CN111647522B - 抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用，该菌株为伯氏致病杆菌的高毒力菌株NN6，保藏编号：CCTCC NO:M 2020097，2020年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明伯氏致病杆菌NN6具有较强的抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型和黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增高，抑菌效果显著。该菌株还具有抑制镰刀菌属孢子萌发的作用，抑制效果显著。该菌具有培养条件要求低、持效期长、来源环保无毒性等特点，对于保护生态环境和提高农产品的附加值上具有重要意义，加上抗菌谱更广这个优势，使其具有很好的市场开发应用前景。

Description

抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种昆虫病原线虫共生菌菌株，具体涉及抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用，本发明是利用生物防治的方法控制植物病原真菌的生长，适用于现代生态农业经济中绿色无公害农产品的生产。

背景技术

西瓜枯萎病俗称“死秧病”，是由尖孢镰刀菌侵染引起的维管束系统病害，是国内外西瓜生产上非常严重的病害，已成为制约我国西瓜生产的主要障碍。尖孢镰刀菌可在离开寄主的情况下存活5-6年，甚至10年以上。在带菌土壤中，病株率可达70％。所以该病的防治仍是农业生产上的一大难题。

小麦赤霉病作为小麦的主要病害之一在全世界普遍发生，主要分布于潮湿和半潮湿区域。中国长江中下游地区因气候湿润多雨而常年存在小麦赤霉病爆发引起产量亏损严重的现象。

水稻是草本稻属的一种，原产于中国和印度，是我国淮河以南大部分地区人口的主要食物。一旦大规模爆发病害，必将带来巨大的经济损失和供粮压力。稻瘟病是水稻的一大重要病害，严重时可减产40％-50％。近年来，广东稻瘟病年发生面积不少于50万亩，而且有逐年增加的趋势。西瓜是一年生蔓生藤本植物，在中国各地均有栽培，其中江苏东台地区出产的品种在长江中下游地区最为有名，兼具食用与药用价值，是重要的经济作用，也深受大众的欢迎与喜爱。

黄瓜枯萎病也是由尖孢镰刀菌引起，经土壤传播，从根或根颈部侵入。枯萎病是黄瓜生产中较难防治且危害严重的一种病害，在我国广泛分布，同一地块连作3年时发病率可高达70％，产量损失10％-50％。

灰霉病可危害辣椒、黄瓜、茄子等多种作物引起果实水腐，在连续阴雨天气多的年份危害严重。江苏地处中国的长江中下游平原，每年春夏之交会有长时间的阴雨天气，而且番茄是江苏地区重要的蔬菜作物，所以番茄灰霉病的防治是重要的科学课题。

辣椒疫霉是霜霉目、霜霉科、疫霉属的一种真菌，菌丝常呈放射性生长，培养后期会出现厚垣孢子，可以在土壤越冬，防治难度大。

据不完全统计，全世界农作物每年因病虫害造成的损失约占其总产量的37％，对病虫害的防治一直是人们提高农作物产量和发展农业生产的途径之一，从无机农药到有机合成农药，化学药剂一度成为控制病虫害的有效手段。但化学农药的广泛使用，带来了一系列的环境问题和食品安全问题；严重影响了人类健康和农产品的出口创汇。倡导绿色消费的绿色无公害的生态农业模式是全球农业发展的必然趋势(农业环境与发展，2012，29：49-52)。绿色无公害农业作为一种符合农业发展方向的生产模式，其基本要求是“优质、高产、高效、生态、安全”，开发绿色农药成为趋势(Nature，2010，466：109-11；植物医生，2012，25(12901)：12)。生物农药是实现无公害农业的关键环节之一。

昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes，EPNs)因其侵染期幼虫消化道内携带有使寄主昆虫罹患败血症死亡的共生菌而得名。共生细菌随着线虫的侵染，而被携带到寄主体内并释放到血腔中，经大量繁殖，产生毒素，在48h之内就能杀死寄主。国内外的研究也表明共生细菌在离体人工培养时产生吲哚类、几丁质酶、蒽醌类、羟化芪二苯乙烯类、二硫吡咯类、细菌素、水溶性的苯并芘类等多种抑菌代谢产物。因此，对昆虫病原线虫共生菌的开发和利用，已经成为了农业与生命科学领域的研究热点，具有极广阔的市场应用前景，是一类值得推崇的环境友好型生物资源。

发明内容

发明目的：针对当前生态农业经济中绿色无公害农产品的生产的实际问题和需求，本发明的所要解决的技术问题是提供了一种昆虫病原线虫共生菌；使用该菌可有效防治西瓜枯萎病、小麦赤霉病、稻瘟病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病和辣椒疫霉病，具有广阔的开发利用前景。

本发明所述的昆虫病原线虫共生菌为伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii NN6，该伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii NN6是发明人从斯氏线虫Steinernemaoregonense的肠道分离纯化获得。

技术方案：本发明提供了一种抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株，所述共生菌菌株为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)的高毒力菌株NN6，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020097，2020年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明的高毒力菌株NN6能够防治西瓜枯萎病、小麦赤霉病、稻瘟病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病和辣椒疫霉病，该昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在NBTA+SP培养基上，初生型菌落可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝绿色菌落，次生型不能吸收形成红褐色菌落。明胶穿刺培养呈水解阳性。生理生化指标测定结果表明：昆虫病原线虫共生菌可利用葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、纤维二糖产酸，不能利用果糖、肝糖、蔗糖、甘油、水杨苷等产酸。可以利用甲酸盐、乳酸盐、丁二酸等，不能利用葡萄糖酸盐、柠檬酸盐等。

本发明具有抑制西瓜枯萎病、小麦赤霉病、稻瘟病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病和辣椒疫霉病的昆虫病原线虫共生菌通过16SrDNA序列比对分析，与致病杆菌属有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌菌株NN6属于伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovineii。

用于防治西瓜枯萎病的病原物为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum西瓜专化型FON1、小麦赤霉病的病原物为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum B4-1、稻瘟病的病原物为稻瘟菌Magnaporthe grisea GuyII、黄瓜枯萎病的病原物为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum黄瓜专化型NFC1、番茄灰霉病的病原物为灰葡萄孢Botrytis cinerea NBC1和辣椒疫霉病的病原物为辣椒疫霉菌Phytophthora capsici NPC1。

本发明还包括所述的共生菌菌株在防治西瓜枯萎病、小麦赤霉病、稻瘟病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病或辣椒疫霉病中的应用。

本发明还包括所述的共生菌菌株在制备抑菌剂中的应用。

其中，所述抑菌剂针对的病原菌为尖孢镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌或禾谷镰刀菌中的一种或几种。

本发明还包括一种抑菌剂，所述抑菌剂含有所述的昆虫病原线虫共生菌菌株NN6的全发酵液、菌细胞悬液或无菌滤液中的一种或几种。

其中，所述抑菌剂的剂型为液体菌剂。

本发明所述的抑菌剂中的全发酵液、菌细胞悬液和无菌滤液的制备方法，包括如下步骤：

1)沾取甘油菌管中昆虫病原线虫共生菌菌株NN6菌悬液，在NBTA+SP平板培养基上划线，28～30℃培养24～48h得到单菌落；

2)挑取蓝绿色初生型菌落接种入LB+SP液体培养基，28～30℃下震荡培养12～24h得到菌液；

3)取步骤2)培养的菌液以2～5％的接种量接种于YS摇瓶发酵培养基中28～30℃震荡培养12～24h得到种子液；

4)将步骤3)得到的种子液以2～5％的接种量接种于相同培养基中继续震荡培养24～72h即得全发酵液；

5)将步骤4)获得的全发酵液以10000rpm离心10min得到菌体沉淀和上清液；

6)离心所得的菌体沉淀用无菌水稀释混匀得到菌细胞悬液；

7)离心所得的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；

8)再用平板涂布法检查过滤后的上清液菌落数，低于10²CFU/mL时认为获得的上清液为无菌滤液。

其中，所述步骤1)的NBTA+SP平板培养基的组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、溴百里酚蓝0.000025％、丙酮酸钠0.1％、氯化三苯基四氮唑0.00004％、pH值7.4。

