CN114350564A - 一种沙福芽孢杆菌lg01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种沙福芽孢杆菌LG01及其应用。本发明公开了一种沙福芽孢杆菌LG01，保藏编号为CCTCC No:M 20211624。该沙福芽孢杆菌具有多种功能特性：(1)对白假丝酵母及黑曲霉等真菌具有抑制活性；(2)对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特氏菌等革兰氏阳性细菌，嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌等革兰氏阴性细菌以及青枯劳尔氏菌等革兰氏阴性植物病原细菌均具有抑制活性；(3)可产蛋白酶；(4)可产纤维素酶；(5)可形成强粘附生物被膜。上述功能特性使该沙福芽孢杆菌具有多样化的应用形式，比如制备植物定殖剂、植物生防剂、生物有机肥、微生物饲料等，应用前景广阔。

Description

一种沙福芽孢杆菌LG01及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种沙福芽孢杆菌LG01及其应用。
背景技术
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)是芽孢杆菌的一种，革兰氏染色呈阳性，嗜温异养。最早是在2006年喷气推进实验室中的航天器和组装设施表面分离获得的。之后，沙福芽孢杆菌被陆续发掘出来，并被证明具有多种功能，应用前景广阔。
首先，沙福芽孢杆菌具有强抗逆性。有研究将48种菌株送往国际空间站，仅沙福芽孢杆菌JPL-MERTA-8-2在太空中的生长状况比在地球上的生长状况好60％。沙福芽孢杆菌对土壤中的重金属离子也有很强的代谢作用。有研究从锰矿土壤中分离得到一株耐锰菌B.safensis S7，其耐锰能力高达2200mg/L，且其能量代谢水平随着作用时间的延长和锰离子浓度的提高而上升，从而产生大量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)以应对锰的毒害作用。也有研究发现了一株产吲哚乙酸(IAA)的抗镍(Ni)和铬(Cd)的B.safensis N4菌株，该菌株与生物炭联合对Ni和Cd复合污染的土壤具有较好的修复效果，为利用产IAA菌修复重金属污染土壤提供了参考。沙福芽孢杆菌对油脂也有很强的降解效果。有研究从坎波斯盆地的油田中分离出一种B.safensis CFA-06菌株，该菌株能够降解芳族化合物和石油芳烃馏分，经鉴定该菌能产生过氧化氢酶(BsPMO)和一种新型氧化还原酶(BsCat)。也有研究通过16S rDNA测序鉴定出一株在有机溶剂中能稳定产脂肪酶的菌株B.safensis DVL-43，该菌株在酯化、酯交换和生物转化反应中具有很高的价值。沙福芽孢杆菌也可以作为植物根际菌减轻非生物胁迫，从而促进植物生长，在可持续农业中具有很深的应用潜力。有研究从小麦根际和白茅根际分离得到的一种B.safensis菌株，该菌株可促进6个小麦品种的根系生长，并可提高地上部的生物量、株高、产量和叶绿素含量，还可以使小麦植株能更有效地抵御水分胁迫，增加植株中的相对含水量，并提高抗氧化反应。沙福芽孢杆菌还具有较强的抗菌活性，应用前景广泛。有研究发现，从甜叶菊根际土壤中分离得到的B.safensis STJP(NAIMCC-B-02323)菌株有较强的生物防治活性，可产生具有抗真菌功能的挥发性有机化合物类胞外代谢产物，对植物病原菌Alternaria alternata的菌丝生长和分生孢子的形成起到抑制作用，具有开发成绿色生物杀菌剂的潜力。也有研究从表面灭菌的绿豆种子中分离到一株新菌株B.safensis C3，该菌株可产生大小约为3.3kDa的多肽，对大肠杆菌、地毯草黄单胞菌和丁香假单胞菌具有抗菌活性，且该多肽对羧肽酶Y和胞内蛋白酶GluC的水解具有抗性，表明该多肽是细菌素AS-48的一种改良变种，为开发用于治疗的新型细菌素提供了新途径。还有研究从橄榄油污染的土壤中分离得到B.safensis F4菌株，该菌株可生产脂肽类生物表面活性剂，经最小抑菌浓度(MIC)测定表明其对多种病原菌均具有重要的抑菌活性，特别是对形成生物膜的表皮葡萄球菌S61菌株具有抗粘附活性，MIC为6.25mg/mL，抗粘附活性超过80％，在预防传染病方面有很好的应用前景。还有研究发现B.safensis能有效减少新型隐球菌抗氧化黑色素的生成和抗吞噬多糖荚膜的产生，降低新型隐球菌的毒力，还能够抑制新型隐球菌生物膜的形成，但对已经形成的生物膜的抑制作用不明显，还可以使白色念珠菌的细胞壁降解。也有研究发现B.safensis B21菌株可产生的抗真菌化合物伊枯草菌素iturin A2和iturin A6，并可以通过破坏菌丝膜的通透性来抑制稻瘟病菌菌丝的生长，可开发为用于稻瘟病生物防治的生物农药。沙福芽孢杆菌还具有抗癌潜力。有研究发现B.safensis RB-5菌株可产出一种RNA酶，该酶具有二聚体结构和良好的结构稳定性，且受常见盐离子的抑制较低，在37℃时有合理的半衰期，具有较低的溶血活性，能强烈抑制许多人体转化细胞的增殖，具有开发成新型抗癌药物的潜力。同时，B.safensis F4菌株生产的脂肽类生物表面活性剂对T47D乳腺癌细胞和B16F10小鼠黑色素瘤细胞均具有抗肿瘤活性。此外，来自智利北部阿塔卡马沙漠土壤的B.safensis RP10的基因组分析表明，这种细菌适应于高重金属、高盐条件、低碳和低能源来源的土壤中生活，揭示了沙福芽孢杆菌在改善重金属污染和助植物抗环境胁迫方面均具有较大的应用潜力。
