <SEP> Source <SEP> Activité <SEP> enzy- <SEP> Activé <SEP> enzymatiorganisme <SEP> de <SEP> car- <SEP> matique <SEP> de <SEP> glu- <SEP> que <SEP> da <SEP> glucose-
<tb>
EMI14.2
bone cose-isomérase 'ismérase-extra- ¯ . ¯¯¯¯ intracellulaire #ilulaire #############% de fructoSe - % de fructose
EMI14.3
<tb>
<tb> formé <SEP> formé
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> ATCC <SEP> Xylose <SEP> 39,3 <SEP> 5,0
<tb> - <SEP> N <SEP> 21113 <SEP> amidon
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> ATCC <SEP> Xylose <SEP> 24,5 <SEP> 3,5
<tb> N <SEP> 2113
<tb>
EMI14.4
S, olivochromoi5en2E6 Xylose 26,6 - ATCC N" 21114 amidon S. clivochromoizenesxylose 14,9 ATCÇ N 2flflfl4
On ne comprend pas parfaitement l'effet particulier qu'a l'amidon sur la production du fructose lorsqu'on l'utilise comme! milieu de culture.
Cependant, on pense que l'amidon induit quelque peu ou active la croissance des microorganismes, et en consé- quenao augmente l'activité enzymatique résultante.
EXEMPLE
Dans une autre série de recherches, on suit l'activité de production enzymatique de S. venezuelae sur diverses périodes de culture. Comme représenté ci-après, l'activité du glucoae-isomé- rase intracellulaire est encore maintenue à un taux sensiblement constant même au bout de 7 jours. L'activité enzymatique extracellulaire de cette es@@ce augmente pendant toute la période de développement et atteint une valeur maximale constante au bout de 5 jours de culture.
Etant donné que pendant ce laps de temps l'activité enzymatique intracellulaire ne diminue pas proportion nellement, ceci souligne le fait que l'activité extracellulaire
EMI14.5
ne provient pas de l'activité eneymatiquo lntràc6llulairo libérée par l'autolyse des cellules.
EMI14.6
C -d 1 i'" ... 1.-..1!¯",,",- 'C.- ","" -t........1.L.: At...::,1.-
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Pour'conduire ces recherches, on utilise les milieux de croissance suivants pour la culture de S, venezuelae ATCC N
EMI15.1
21113. L'addition 't!'!!:!.t ':!01nhlp. du maïs aux milieux conte- nant le xylose et l'amidon comme source d'azote semble améliorer davantage l'isomérisation du glucose.
La composition des deux milieux. de culture utilisés est la suivante :
EMI15.2
<tb>
<tb> Milieu <SEP> à <SEP> base <SEP> d'extrait <SEP> soluble <SEP> Milieu <SEP> non <SEP> à <SEP> base <SEP> d'extrait <SEP> sodu <SEP> mais <SEP> (g) <SEP> luble <SEP> du <SEP> Maïs <SEP> (g)
<tb> Xylose <SEP> 0,5 <SEP> Xylose <SEP> 0,5
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> 0,5 <SEP> Amidon <SEP> de <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> 0,5
<tb> Extrait <SEP> soluble <SEP> du <SEP> mais <SEP> 1,0 <SEP> Peptone <SEP> 1,0
<tb> Peptone <SEP> 0,5 <SEP> Extrait <SEP> de'viande <SEP> 0,5
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 0,5 <SEP> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,25
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,25 <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,05
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,05 <SEP> Cobalt <SEP> 0,
0024
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> cobalt <SEP> 0,0024
<tb>
Le pH des milieux ci-dessus est de 7,2 dans les deux cas.
Les tableaux IV et V ci-après montrent les résultats de diverses recherches. Le Tableau IV concerne l'activité enzymatique de S, venezuelae provenant d'un milieu de culture contenant de l'extrait soluble du mais. Le Tableau V montre la même activité provenant d'un milieu ne contenant pas d'extrait soluble du mais comme indiqué ci-dessus. On obtient des résultats légèrement supérieurs lorsque l'extrait soluble du mais fait partie du milieu nutritif.
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3E.¯ .... : ....¯ .a . ¯ s¯ -.........