其中，所述步骤2)的LB+SP液体培养基的组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、丙酮酸钠0.1％、pH值7.4。

其中，所述步骤3)和步骤4)的YS摇瓶发酵培养基组成为：磷酸二氢铵0.05％、磷酸二氢钾0.05％、七水合硫酸镁0.02％、氯化钠0.5％、酵母提取物0.5％、pH值7.0。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

平板抑菌实验结果表明，在固体培养条件下，本发明的伯氏致病杆菌NN6具有较强的抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型和黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌菌丝生长的能力，随着菌体浓度的增加而增大，持效期长，抑菌效果显著。凹玻片法实验结果表明，在糖类营养源充足的情况下，本发明的伯氏致病杆菌NN6具有较强的抑制尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌分生孢子萌发的能力。

综上，本发明伯氏致病杆菌NN6具有较强的抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型和黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果显著。此外，伯氏致病杆菌NN6还具有抑制镰刀菌属孢子萌发的作用，抑制效果显著。平行对比化学农药多菌灵常规施用浓度时的防效，伯氏致病杆菌NN6抑菌效果更佳。同时，该菌具有培养条件要求低、持效期长、来源环保无毒性等特点，对于保护生态环境和提高农产品的附加值上具有重要意义，加上抗菌谱更广这个优势，使其具有很好的市场开发应用前景。

附图说明

图1、伯氏致病杆菌NN6菌细胞悬液(Cell)与无菌滤液(Fer)对尖孢镰刀菌FON1的抑制效果图；

图2、不同处理下尖孢镰刀菌西瓜专化型FON1的生长直径(A)和抑制率(B)；注：CK表示对照组，X.bovienii-Cell表示菌细胞悬液处理，X.bovienii-Fer表示无菌滤液处理。“****”表示单因素方差分析中P-value＜0.0005；下同；

图3、伯氏致病杆菌NN6对禾谷镰刀菌B4-1的抑制效果图；

图4、伯氏致病杆菌NN6对稻瘟菌GuyII的抑制效果图；

图5、伯氏致病杆菌NN6菌细胞悬液与无菌滤液对尖孢镰刀菌NFC1的抑制效果图；

图6、不同处理下尖孢镰刀菌黄瓜专化型NFC1的生长直径(A)和抑制率(B)；

图7、伯氏致病杆菌NN6菌细胞悬液与无菌滤液对灰葡萄孢NBC1的抑制效果图；

图8、不同处理下灰葡萄孢NBC1的生长直径(A)和抑制率(B)；

图9、伯氏致病杆菌NN6菌细胞悬液与无菌滤液对辣椒疫霉NPC1的抑制效果图；

图10、不同处理下辣椒疫霉NPC1的生长直径(A)和抑制率(B)；

图11、不同处理下尖孢镰刀菌FON1的孢子萌发状态；A：对照组；B：发酵液处理；C：菌细胞悬液处理；D：无菌滤液处理；

图12、不同处理下禾谷镰刀菌B4-1的孢子萌发状态；A：对照组；B：发酵液处理；C：菌细胞悬液处理；D：无菌滤液处理；

图13、不同处理下尖孢镰刀菌FON1孢子的萌发率(A)与相对抑制率(B)；X.bovienii-All表示全发酵液。

图14、不同处理下禾谷镰刀菌B4-1孢子的萌发率(A)与相对抑制率(B)；

图15、伯氏致病杆菌NN6与多菌灵对禾谷镰刀菌B4-1的抑制率对比。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明的昆虫病原线虫共生菌菌株NN6以甘油菌的形式保藏在-80℃冰箱中。

NBTA+SP平板培养基组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、溴百里酚蓝0.000025％、丙酮酸钠0.1％、氯化三苯基四氮唑0.00004％、pH值7.4。

LB+SP液体培养基组成为：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、丙酮酸钠0.1％、pH值7.4。

YS摇瓶发酵培养基组成为：磷酸二氢铵0.05％、磷酸二氢钾0.05％、七水合硫酸镁0.02％、氯化钠0.5％、酵母提取物0.5％、pH值7.0。

尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum西瓜专化型FON1(江苏省农业科学院蔬菜研究所西甜瓜研究室惠赠)、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum B4-1(南京农业大学植物保护学院农药学系惠赠)、稻瘟菌Magnaporthe grisea GuyII(南京农业大学植物保护学院植物病理学系惠赠)、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum黄瓜专化型NFC1(南京农业大学植物保护学院农药学系惠赠)和灰葡萄孢Botrytis cinerea NBC1(南京农业大学植物保护学院农药学系惠赠)由发明人进一步分纯后以滤纸片的形式保藏在-80℃冰箱中。辣椒疫霉菌Phytophthora capsici NPC1(南京农业大学植物保护学院农药学系惠赠)由发明人进一步分纯后以斜面培养基的形式保藏在-80℃冰箱中。

实施例1菌株的筛选

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌菌株NN6，属于伯氏致病杆菌(Xenorhabdusbovineii)，保藏编号：CCTCC NO：M 2020097，2020年4月29保藏于中国典型培养物保藏中心。

本实施方式的伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6是按照如下方式获取的：

用昆虫病原线虫感染大蜡螟5龄幼虫，幼虫死亡后，用体积百分比为75％的酒精浸泡30s后，用质量百分比为0.5％的NaClO溶液擦拭虫体表面，并用灭菌滤纸吸干虫体上的液体；用灭菌剪刀剪掉大蜡螟的第5或第6对腹足，用移液枪吸取将从伤口渗流出的血淋巴并滴加在NBTA+SP平板培养基上，用接种环进行四区划线，置于28℃生化培养箱中培养2-3d，挑取蓝绿色初生型单菌落并接种于LB+SP液体培养基中，于28℃、180rpm振荡培养24h后，与60％灭菌甘油按1∶1混合，分装入1.5mL离心管中，保存于-80℃冰箱中。

本发明所筛选的具有抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型及黄瓜专化型、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢和辣椒疫霉菌的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在NBTA+SP培养基上，初生型菌落可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝绿色菌落，次生型不能吸收呈深红色菌落。明胶穿刺培养呈水解阳性。生理生化指标测定结果表明：昆虫病原线虫共生菌可利用葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、纤维二糖产酸，不能利用果糖、肝糖、蔗糖、甘油、水杨苷等产酸。可以利用甲酸盐、乳酸盐、丁二酸等，不能利用葡萄糖酸盐、柠檬酸盐等。

对分离筛选得到的致病杆菌进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，根据共生菌16SrDNA设计引物(上游：CGTTACCCGCAGAAGAAGCAC，下游：GCGGGACTTAACCCAACATTTC)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后，进行克隆、转化，测序。测序结果与GeneBank中的16SrDNA序列进行同源性比对，同源性达到99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌NN6属于致病杆菌属(Xenorhabdus)，为伯氏致病杆菌(Xenorhabdusbovineii)。

