JPH04139194A - 新規ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を何する新規なペプチドを提供す°
るものであり、アンギオテンンン変換酵素阻害剤等とし
て有用なペプチドに関する。

Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ｐｒ。

［従来の技術］ アンギオテンンン変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンンンＩ（Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−４ａｌ−Ｔｙｒ−ｌｉｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して、アンギオテン
ンン■のＣ末端よりノペプチト（Ｈｉｓ”−Ｌｅｕ”）
を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有するアンギオテン
ンン■を生成させる酵素である。また、この酵素は生体
内降圧物質であるプラノキニンを破壊し不活化する作用
も併存し、昇圧系に強力に関与している。

従来より、アンギオテンンン変換酵素の活性を阻害すれ
ば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に有
効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトグリルか合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギ才テンノン
変換酵素阻害物質の合成研究か盛んであり、又天然物か
らの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンンン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることが期待されるからである。

［発明か解決しようとする課題］ しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテプロタイト（ノナペプチド５
Ｑ２０８８１）等や、ストレプトミセス属に属する放線
菌の代謝産物ｌ５８３　（特開昭５８−１７７９２０号
公報）か知られているに過ぎない。また、天然物を酵素
処理して得られたアンギオテンンン変換酵素阻害物質と
しては、牛乳カゼインをトリプトシンにより分解して得
たペプチド類等が知られているが（特開昭５８ｉ０９４
２５号、同５９−４４３２３号、同５９−４４３２４号
、同６１−３６２２６号、同６１−３６２２７号）新規
な阻害物質の開発が望まれているところである。

し課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副作
用の少ないアンギオテンシン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、蛋白質特に魚肉、カツオブノを特定の酵素
で加水分解した組成物中にアンギオテンシン変換酵素阻
害活性を有する物質の存在をつきとめ、該物質が一般弐
Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏで示されるペプチドであること
を知見し、本発明を完成した。

本発明の一般式Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏで示されるペプ
チドは文献未載の新規なペプチドであり、カツオブッ等
の蛋白質をサーモライシンによって加水分解することに
よって製造され、実用にあたっては組成物をそのまま用
いても良く、あるいは必要に応じて精製して使用される
。更にはペプチド合成の常套手段を適用して合成するこ
とによって製造することもできる。

上記でいうＰｈｅはフェニルアラニン、Ｇｌｎはグルタ
ミン、Ｐｒｏはプロリンを意味し、かかるアミノ酸はい
ずれもし一体である。

本発明のペプチドは蛋白質をサーモライシンで加水分解
することによっても、ペプチド合成法でも取得できる。

蛋白質をサーモライシンで加水分解するには、蛋白質の
性状により処理は異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のサ
モライノンを加え温度１０〜８５℃程度で０．１〜４８
時間反応を行う。

蛋白質としては、動物由来や微生物由来のもの等が任意
に用いられ、特に有用なものはカツオブノ、イワシ等の
魚類又はアクチンである。加水分解液中には本発明のペ
プチド以外に、他のペプチドが存在してるが、これらは
混合物のままで各種の用途に用いられても良く、又、本
発明のペプチドのみを単離して用いても差し支えない。

単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法
、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置
で二分される２Ｎのフラグメントの一方に相当する反応
性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメント
に相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジイ
ミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する
縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させる
ことによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばペンノルオキシカルボニル、ｔ−プチルオキノ
カルボニル、ｐ−ビフェニルイソブロビロオキンヵルポ
ニル、９−フルオレニルメチルオキンヵルボニル等が挙
げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙
げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基
はクロルメチル樹脂、オキンメチル樹脂、Ｐ−アルコキ
ンベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投
与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、を者の症状・年令等により異なるか
、通常１回０．００１−１０００ｍｙ、好ましくは００
１〜１０ｍ９を１日当たり１〜３回である。本発明のペ
プチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形
で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において
常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用
いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニ
ット、デキストリン、ンクロデキストリン、デンプン、
蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸
アルミニウム、カルホキツメチルセルロースナトリウム
、ヒトロキノプロビルデンブン、カルポキンメチルセル
ロースカルンウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース
、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキンプロピルセルロ
ース、ヒドロキンプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン、ボリヒニルアルコール、軽質無水ケイ酸
、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベ
ントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸
エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪
酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチ
ン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流
動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーホン、非イ
オン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げら
れる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ンロ
ツブ剤、懸濁剤、半開、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又はＰ、局する形であ
ってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティ
ングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチド
を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩
水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝
剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、
好ましくは０．５〜７０％の割合で含有することができ
る。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含
有していてもよい。

［作　　用１ 本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れたアン
ギオテンンン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
ブラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎
性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤
、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられ
る血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少
、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であ
る。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

