CN116837045A - 一种化学-生物级联合成l-草铵膦的方法及突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化学‑生物级联合成L‑草铵膦的方法及突变体，以三氯化磷、二氯化磷和丙烯酸加成反应合成亚磷酸甲基丙烯酯，然后将亚磷酸甲基丙烯酯与乙醇钠缩合反应后，再与草酸二乙酯水解合成α‑酮酸‑2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，最后采用草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶共表达湿菌体或草铵膦脱氢酶突变体与醇脱氢酶共表达湿菌体为生物催化剂合成L‑草铵膦，解决了现有L‑草铵膦合成繁锁，不对称胺化还原活性不高和稳定性较差的问题。本发明工艺路线绿色、简单、温和，避免了合成D,L‑草铵膦所用剧毒氰化物，三废产生量较D,L‑草铵膦减少50％以上。本发明生物催化步骤转化率达到100％，无底物残留，产物ee值大于99％。

Description

一种化学-生物级联合成L-草铵膦的方法及突变体
(一)技术领域
本发明属于生物工程和化学化工技术领域，具体涉及生物催化剂、突变体和化学-生物级联合成L-草铵膦的新工艺。
(二)背景技术
草铵膦，也称草丁膦，英文名为Phsophinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，具有除草活性高、除草谱广及环境相容性好的特点，非常适合发展除草剂抗性基因。草铵膦抗性基因已经导入水稻、小麦、玉米、甜菜、烟草、大豆、棉花、马铃薯、番茄、油菜、甘蔗等20多种作物中，近年来已在美洲、亚洲、欧洲、澳洲等地区的农业大国推广种植这些转基因作物，应用前景非常广阔。但目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。其中含有50％D-草铵膦无除草活性，只有L-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。
生成L-草铵膦的方法有化学合成法、发酵法、生物合成法。其中，生物合成法中涉及到的酶类主要有：蛋白酶、脱乙酰基酶、转氨酶、酰胺酶、酯水解酶和腈水合酶。在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。
生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：
1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。
2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如Cao等人(CaoC-H,Cheng F,Xue Y-P,Zheng Y-G(2020)Efficient synthPseis of L-phosphinothricinusing a novel aminoacylase mined from Stenotrophomonas maltophilia.Enzyme andMicrobial Technology 135doi:10.1016/j.enzmictec.2019.109493)采用一种来源于Stenotrophomonas maltophilia的新型的氨基酰化酶手性拆分N-乙酰-PPT，得到L-草铵膦。用全细胞进行催化，在4小时内转化率>49％，获得了光学纯的L-PPT(>99.9％e.e.)。
3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与草铵膦脱氢酶。Bartsch(Bartsch K(2005)ProcPsPsefor the preparation of L-phosphinothrcine by enzymatic transamination withaspartate.US Patent no.US6936444B1)等利用PPO为底物，L-天冬氨酸为氨基供体，利用从土壤微生物中筛选分离出来的对PPO和L-天冬氨酸有特异性酶活的转氨酶进行催化，当底物浓度为552mM时，在非常高的温度(80℃)下反应4小时，转化率仍达到52％，时空产率为4.5g L-PPT/g·L-1·d-1。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是这是一个可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率无法达到100％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要加入至少2倍以上的L-天冬氨酸作为氨基供体，过量的天冬氨酸给L-PPT的分离带来了很大的麻烦。
而草铵膦脱氢酶具有NADH依赖型和NADPH依赖型两类，都能利用无机的氨供体进行不对称胺化反应，以PPO为底物合成L-草铵膦。区别是不同类型的草铵膦脱氢酶所需要的辅酶不同：NADH依赖型的草铵膦脱氢酶进行催化反应时需要辅酶NADH(CN114350631A)，而NADPH型草铵膦脱氢酶则需要NADPH(CN109609475A)。转化率均可达100％。然而底物PPO的化学合成也是制备L-草铵膦的关键所在，清洁安全的合成工艺是成功的关键，传统的D,L-草铵膦合成工艺涉及到剧毒氰化物，从传统路线出发寻找PPO的类似合成工艺不符合环保的理念。
为此，本发明从甲基亚磷酸二乙酯出发，经过加成、缩合和水解反应合成PPO，革除了剧毒氰化物的使用，三废产生量较DL-草铵膦减少50％以上。进一步通过生物无机胺化反应，不对称合成L-草铵膦。整个化学-酶法合成工艺过程简单，反应条件温和，工业化放大易于实现连续化生产。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种化学-生物级联合成L-草铵膦的方法及突变体，本发明以三氯化磷、二氯化磷和丙烯酸加成反应合成亚磷酸甲基丙烯酯，然后将亚磷酸甲基丙烯酯与乙醇钠进行缩合反应后，再与草酸二乙酯水解合成α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，最后采用活性高、稳定性好的草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶共表达湿菌体或草铵膦脱氢酶突变体与醇脱氢酶共表达湿菌体为生物催化剂，以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料催化合成L-草铵膦，解决了现有L-草铵膦合成繁锁，不对称胺化还原活性不高和稳定性较差的问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以三氯化磷、二氯化磷和丙烯酸(优选纯度98％)为原料，在温度100-150℃、压力0.5-5MPa条件下加成反应合成亚磷酸甲基丙烯酯；