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TABLEAU IV
EMI16.1
<tb> Durée <SEP> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7. <SEP> 10
<tb>
EMI16.2
heures heures heures heures .i19.1 .!.i1.2! ! ;1ourf:L. jÍ9urs iours
EMI16.3
<tb> pH <SEP> 7,1 <SEP> 7,5 <SEP> 8,0 <SEP> 7,9 <SEP> 8,4 <SEP> 8,4 <SEP> 8,8 <SEP> 8,9 <SEP> 9,0
<tb> Activité <SEP> enzymatique <SEP> intracellulaire, <SEP> % <SEP> de <SEP> fructose
<tb> formé <SEP> 44,4 <SEP> 43,8 <SEP> 45,9 <SEP> 40,8 <SEP> 43,8 <SEP> 42,8 <SEP> 45,2 <SEP> 45,2 <SEP> 30,2
<tb> Activité <SEP> enzymatique <SEP> extracellulaire, <SEP> % <SEP> de <SEP> fructose
<tb> formé <SEP> 4,4 <SEP> 9,6 <SEP> 8,9 <SEP> 9,5 <SEP> 13,9 <SEP> 13,6 <SEP> 17,8 <SEP> 16,8 <SEP> 15,
1
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
TABLEAU V
EMI17.1
<tb> Durée <SEP> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10
<tb> , <SEP> heures <SEP> heures <SEP> heures <SEP> heures <SEP> jours <SEP> ours <SEP> ours <SEP> jours <SEP> jours
<tb> pH <SEP> 7,3 <SEP> 7,6 <SEP> 7,75 <SEP> 8,1 <SEP> 8,2 <SEP> 8,4 <SEP> 8,6 <SEP> 9,0 <SEP> 9,0
<tb> Activité <SEP> enzymatique <SEP> intracellulaire, <SEP> % <SEP> de <SEP> fructose
<tb> formé <SEP> 39,3 <SEP> 40,3 <SEP> 41,2 <SEP> 37,0 <SEP> 40,3 <SEP> 40,8 <SEP> 32,2 <SEP> 40,3 <SEP> 34,5
<tb> Activité <SEP> enzymatique <SEP> extracellulaire, <SEP> % <SEP> de <SEP> fructose
<tb> formé <SEP> 3,2 <SEP> - <SEP> 4,3 <SEP> 5,4 <SEP> 5,0 <SEP> 11,6 <SEP> 14,6 <SEP> 13,4 <SEP> 8,0
<tb>
<Desc/Clms Page number 18>
EXEMPLE
Dans cet exemple,
on utilise de nouveau diverses sources de carbone pour préparer l'enzyme glucose-isomérase, daim ce cas une préparation enzymatique de glucose-isomérase intracellulaire. Comme on peut le voir d'après les résultats présentée sur le tableau VI, le mélange nutritif de xylose-amidon est nettement supérieur pour produire des préparations enzymatiques de glucose-, isomérase plus actives en comparaison des mélanges . base de xy- lose ou d'amidon seul comme milieu nutritif.
TABLEAU VI
EMI18.1
<tb>
<tb> Source <SEP> de <SEP> %de <SEP> fruc- <SEP> mg <SEP> d'enzyme
<tb> Mioroorganieme <SEP> carbone <SEP> tose <SEP> par <SEP> ml <SEP> de <SEP> mélange <SEP> réac-
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> @ <SEP> tionnel
<tb> .#######.##########
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> Xylose-amidon <SEP> (mélanATCC <SEP> N <SEP> 21113 <SEP> ge <SEP> à <SEP> 50-50 <SEP> pour <SEP> cent <SEP> 35,5 <SEP> 12,5
<tb> en <SEP> poids)
<tb> " <SEP> Xylose <SEP> 9,2 <SEP> 6,8
<tb> " <SEP> Amidon <SEP> 0 <SEP> 5,9
<tb> " <SEP> Glucose <SEP> 0 <SEP> 13,5
<tb>
.
La quantité totale de milieu nutritif utilisé est la même dans tous les cas
EXEMPLE 6 ;
Dans cet exemple, on étudie uit certain nombre de variables en ce qui concerne la production de préparation enzymatiques de glucose-isomérase extracellulaires et intracellulaires au moyen de l'espèce S, venezuelae, ATCC N 21113.
Premièrement, on étudie les activités enzymatiques extracellulaires et intracellulaires en ce qui concerne l'effet du pH.
La réaction de transformation à partir du typé extraceilulaire atteint une valeur optimale à un pH de 9,0 environ. L'activité intracellulaire est également optimale à un pH de 9,0 environ.
Egalement, on effectue divers essais pour se rendre compte de l'effet qu'a la température sur les activités des enzymes extracellulaires et intracellulaires de S, venezuelae pour favoriser la transformation. L'activité intracellulaire augmente d'une façon linéaire dans toute la gamme de températures comprise entre 40 et 70 C environ pendant des durées de réaction de 1 et 3 heures. La valeur optimale se trouve à environ 70 C. Dans le cas d'une durée de réaction d'une demi-heure, la température optimale est de 80 C. Si la durée de réaction est supérieure à 1 heure;
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l'activité intracellulaire diminue au-dessus d'une température d'environ 70 C. On remarque le même effet de la température sur l'activité extracellulaire, excepté qu'il se produit une inaoti-, vation à une température légèrement supérieure.
Dana un autre groupe d'études, des concentrations de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 et 4,0 moles de glucose sont soumises à l'action d'enzyme gluoose-isomérase extracellulaires et intracellu- lairee de S. venezuelae. On a constaté que même à la concentra- , tion la plus élevée de 4,0 moles de glucose par litre, à savoir ' presque un état de solution saturée, les réactions enzymatiques extracellulaires et intracellulaires s'effectuent et s'approchant: de l'équilibre théorique à mesure que la période de réaction est prolongée. Ainsi, on peut voir que l'invention est destinée à l'isomérisation de solutions de glucose- même fortement concentrée ce qui la rend encore plus intéressante dans un procédé réalisable industriellement.
Dans une autre série d'essais encore, la réaction d'isomérisation est effectuée pendant un temps relativement long afin de déterminer un point d'équilibre approximatif. En ce qui concerne l'interconversion en utilisant un enzyme intracellulaire de S. venezuelae ; la teneur en fructose atteint environ 48 % du sucre ajouté en portant du glucose. D'autre part, lorsque le fructose est le substrat, la teneur finale en fructose est d'environ 50 % Ainsi, il semble que le point d'équilibre soit au voisinage d'u- ne interconversion de 48 à 50 % environ.