但由于沙福芽孢杆菌发现得较晚，目前对诱变后的沙福芽孢杆菌研究得较少。有研究通过紫外照射分离出了一株突变体B.safensis LAU13，该突变体能够产生高活性的角蛋白酶，该角蛋白酶可以在30℃下6天完全降解整只鸡的羽毛，且对皮肤不造成任何损伤。
沙福芽孢杆菌有着丰富的多样性，其中不乏具有潜在开发价值的菌株，基于现状，开发具有新功能的沙福芽孢杆菌具有非常重要的应用价值和现实意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种沙福芽孢杆菌LG01。
本发明的第二个目的是提供上述沙福芽孢杆菌LG01的应用。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
一种沙福芽孢杆菌LG01，其特征在于，所述沙福芽孢杆菌LG01于2021年12月13日送往中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M 20211624。
本发明从中国广东省广州市中山大学的环境样本中分离出来一株菌株LG01，其16S rDNA sequence如SEQ ID NO：1所示，其gyrB sequence如SEQ ID NO：2所示，与已知的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)gyrB序列的同源性>99％，确认菌株LG01是同种不同株的沙福芽孢杆菌，因此，命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)LG01。该菌在BCYE平板上线培养24h后形成顶部隆起、侧面褶皱的白色火山状菌落，经芽孢染色表明其具有较强的产生芽孢这一抗逆性休眠体的能力，经革兰氏染色表明其为一种革兰氏阳性(G+)细菌。
本发明还提供了含有上述的沙福芽孢杆菌LG01的菌剂。
优选地，沙福芽孢杆菌LG01的培养方法为：将保存的沙福芽孢杆菌LG01划线接种于LB平板上，37℃过夜培养活化菌株后，挑取单菌落至LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床培养一段时间后即可。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
沙福芽孢杆菌LG01或其菌剂在防治由黑曲霉引起的植物真菌病害中的应用。
优选地，所述真菌病害包括但不限于霉腐。
黑曲霉容易大量生长繁殖产生大量的酶，侵染棉花时引起落花或烂铃，或生于多汁的果实上，引起腐烂或软腐，侵染洋葱鳞片表面生大量黑粉；梅雨季节亦容易引起衣物发霉等。经研究发现，沙福芽孢杆菌LG01对黑曲霉具有较好的抑制作用，可应用于防治由黑曲霉引起的植物真菌病害，可制备成防治植物真菌病害的微生物肥料或生物农药等形式进行使用。
沙福芽孢杆菌LG01或其菌剂在防治由青枯劳尔氏菌引起的植物细菌病害中的应用。
青枯劳尔氏菌是世界上危害第二大的植物病原细菌，其能够感染超过250种植物，这些植物包括许多重要的经济作物，比如番茄、马铃薯、香蕉及烟草等。经研究发现，沙福芽孢杆菌LG01对青枯劳尔氏菌具有较好的抑制作用，可应用于防治由青枯劳尔氏菌引起的植物细菌病害，可制备成防治植物细菌病害的微生物肥料或生物农药等形式进行使用。
沙福芽孢杆菌LG01或其菌剂在制备防治真菌性疾病的药物中的应用，所述真菌为白假丝酵母和黑曲霉。
白假丝酵母可引起皮肤、口腔、黏膜和内脏的急、慢性感染，即假丝酵母菌病。黑曲霉是耳真菌病中最常见分离菌，还引起免疫低下患者肺部真菌感染，导致真菌性角膜炎等。经研究发现，沙福芽孢杆菌LG01对白假丝酵母和黑曲霉有较好的抑制作用，可制备成针对白假丝酵母和黑曲霉引起的真菌性疾病的药剂进行使用。
沙福芽孢杆菌LG01或其菌剂在制备防治细菌性疾病的药物中的应用，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌、嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌。
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，可导致人和动物的多种疾病，包括伪膜性肠炎、败血症和脓毒症等，严重威胁人类和动物的生命安全。藤黄微球菌是条件致病菌，引起伤口等局部组织感染，也能引起严重的感染，如心内膜炎等疾病。单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。军团菌是一种广泛存在于自然界中的机会致病菌，能引起以发热和呼吸道症状为主的疾病，即军团菌病，其中最为多见和严重的临床类型为以肺部感染为主，同时伴有全身多系统损害的军团菌肺炎。经研究发现，沙福芽孢杆菌LG01对黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌、嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌均具有较好的抑制作用，可制备成针对黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌、嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌引起的细菌性疾病的药剂进行使用。
沙福芽孢杆菌LG01或其菌剂在制备植物定殖剂，和/或植物生防剂，和/或生物有机肥，和/或植物促生剂，和/或微生物饲料中的应用。