(2)亚磷酸甲基丙烯酯与乙醇钠在温度40-80℃、压力1-5MPa条件下缩合反应后，再加入草酸二乙酯，调节pH至6-8(优选7.5)，在50-70℃下加热水解反应，反应液利用小型精馏塔回收副产物乙醇后，过滤除去氯化钠，得到α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液；
(3)以含草铵膦脱氢酶编码基因与醇脱氢酶编码基因的共表达重组大肠杆菌工程菌经发酵培养获得的湿菌体或含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因和醇脱氢酶编码基因共表达重组大肠杆菌工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以步骤(2)α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液为底物，加入异丙醇、NAD+，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在40-60℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的草铵膦脱氢酶的第73位或第91位进行单独突变或双突变获得的。
优选的，步骤(1)温度120℃、压力1MPa，反应时间6h。所述三氯化磷与二氯化磷投料质量比为1:1-3，优选1:1；所述丙烯酸体积用量以三氯化磷和二氯化磷总质量计为10-150L/kg，优选100L/kg。
优选的，步骤(2)缩合反应条件为：温度60℃、压力1.5MPa条件下反应8h；水解反应温度为60℃。亚磷酸甲基丙烯酯体积用量以乙醇钠质量计为20-50L/kg，优选36.5L/kg；乙醇钠与草酸二乙酯质量比为1:1-3，优选1:1。
优选的，步骤(3)反应体系中，湿菌体加入终浓度为10-40g/L(优选10g/L)，底物加入终浓度为200-800mM，优选200mM；异丙醇加入终浓度为200-1000mM，优选300mM；NAD+加入终浓度为0.4-0.8mM，优选0.6mM；所述反应介质优选为pH＝7.5的磷酸盐缓冲液。
优选的，步骤(3)草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸，V73C；(2)第91位蛋氨酸突变为甘氨酸，M91G；(3)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸且第91位蛋氨酸突变为甘氨酸，V73C-M91G。
本发明所述草铵膦脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如1所示；醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
优选的，步骤(3)所述催化剂制备方法为：将含草铵膦脱氢酶编码基因与醇脱氢酶编码基因的共表达重组大肠杆菌工程菌或含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因和醇脱氢酶编码基因共表达重组大肠杆菌工程菌接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。所述湿菌体产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于制备固定化细胞。
优选的，所述含草铵膦脱氢酶编码基因与醇脱氢酶编码基因的共表达重组大肠杆菌工程菌按如下方法构建：将醇脱氢酶基因ADH(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，通过Vazyme公司的One Step Cloning Kit构建至重组表达载体pETDuet-LcGluDH的MCS2(多克隆位点2)的NdeI和AvrⅡ上，获得共表达载体pETDuet-LcGluDH-ADH，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH。同样方法，构建含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因和醇脱氢酶编码基因共表达重组大肠杆菌工程菌。
本发明还提供一种用于合成L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的草铵膦脱氢酶的第73位或第91位进行单突变或双突变获得的，优选将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸，V73C；(2)第91位蛋氨酸突变为甘氨酸，M91G；(3)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸且第91位蛋氨酸突变为甘氨酸，V73C-M91G。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1)传统路线从现有的D,L-草铵膦出发通过拆分法获得L-草铵膦，而本发明路线创新地采用化学-生物级联合成技术，以常规化合物代替D,L-草铵膦为原料生产L-草铵膦，摒弃了采用Strecker反应先合成D,L-草铵膦再拆分获得L-草铵膦的技术路线。
2)本发明工艺路线绿色，因为路线中不需要合成D,L-草铵膦，所以避免了合成D,L-草铵膦所用剧毒氰化物，三废产生量较D,L-草铵膦减少50％以上。
3)本发明工艺过程简单，化学反应步骤和生物反应步骤条件温和，工业化放大易于实现连续化生产。
4)通过偶联本发明的草铵膦脱氢酶突变体和醇脱氢酶，生物催化步骤转化率达到100％，无底物残留，产物ee值大于99％，与现有方法相比，分离纯化便利。
(四)附图说明
图1为生物合成L-草铵膦的反应方程式示意图。
图2为实施例3中pETDuet-LcGluDH-ADH重组质粒的物理图谱。
图3为实施例3中的SDS-PAGE图；其中，泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为草铵膦脱氢酶LcGluDH和醇脱氢酶ADH共表达湿菌体超声破碎上清液。
图4为α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸标准品的高效液相色谱(HPLC)光谱分析图。