EXEMPLE
On a découvert pendant les recherches en laboratoire que bien qu'un certain nombre d'espèces Streptomyces présentent une activité glucose-isomérase extracellulaire, un nombre surpre-.: nant ne présentant pas d'activité enzymatique glucose isomérase extracllulaire. On effectue des essaie de la façon générale indiquée dans l'exemple 1 sur un grand nombre d'espèces Streptomyces. Les résultats en ce qui concerne quelques-uns de ces essais sont indiqués ci-dessous.
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TABLEAU VII
EMI20.1
<tb>
<tb> Microorganisme <SEP> Activité <SEP> de <SEP> glucose-isomérase <SEP> extracellulaiMicroorganisme <SEP> re
<tb> mg <SEP> de <SEP> fructose <SEP> par <SEP> de <SEP> fructose <SEP> par <SEP> ml
<tb> ml <SEP> de <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> de <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> cultuculture <SEP> ne <SEP> ¯¯¯ <SEP>
<tb>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S <SEP> flaveolue <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> coelicolor <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S, <SEP> parvus <SEP> 1,4 <SEP> 0,24
<tb>
EMI20.2
S, roseochrcmo8er.ue 0 0
EMI20.3
<tb>
<tb> S.
<SEP> purpurascens <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S, <SEP> scabies <SEP> 1,3 <SEP> 0,23
<tb> S, <SEP> vinaceus <SEP> 1,6 <SEP> 0,28
<tb>
EMI20.4
S, tanashienais 1,9 - Os33 naturellement, l'invention n'est pas limitée aux modes opératoires débits et est susceptible de recevoir diverses variantes entrant dans son cadre et son esprit.
<Desc / Clms Page number 1>
"Process for the production of an enzyme preparation".
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The present invention relates to the preparation of a glucose isomerization enzyme, hereinafter referred to as glucose isomerase, to a process for producing the enzyme preparation, and to a process for isomerization of glucose to fructose using the enzyme preparation.
More especially, the present invention provides an enzymatic preparation of glucose-isomerase in which at least part of the glucose-isomerase enzyme is of extracellular origin.
The enzyme preparation of glucose - isomerase is obtained by developing, in a culture medium containing a source! of suitable carbon, a microorganism of the genus Streptomyces capable of producing the enzyme preparation and allowing the enzyme preparation of glucose isomerase to form by means of the microorganism.
The invention further provides in particular a process for the preparation of levulose by isomerization of glucose, which consis. te to produce an enzyme preparation of glucose isomerase having enzymatic activity of extracellular origin by growing in a culture medium containing a suitable carbon source a microorganism of the genus Streptomyces which is capable of producing the enzyme preparation, and subjecting the glucose on the action of enzyme preparation.
The isomerization of glucose by the action of an alkaline solution has been known for a long time. Catalysts such as sodium hydroxide, sodium carbonate, calcium hydroxide, alkaline earth carbonates, alkaline ion exchangers, ammonia, pyridine etc. have been used to isomerize glue. However, the yields of fructose thus formed amount to about 20-30% at most, which makes the process extremely unattractive from an industrial point of view. Fructose can still be isolated from the reaction mixture, if desired, only with great difficulty and with considerable losses, which makes the overall process even less industrially feasible.
In attempts to improve the above method, a number of methods of isomerization of glucose involving the action of enzymes have been proposed. These proposed methods have proved to be unacceptable from an industrial point of view for one or more of the following reasons, namely a low yield.
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slow reaction order, difficulty in obtaining the desired enzyme preparation, inability to efficiently recover the fructose component, if desired, etc. In particular, processes of this type using enzymes have all involved the use of substantially intracellular enzyme systems. That is to say that the culture medium used contains the enzyme only in the cellulo of the organism or adhering to it.
Although cells can be artificially disrupted to produce an extracellular enzymatic source, for example by disaggregating them with a sonic or supersonic disaggregator, this extra step is time consuming and sometimes difficult to achieve, and results in costs for the production of protein. -. appears materially increased from the isomerization process.
In view of the above, it would be extremely advantageous to produce an enzyme preparation of glucose isomerase which exhibits a high degree of extracellular enzyme activity. If this type of activity could be obtained directly without resorting to the tedious additional stage of cell disruption, this discovery would constitute a material advance in the art. It is very preferable that an enzyme preparation exhibits a high degree of extracellular enzyme activity for a number of other reasons.
For example, it is generally established that intracellular enzymes act more slowly in their particular role, compared to the extracellular class. Extracellular enzymatic materials are generally considered to be more active both in obtaining a higher degree of isomerization and in achieving this high percentage of yield in significantly less time compared to using the intracellular sources. Even more importantly, theoretically there is less limitation to the amount of extracellular enzyme an organism can produce.
On the other hand, the amount of intracellular enzyme present naturally depends on the amount of cells of organisms present in the biologically created state. However, at the present time, an enzymatic preparation has not been discovered in the art. glucoseisomerase which is entirely extracellular in nature, or even a preparation which exhibits a high degree of extracellular enzymatic activity in addition to the intracellular type.
In view of the above, a main advantage of
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the invention resides in the fact that it provides an enzymatic preparation of glucose isomerase characterized in that it exhibits a high degree of extracellular enzymatic activity.
Other advantages of the invention reside in that it provides a process for producing the enzyme system which has just been described; allows - in that the above process / the production of the desired glucose-isomerase enzyme by the growth of a suitable microorganism in a specific culture medium provides a high yield of enzyme, compared to analogous processes using other sources of carbon known in the culture medium; - in the fact that it provides a process for the isomerization of glucose into fructose using the enzyme preparation, which has just been described;
- in that the above isomerization process may be suitable for working with high concentrations of glucose substrate, as well as for providing excellent yields of fructose over a relatively short period of time; - in the fact that the process of isomerization of glucose can produce fructose in quantities reaching the theoretical limit dictated by considerations of equilibrium.