实施例2昆虫病原线虫共生菌发酵液的制备

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌的发酵液制备方法是按照以下步骤进行的：

1)用1mL的tip头从-80℃保存的昆虫病原线虫共生菌NN6甘油菌管中沾取菌悬液，在NBTA+SP平板培养基上划线，28℃培养24h得到单菌落；

2)挑取蓝绿色初生型菌落接种入LB+SP液体培养基，28℃下震荡培养24h得到菌液；

3)取2)培养的菌液以5％的接种量接种于YS摇瓶发酵培养基中震荡培养24h得到种子液；

4)将3)得到的种子液以5％的接种量接种于相同培养基中继续震荡培养72h得到昆虫病原线虫共生菌的发酵液。

实施例3昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液的制备

本实施方式所述的昆虫病原线虫共生菌NN6的发酵液的组分分离是按照以下步骤进行的：

1)将实施例2发酵完成的新鲜发酵液以10000rpm离心10min得到菌体沉淀和上清液；

2)离心所得的菌体沉淀用无菌水稀释混匀得到菌细胞悬液；

3)离心所得的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；

4)再用平板涂布法检查过滤后的上清液菌落数，低于10²CFU/mL时认为获得的上清液为无菌滤液。

实施例4

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6它用于防治西瓜枯萎病。它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液防治西瓜枯萎病，应用平板菌丝生长抑制法分别测定共生菌发酵后的菌细胞悬液和无菌滤液对尖孢镰刀菌西瓜专化型FON1的抑制效率。

具体步骤为：

1.真菌制备：将尖孢镰刀菌西瓜专化型(菌株名：FON1)保存滤纸接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，置于25℃恒温培养箱内避光培养，培养至菌丝铺满培养皿面积的75％，备用。

2.共生菌菌体细胞的稀释：按照实施例2和实施例3的方法得到菌体细胞，用与原发酵液等体积的无菌水稀释混匀，制成菌细胞悬液，测定OD₆₀₀值和镜检统计CFU值后备用(表1)。

3.带药培养基的制备：用100mL规格的锥形瓶配制45mL的PDA培养基若干瓶备用。在无菌条件下，取伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6菌细胞悬液和按照实施例3制备方法获得的无菌滤液5mL加入到冷却至40-45℃的PDA培养基中并混匀，每瓶培养基制成3个平板，每个处理3次重复。以加5mL无菌水的培养基为对照。

4.抑制效率测定：在无菌条件下，用真菌打孔器从步骤1中的真菌(即尖孢镰刀菌西瓜专化型FON1)边缘打出若干直径7.5mm的菌饼，并将菌饼接于上述带药培养基平板的中央，对照组处理同上。处理完成后用透气滤菌膜密封平板边缘，在25℃下恒温避光培养5d。最后采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制效率。

5.数据处理：抑制效率公式如下：

抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％；

为验证本实施例中伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6的抑菌效果，现将结果列出如下：

通过上述抑菌实验，结果表明在PDA平板培养条件下，NN6的菌细胞悬液(2.72×10⁷CFU/mL)和无菌滤液(干物质浓度为6.90g/L)对尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长均具有较好的抑制作用。菌落生长状态见图1，生长直径统计与抑菌率统计见图2。

实施例5

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6发酵液，它用于防治小麦赤霉病和稻瘟病。发酵液的制备方法与实施例2相同。

应用平板菌丝生长抑制法分别测定不同浓度的共生菌发酵液对禾谷镰刀菌和稻瘟菌的抑制效率及剂量效应。

具体步骤为：

1.真菌培养：将禾谷镰刀菌(菌株名：B4-1)保存滤纸接于V8平板培养基上，将稻瘟菌(菌株名：GuyII)保存滤纸接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，置于25℃恒温培养箱内避光培养，培养至菌丝铺满培养皿面积的75％，备用。

2.共生菌发酵液的倍比稀释：按照实施例2发酵方法得到的发酵液用无菌自来水按1倍、2倍、5倍、10倍稀释，共得4个浓度处理组，测定OD₆₀₀和镜检统计CFU值后备用(表1)。

3.带药培养基的制备：用100mL规格的锥形瓶配制45mL的PDA培养基和V8固体培养基若干瓶备用。在无菌条件下，取伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6发酵液1倍、2倍、5倍和10倍稀释液各5mL分别加入到冷却至40-45℃的PDA培养基和V8固体培养基中并混匀，以加5mL无菌水的培养基为对照，每瓶培养基制成3个平板，每个处理3次重复。