图5为D-PPT标准品和L-PPT标准品的高效液相色谱(HPLC)光谱分析图。
图6为用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH及突变体催化200mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸反应进程图。
图7为用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH及突变体催化800mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸反应进程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、亚磷酸甲基丙烯酯的规模化化学合成
在5m3高压反应釜中投入丙烯酸2000L(含量98％)，在100rpm搅拌下，加入1kg三氯化磷和1kg二氯化磷进行加成反应，控制反应温度120℃和压力1MPa，反应6小时后，反应液通过小型精馏塔回收副产物乙醇后，过滤除去氯化钠，得到亚磷酸甲基丙烯酯2500L。通过HPLC确定加成反应收率为96％。
实施例2、从亚磷酸甲基丙烯酯合成α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸
在5m3缩合反应釜内加入实施例1方法制备的亚磷酸甲基丙烯酯3000L和乙醇钠82kg，在反应温度60℃和压力1.5MPa下反应8小时后，加入草酸二乙酯86kg；再加入定量盐酸(通过反应pH测算)调节至pH7.5；然后进行加热反应，控制反应温度在60℃，同时蒸出副产乙醇用以精馏回收95％乙醇。反应完后，过滤除去氯化钠，得到α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液，其浓度为10mol/L，体积为3.2L，测得pH＝1.5。
实施例3：草铵膦脱氢酶母本工程菌和出发共表达菌株的构建及表达
1、草铵膦脱氢酶母本工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH
将来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的LcGluDH基因(NCBI登录号为WP_150701510.1)氨基酸序列进行密码子优化(密码子优化后的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，由杭州擎科生物技术有限公司进行基因合成，获得LcGluDH基因，克隆到质粒pETDuet的MCS1(多克隆位点1)的NcoI上，构建重组表达载体pETDuet-LcGluDH，保留质粒本身的His-Tag基因，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，送杭州擎科生物技术有限公司合成草铵膦脱氢酶母本工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH。
将草铵膦脱氢酶母本工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得草铵膦脱氢酶母本工程菌的湿菌体。
2、出发共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH
再从嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中克隆得到醇脱氢酶基因ADH(PDB登录号为1rjw，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示)，通过Vazyme公司的One Step Cloning Kit构建至重组表达载体pETDuet-LcGluDH的MCS2(多克隆位点2)的NdeI和AvrⅡ上，获得共表达载体pETDuet-LcGluDH-ADH(质粒图见图2)，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得草铵膦脱氢酶母本与醇脱氢酶的出发共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH。
将出发共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得出发共表达菌株的湿菌体。
取湿菌体0.2g，用10ml结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎15分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清进行琼脂糖凝胶电泳，SDS-PAGE图见图3所示。
实施例4、草铵膦脱氢酶突变体共表达文库的构建及筛选
1、草铵膦脱氢酶突变体共表达文库
草铵膦脱氢酶突变体共表达文库的制备通过随机点饱和突变来实现，引物设计如表1，以载体pETDuet-LcGluDH-ADH为模板，进行定点饱和突变PCR，PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，220转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、220转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑取长出的菌株，即为草铵膦脱氢酶突变体共表达文库。
突变PCR体系(100μL)为：2倍DNA taq聚合酶缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，DNA taq聚合酶0.5μL，10mM MnCl2溶液1μL，补ddH2O至50μL。
PCR条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟，最后72℃终延伸5分钟。
表1草铵膦脱氢酶定点饱和突变引物设计
引物名称 引物序列(5’-3’)
LcGluDH-73-F AGGTGGCNNKCGTTTTCATCCTATGGTTTCTGAA
LcGluDH-73-R GAAAACGMNNGCCACCTTTGGTGGGACCTACT
LcGluDH-91-F CATGTGGNNKACCCTGAAGTGCGGGATTGTAG
LcGluDH-91-R TCAGGGTMNNCCACATGCTCAGTGCTTTAACTTC