Other advantages will emerge from the description which follows.
According to the invention, the Applicant has discovered a novel enzymatic preparation of glucose-ipomerase. In general, this enzymatic preparation is an enzymatic preparation of glucose-isomerase of extracellular origin. The invention also relates to an enzymatic preparation of glucose isomerase derived from a culture fluid exhibiting a large proportion of cellular isoerase activity. In particular, the invention relates to an enzymatic preparation of glucoseisomerase derived only from the extracellular portion of the culture fluid of an organism producing glucose isomerase.
Very preferred glucose isomerase enzyme preparations of this type are derived from microorganisms such as the species Streptomyces venezuelae.
By the expression “of extracellular origin”, the Applicant means that in the culture fluid a proportion
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Importantly, glucose isomerase activity builds up in the fluid surrounding cells, distinct from the activity in the cells themselves. Enzymatic activity of ek-tracellular origin can easily be separated from cellular activity by filtration or other simple techniques. In contrast, the enzymatic activity of intra-cellular origin is that which is found in cells. To release and accumulate this activity, cell membranes must be ruptured by physical or chemical disruption processes.
Generally, the method of producing the above enzyme system involves growing in a culture medium containing an appropriate carbon source a certain amount of an organism which can produce this enzyme, and then allowing the enzyme to settle. train through the body. The organism can originate from a plant, animal, or grain, and can be microscopic or macroscopic in nature. It is generally very preferable that the protein enzyme is produced using a bacterial or fungal type microorganism.
Particularly preferred elements in the process proposed above are elements of the genus Streptomyces. Particularly preferred species in this genus are Streptomyces venezuelae. and Streptomyces olivochromogenes. Cultures of one strain of each of these organisms were deposited in the American Type Culture Collection, Washington, DC., And added to its permanent collection of microorganisms, they were assigned the following designations: Streptomyces venazuelae: ATCC N 21113; Streptomyces olivochromogenes: ATCC N 21114.
We have found that by using these or other strains, we can obtain a useful glucose-isomerase enzyme which exhibits extracellular enzymatic activity, which has not heretofore been obtained with respect to class d. enzyme of this type of glucose isomerization activity.
The invention also relates generally to a process for preparing fructose by isomerization of glucose. The stages involved consist, in this aspect of the invention, in producing the enzyme glucose-isomerase extracellular, then in subjecting the glucose to the action of the enzyme preparation.
The desired enzyme is prepared in the usual way. We use a prepared inoeulum eg eu? a slanted agar agar plate for inoculating a flask containing a medium or culture
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appropriate. Thus, for example, a culture containing a Streptomyces species capable of producing an extracellular enzyme preparation of glucose isomerase is used to inoculate a substrate containing a suitable carbon source in which the organism is allowed to grow and produce the desired enzyme. The incubation period can vary over a wide range depending on the particular microorganisms involved, as well as the particular culture medium used. Usually, the incubation period can last from about 4 to 48 hours.
In the usual case, an aliquot or all of the medium containing the organism is then used to inoculate a larger volume of nutrient medium. You can repeat this one or more times. The final culture, with or without a purification process, is used to effect the isomerization of glucose to fructose.
Thus, one wants to use all of the medium directly as a source of glucose isomerase, or one can filter the medium or process it in some other way. The filtrate or centrifugation usually contains the extracellular enzyme preparation, which can then be used directly or further purified by a number of known methods. Similarly, the intracellular fraction, which usually remains as a solid cell mass, can be discarded, or used separately in the glucose isomerization step.
For economic reasons, normally 1 ± all of the medium is used without further separation when isomerization is carried out on a large industrial scale.
In the usual practice ie the invention, 20% to 60% of the total enzyme activity of glucoseisomerase, or even more, is attributed to the extracellular enzyme source.
It should be noted in this case that not all species or strains of Streptomyces are active to produce an enzyme preparation of glucose isomerase having at least one extracellular enzyme activity. However, the invention is not limited to the use of any particular organism or microorganism, provided that the organism has the ability to produce an enzymatic preparation characterized by the fact that it contains at least one enzymatic source extracellular which has activity in the isomerization of glucose into fructose. As mentioned above, these enzyme preparations have hitherto been unknown in practice.
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In another embodiment of the invention, Applicants have discovered a particularly suitable carbon source or nutrient medium which can be used to produce the above-described enzyme preparations. This carbon source is a mixture of dexylose and starch which can be used as the sole source of carbon or in combination with various other carbon sources such as mannitol, gluconic acid, galactose, glycerin, sorbitol, glucose and other pure or impure sources of carbohydrates. As will be seen below, this mixture of xylose and starch, as a whole, is better as a culture broth than either of the two components on an equal dosage basis.
The nutrient mixture in particular provides a more active enzyme preparation than xylose which has been widely used as a carbon source in the preparation of glucose isomerase enzyme. Again, starch alone as a carbon source is poorly suited.
The starch nutrient medium which is used in the implementation of the invention can come from any vegetable source such as, for example, corn, wheat, potato, tapioca, rice, sago and grains of sorghum. Waxy starches can also be used. The term "starch" is widely used in the present application and includes unmodified starches and impure products, as well as starch which has been modified by treatment with acids, bases, enzymes or oxidizing agents. Soluble or partially soluble modified starches, dextrins, pregelatinized products, and starch derivatives such as certain cationic, anionic and nonionic products derived from starch are also suitable in the present application.