4.抑制效率测定：在无菌条件下，用真菌打孔器从步骤1中真菌(即禾谷镰刀菌B4-1和稻瘟菌GuyII)的边缘打出若干直径7.5mm的菌饼，并将稻瘟菌GuyII菌饼接于上述混有不同浓度发酵液的PDA平板的中央，将禾谷镰刀菌B4-1菌饼接于上述混有不同浓度发酵液的V8固体培养基平板的中央，对照组处理同上。处理完成后用透气滤菌膜密封平板边缘，稻瘟菌GuyII在25℃下恒温避光培养8d，禾谷镰刀菌B4-1避光培养3d。最后采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制效率。

5.数据处理：抑菌效力公式如下，几率值法求毒力回归方程，算出各药剂对病原菌的EC₅₀。

抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％；

为验证本实施例伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6的抑菌效果，现将结果列出如下：

通过上述抑菌实验，结果表明在V8平板培养条件下，NN6对禾谷镰刀菌B4-1的生长具有较好的抑制作用。且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果越明显(见图3和表2)，抑菌中浓度及线性回归方程见表3。在PDA平板培养条件下，NN6对稻瘟菌GuyII的生长同样具有高效的抑制作用，且抑菌效果在发酵液被10倍稀释后仍未见明显降低(见图4和表4)，抑菌中浓度及回归方程见表5。

表1.稀释倍数、吸光值与菌细胞数的对应关系表

表2.V8平板培养条件下伯氏致病杆菌NN6对禾谷镰刀菌的拮抗效果

CFU/mL	1.97×10<sup>6</sup>	5.13×10<sup>6</sup>	1.45×10<sup>7</sup>	2.72×10<sup>7</sup>
					抑菌率(％)	46.04	59.90	71.78	77.23

注：表中数据为接种真菌后第3d时不同浓度发酵液的抑菌率，数值为5次重复平均值。

表3.NN6对禾谷镰刀菌的抑菌中浓度和毒力回归方程

共生菌	毒力回归方程	EC<sub>50</sub>	相关系数
				NN6	Y＝-1.038+2.161X	0.0425	0.903

注：EC₅₀为0.0425×10⁸CFU/mL

表4.PDA平板培养条件下伯氏致病杆菌NN6对稻瘟菌的拮抗效果

CFU/mL	1.03×10<sup>6</sup>	3.9×10<sup>6</sup>	1.56×10<sup>7</sup>	2.83×10<sup>7</sup>
					抑菌率(％)	83.82	84.19	85.66	89.71

注：表中数据为接种真菌后第8d时不同浓度发酵液的抑菌率，数值为5次重复平均值。

表5.NN6对稻瘟菌的毒力回归方程

共生菌	毒力回归方程	相关系数
			NN6	Y＝-11.213+13.488X	0.973

实施例6

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6它用于防治黄瓜枯萎病。它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液防治黄瓜枯萎病，发酵液的制备方法与实施例2相同，菌细胞悬液与无菌滤液的获得方法与实施例3相同，真菌培养方法与实施例4相同。

应用平板菌丝生长抑制法测定共生菌发酵后的菌细胞悬液和无菌滤液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(菌株名：NFC1)的抑制效率，具体操作步骤与实施例4相同。

实验结果表明在PDA平板培养条件下，NN6的菌细胞悬液(2.72×10⁷CFU/mL)和无菌滤液(干物质浓度为6.90g/L)对尖孢镰刀菌NFC1的菌丝生长均有一定的抑制作用。菌落生长状态见图5，生长直径统计与抑菌率统计见图6。

实施例7

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6它用于防治番茄灰霉病。它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液防治番茄灰霉病，发酵液的制备方法与实施例2相同，菌细胞悬液与无菌滤液的获得方法与实施例3相同。真菌培养方法与实施例5的稻瘟菌相同。通过以下实施例验证本发明的有益效果：

应用平板菌丝生长抑制法测定共生菌发酵后的菌细胞悬液和无菌滤液对灰葡萄孢(菌株名：NBC1)的抑制效率。具体操作步骤与实施例4相同。

实验结果表明在PDA平板培养条件下，NN6的菌细胞悬液(2.72×10⁷CFU/mL)和无菌滤液(干物质浓度为6.90g/L)对灰葡萄孢NBC1的生长均具有一定的抑制作用。菌落生长状态见图7，生长直径统计与抑菌率统计见图8。