注，表1中N代表A/C/G/T，M代表A/C，K代表G/T。
2、草铵膦脱氢酶突变体共表达工程菌的诱导表达
将步骤1菌株分别接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。
以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于制备固定化细胞。
3、突变体共表达文库筛选
以实施例3方法制备的草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶出发共表达湿菌体或步骤2方法制备的草铵膦脱氢酶突变体与醇脱氢酶共表达湿菌体为催化剂，以中间产物α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物，以异丙醇为辅底物，外源添加微量NAD+，以pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质构成1mL反应体系，催化剂用量以湿菌体终浓度计10g/L，底物终浓度100mM，异丙醇终浓度120mM，NAD+终浓度0.4mM。55℃、600转/分钟反应5min，取反应液50μL，加5μL盐酸终止反应，反应液用超纯水稀释100倍，取200μL稀释后的反应液+400μL衍生化试剂(含15mM邻苯二甲醛、15mM N-乙酰-L-半胱氨酸的pH9.8的硼酸缓冲液)30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，收集滤液作为液相样品，液相检测测α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及e.e.值。以产物L-草铵膦和e.e.为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2和表3。
α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸液相检测条件：色谱柱UnitaryR○C18(4.6×250mm，Acchrom，China)，流动相乙腈：50mM磷酸二氢铵溶液(pH3.8，含10％四丁基氢氧化铵)体积比为12∶88。流速为1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温40℃，α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸保留时间为：11.1分钟。
草铵膦液相检测条件：色谱柱UnitaryR○C18(4.6×250mm，Acchrom，China)，流动相甲醇∶0.05M乙酸铵(pH 5.7)体积比为10∶90，流速1.0mL/min，检测波长Ex＝340nm、Em＝450nm，进样量10μL，柱温35℃。L-草铵膦、D-草铵膦保留时间分别为：13分钟，15.5分钟。
表2LcGluDH定点饱和突变后多酶催化反应的转化率(5min反应)
N.D.：检测不到
表3 LcGluDH及其突变体(共表达菌种)的催化性能和立体选择性
突变位点 L-草铵膦(mM) 转化率(％) e.e(％)
LcGluDH-ADH 1.482 12 99.9
LcGluDH-V73C-ADH 20.265 45 99.9
LcGluDH-M91G-ADH 26.525 60 99.9
LcGluDH-V73C-M91G-ADH 45.432 80.1 99.9
注：该转化率为100mM底物反应5min数据
表2表明，通过V73点饱和诱变和筛选，筛选到活力提高的菌株V73C；通过M91点饱和诱变和筛选，筛选到活力提高的菌株M91G。
通过表3可以看出，在添加外源NAD+条件下，草铵膦脱氢酶突变体V73C，可以把100mM PPO的转化率从12％提高到了45％。在添加外源NAD+条件下，草铵膦脱氢酶M91G的突变体，使300mM底物的转化率从从12％提高到60％。然后将V73C和M91G两个突变点进行组合突变，发现活力进一步提高，100mM底物的转化率达到80.1％。
实施例5：草铵膦脱氢酶母本及其突变体的纯化
将实施例3制备的草铵膦脱氢酶母本工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH的湿菌体，并根据实施例4筛选的草铵膦脱氢酶突变体共表达工程菌催化性能的结果，构建草铵膦脱氢酶单独表达的工程菌(E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-M91G、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-M91G)按实施例3母本工程菌湿菌体的方法制备草铵膦脱氢酶突变体的湿菌体。
分别取草铵膦脱氢酶母本工程菌及草铵膦脱氢酶突变体工程菌的湿菌体各0.2g，分别用10ml结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎15分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清，作为样品。
使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量以蛋白含量计为200mg，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH7.4、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.4、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，洗脱6个柱体积，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.4、20mM磷酸盐缓冲液中透析(透析袋截留分子量10kDa)过夜，收集截留液，分别获得草铵膦脱氢酶母本纯酶液10ml和草铵膦脱氢酶突变体纯酶液10ml；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。
纯酶液的蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定，结果见表4所示。
表4草铵膦脱氢酶母本及其突变体纯酶液蛋白浓度
酶 蛋白浓度
LcGluDH 0.24(μg/μL)
LcGluDH-V73C 0.5(μg/μL)
LcGluDH-M91G 0.4(μg/μL)
LcGluDH-V73C-M91G 0.22(μg/μL)
