CN103388002A - 一种产l-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用 - Google Patents

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牛盼清
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Abstract

本发明阐述了一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用，属于基因工程与酶学品领域，将重组产生的谷氨酸氧化酶包涵体进行蛋白变性、复性和浓缩，使30％的蛋白包涵体恢复活性，通过对重组酶的酶学性质研究，发现重组酶最适pH8.5，最适温度35℃，Mn2+可以使酶比活力提高20％以上，而外源添加FAD对酶活力没有影响；结合酶学特征，将重组酶添加到含有20g/L的谷氨酸钠pH8.5的缓冲液中，35℃转化12h可以生成8.3g/L的α-酮戊二酸。

Description

一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及酶学领域中一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用。
背景技术
L-谷氨酸氧化酶目前主要发现存在于链霉菌属中，Streptomyces platensis NTU3304，Streptomyces sp.X-119-6，Streptomyces sp.Z-11-6，Streptomyces endus and Streptomycesghanaensis都已报道可以生产L-谷氨酸氧化酶，谷氨酸氧化酶可以氧化1moL L-谷氨酸需要1moL O2和1moL和H2O，生成1moLα-酮戊二酸、1moL NH3和1moL H2O2。目前国内外研究主要集中在利用该反应来测定食品及发酵过程中谷氨酸的含量，最近的研究发现该酶可以用来测定生物流体中谷丙转氨酶与谷草转氨酶含量，从而对心脏与肝脏疾病作出早期诊断。
L-谷氨酸氧化酶首是一种胞外酶，以FAD作为辅因子，该酶具有很高的底物专一性，而目前野生菌株生产该酶酶活产量都比较低，1993年，华东化工学院生化工程研究所的徐水清和李友荣，用链霉菌p-26，经L-谷氨酸诱导培养能形成胞外L-谷氨酸氧化酶，其粗酶液活力大约为0.2U/mL。目前对谷氨酸氧化酶重组菌株的构建也有报道，主要是来自Streptomycessp.X-119-6的基因，产生的是包涵体或者前提，都没有活性。
而利用L-谷氨酸氧化酶来生产α-酮戊二酸的酶法转化的尚未有报道，由于酶催化反应条件比较温和，通常在常温、常压、pH值近中性的条件下进行，可减少或避免强酸、强碱或有毒物质的使用，从而减轻对环境的污染；转化率高，通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；专一性强，不需要对集团进行保护，所形成的副产物少，手性和旋光性好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组生产L-谷氨酸氧化酶菌株的构建方法，及重组酶的性质和应用。
本发明的技术方案：
1.将来自于Streptomyces ghanaensis ATCC14672菌株的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)提取出来与表达载体pET20b(重组蛋白分泌到周质空间)与pET28a(重组蛋白形成于胞内)连接，分别导入E.coli BL21中构建两株重组菌株；目的基因可以PCR扩增出来，由大肠杆菌JM109中克隆得到。构建重组菌株的方法：
1)将PCR得到的目的基因与载体pET20b和pET28a连接，转入大肠杆菌JM109中测序验证得到正确的重组质粒。
2)将构建好的重组质粒转入表达菌株E.coli BL21中，得到重组菌株，转化方法包括化学转化法，电转法，冷冻法及结合转化法，并对构建好的菌株进行测序验证。
2.对两株重组菌株进行IPTG诱导表达，发现重组产生的是包涵体没有活性，蛋白大小为73KDa，经过蛋白复性，有30％的蛋白回复了活性；其中IPTG诱导温度为25-37℃，浓度0.4mmol/L，诱导4-6h；蛋白复性流程如图1。
3.对纯化得到的谷氨酸氧化酶进行生物化学特性研究，该酶最适pH8.5，pH7.5-pH9.5之间酶活力保持在80％以上；温度35℃，在20-40℃下放置12h，酶活力在80％以上；Mn2+对该酶酶活有明显的提高作用，外源添加FAD对该重组酶活性没有影响，该重组酶具有较高底物专一性。
4.将纯化获得的有活性的谷氨酸氧化酶进行转化实验，以谷氨酸钠为转化底物，在pH8.5磷酸盐缓冲液中35℃转化12h，可以得到α-酮戊二酸8.3g/L。
附图说明
图1L-谷氨酸氧化酶蛋白复性流程图。
图2诱导表达的重组谷氨酸氧化酶蛋白电泳图谱。
图3重组酶最适pH测定结果。
图4重组酶最适温度测定结果。
图5重组酶温度稳定性测定结果。
图6不同金属离子对重组酶活力影响测定结果。
图7不同底物浓度对重组酶转化测定结果。
具体实施方式：
1、重组菌株的构建：
1)用引物1：5′CATGCCATGGCAATGACTGAAGATCACGCGG3′和引物2：5′CCCAAGCTTGCGCTGTGTGGATCTCCAAG3′将来自于Streptomyces ghanaensisATCC14672的基因(NCBI序列号：EFE71695.1)组进行PCR扩增：体系中加入LA taq酶，95℃预处理9min，95℃解链30s，65℃退火30s，72℃延伸2.2min，30个循环；
2)用限制性内切酶Nco I和HindIII将目的基因和表达载体pET20b和pET28a37℃酶切2h；
3)用T4连接酶分别将酶切后的目的基因和质粒pET20b和pET28a16℃连接10h用化学转化法转入表达菌株E.coli BL21中，并涂布于含有氨苄青霉素和卡纳青霉素的LB平板中培养12h；
4)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的两株菌株；将两株菌株接种于含有相应抗生素的LB培养基中37℃诱导5h，进行蛋白电泳，发现目的条带大小在73KDa(图2)，并形成的是包涵体，没有活性。
2、包涵体的复性：
将构建好的重组菌株接种于LB培养基中，OD600为0.5-0.6之间时，加入0.4mmol/L IPTG37℃诱导5h，发酵液8000rpm离心20min，倒掉上清液，菌体用缓冲液A：20mM的Tris-HCl(pH8.0)重悬细胞，超声破碎20min；破碎后的细胞8000rpm离心30min，沉淀用缓冲液B：20mM Tris-HCl，2M urea，2mM EDTA，pH8.0洗涤两次，8000rpm离心30min倒掉上清液；沉淀用缓冲液C：20mM Tris-HCl，8M urea，2mM EDTA，10uM FAD，50mM DTT溶解，4℃放置12h；8000rpm离心30min取上清液用缓冲液C稀释至蛋白浓度小于0.1mg/mL后加入透析袋中，用缓冲液D：20mM Tfis-HCl，1M NaCl于4℃流速0.5mL/min逐步稀释36h；将复性好的蛋白用超滤管浓缩至1mL，得到有活性的重组谷氨酸氧化酶。
3、酶学性质研究
将复性好的谷氨酸氧化酶在pH4.5-10.5下测定其比活力结果如图3所示，发现重组酶最适pH8.5，在pH7.5-9.5之间酶比活力都在80％以上；如图4所示，20-60℃下测定最适温度为35℃，20，30，40，50，60，70和80℃下测定酶的稳定性结果如图5所示，发现20-40℃放置12h酶比活力保持在80％以上，温度大于50℃酶比活力迅速下降；添加5mM的不同金属离子，结果如图6所示，发现Mn2+，Ca2+和Mg2+有利于酶活力的提高，其中Mn2+最有利于酶活力的提高，酶比活力增加了20％。
4、重组L-谷氨酸氧化酶底物特异性实验：
根据Trinder反应，用pH7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度11mg/mL的L型氨基酸溶液进行显色反应测定，30℃准确反应30min后，i00℃下煮沸5min，在550nm下进行测定。
Figure BSA0000092891510000031
5、转化谷氨酸钠生产α-酮戊二酸
将复性后的重组酶加入到含有不同浓度的谷氨酸钠pH8.5缓冲液中，35℃转化12h，结果如图7所示，谷氨酸钠浓度小于20g/L时，α-酮戊二酸产量随着底物浓度的增大而增加，谷氨酸钠浓度为20g/L时，α-酮戊二酸产量达到最大值8.3g/L，谷氨酸钠浓度大于20g/L时，α-酮戊二酸产量不再增加。