实施例8

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6它用于防治辣椒疫霉病。它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液防治辣椒疫霉病，发酵液的制备方法与实施例2相同，菌细胞悬液与无菌滤液的获得方法与实施例3相同。通过以下实施例验证本发明的有益效果：

真菌培养：用接种针从保存的辣椒疫霉菌(菌株名：NPC1)斜面培养基上挑取疫霉菌接于V8平板培养基上，置于25℃恒温培养箱内避光培养，培养至菌丝铺满培养皿面积的75％，备用。

应用平板菌丝生长抑制法测定共生菌发酵后的菌细胞悬液和无菌滤液对辣椒疫霉(菌株名：NPC1)的抑制效率。具体操作步骤与实施例4相同。

实验结果表明在PDA平板培养条件下，NN6的菌细胞悬液(2.72×10⁷CFU/mL)和无菌滤液(干物质浓度为6.90g/L)对辣椒疫霉NPC1的生长均具有较好的抑制作用。菌落生长状态见图9，生长直径统计与抑菌率统计见图10。

实施例9

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌细胞悬液和无菌滤液防治西瓜枯萎病和小麦赤霉病，其发酵液的制备方法与实施例2相同，菌细胞悬液与无菌滤液的获得方法与实施例3相同。

应用凹玻片法分别测定共生菌抑菌剂对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的抑制效率。

具体步骤为：

1)尖孢镰刀菌FON1分生孢子悬液的制备：从培养5-7d的尖孢镰刀菌FON1平板上用真菌打孔器打出3个直径7.5mm的菌饼，加入到50mL液体PDA培养基中，180rpm震荡培养3d，调整转速为200rpm，继续震荡培养6d。再用六层纱布过滤，滤液用无菌水洗涤1遍，8000rpm离心5min，获得的分生孢子沉淀用无菌水稀释重悬至1×10⁶CFU/mL得到尖孢镰刀菌FON1分生孢子悬液；

2)禾谷镰刀菌B4-1分生孢子悬液的制备：从田间采集的小麦病穗上剥下最外层颖壳，在无菌水中浸泡30s，洗下分生孢子，再用无菌水洗涤1遍，8000rpm离心5min，获得的分生孢子沉淀用无菌水稀释重悬至1×10⁶CFU/mL得到禾谷镰刀菌B4-1分生孢子悬液；

3)分生孢子的处理：分别吸取10μL尖孢镰刀菌FON1分生孢子悬液或谷镰刀菌B4-1分生孢子悬液滴于凹玻片中心，再分别滴加NN6菌细胞悬液(2.72×10⁷CFU/mL)、无菌滤液(干物质浓度为6.90g/L)和无菌水10μL，最后吸取10μL 0.5％的葡萄糖溶液加入，轻轻吹打以混匀三者；

4)分生孢子的培养：将凹玻片架放于带浅层水或湿润滤纸的培养皿中，加盖保湿，于25℃避光培养9h；

5)萌发数的统计：以无菌水加葡萄糖处理分生孢子作为对照。在对照组萌发率达到90％以上时，检查各处理组分生孢子萌发情况，随机选取视野，每组调查总数不低于100个，分别记录观察的分生孢子总数与萌发数，分生孢子芽管长度大于分生孢子的短半径视为萌发。

5)数据处理：根据公式C计算相对萌发抑制率(R为分生孢子萌发率；N_g表示萌发的分生孢子数；N_t表示调查的分生孢子总数；R_g表示处理校正的分生孢子萌发率；R_t为处理分生孢子萌发率；_R0为对照分生孢子发芽率；I为分生孢子萌发的相对抑制率)。

