CN109988786A - 一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 - Google Patents
一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109988786A CN109988786A CN201910241528.0A CN201910241528A CN109988786A CN 109988786 A CN109988786 A CN 109988786A CN 201910241528 A CN201910241528 A CN 201910241528A CN 109988786 A CN109988786 A CN 109988786A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- content
- pidolidone
- substrate
- ketoglutaric acid
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 91
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 25
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 abstract description 7
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 abstract description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 abstract description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 5
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种增加酶催化制备α‑酮戊二酸转化率的方法，包括以下步骤：在酶催化L‑谷氨酸或L‑谷氨酸盐制备α‑酮戊二酸的过程中，监测丁二酸的含量，通过流加过氧化氢酶，控制丁二酸的含量不超过0.1‑1.0g/L。采用本发明的方法可以提高L‑谷氨酸(钠)的转化率至99‑100％，减少副产物的生成，有利于α‑酮戊二酸的分离纯化。通过分批添加底物，产物浓度最高达130g/L以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法。
背景技术
α-酮戊二酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品领域。市场上应用作为广泛的是作为功能性运动型饮料或食品的原料，如精酮、鸟酮(1:1或2:1)等。
α-酮戊二酸的主要生产方法包括：化学合成法、微生物发酵法和生物酶催化法。其中，化学合成法涉及到有害试剂，对生态环境有较为负面的影响，目前α-酮戊二酸的合成已经很少使用化学合成法。微生物发酵法生产α-酮戊二酸，具有制备条件温和、环境友好等优势，但缺点是生产周期较长、产物浓度较低、副产物多、分离纯化困难、生产成本高等。如CN101717735中改造了丙酮酸工业生产菌株，将代谢流导向TCA循环，过量积累α-酮戊二酸，最终产物浓度为31.7g/L，仍处于较低水平，没有工业化生产价值。CN102676438A中构建了一株大肠杆菌基因工程菌，48h发酵α-酮戊二酸含量达90g/L，但其纯度仅为95％，杂酸较多，不利于分离纯化。
酶催化制备α-酮戊二酸，具有反应条件温和，控制简单，周期短，产率高，环保压力小等优势。而在酶催化法中，一般使用L-谷氨酸氧化酶，有是否串联表达过氧化氢酶的基因工程菌之分；近年也有L-谷氨酸脱氢酶的报道，如CN106834366A中使用L-谷氨酸脱氢酶制备α-酮戊二酸，但该酶需要额外添加辅因子(NAD或NADP)导致成本较高，不利于工业化生产。串联表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的优势是减少了外源添加的原料成本，简化了转化工艺，缺点是由于过氧化氢酶的稳定性本身也受到过氧化氢的负面影响，不利于α-酮戊二酸的大量积累。如CN106047913A中串联表达双酶，最大产物浓度127.1g/L，但转化率仅为96.9％，其平均转化率仅在95％左右，转化率较低意味这副产物多，不利于分离纯化。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法。采用本发明的方法，α-酮戊二酸的转化率可达99-100％，同时可以达到较高的产物积累，最高可达130g/L以上。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法，包括以下步骤：
在酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸的过程中，监测丁二酸的含量，通过流加过氧化氢酶，控制丁二酸的含量为0.1-1.0g/L。
由于反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，需要对反应体系中的丁二酸的含量进行控制，以保证α-酮戊二酸的转化率。经试验发现，将体系中的丁二酸含量控制在0.1-1.0g/L，α-酮戊二酸的转化率较高。若丁二酸的含量高于1.0g/L，说明过氧化氢的残留较高，不仅对酶活产生不利影响，而且也不利于α-酮戊二酸的稳定性；若过量添加过氧化氢酶将丁二酸的含量控制在更低水平(如0.1g/L以下)，则过量的过氧化氢酶会抑制L-谷氨酸氧化酶的活性，导致α-酮戊二酸的转化率降低。
优选的，所述酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸具体为：
以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为底物，加入一水合硫酸锰和过氧化氢酶，调节pH至6.5，再加入L-谷氨酸氧化酶，转化反应14-20h。
本发明在酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸的过程中，加入一水合硫酸锰可以作为酶的激活剂，有效提高了过氧化氢酶和L-谷氨酸氧化酶的酶活力。
更优选的，所述底物采用分批加入的形式。