实施例6：草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活测定
酶活单位(U)定义为：在55℃、pH 7.5条件下，每分钟每生成1μmol的L-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。
酶活检测标准条件：取实施例5方法制备的蛋白含量为0.22mg的草铵膦脱氢酶母本及其突变体的纯酶，加入终浓度100mM的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，终浓度10mM辅酶NADH，构成反应体系，总体积为10mL；在55℃、pH 7.5，600转/分钟条件下反应10分钟，采用实施例4方法进行HPLC检测分析，结果见表5。
表5草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活
酶 相对酶活(％) e.e(％)
LcGluDH 100a 99.9
LcGluDH-V73C 25298±12.5 99.9
LcGluDH-M91G 3125.8±10..8 99.9
LcGluDH-V73C-M91G 3986.2±17.5 99.9
a：在标准条件下，每个草铵膦脱氢酶母本的初始酶活均指定为100％。
实施例7：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH转化200mM的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入200mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度240mM异丙醇、0.4mM的NAD+、10g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图6)，底物残余浓度为150mM，转化率为25％，L-PPT为48mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸标准品的液相色谱图见图4所示，D-PPT和L-PPT标准品的液相色谱图见图5所示。
实施例8：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-ADH转化200mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入200mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度240mM异丙醇、0.4mM的NAD+、10g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图6)，底物残余浓度为63mM，转化率为68.5％，L-PPT为136mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例9：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-M91G-ADH转化200mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入200mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度240mM异丙醇、0.4mM的NAD+、10g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-M91G-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图6)，底物残余浓度为40mM，底物转化率为80％，L-PPT为159mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例10：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-M91G-ADH转化200mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在1L反应器中，加入200mL实施例2方法制备的2M的底物α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度240mM异丙醇、0.4mM的NAD+、10g/L的实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图6)，底物残余浓度为0mM，底物转化率为100％，L-PPT为199mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例11：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH转化800mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入800mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，之后加入终浓度960mM异丙醇、0.8mM的NAD+、40g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图7)，底物残余浓度为560mM，底物转化率为30％，L-PPT为239mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例12：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-ADH转化800mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入800mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度960mM异丙醇、终浓度0.8mM的NAD+、40g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图7)，底物残余浓度为240mM，底物转化率为70％，L-PPT为559mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例13：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-M91G-ADH转化800mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入800mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度960mM异丙醇、终浓度0.8mM的NAD+、40g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-M91G-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图7)，底物残留浓度为120mM，底物转化率为85％，L-PPT为680mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。