A：R＝N_g/N_t×100

B：R_g＝R_t/R₀×100

C：I＝(R₀-R_g)/R₀×100

为验证伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)NN6的抑菌效果，现将结果列出如下：

通过上述分生孢子萌发抑制实验，实验结果表明在凹玻片培养环境下，NN6的菌细胞悬液(2.79×10⁷CFU/mL)和无菌滤液对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌分生孢子的萌发均具有较好的抑制作用。分生孢子萌发状态见图11和图12，萌发率统计与相对抑制率统计见图13和图14。

实施例10

本实施方式的昆虫病原线虫共生菌NN6，它对小麦赤霉病的防治效果优于化学农药多菌灵。发酵液的制备方法与实施例2相同，菌细胞悬液与无菌滤液的获得方法与实施例3相同。

应用平板菌丝生长抑制法测定共生菌无菌滤液、菌细胞悬液与多菌灵溶液对禾谷镰刀菌的抑制效率，具体操作步骤与实施例4相同。按田间施用的常用浓度对多菌灵粉末进行稀释，稀释终浓度为1.25g/L。将共生菌发酵液的10×稀释液过滤除菌后，旋转蒸发后测得所获干物质浓度为0.62g/L。

实验结果表明NN6发酵液的10×稀释液(1.97×10⁶CFU/mL)和无菌滤液的10×稀释液对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制效率均显著高于常用浓度下的多菌灵，抑菌率统计见图15。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 共生菌16SrDNA设计上游引物(Artificial Sequence)

<400> 1

cgttacccgc agaagaagca c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 共生菌16SrDNA设计下游引物(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgggactta acccaacatt tc 22

Claims (10)

1.一种抑制多种植物真菌病害的昆虫病原线虫共生菌菌株，其特征在于，该共生菌菌株为伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovienii）的高毒力菌株NN6，保藏编号为：CCTCC NO: M2020097，2020年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的共生菌菌株在防治西瓜枯萎病、小麦赤霉病、稻瘟病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病或辣椒疫霉病中的应用。

3.权利要求1所述的共生菌菌株在制备抑菌剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂针对的病原菌为尖孢镰刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌或禾谷镰刀菌中的一种或几种。

5.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂含有权利要求1所述的昆虫病原线虫共生菌菌株NN6的全发酵液、菌细胞悬液或无菌滤液中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂的剂型为液体菌剂。

7.权利要求5或6所述的抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述抑菌剂中的全发酵液、菌细胞悬液和无菌滤液的制备方法包括如下步骤：

1）沾取甘油菌管中昆虫病原线虫共生菌菌株NN6菌悬液，在NBTA+SP平板培养基上划线，28~30℃培养24~48h得到单菌落；

2）挑取蓝绿色初生型菌落接种入LB+SP液体培养基，28~30℃下震荡培养12~24h 得到菌液；

3）取步骤2）培养的菌液以2~5%的接种量接种于YS摇瓶发酵培养基中28~30℃震荡培养12~24h得到种子液；

4）将步骤3）得到的种子液以2~5%的接种量接种于相同培养基中28~30℃继续震荡培养24~72h即得全发酵液；

5）将步骤4）获得的全发酵液离心得到菌体沉淀和上清液；

6）离心所得的菌体沉淀用无菌水稀释混匀得到菌细胞悬液；

7）离心所得的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；

8）再用平板涂布法检查过滤后的上清液菌落数，低于10² CFU/mL时认为获得的上清液为无菌滤液。

8.根据权利要求7所述的抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）的NBTA+SP平板培养基的组成为：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%、琼脂1.5%、溴百里酚蓝0.000025%、丙酮酸钠0.1%、氯化三苯基四氮唑 0.00004%、pH值7.4。

9.根据权利要求7所述的抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）的LB+SP液体培养基的组成为：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%、丙酮酸钠0.1%、pH值7.4。

10.根据权利要求7所述的抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3）和步骤4）的YS摇瓶发酵培养基组成为：磷酸二氢铵0.05%、磷酸二氢钾0.05%、七水合硫酸镁0.02%、氯化钠0.5%、酵母提取物0.5%、pH值7.0。

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