进一步的，所述底物的初始浓度为120-130g/L，待反应至底物含量低于50g/L后，再补加底物至底物浓度为80-100g/L，继续反应。
由于存在底物抑制现象，底物浓度过高会抑制酶活，因此，为提高产物α-酮戊二酸的积累，本发明采用分批加入的形式，经试验发现，将底物的初始浓度设置为120-130g/L，待反应至底物含量低于50g/L后，再补加底物，继续反应，可以达到较高的产物积累，最高可达130g/L以上。
更优选的，每1L的反应体系中，过氧化氢酶的酶活力为30-60W单位；L-谷氨酸氧化酶生物酶活力为4000-8000U。
更优选的，所述转化反应的条件为：控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa。
经试验发现，采用上述的转化反应条件可以提高α-酮戊二酸的转化率。
优选的，采用HPLC法监测丁二酸的含量。
进一步的，HPLC法监测丁二酸的含量所采用的色谱条件为：色谱柱为月旭XtimateSugar-H，5μm，7.8*300mm。流动相为5mM硫酸，紫外检测器，波长为210nm，流速为0.2-1.0ml/min，柱温25-40℃。
优选的，流加的过氧化氢酶的酶活力为5-40W单位/ml。
由于L-谷氨酸氧化酶加入反应体系后就会立即产生过氧化氢，本发明将过氧化氢酶分成两部分加入，其中一部分先加入是保证反应刚开始时丁二酸积累不会过高，从而影响酶活及转化率；另一部分的过氧化氢酶采用流加的方式加入，一方面避免初始过氧化氢酶的浓度过高，影响L-谷氨酸氧化酶的活性，另一方面可以控制反应过程中丁二酸的含量，提高α-酮戊二酸的转化率。
本发明的有益效果：
(1)与现有的外源添加过氧化氢酶制备α-酮戊二酸相比，采用本发明的方法能够最大化的利用过氧化氢酶，节省了成本，提高了转化率，减少了副产物的发生，有利于α-酮戊二酸的分离纯化。
(2)与现有的串联表达双酶体系制备α-酮戊二酸相比，采用本发明的方法制备α-酮戊二酸的转化率更高，可达99-100％，同时可以达到较高的产物积累，最高可达130g/L以上。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，现有的酶催化制备α-酮戊二酸一般是以L-谷氨酸或谷氨酸钠为底物，采用L-谷氨酸氧化酶将底物转化生成过氧化氢、氨和α-酮戊二酸。由于反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系中需要加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。
但是，由于过氧化氢酶的稳定性和酶活性受过氧化氢的负面影响，使得外源加入的过氧化氢酶对产物α-酮戊二酸的保护效果欠佳，α-酮戊二酸的转化率仍有待进一步提高。
基于此，本发明创新了外源过氧化氢酶的加入方式，将过氧化氢酶分成两部分加入，其中一部分与L-谷氨酸氧化酶共同加入形成转化体系；另一部分的过氧化氢酶采用流加的方式加入，通过监测转化体系中丁二酸的含量，流加过氧化氢酶，将丁二酸的含量控制在0.1-1.0g/L以内。结果发现，采用本发明的方法极大的提高了α-酮戊二酸的转化率，可达99-100％，减少了副产物的生成，有利于α-酮戊二酸的分离纯化。
为进一步的提高产物浓度，本发明创新性的采用底物分批加入的形式，控制底物的初始浓度为120-130g/L，待反应至底物含量低于50g/L后，再加入底物至底物浓度为80-100g/L，继续反应。采用上述方法可以达到较高的产物积累，最高可达130g/L以上。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
126g L-谷氨酸钠，加入800mL水中，加入一水合硫酸锰0.507g，保温30℃搅拌使其完全溶解，加入1mL 40W单位/mL的过氧化氢酶，调节pH至6.5，最后加入用PBS混悬的L-谷氨酸氧化酶酶液，定容至1L，L-谷氨酸氧化酶的总酶活为6000U。控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa，开始反应，HPLC监测丁二酸的含量，流加5W单位/mL过氧化氢酶溶液控制丁二酸含量在0.1-0.5g/L。14h后，反应液体积为1050ml，测定α-酮戊二酸含量为102.9g/L。按下式测定摩尔转化率：
摩尔转化率
C1—α-酮戊二酸的浓度(g/L)；
V—反应结束后反应体系的体积(L)；
Mr2—L-谷氨酸钠的分子的量(169g/mol)；
Mr1—α-酮戊二酸的分子的量(146g/mol)；
m—L-谷氨酸钠的质量(g)
转化率为99.25％。
实施例2：
126gL-谷氨酸钠，加入800mL水中，加入一水合硫酸锰0.507g，保温30℃搅拌使其完全溶解，加入1mL 40W单位/mL的过氧化氢酶，调节pH至6.5，最后加入用PBS混悬的L-谷氨酸氧化酶酶液，定容至1L，L-谷氨酸氧化酶的总酶活为6000U。控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa，开始反应，HPLC监测丁二酸的含量，流加5W单位/mL过氧化氢酶溶液控制丁二酸含量不超过0.1-0.2g/L。反应至L-谷氨酸钠含量低于50g/L后，再加入30g L-谷氨酸钠继续反应，20h后，反应液体积为1082ml，测定α-酮戊二酸含量为124.1g/L。转化率为99.63％。
实施例3：
126gL-谷氨酸钠，加入800mL水中，加入一水合硫酸锰0.507g，保温30℃搅拌使其完全溶解，加入1mL 40W单位/mL的过氧化氢酶，调节pH至6.5，最后加入用PBS混悬的L-谷氨酸氧化酶酶液，定容至1L，L-谷氨酸氧化酶的总酶活为8000U。控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa，开始反应，HPLC监测丁二酸的含量，流加10W单位/mL过氧化氢酶溶液控制丁二酸含量不超过0.1-0.2g/L。反应至L-谷氨酸钠含量低于50g/L后，再加入50g L-谷氨酸钠继续反应，20h后，反应液体积为1121ml，测定α-酮戊二酸含量为135.5g/L。转化率为99.90％。
对比例1：
126gL-谷氨酸钠，加入800mL水中，加入一水合硫酸锰0.507g，保温30℃搅拌使其完全溶解，加入10mL 40W单位/mL的过氧化氢酶，调节pH至6.5，最后加入用PBS混悬的L-谷氨酸氧化酶酶液，定容至1L。控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa，反应14h后，测定α-酮戊二酸含量为103.8g/L，转化率为95.35％。