经研究发现，沙福芽孢杆菌LG01具有产蛋白酶特性，可以用于蛋白酶的提取，满足食品工业或洗涤工业等蛋白酶领域的需求；也可以用于农业微生物肥料中对病原细菌的细胞膜进行降解以控制病害，以及用于堆肥农业有机肥料中蛋白质的降解，以利于植物吸收；还可以用于动物饲料中提高动物对饲料的利用率。同时，还具有产纤维素酶特性，可以用于纤维素酶的提取，在食品行业和环境行业均有广泛应用前景；也可以应用于降解病原真菌的细胞壁，以控制病害，以及应用于堆肥中纤维素的分解，以利于植物吸收；还可以用于畜禽生产的饲料中，克服动物猪、鸡等单胃动物不能利用纤维素的问题。此外，还具有可形成强粘附生物被膜的特性，表明其具有良好的定植能力，可以在植物抗菌时提供更好的根际定植效果；也有利于逆境中的定植以帮助其更好的发挥纤维素酶和蛋白酶活性，促进蛋白质和纤维素的分解。
本发明还提供了一种蛋白酶的制备方法，该方法利用沙福芽孢杆菌LG01的产蛋白酶特性来制备蛋白酶。
本发明还提供了一种纤维素酶的制备方法，该方法利用沙福芽孢杆菌LG01的产纤维素酶特性来制备纤维素酶。
需要指出的是，沙福芽孢杆菌LG01的应用远远不止上述提及的这些领域，凡是根据沙福芽孢杆菌LG01的功能特性加以开发利用的领域均属于本发明的应用范畴。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种沙福芽孢杆菌LG01，所述沙福芽孢杆菌LG01于2021年12月13日送往中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M 20211624。该沙福芽孢杆菌具有多种功能特性：(1)对白假丝酵母及黑曲霉等真菌具有抑制活性；(2)对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特氏菌等革兰氏阳性细菌，嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌等革兰氏阴性细菌以及青枯劳尔氏菌等革兰氏阴性植物病原细菌均具有抑制活性；(3)可产蛋白酶；(4)可产纤维素酶；(5)可形成强粘附生物被膜。上述功能特性使沙福芽孢杆菌LG01具有多样化的应用形式，比如防治植物病害，制备防治真菌性或细菌性疾病的药物，制备植物定殖剂、植物生防剂、生物有机肥、植物促生剂、微生物饲料等，应用前景广阔。
附图说明
图1为沙福芽孢杆菌LG01的形态观察和鉴定(A为培养平板，B为革兰氏染色结果，C为芽孢染色结果)；
图2为沙福芽孢杆菌LG01与其他芽孢杆菌基于16S rDNA sequence的系统发育树；
图3为沙福芽孢杆菌LG01与其他芽孢杆菌基于gyrB sequence的系统发育树；
图4为沙福芽孢杆菌LG01对白假丝酵母(左)和黑曲霉(右)的抑菌实验；
图5为沙福芽孢杆菌LG01对金黄色葡萄球菌(左)、藤黄微球菌(中)和单增李斯特氏菌(右)的抑菌实验；
图6为沙福芽孢杆菌LG01对青枯劳尔氏菌的抑菌实验；
图7为沙福芽孢杆菌LG01对军团菌属的抑菌实验；
图8为沙福芽孢杆菌LG01对牛奶平板的降解实验(左边，LG01实验组；右边，空白对照组)；
图9为沙福芽孢杆菌LG01对纤维素平板的降解实验(左边，LG01实验组；右边，空白对照组)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施例中涉及的菌株包括：
(1)作为抑菌机制研究对象的供试菌种为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)LG01菌株，由中国广东省广州市中山大学生命科学学院胃肠道微生物组研究润泽实验室分离自本实验室的空气环境样本中，于甘油管内-80℃低温冷冻保藏。一般情况下将其接种于LB固体培养基平板表面并在37℃恒温培养箱中倒置培养24h以获得菌落，或在37℃恒温摇床内于LB液体培养基中振荡培养18-24h以获得发酵液。
(2)金黄色葡萄球菌ATCC6538、白假丝酵母ATCC10231、黑曲霉ATCC16404、藤黄微球菌ATCC10240、单增李斯特氏菌ATCC19115、青枯劳尔氏菌GMI1000、嗜肺军团菌ATCC33152、以色列军团菌ATCC33623、马氏军团菌ATCC35300，购自广东省微生物所菌种保藏中心。
表1实验所用菌株及培养条件
Figure BDA0003480482500000061
(3)所涉及的培养基如下：
1)LB平板：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，氢氧化钠调PH至7.2，121℃、20min高压灭菌配置成LB平板。
2)LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，氢氧化钠调PH至7.2，121℃、20min高压灭菌使用。
3)YM平板：蛋白胨5g，葡萄糖10g，酵母提取物3g，麦芽提取物3g，蒸馏水定容至1L，琼脂20g，用柠檬酸调节pH至6.2，121℃、20min高压灭菌配置成YM平板。
4)YM液体培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，酵母提取物3g，麦芽提取物3g，蒸馏水定容至1L，用柠檬酸调节pH至6.2，121℃、20min高压灭菌使用。
5)PDA平板：PDA粉末40.1g，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高压灭菌配置成PDA平板。
6)BHI平板：脑心浸液干粉37g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高压灭菌配置成BHI平板。