Typical starches useful in the present application are corn and potato starches.
The xylose part of the material can be xylose itself or its native forms which exist in the cell envelopes of almost all plants as polymeric xylan, containing xylose sugar as the main constituent. Thus, xylose can be used as it exists in impure form in straw, husks, wood, corn stalks, wheat bran, etc. Usually, the above or other materials are treated with alkali to extract the hemi-cellulose from the various wastes or pulps used as.
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environments. In order to obtain the xylose monosaccharide, the hemicellulose is usually hydrolyzed.
Thus, by the term “xylose”, as used in the previous application, the Applicant designates both the pure material and the impure sources containing this carbohydrate.
In a preferred embodiment, the mixture providing the carbon usually consists of 25 to 75% starch and 25 to 75% dexylose by weight of the mixture constituting the carbon source. In other words, the carbon source comprising xylose and starch usually constitutes 0.2 to 10% by weight of the culture medium and most often 0.5 to 2% by weight of the medium.
In yet another embodiment of the invention, a particularly advantageous culture medium also contains a soluble extract of maize as a source of protein. This combination, in addition to the mixture just described of xylose and starch as a carbon source, is particularly advantageous. Usually, the soluble extract of the corn composed of various amino acids constitutes 0.1 to 5.0% by weight, on a total weight basis, of the culture medium.
To prepare the enzymes of the invention, it is evident that the seed medium and the subsequent cell development media may also contain, in addition to the carbon sources described above or other sources: a source of suitable nitrogen, mineral salts, such as magnesium sulfate, monopotassium phosphate, etc., and other materials if desired. Usually, the culture, such as cell of Streptomyces venezuelae, is carried out at a pH of between 7 and 9 at a temperature of between 20 and 40 C approximately.
Again, the actual stage of isomerization, depending on the source of the enzyme preparation, glucose concentration, temperature, presence or absence of enzyme cofactors, etc., may vary in the time required to achieve maximum yields. in fructose. In the usual case, suitable yields are obtained from 1 to about 36 hours. During this time, the temperature can be room temperature, or it can be raised to about 50-70 C. Usually, the pH of the glucose system subjected to isomerization is maintained at 7-9 ', using a suitable buffer system, for example a phosphate buffer. Other activators such as magnesium ions or
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manganese may also be present.
It is possible in some cases to minimize side reactions by adding inhibitors such as sodium arsenate, sodium arsenite and sodium fluoride. It is noted that the enzymatic activity increases to a maximum value by using an enzymatic cofactor such as cobalt in the form of cobalt chloride.
Glucose itself is usually present as a concentrated solution. Excellent results have been observed when the glucose concentration is 0.5 to 5.0 molar. It is obvious that more dilute sources of glucose can be isomerized, as well as even supersaturated solutions.
The following examples are given by way of illustration, but not limitatit, of the invention. All parts and percentages are expressed by weight, unless otherwise indicated.
EXAMPLE 1
In this example, an extracellular glucose isomerase enzyme preparation is made from two species, namely S, venezuelae, ATCC N 21113 and S, olivochromogenes, ATCC N 21114, and the enzyme preparations are used to isomerize glucose samples. .
The culture medium used in this test has the following composition: Xylose 0.5 g Solubilized potato starch 0.5 g Peptone 1.0 g Meat extract 0.5 g Yeast extract 0.25 g Sodium chloride 0.5 g Magnesium sulphate 0.05 g Cobalt chloride 0.005 g The pH of the culture medium is adjusted to about 7.0 before incubation.
After sterilization and cooling to 25 ° C., 100 ml samples of the above xylose and starch medium are inoculated with the species just mentioned. Inoculations are performed in a specific fashion by inoculating the medium with three contents of cell loops from slanted plates of starch xylose and agar-agar.
After incubation for 48 hours at 28 C on a device
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To aerate the culture, the cells were harvested in trifuge in the culture medium at 0,000 rpm for 10 minutes. The cells were washed twice with 0.85% saline and suspended in 5 ml of 0.05 molar phosphate buffered alutim (pH 7.5). The cell suspension is then treated in a water-cooled sonic oscillator for 20 minutes at 10 KC, then centrifuged again at 12,000 rpm for 30 minutes. The supernatant fluid is used as a crude source of. enzymatic solution of intracellular glucose isomerase.
The crude solution of extracellular glucose isomerase is prepared by releasing 50 ml of a culture centrifuged with ammonium sulfate at a saturation of 60%. After centrifugation, the partially purified extracellular enzyme solution is obtained by dissolving the precipitate in 4 ml of a 0.05 molar phosphate buffer solution (pH 7.5) and dialyzing the solution against the buffer for one day at 5 ° C.
The actual isomerization is carried out by preparing a 1.6 molar aqueous solution of glucose which also contains 0.05 molar phosphate buffer, 0.2 molar magnesium sulfate, and 0.05 molar cobalt chloride. 2 ml of the enzymatic solutions described above are added to 2 ml of the glucose solution.
After a three-hour incubation at 60 ° C., 0.5 ml of the reaction mixture is removed in 4.5 ml of a 0.5 N perchloric acid solution. The amount of fructose formed in the aliquot is determined by the cysteine-carbezole method, as described in "J. Biol. Chem.". 192, 583 (1951). In this test, the color intensity is developed for 10 minutes at 60 ° C. after the addition of the reagents. The intensity is then read on a spectrophotometer at 560 millimicrons, and the amount of fructose present is calculated from standards. The results are given below. Enzyme activities are calculated to show the activity per milliliter of the initial culture liquor.
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TABLE I
EMI11.1
<tb> Mocroorganism <SEP> Activity <SEP> of <SEP> glucose-isomerase.intra- <SEP> Activity <SEP> of <SEP> glucose-isomerase <SEP> extracellular <SEP>
<tb>% <SEP> of <SEP> Fructose <SEP> mg <SEP> of <SEP> fruc- <SEP>% <SEP> of <SEP> fructo- <SEP> Fructose <SEP> mg <SEP> of <SEP> fructo- <SEP>% <SEP> of <SEP> fructose
<tb> formed, <SEP> tose <SEP> by <SEP> ml <SEP> se <SEP> parml <SEP> from <SEP> formed <SEP> se <SEP> by <SEP> ml <SEP> from < SEP> by <SEP> ml <SEP> of <SEP> lide <SEP> liquor <SEP> liquor <SEP> of <SEP> ass <SEP> liquor <SEP> of <SEP> queur <SEP> of <SEP> culde <SEP> culture <SEP> ture <SEP> culture <SEP> ture
<tb> S. <SEP> olivochromogenic <SEP> 38.9 <SEP> 5.6 <SEP> 0.97 <SEP> 5.6 <SEP> 1.3 <SEP> 0.22
<tb> S.
<SEP> venezuelae <SEP> 37.5 <SEP> 5.4 <SEP> 0.94 <SEP> 24.8 <SEP> 5.8 <SEP> 0.99
<tb>
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EXAMPLE 2
In this example, the effect of the culture period on the isomerase activity of S. venezuclae ATCC N 21113 is studied.
The culture medium and other conditions are the same as described in Example 1, except that 10 ml of a preculture broth as inooulum was added to 100 ml of the main culture mixture. Then, the cell and culture filtrate was harvested after 16, 20, 24, 48,, 2 and 168 hours of incubation, respectively, and used as glucose isomerase solutions. The results are presented in tabl @ II.
As is evident, the intracellular enzymatic activity from S. venezuelae shows maximum activity after only 16 hours of culture, and maintains this value at a substantially constant level for about 7 days.
The enzymatic activity of extracellular glucose isomerase de.9venezuelae gradually increases and remains at a substantially constant value after about two days. Thus, it is seen that a very preferred enzyme producing species is S. venezuelae for the purposes of the present invention due to the excellent slow activity in producing significant amounts of extracellular and intracellular enzymatic activity.
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TABLE II
EMI13.1
<tb> Micro- <SEP> Duration <SEP> of <SEP> Enzymatic <SEP> activity <SEP> of <SEP> glucose- <SEP> Enzymatic <SEP> activity <SEP> of <SEP> glucose-isomerase
<tb>
EMI13.2
orsaniaae culture isomerase intracellular extracellular ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ (hours) e fruc-% fruc- z of ruc- mg of fruct-% fructose
EMI13.3
<tb> tose <SEP> formed <SEP> tose <SEP> by <SEP> ml <SEP> tose <SEP> by <SEP> tose <SEP> formed <SEP> tose <SEP> by <SEP> ml <SEP > by <SEP> ml <SEP> of <SEP> mide <SEP> middle <SEP> of <SEP> ml <SEP> of <SEP> mid- <SEP> of <SEP> middle <SEP> place <SEP> of <SEP> culture
<tb> culture <SEP> locale <SEP> of <SEP> of <SEP> culture
<tb>
EMI13.4
-- culture
EMI13.5
<tb> S, <SEP> venazuelae <SEP> 16 <SEP> 39.3 <SEP> 5.6 <SEP> 0.98 <SEP> 7.0 <SEP> 1.6 <SEP> 0,
28
<tb> 20 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 11.0 <SEP> 2.5 <SEP> 0.44
<tb> 24 <SEP> 39.9 <SEP> 5.7 <SEP> 1.0 <SEP> 17.3 <SEP> 4.0 <SEP> 0.69
<tb>
EMI13.6
48 3ô, 4 5.2 0.91 19.6 4.5 0.78
EMI13.7
<tb> 72 <SEP> 38.0 <SEP> 5.5 <SEP> 0.95 <SEP> 19.7 <SEP> 4.5 <SEP> 0.79
<tb> 168 <SEP> 38.0 <SEP> 5.5 <SEP> 0.95 <SEP> 16.0 <SEP> 3.7 <SEP> 0.64
<tb>
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EXAMPLE
In this example, we study the effect of the carbon source on the production of enzymes. In culture medium, 1.0% xylose is used. In another medium, 0.5% xylose and 0.5% potato starch are used.
As can be seen from Table III below, the media containing starch and xylose cause a higher fructose forming activity compared to that of xylose media, and in particular. with regard to inducing intracellular glucose isomerase enzymatic activity.
TABLE III
EMI14.1
<tb>
<tb> Micro- <SEP> Source <SEP> Activity <SEP> Enzy- <SEP> Activated <SEP> enzymatic organism <SEP> of <SEP> car- <SEP> matic <SEP> of <SEP> glu- <SEP > that <SEP> da <SEP> glucose-
<tb>
EMI14.2
bone cose-isomerase 'ismerase-extra- ¯. ¯¯¯¯ intracellular #ilular #############% fructoSe -% fructose
EMI14.3
<tb>
<tb> trained <SEP> trained
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> ATCC <SEP> Xylose <SEP> 39.3 <SEP> 5.0
<tb> - <SEP> N <SEP> 21113 <SEP> starch
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> ATCC <SEP> Xylose <SEP> 24.5 <SEP> 3.5
<tb> N <SEP> 2113
<tb>
EMI14.4
S, olivochromoi5en2E6 Xylose 26.6 - ATCC N "21114 starch S. clivochromoizenesxylose 14.9 ATCÇ N 2flflfl4
We do not fully understand the particular effect that starch has on fructose production when used as a! culture centre.
However, it is believed that starch somewhat induces or activates the growth of microorganisms, and therefore increases the resulting enzyme activity.
EXAMPLE
In another series of studies, the enzyme production activity of S. venezuelae is monitored over various periods of culture. As shown below, the activity of intracellular glucoae isomerase is still maintained at a substantially constant level even after 7 days. The extracellular enzymatic activity of this cell increases throughout the development period and reaches a constant maximum value after 5 days of culture.
Since during this time the intracellular enzyme activity does not decrease proportionally, this underlines the fact that the extracellular activity
EMI14.5
does not come from the eneymatiquo lntràc6llulairo activity released by the autolysis of cells.
EMI14.6
C -d 1 i '"... 1 .- .. 1! ¯" ,, ", -' C.-", "" -t ........ 1.L .: At .. . ::, 1.-
<Desc / Clms Page number 15>
To carry out this research, the following growth media were used for the culture of S. venezuelae ATCC N
EMI15.1
21113. The addition 't!' !!:!. T ':! 01nhlp. from corn to media containing xylose and starch as the nitrogen source appears to further enhance glucose isomerization.
The composition of the two environments. of culture used is as follows:
EMI15.2
<tb>
<tb> Medium <SEP> to <SEP> base <SEP> of extract <SEP> soluble <SEP> Medium <SEP> not <SEP> to <SEP> base <SEP> of extract <SEP> sodu <SEP > but <SEP> (g) <SEP> luble <SEP> from <SEP> Corn <SEP> (g)
<tb> Xylose <SEP> 0.5 <SEP> Xylose <SEP> 0.5
<tb> Starch <SEP> from <SEP> apple <SEP> from <SEP> earth <SEP> 0.5 <SEP> Starch <SEP> from <SEP> apple <SEP> from <SEP> earth <SEP> 0 , 5
<tb> Extract <SEP> soluble <SEP> from <SEP> but <SEP> 1.0 <SEP> Peptone <SEP> 1.0
<tb> Peptone <SEP> 0.5 <SEP> Meat extract <SEP> <SEP> 0.5
<tb> Extract <SEP> of <SEP> meat <SEP> 0.5 <SEP> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 0.25
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 0.25 <SEP> Sulfate <SEP> of <SEP> magnesium <SEP> 0.05
<tb> <SEP> Magnesium <SEP> <SEP> 0.05 <SEP> Cobalt <SEP> 0,
0024
<tb> <SEP> cobalt <SEP> <SEP> chloride <SEP> 0.0024
<tb>
The pH of the above media is 7.2 in both cases.
Tables IV and V below show the results of various searches. Table IV relates to the enzymatic activity of S, venezuelae originating from a culture medium containing soluble extract of corn. Table V shows the same activity from a medium containing no soluble extract of maize as indicated above. Slightly better results are obtained when the soluble corn extract is part of the nutrient medium.
EMI15.3
3E.¯ ....: .... ¯ .a. ¯ s¯ -.........
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TABLE IV
EMI16.1
<tb> Duration <SEP> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7. <SEP> 10
<tb>
EMI16.2
hours hours hours hours .i19.1.!. i1.2! ! ; 1ourf: L. days
EMI16.3
<tb> pH <SEP> 7.1 <SEP> 7.5 <SEP> 8.0 <SEP> 7.9 <SEP> 8.4 <SEP> 8.4 <SEP> 8.8 <SEP> 8 , 9 <SEP> 9.0
<tb> Enzymatic <SEP> intracellular <SEP> activity, <SEP>% <SEP> of <SEP> fructose
<tb> trained <SEP> 44.4 <SEP> 43.8 <SEP> 45.9 <SEP> 40.8 <SEP> 43.8 <SEP> 42.8 <SEP> 45.2 <SEP> 45 , 2 <SEP> 30.2
<tb> Extracellular <SEP> enzymatic <SEP> activity, <SEP>% <SEP> of <SEP> fructose
<tb> trained <SEP> 4.4 <SEP> 9.6 <SEP> 8.9 <SEP> 9.5 <SEP> 13.9 <SEP> 13.6 <SEP> 17.8 <SEP> 16 , 8 <SEP> 15,
1
<tb>
<Desc / Clms Page number 17>
TABLE V
EMI17.1
<tb> Duration <SEP> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10
<tb>, <SEP> hours <SEP> hours <SEP> hours <SEP> hours <SEP> days <SEP> bear <SEP> bear <SEP> days <SEP> days
<tb> pH <SEP> 7.3 <SEP> 7.6 <SEP> 7.75 <SEP> 8.1 <SEP> 8.2 <SEP> 8.4 <SEP> 8.6 <SEP> 9 , 0 <SEP> 9.0
<tb> Enzymatic <SEP> intracellular <SEP> activity, <SEP>% <SEP> of <SEP> fructose
<tb> trained <SEP> 39.3 <SEP> 40.3 <SEP> 41.2 <SEP> 37.0 <SEP> 40.3 <SEP> 40.8 <SEP> 32.2 <SEP> 40 , 3 <SEP> 34.5
<tb> Extracellular <SEP> enzymatic <SEP> activity, <SEP>% <SEP> of <SEP> fructose
<tb> trained <SEP> 3.2 <SEP> - <SEP> 4.3 <SEP> 5.4 <SEP> 5.0 <SEP> 11.6 <SEP> 14.6 <SEP> 13.4 <SEP> 8.0
<tb>
<Desc / Clms Page number 18>
EXAMPLE
In this example,
Again, various carbon sources are used to prepare the enzyme glucose isomerase, in this case an enzymatic preparation of intracellular glucose isomerase. As can be seen from the results shown in Table VI, the nutrient mixture of xylose-starch is markedly superior to produce more active glucose- isomerase enzyme preparations compared to the mixtures. based on xylose or starch alone as a nutrient medium.