实施例14：E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-M91G-ADH转化800mMα-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸
在3L普通搅拌反应釜中，加入800mL实施例2方法制备的2M的α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸溶液，用氨水将pH调至7.5，加入终浓度960mM异丙醇、终浓度0.8mM的NAD+、40g/L实施例3方法制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-LcGluDH-V73C-M91G-ADH菌体，用pH＝7.5的磷酸盐缓冲液将反应体系补足到2000mL，在温度55℃、150rpm下反应15小时，反应液采用实施例4方法液相检测(图7)，底物残留浓度为0mM，底物转化率为99.9％，L-PPT为799mM，产品L-草铵膦的ee值为99.9％。

Claims (10)

1.一种化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以三氯化磷、二氯化磷和丙烯酸为原料，在温度100-150℃、压力0.5-5MPa条件下加成反应合成亚磷酸甲基丙烯酯；
(2)亚磷酸甲基丙烯酯与乙醇钠在温度40-80℃、压力1-5MPa条件下缩合反应后，再加入草酸二乙酯，调节pH至6-8，在50-70℃下加热水解反应，反应液精馏回收副产物乙醇后过滤除去氯化钠，取滤液，得到α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液；
(3)以含草铵膦脱氢酶编码基因与醇脱氢酶编码基因的共表达重组大肠杆菌工程菌经发酵培养获得的湿菌体或含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因和醇脱氢酶编码基因共表达重组大肠杆菌工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以步骤(2)α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液为底物，加入异丙醇、NAD+，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在40-60℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的草铵膦脱氢酶的第73位或第91位进行单独突变或双突变获得的。
2.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(1)所述三氯化磷与二氯化磷投料质量比为1:1-3；所述丙烯酸体积用量以三氯化磷和二氯化磷总质量计为10-150L/kg。
3.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(2)缩合反应条件为：温度60℃、压力1.5MPa条件下反应8h；水解反应温度为60℃。
4.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(2)亚磷酸甲基丙烯酯体积用量以乙醇钠质量计为20-50L/kg；乙醇钠与草酸二乙酯质量比为1:1-3。
5.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(3)反应体系中，湿菌体加入终浓度为10-40g/L，底物加入终浓度为200-800mM；异丙醇加入终浓度为200-1000mM；NAD+加入终浓度为0.4-0.8mM。
6.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(3)草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸；(2)第91位蛋氨酸突变为甘氨酸；(3)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸且第91位蛋氨酸突变为甘氨酸。
7.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(3)所述催化剂制备方法为：将含草铵膦脱氢酶编码基因与醇脱氢酶编码基因的共表达重组大肠杆菌工程菌或含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因和醇脱氢酶编码基因共表达重组大肠杆菌工程菌接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃培养14小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。
8.如权利要求1所述化学-生物级联合成L-草铵膦的方法，其特征在于所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.一种用于权利要求1所述方法合成L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述草铵膦脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的草铵膦脱氢酶的第73位或第91位进行单突变或双突变获得的。
10.如权利要求9所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸；(2)第91位蛋氨酸突变为甘氨酸；(3)第73位缬氨酸突变为半胱氨酸且第91位蛋氨酸突变为甘氨酸。
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