7)BHI液体培养基：脑心浸液干粉37g，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高压灭菌使用。
8)CPG平板：蛋白胨10g，酪蛋白水解物1g，葡萄糖5g，琼脂粉20g，使用10M的KOH溶液调节溶液pH值至7.0后，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高压灭菌配置成CPG平板。
9)CPG液体培养基：蛋白胨10g，酪蛋白水解物1g，葡萄糖5g，使用10M的KOH溶液调节溶液pH值至7.0后，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高压灭菌使用。
10)BCYE平板：酵母提取物10g，ACES 10g，活性炭3g，琼脂粉16g，使用10M的KOH溶液调节溶液pH值到6.9-7.0，蒸馏水定容至1L，121℃、20min高温灭菌。冷却至58℃左右，加入0.4％(w/v)的L-半胱氨酸和0.25％(w/v)的焦磷酸铁配制成BCYE培养基。
11)AYE液体培养基：酵母提取物10g，ACES 10g，使用10M的KOH溶液调节溶液pH值到6.9-7.0，加入0.4％(w/v)的L-半胱氨酸和0.25％(w/v)的焦磷酸铁，蒸馏水定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌配制成AYE液体培养基。
实施例1沙福芽孢杆菌LG01的分离鉴定
在培养嗜肺军团菌的污染事件中，发现一株对嗜肺军团菌生长有显著抑制效果的细菌。用记号笔将平板中待划线纯化的菌落编号，并相应地在平板上标明菌株编号。挑取菌落接种到BCYE上，用平板划线法纯化菌株。若此法不能将菌株分离则需要从富集平板上挑取菌落，经AYE液体培养基梯度稀释后，涂布于培养基上。然后参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《真菌分类鉴定手册》，首先分辨属于细菌的菌株，然后观察菌落的生长状况：生长形态、是否有菌丝、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘等，初步筛选得到一株候选菌株LG01，最后由广东美格基因科技有限公司对获得的LG01菌株进行全基因组测序。
如图1A所示，菌株LG01在从BCYE平板上进行分离鉴定时，发现划线培养24h后形成了顶部隆起、侧面褶皱的白色火山状菌落，初步鉴定为芽孢杆菌属。
在光学显微镜油镜下对革兰氏染色及芽孢染色的LG01菌液涂片进行观察，结果表明菌株LG01是一种两端钝圆、中间略细长的棒状杆菌，其菌体经革兰氏染色呈紫色，表明其为一种革兰氏阳性(G+)细菌，如图1B所示。
在经芽孢染色的菌液涂片中，芽孢被孔雀绿染色，菌体则被番红染色，故可根据颜色差异对二者进行区分；如图1C所示，视野中除红色的菌体外亦可观察到较多的绿色短棒状芽孢，其相对于菌体长度略短、直径略粗，表明菌株LG01具有较强的产生芽孢这一抗逆性休眠体的能力。
委托广东美格基因科技有限公司对LG01菌株进行全基因组测序后，使用MEGAX将测序结果的16S rDNA序列与芽孢杆菌属构建进化树(图2)，并将该菌株的16S rDNAsequence(SEQ ID NO：1)在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对，确认LG01是一株沙福芽孢杆菌。为了进一步区分近缘菌株，使用MEGAX将测序结果的gyrB序列与芽孢杆菌属构建进化树(图3)，并将其gyrB sequence(SEQ ID NO：2)在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与已知的沙福芽孢杆菌gyrB序列的同源性>99％，确认菌株LG01是同种不同株的沙福芽孢杆菌。
最后，将LG01菌株于2021年12月13日送去中国典型培养物保藏中心进行保藏，经鉴定该菌株的保藏名称为Bacillus safensis LG01，分类命名为Bacillus safensis，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月13日，保藏号为CCTCC NO:M20211624。保藏中心于2021年12月20日完成检测，确定保藏的微生物存活。
16S rDNA sequence(1537bp，SEQ ID NO：1)
AGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGCCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTATGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT。
gyrB sequence(1923 bp，SEQ ID NO：2)：
GTGGCAATGGAACAGCAACATAATAGTTATGATGAAAATCAGATACAGGTGCTTGAAGGACTAGAAGCTGTTAGAAAACGTCCAGGAATGTACATTGGGTCAACCAATGCAAAAGGACTTCACCATCTTGTATGGGAAATTGTCGACAACAGTATTGATGAGGCATTAGCTGGTTATTGTACAGACATTACAGTGCAAATTGAAAAGGATAACAGCATTACAGTAAAAGATAATGGCCGCGGGATTCCTGTTGGAATTCATGAGAAAATGGGGCGTCCTGCCGTAGAGGTCATTATGACTGTTCTTCACGCTGGCGGTAAATTTGACGGCAGCGGTTATAAAGTATCTGGCGGTCTGCATGGTGTAGGGGCATCTGTTGTAAATGCATTATCTACTACCTTAGACGTGACCGTATACCGTGACGGAAAAATTCATTATCAGCAGTTCAAACGCGGTGTTCCAGTGGGAGATTTAGAGGTTATTGGTGAAACAGATGTAACCGGGACAACAACCCACTTTGTGCCAGATCCAGAAATTTTCACGGAAACCATTGAATTTGATTACGATACACTTGCTAACCGTGTTCGTGAGTTAGCTTTCTTAACAAAAGGTGTAAACATCATCATAGAAGACTTGCGTGAAGGCAAAGAGCGGAGAAATGAATACTGCTACGAAGGCGGTATTAAGAGCTATGTAGAACATTTAAACCGCTCAAAAGAAGTCGTTCATGAAGAACCTGTGTACATCGAAGGTGAGAAAGACGGAATCACAGTTGAAGTAGCATTACAATATAACGATTCCTATACAAGCAATATCTATTCCTTCGCCAACAATATCAACACGTATGAAGGCGGAACACATGAAGCTGGCTTTAAAACCGGTCTAACGCGTGTCATCAATGACTATGCTCGTAAAAATGGCGTATTCAAAGATGGGGATGCGAATTTAAGTGGTGAAGATGTGCGAGAAGGCTTAACAGCCATTATCTCCATCAAACATCCAGACCCTCAATTCGAAGGACAAACGAAGACAAAGCTTGGGAACTCAGAAGCGAGAACCATCACAGACTCCCTTTTCTCAGAAGCACTTGAGAAATTCTTGCTTGAAAATCCTGATTCTGCGAAAAAAATTGTGGAAAAAGGACTGATGGCAGCTCGTGCAAGAATGGCTGCCAAAAAGGCTCGTGAGCTGACAAGACGTAAAAGTGCGCTGGAAGTCTCCAGCTTACCTGGGAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCTTCCATCTCTGAGCTCTATATTGTAGAGGGAGATTCTGCGGGCGGATCTGCTAAGCAAGGCCGTGATCGTCACTTCCAAGCGATCTTACCGTTAAGAGGGAAGATCCTAAACGTAGAAAAAGCTCGTTTAGATAAAATTTTATCGAACAACGAGGTTCGTGCAATGATTACAGCGTTAGGAACTGGAATTGGAGAAGACTTCACTTTAGAGAAAGCACGCTATCACAAAGTTGTGATCATGACAGATGCCGATGTAGATGGAGCGCATATCCGAACGCTTCTCTTAACATTCTTTTATCGTTACATGCGTCAAATCATTGAAAACGGTTATGTGTATATTGCGCAGCCGCCTTTATATAAAGTGCAGCAAGGAAAACGTGTGGAGTACGTGTATAACGATAAACAGCTGGATGAGCTGTTAAAATCACTACCTCAAACACCAAAGCCTGGACTTCAGCGTTATAAAGGTCTTGGAGAGATGAATGCTACTCAGCTTTGGGAAACAACAATGGACCCTGATGCGAGAACACTTCTTCAAGTCACACTTGAGGATGCGATCGATGCTGATGAGACATTTGAAATGCTGATGGGAGATAAAGTAGAGCCGAGACGGAACTTTATCGAAGAAAATGCACAATACGTGAAAAACCTTGATATTTAG。
实施例2沙福芽孢杆菌LG01的抑菌作用
1、沙福芽孢杆菌LG01对真菌白假丝酵母和黑曲霉的抑制作用
(1)菌株的培养
1)沙福芽孢杆菌LG01培养：将-80℃保存的菌种挑至LB平板上划线，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上生长出菌落，挑取单菌落至LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用LB液体培养基稀释至0.01Abs待用。
2)白假丝酵母培养：将-80℃保存的菌种挑至YM平板上划线，置于30℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上生长出菌落，挑取单菌落至YM液体培养基中，置于30℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用YM液体培养基稀释至0.01Abs待用。
3)黑曲霉培养：将-80℃保存的菌种挑至PDA平板上划线，置于30℃恒温培养箱中培养2-5d，待平板上生长出孢子，用无菌水洗脱平板上的孢子，重悬获得黑曲霉菌液。使用血球计数器测定黑曲霉孢子浓度，并用无菌水稀释为106/mL待用。
(2)测试方法
在平板表面滴加100μL浓度为0.01Abs的白假丝酵母菌液或106/mL黑曲霉孢子重悬液并涂布均匀；随后在培养基中央贴一张直径为5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加5uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液；白假丝酵母平板倒置于30℃培养箱中培养24h，黑曲霉平板则倒置于30℃培养箱中培养2-3d。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以对白假丝酵母和黑曲霉形成明显的抑菌圈(图4)，说明其对两种真菌的生长具有抑制作用。
由于白假丝酵母可引起皮肤、口腔、黏膜和内脏的急、慢性感染，即假丝酵母菌病。而黑曲霉容易大量生长繁殖产酶生热，侵染棉花时引起落花或烂铃，或生于多汁的果实上，引起腐烂或软腐，侵染洋葱鳞片表面生大量黑粉；梅雨季节亦容易引起衣物发霉等。同时，黑曲霉也是耳真菌病中最常见的分离菌之一，可以引起免疫低下患者肺部真菌感染，导致真菌性角膜炎等。可见，菌株LG01对白假丝酵母、黑曲霉等人体病原真菌以及黑曲霉等植物病原真菌均具有抑制作用，在医学和农业领域均具有较好的应用前景。
2、沙福芽孢杆菌LG01对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特氏菌的抑制作用
(1)菌株的培养
1)金黄色葡萄球菌培养：将-80℃保存的菌种挑至LB平板上划线，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上生长出菌落，挑取单菌落至LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用LB液体培养基稀释至0.01Abs待用。
2)藤黄微球菌培养：将-80℃保存的菌种挑至LB平板上划线，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上生长出菌落，挑取单菌落至LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用LB液体培养基稀释至0.01Abs待用。
3)单增李斯特氏菌：将-80℃保存的菌种挑至BHI平板上划线，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上生长出菌落，再挑取单菌落接种在BHI液体培养基，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用BHI液体培养基稀释至0.01Abs待用。
(2)测试方法
在平板表面滴加100μL浓度为0.01Abs的金黄色葡萄球菌菌液或0.01Abs藤黄微球菌菌液或0.01Abs单增李斯特氏菌并涂布均匀；随后在培养基中央贴一张直径为5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加5uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液；将平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特氏菌形成明显的抑菌圈(图5)，说明其对这三种真菌的生长具有抑制作用。
由于金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，可导致人和动物的多种疾病，包括伪膜性肠炎、败血症和脓毒症等，严重威胁人类和动物的生命安全。藤黄微球菌是条件致病菌，引起伤口等局部组织感染，也能引起严重的感染，如心内膜炎等疾病。单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。可见，菌株LG01对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特氏菌等革兰氏阳性病原细菌具有较好的抑制作用，在医学领域具有较好的应用前景。
3、沙福芽孢杆菌LG01对革兰氏阴性植物病原细菌青枯劳尔氏菌的抑制作用
(1)菌株的培养
青枯劳尔氏菌：将-80℃保存的菌种挑至CPG平板上划线，置于37℃恒温培养箱中培养48h，待平板上生长出菌落，再挑取单菌落接种在CPG液体培养基，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用CPG液体培养基稀释至0.01Abs待用。
(2)测试方法
在平板表面滴加100μL浓度为0.01Abs的青枯劳尔氏菌菌液并涂布均匀；随后在培养基中央贴一张直径5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加5uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液；将平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以对青枯劳尔氏菌形成明显的抑菌圈(图6)，说明其对植物病原细菌青枯劳尔氏菌的生长具有抑制作用。
由于青枯劳尔氏菌是世界上危害第二大的植物病原细菌，其能够感染超过250种植物，这些植物包括许多重要的经济作物，比如番茄、马铃薯、香蕉及烟草等。可见，菌株LG01对青枯劳尔氏菌等革兰氏阴性植物病原细菌具有较好的抑制作用，在农业领域均具有较好的应用前景。
4、沙福芽孢杆菌LG01对革兰氏阴性细菌嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌的抑制作用
(1)菌株的培养
嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌培养：将-80℃保存的菌种(嗜肺军团菌、以色列军团菌、马氏军团菌)分别挑至BCYE平板上划线，置于37℃恒温培养箱中培养3d，待平板上生长出菌落，再挑取单菌落接种在AYE液体培养基，置于37℃恒温摇床培养24h获得菌液。通过紫外分光光度计测定菌液浓度，用AYE液体培养基稀释至0.01Abs待用。
(2)测试方法
在平板表面滴加100μL浓度为0.01Abs的嗜肺军团菌菌液或0.01Abs以色列军团菌菌液或0.01Abs马氏军团菌菌液并涂布均匀；随后在培养基中央贴一张直径为5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加5uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液；将平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以对嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌形成明显的抑菌圈(图7)，说明其对军团菌属的生长具有抑制作用。
军团菌是一种广泛存在于自然界中的机会致病菌，能引起以发热和呼吸道症状为主的疾病，即军团菌病，其中最为多见和严重的临床类型为以肺部感染为主，同时伴有全身多系统损害的军团菌肺炎。可见，沙福芽孢杆菌LG01对嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌的生长等革兰氏阴性病原细菌具有较好的抑制作用，在军团菌病等医学领域具有较好的应用前景。
实施例3沙福芽孢杆菌LG01的产蛋白酶特性
沙福芽孢杆菌LG01分泌蛋白酶水解蛋白能力的鉴定和测量是根据琼脂孔扩散实验基础上进行的：即配置脱脂牛奶平板后，在平板的中央贴一张直径5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加2uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液，对照组滴加2uL空白培养基，将平板倒置于37℃培养箱中培养1d；观察平板上蛋白的降解圈直径。所使用的脱脂牛奶平板培养基为：5g/L牛肉提取物，10g/L蛋白胨，1g/LNaCl，16g/L琼脂，pH 7.2。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以显著降解蛋白，形成明显的降解圈(图8)，说明沙福芽孢杆菌LG01可产蛋白酶。可以用于蛋白酶的提取，满足食品工业或洗涤工业等蛋白酶领域的需求；也可以用于农业微生物肥料中对病原细菌的细胞膜进行降解以控制病害，以及用于堆肥农业有机肥料中蛋白质的降解，以利于植物吸收；还可以用于动物饲料中提高动物对饲料的利用率。
实施例4沙福芽孢杆菌LG01可产纤维素酶
沙福芽孢杆菌LG01纤维素降解能力的鉴定和测定是根据琼脂孔扩散法基础上进行的：即配置纤维素平板后，在平板的中央贴一张直径5mm的圆形无菌滤纸片；在滤纸片上滴加2uL浓度为0.01Abs的沙福芽孢杆菌LG01菌液，对照组滴加2uL空白培养基，将平板倒置于37℃培养箱中培养1d，使用1mg/mL的刚果红染料对平板染色10min，使用去离子水清洗两次洗去未染上的染料；观察平板上纤维素的降解圈直径。所使用的纤维素板培养基为：1.5g/L K2HPO4,1.5g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,0.2g/L CaCl·2H2O,5g/L NaCl,0.3g/L尿素,10g/L CMC-Na,0.3g/L蛋白胨,16g/L琼脂,pH 7.2。
结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株LG01可以显著降解纤维素，形成明显的降解圈(图9)，说明沙福芽孢杆菌LG01可产纤维素酶。可以用于纤维素酶的提取，在食品行业和环境行业均有广泛应用前景；也可以应用于降解病原真菌的细胞壁，以控制病害，以及应用于堆肥中纤维素的分解，以利于植物吸收；还可以用于畜禽生产的饲料中，克服动物猪、鸡等单胃动物不能利用纤维素的问题。
实施例5沙福芽孢杆菌LG01可形成强粘附生物被膜
使用结晶紫染色对生物膜形成能力进行量化。即将过夜培养的细菌稀释至1×106CFU/mL。随后将200μL稀释的菌液转移至96孔培养板中，做6个复孔，37℃培养24h，并以空白培养基作为对照。孵育后弃去培养基，用PBS漂洗细胞3次，去除杂质和浮游细菌。然后每孔加入200μL甲醇固定生物膜。15分钟后弃去甲醇，干燥后加入200μL 0.1％结晶紫。结晶紫染色5min后，洗去多余染料溶液，每孔加入200μL 33％冰醋酸。最后用酶标仪高速振荡20min，在595nm波长处测量光密度。
根据临界ODc值(ODc值等于空白孔的平均值加上标准偏差的3倍)，生物膜可分为以下几种类型：OD≤ODc表示无粘附(-)，ODc<OD≤2ODc表示弱附着力(+)，2ODc<OD≤4ODc为中等附着力(++)，OD>4ODc为强附着力(+++)。每个实验重复3次，取平均值。
结果表明，沙福芽孢杆菌LG01可以形成强粘附的生物被膜(表2)，表明其具有良好的定植能力，可以在植物抗菌时提供更好的根际定植效果；也有利于逆境中的定植以帮助其更好的发挥纤维素酶和蛋白酶活性，促进蛋白质和纤维素的分解。
表2生物被膜测定结果
Figure BDA0003480482500000141
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种沙福芽孢杆菌LG01及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1537
<212> DNA
<213> 16S rDNA sequence(Bacillus safensis)
<400> 1
aggtgatcca gccgcacctt ccgatacggc taccttgtta cgacttcacc ccaatcatct 60
gccccacctt cggcggctgg ctccataaag gttacctcac cgacttcggg tgttgcaaac 120
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 180
atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact 240
gagaacagat ttatgggatt ggctaaacct tgcggtcttg cagccctttg ttctgtccat 300
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 360
cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat 420
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 480
catgcaccac ctgtcactct gtccccgaag ggaaagccct atctctaggg ttgtcagagg 540
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 600
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gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat 720
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 780
cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg 840
catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc 900
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gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1200
tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt 1260
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<211> 1923
<212> DNA
<213> gyrB sequence(Bacillus safensis)
<400> 2
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Claims (10)

1.一种沙福芽孢杆菌LG01，其特征在于，所述沙福芽孢杆菌LG01于2021年12月13日送往中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M 20211624。
2.含有权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，沙福芽孢杆菌LG01的培养方法为：将保存的沙福芽孢杆菌LG01划线接种于LB平板上，37℃过夜培养活化菌株后，挑取单菌落至LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床培养一段时间后即可。
4.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01或权利要求2所述的菌剂在防治由黑曲霉引起的植物真菌病害中的应用。
5.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01或权利要求2所述的菌剂在防治由青枯劳尔氏菌引起的植物细菌病害中的应用。
6.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01或权利要求2所述的菌剂在制备防治真菌性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述真菌为白假丝酵母和黑曲霉。
7.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01或权利要求2所述的菌剂在制备防治细菌性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌、嗜肺军团菌、以色列军团菌和马氏军团菌。
8.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01或权利要求2所述的菌剂在制备植物定殖剂，和/或植物生防剂，和/或生物有机肥，和/或植物促生剂，和/或微生物饲料中的应用。
9.一种蛋白酶的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01的产蛋白酶特性制备蛋白酶。
10.一种纤维素酶的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述的沙福芽孢杆菌LG01的产纤维素酶特性制备纤维素酶。
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