TABLE VI
EMI18.1
<tb>
<tb> Source <SEP> of <SEP>% <SEP> fruc- <SEP> mg <SEP> of enzyme
<tb> Mioroorganieme <SEP> carbon <SEP> tose <SEP> by <SEP> ml <SEP> of <SEP> mixture <SEP> reaction
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> @ <SEP> tional
<tb>. #######. ##########
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> Xylose-starch <SEP> (melanATCC <SEP> N <SEP> 21113 <SEP> ge <SEP> to <SEP> 50-50 <SEP> for <SEP> hundred <SEP> 35.5 <SEP> 12.5
<tb> in <SEP> weight)
<tb> "<SEP> Xylose <SEP> 9.2 <SEP> 6.8
<tb> "<SEP> Starch <SEP> 0 <SEP> 5.9
<tb> "<SEP> Glucose <SEP> 0 <SEP> 13.5
<tb>
.
The total amount of nutrient medium used is the same in all cases
EXAMPLE 6;
In this example, a number of variables are investigated with respect to the production of extracellular and intracellular glucose isomerase enzyme preparations using the species S, venezuelae, ATCC N 21113.
First, the extracellular and intracellular enzymatic activities are studied with regard to the effect of pH.
The transformation reaction from the extracellular type reaches an optimum value at a pH of about 9.0. Intracellular activity is also optimal at a pH of about 9.0.
Also, various assays were performed to ascertain the effect that temperature has on the activities of extracellular and intracellular enzymes of S. venezuelae to promote transformation. The intracellular activity increases in a linear fashion over the entire temperature range of between 40 and 70 C approximately during reaction times of 1 and 3 hours. The optimum value is around 70 C. In the case of a reaction time of half an hour, the optimum temperature is 80 C. If the reaction time is greater than 1 hour;
<Desc / Clms Page number 19>
intracellular activity decreases above a temperature of about 70 ° C. The same effect of temperature on extracellular activity is noted, except that inaotivation occurs at a slightly higher temperature.
In another group of studies, concentrations of 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 moles of glucose are subjected to the action of the enzyme gluoose isomerase extracellular and intracellular. of S. venezuelae. It has been found that even at the highest concentration of 4.0 moles of glucose per liter, i.e. almost a state of saturated solution, the extracellular and intracellular enzymatic reactions proceed and approach: Theoretical equilibrium as the reaction period is extended. Thus, it can be seen that the invention is intended for the isomerization of glucose solutions, even highly concentrated, which makes it even more advantageous in an industrially feasible process.
In yet another series of tests, the isomerization reaction is carried out for a relatively long time in order to determine an approximate equilibrium point. Regarding interconversion using an intracellular enzyme from S. venezuelae; the fructose content reaches about 48% of the added sugar when carrying glucose. On the other hand, when fructose is the substrate, the final fructose content is about 50%. Thus, it seems that the equilibrium point is in the vicinity of an interconversion of about 48 to 50%.
EXAMPLE
It has been found during laboratory research that although a number of Streptomyces species exhibit extracellular glucose isomerase activity, a surprising number do not exhibit extracellular glucose isomerase enzymatic activity. Tests are carried out in the general manner indicated in Example 1 on a large number of Streptomyces species. The results for a few of these tests are shown below.
<Desc / Clms Page number 20>
TABLE VII
EMI20.1
<tb>
<tb> Microorganism <SEP> Activity <SEP> of <SEP> glucose-isomerase <SEP> extracellular Microorganism <SEP> re
<tb> mg <SEP> of <SEP> fructose <SEP> by <SEP> of <SEP> fructose <SEP> by <SEP> ml
<tb> ml <SEP> of <SEP> liquor <SEP> of <SEP> of <SEP> liquor <SEP> of <SEP> cultuculture <SEP> ne <SEP> ¯¯¯ <SEP>
<tb>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S <SEP> flaveolue <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> coelicolor <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S, <SEP> parvus <SEP> 1.4 <SEP> 0.24
<tb>
EMI20.2
S, roseochrcmo8er.ue 0 0
EMI20.3
<tb>
<tb> S.
<SEP> purpurascens <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S, <SEP> scabies <SEP> 1.3 <SEP> 0.23
<tb> S, <SEP> vinaceus <SEP> 1.6 <SEP> 0.28
<tb>
EMI20.4
S, tanashienais 1,9 - Os33 naturally, the invention is not limited to flow rate operating modes and is capable of receiving various variants within its scope and spirit.