Claims (4)

1.一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法，其特征如下：
1)通过构建重组质粒，将谷氨酸氧化酶基因表达于E.coli BL21中构建重组菌株，该菌株具有产生L-谷氨酸氧化酶的能力；
2)菌株产生的L-谷氨酸氧化酶是包涵体，没有蛋白质活性。
2.根据权利要求1所获得的由重组菌株产生的谷氨酸氧化酶包涵体经过蛋白变性，复性，浓缩，使30％以上的蛋白包涵体恢复活性。
3.根据权利要求2所得到的具有活性的谷氨酸氧化酶，其酶学性质如下：
1)最适pH范围为7.5-9.5；
2)最适温度为30-40℃，重组酶在20-40℃放置12-24h，酶的比活力保持在80％以上；
3)Mn2+、Ca2+和Mg2+对酶的活性有促进作用，酶的比活力分别能提高20％、5％和5％以上，而Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+和Ag+对酶活力有抑制作用，Ag+抑制作用显著，使酶的比活力下降到10％以下；
4)外源添加FAD对重组酶的活力没有影响；
5)该重组酶具有底物专一性。
4.根据权利要求1和2得到的具有活性的谷氨酸氧化酶可以将谷氨酸和谷氨酸钠转化生成α-酮戊二酸，转化率大于40％，其转化条件：底物谷氨酸钠浓度为10-25g/L，pH7.5-9.5，30-40℃转化8-16h。
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