对比例2：
126gL-谷氨酸钠，加入800mL水中，保温30℃搅拌使其完全溶解，加入10mL 40W单位/mL的过氧化氢酶，调节pH至6.5，最后加入用PBS混悬的L-谷氨酸氧化酶酶液，定容至1L。控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa，反应20h后，测定α-酮戊二酸含量为97.8g/L，转化率为92.20％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸的过程中，监测丁二酸的含量，通过流加过氧化氢酶，控制丁二酸的含量为0.1-1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸具体为：
以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为底物，加入一水合硫酸锰和过氧化氢酶，调节pH至6.5，再加入L-谷氨酸氧化酶，转化反应14-20h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物采用分批加入的形式。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述底物的初始浓度为120-130g/L，待反应至底物含量低于50g/L后，再加入底物至底物浓度为80-100g/L，继续反应。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1L的反应体系中，一水合硫酸锰的加入量为0.507g。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1L的反应体系中，过氧化氢酶的酶活力为30-60W单位；L-谷氨酸氧化酶生物酶活力为4000-8000U。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转化反应的条件为：控制搅拌转速400rpm，通气量≥0.4vvm，罐压保持0.05MPa。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用HPLC法监测丁二酸的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，HPLC法监测丁二酸的含量所采用的色谱条件为：色谱柱为月旭Xtimate Sugar-H，5μm，7.8*300mm；流动相为5mM硫酸，紫外检测器，波长为210nm，流速为0.2-1.0ml/min，柱温25-40℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流加的过氧化氢酶的酶活力为5-40W单位/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910241528.0A CN109988786B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910241528.0A CN109988786B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109988786A true CN109988786A (zh) | 2019-07-09 |
| CN109988786B CN109988786B (zh) | 2022-04-05 |
Family
ID=67131790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910241528.0A Active CN109988786B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109988786B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116813466A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-09-29 | 江苏惠利生物科技有限公司 | 一种α-酮戊二酸的制备工艺 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152498A (zh) * | 2014-07-31 | 2014-11-19 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法 |
| CN106834366A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-06-13 | 南京工业大学 | 一种利用L‑谷氨酸脱氢酶催化生产α‑酮戊二酸的方法 |
| CN108486173A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-04 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种α-酮戊二酸的制备方法 |
-
2019
- 2019-03-28 CN CN201910241528.0A patent/CN109988786B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152498A (zh) * | 2014-07-31 | 2014-11-19 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法 |
| CN106834366A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-06-13 | 南京工业大学 | 一种利用L‑谷氨酸脱氢酶催化生产α‑酮戊二酸的方法 |
| CN108486173A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-04 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种α-酮戊二酸的制备方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116813466A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-09-29 | 江苏惠利生物科技有限公司 | 一种α-酮戊二酸的制备工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109988786B (zh) | 2022-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| San et al. | Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution in Escherichia coli | |
| US5897995A (en) | Enzymatic production of gluconic acid or its salts | |
| Conlon et al. | Two‐step immobilized enzyme conversion of cephalosporin C to 7‐aminocephalosporanic acid | |
| CN107119002B (zh) | 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用 | |
| CN104531629B (zh) | 一种提高aa‑2g转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 | |
| CN105821066B (zh) | 一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株 | |
| Bommarius et al. | Operational Stability of Enzymes: Acylase‐Catalyzed Resolution of N‐Acetyl Amino Acids to Enantiomerically Pure l‐Amino Acids | |
| US10428361B2 (en) | Biocatalytic production of l-fucose | |
| CN106868030B (zh) | 重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用 | |
| CN107686850A (zh) | 一种利用共表达重组菌株转化生产α‑酮戊二酸的方法 | |
| CN109988786A (zh) | 一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法 | |
| CN109679979A (zh) | 表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法 | |
| Träger et al. | Comparison of direct glucose oxidation by Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans and Aspergillus niger in a pilot scale airlift reactor | |
| CN114540440A (zh) | 一种加压催化制备2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的方法 | |
| CN103074400B (zh) | 一种棕榈酰辅酶a的制备方法 | |
| CN111635893A (zh) | 一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用 | |
| CN111705043A (zh) | 一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用 | |
| CN112143692A (zh) | 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用 | |
| US20230016226A1 (en) | Selective process for the preparation of sulfones by enzymatic catalysis | |
| US20220259624A1 (en) | Selective process for preparing sulfoxides by enzymatic catalysis | |
| CN116904382B (zh) | 联产二羟基丙酮和波色因的宿主细胞及方法 | |
| CN114457133B (zh) | 一种以n-乙酰葡萄糖胺发酵液为底物全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的方法 | |
| EP0745677A1 (en) | Enzymatic production of gluconic acid or its salts | |
| US20230242953A1 (en) | Engineered Bacterial Strain and Method of Use for One-Pot Vitamin C Synthesis | |
| KR20030035139A (ko) | 효소반응을 이용한 글루콘산 마그네슘의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method of increasing enzyme catalyzed preparation a- Method for determining the conversion rate of ketoglutaric acid Effective date of registration: 20231213 Granted publication date: 20220405 Pledgee: Shantou Bay Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANTOU JIAHE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.|XINTAI JIAHE BIOTECH CO.,LTD. Registration number: Y2023980071291 |