〔ペプチドの製造〕

（Ａ）カツオブン５９に水４０ｍｌを加え充分ポモノナ
イズし、サーモライシンを２０ｒＱｇ加え３７℃、ｐＨ
７で３時間加水分解反応を行った後、１００℃で１０分
間煮沸し、冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー（ＯＤＳ−、Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）に
より精製し、ペプチドを得た。

氷晶を気相プロティンシーケンサ−（アプライド　バイ
オノステムズ社製　４７７　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

Ｈ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ［ｎ−ブタノール、酢酸：ピリジン　水＝１５３
・ＩＯ・＋２］ （ンリカゲルプレート、ニンヒドリン発色）Ｒｆ：０．
３６８ ｍ、ｐ：１３７°Ｃ 元素分析　Ｃ＠Ｈ１，Ｎ、Ｏ，・０．４Ｈ，０としてＣ
ＨＮ 計算値　３８，９５　９，７３　２０．１９測定値　３
８，９３　９．７０　２０．１３比旋光度［α］”、（
Ｃ＝０．５　　水）ニー６３．８゜〔ペプチドの合成〕 市販のＢｏ　ｃ（ブトキシカルボニル）　−Ｐｒｏ　−
０−Ｒｅｓｉｎ０．８３９をバイオサーチ社のペプチド
合成装置Ｓ　Ａ　Ｍ　２の反応槽に分取し、以下のよう
に合成を行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２．５％アニソールを含む塩
化メチレン中、２５分間の反応により、Ｂｏａ基を除去
したのち、塩化メチレンによる洗浄、１０％ノイソブロ
ピルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び
塩化メチレンによる洗浄を行った。

これと５ｍｌの０　、４　Ｍ　Ｂｏａ　−Ｇｉｎのジメ
チルホルムアミド溶液、５ｍｌの０．４Ｍンイソプロピ
ル力ルポジイミドの塩化メチレン溶液とを混合した後、
反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させた。

得られた樹脂をツメチルホルムアミド、塩化メチレン、
ｌＯ％ノイソブロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びツメチルホルムア
ミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏａ−Ｇ　ｉｎ　−Ｐｒｏ
樹脂を得た。

引き続き同様のＢｏａ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカ
ップリングを繰り返しＰｈｅ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ樹脂を得
た。

該樹脂を２０ｍ１の１０％アニソールを含むフッ化水素
中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させ
た。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽出
し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｃ＋ｓ）による逆相クロ７
トグラフイーにより精製し、Ｈ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒ
ｏ−ＯＨ（収量９０ｍｇ）を得た。

本島を前記と同一のプロティンシーケンサ−により分析
した結果、上記の組成であることが判明した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。

Ｒｆ　　・　０．３６８ ｍ、ｐ：１３７℃ 元素分析　Ｃ＊ＨｔａＮ−Ｏｓ・０．９ＨｔＯとしてＣ
）（Ｎ 計算値　３７．７２　９．７８　１９．５５測定値　３
７，６８　９゜７９　１９．５９比旋光度［α］”、（
Ｃ＝０．５　　水）ニー６３．８゜実施例 （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンシン変換酵素阻害活性の測定は、ＣＣ１１ｅｕｎと
Ｃｕ５ｔ＋ａ＋ａｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０１６３７（＋　９７
１））に準じて以下の方法で行った。

酵素基質；　Ｂｚ　（ベンジル）　−ＧＬｙ　−Ｈｉｓ
　−Ｌｅｕ（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８　ｆ
ｉｌｌｌこ溶解した溶液） 酵　素：うさぎの肺のアセトンノくウダー（シグマ社製
）（１ｇを５（１＋Ｍのリン酸緩衝液１０ｍ１中で粉砕
した後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μＱ１酵素溶液を１２μρ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μＱとした後、３７°Ｃで３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μＱを用し）て終了させ
た。

反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ　ｏｒｔｅ
ｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチル
を留去し、それに１Ｉａｌの蒸留水を入れて残渣を溶解
し、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ
ｚｔａ）を測定した。

阻害率は阻害剤なしで反応したときの０Ｄｚｔｅを１０
０％とし、反応時間０分のときのＯＤ＊ｔｓを０％とし
て求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド）
の濃度ＩＣ５ｏ（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

第 表 ［効　　果］ 本発明ではアンギオテンンン変換酵素阻害剤として有用
な、新規なペプチドが得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏで示される新規ペプ
   チド。 ２、蛋白質をサーモライシンで加水分解することを特徴
   とする一般式Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ新規ペプチドの製
   造法。 ３、蛋白質としてアクチンを使用する請求項２記載の製
   造法。 ４、蛋白質として魚肉を使用する請求項２記載の製造法
   。 ５、蛋白質としてカツオブシを使用する請求項２記載の
   製造法。 ６、一般式Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏで示されるペプチド
   を有効成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤。