(SHINODA, Tadashi) T2290006 ftgjllftffi (84) ¾¾§<¾¾?&? ß9. ¾)Sr&iSgBi5-i i-i o * nfx»s$asffi Hg>: ¾¾Sf ¾RÍrt Kanagawa (74) ftSA:S#— . #(SAKAI,Hajiroeeta].);T 1020083 TB fJI- Tokyo (JP).
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HIDROLIZADO DE CASEINA, PROCESO PAIRA PRODUCIRLA Y USO DE LA MISMA
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona a hidrolizado de caseína el cual se obtiene por hidrólisis de caseína de leche animal, se espera que exhiba varias funciones las cuales incluyen actividad inhibitoria de enzimas que convierten la angiotensina y efecto hipotensivo, y que sea útil para varios alimentos y medicinas, así como también a un método para preparar tal hidrolizado de caseína, y uso del mismo. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se ha reportado una variedad de péptidos que tienen varias funciones, tales como efecto hipotensivo, actividad antibacteriana, efecto solubilizante de calcio, y efecto inmunomodulador, y estos péptidos están en uso en alimentos y medicina . Por ejemplo, se han propuesto los péptidos hipotensivos, muchos de los cuales tienen actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensiva (abreviada como ACE posteriormente en la presente) . ACE convierte un precursor, la angiotensina I, a la angiotensina II que tiene actividad vasoconstrictiva en organismos vivos, para por lo mismo incrementar la presión sanguínea. De esta forma se espera que los péptidos que tienen la actividad inhibitoria de ACE exhibiban el efecto hipotensivo por REF:169152 2
inhibir ACE para suprimir la producción de la angiotensina II en el organismo vivo. En el desarrollo de los péptidos hipotensivos , las investigaciones son usualmente dirigidas primero a los péptidos que tienen actividad inhibitoria de ACE, de tal forma que el efecto hipotensivo de los péptidos propuestos son principalmente indicados por el efecto inhibitorio de ACE como índice de referencia. Un gran número de agentes que tienen efecto hipotensivo evaluado por la actividad inhibitoria de ACE como índice de referencia, han sido propuestos a la fecha, y están en uso para la prevención y tratamiento de la hipertensión. En la producción de péptidos funcionales, tales como péptidos que tienen efecto hipotensivo evaluados por el efecto inhibitorio de ACE, en particular, en producción de péptidos funcionales por digestión de proteína de alimento con enzimas, se requieren usualmente etapas complicadas después de la digestión enzimática, tal como concentración, purificación, y aislamiento de los productos digeridos, para mejorar la expresión de los efectos funcionales. Ya que los péptidos son absorbidos a través del canal alimentario en la sangre para expresar sus funciones en organismos vivos, se espera que los péptidos no digeribles in vivo son esperados sean ventajosos ya que tienen alta capacidad de absorción y resistencia a la digestión contra varias enzimas digestivas en organismos vivos. Sin embargo, 3
es conocido en detalle que los péptidos contribuyen a mejorar la resistencia de la digestión in vivo. De esta forma es deseado el desarrollo de los productos de digestión enzimática para alimentos o medicina y métodos para producir tales productos, los productos que tienen alta resistencia a la digestión in vivo, y pueden expresar efectivamente sus funciones deseadas sin sufrir procesos complicados tales como concentración, purificación, o aislamiento después de la digestión enzimática. Por ejemplo, la Publicación 1 de Patente describe un método para producir una mezcla de péptidos de bajo pesó molecular principalmente compuesta de dipéptidos y tripéptidos, que tienen una longitud de cadena promedio de no más de 3, y que tienen excelente capacidad de absorción de absorción intestinal. Se prepara la mezcla de péptidos a partir de proteína de fríjol de soya por acción simultánea o secuencial de dos o más enzimas que tienen actividad de endoproteasa pero substancialmente no tienen actividad de exoproteasa, con no más de 5% de aminoácidos libres que son generados . La Publicación de Patente 2 describe los alimentos funcionales que utilizan los productos de digestión de proteina de fríjol de soya y método para producir los mismos. Los productos de digestión contienen como ingredientes activos un dipéptido y tripéptidos que consisten de Ala-Tyr, Gly-Tyr-Tyr; Ala-Asp-Phe, y Ser-Asp-Phe, preparados por 4
digerir proteína de fríjol de soya desnaturalizada por calor con enzimas tales como proteasas derivadas de Aspergill s oryzae. Los productos de digestión preferentemente tienen una longitud de cadena de péptido promedio de 2 a 4 , y contienen 20 a 30% en peso de aminoácidos libres. ' Sin embargo, estos . productos de digestión enzimáticos de proteína de fríjol de soya tienen componentes que son muy diferentes de aquellos de los productos de digestión enzimática de caseína de leche animal . De esta forma las publicaciones de patente anteriores no sugieren nada acerca de métodos para preparar, a partir de caseína de leche animal como un material de partida, productos de digestión de caseína e hidrolizado de caseína que tienen una alta concentración de ingredientes activos y excelente capacidad de absorción de ingredientes activos y excelente capacidad de absorción en organismos vivos, y pueden ser usados sin sufrir necesariamente procesos complicados tales como concentración, purificación, y aislamiento. Por otra parte, las Publicaciones de patente 3 y 4 proponen métodos para preparar los péptidos que tienen varias funciones por digerir caseína de leche animal con enzimas tales como proteasas y peptidasas, y particularmente péptidos funcionales obtenidos por los métodos. Los productos de digestión enzimática descritos en estas publicaciones son, sin embargo, para obtener péptidos 5
particulares como ingredientes activos . De esta forma no hay enseñanza en estas publicaciones para la hidrólisis de caseína de leche animal que tengan una longitud de cadena promedio de no más de 2.1, procesos específicos de la hidrólisis, y eficacia del hidrolizado de caseína que tienen longitud de cadena promedio particular. Publicación de Patente 1: JP-5-252979-A Publicación de Patente 2: JP-2003-210138-A Publicación de Patente 3: JP-6-128287-A Publicación de Patente 4: JP-2001-136995-A SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto dé la presente invención proporcionar un hidrolizado de caseína el cual contiene péptidos indigeribles in vivo y aminoácidos libres que tienen capacidad de digestión enzimática in vivo, y se espera que exprese las funciones, tales como el efecto hipotensivo, en organismos vivos . Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar el hidrolizado de caseína mencionado anteriormente, el cual permite fácil y eficientemente la producción del hidrolizado de caseína anterior sin implicar necesariamente procesos complicados. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un agente el cual tiene actividad inhibitoria de ACE o efecto hipotensivo que contiene péptidos indigeribles 6
in vivo y aminoácidos libres, se espera que tenga un efecto hipotensivo excelente en organismos vivos, y sea útil para varios alimentos o medicina funcionales . En la presente invención se han hecho investigaciones intensivas para lograr los objetos anteriores, para encontrar que, al hidrolizar caseína dé leche animal que tenga longitud de cadena promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos, un hidrolizado de caseína que contiene aminoácidos libres y péptidos de bajo peso molecular, tales como tripéptidos y dipéptidos, pueden ser obtenidos, en donde los aminoácidos libres y moléculas de péptidos indigeribles in vivo que tienen el residuo Pro en la terminal carboxilo son eficientemente formados . En la presente invención se ha encontrado también que los péptidos indigeribles in vivo que tienen un residuo Pro en la terminal carboxilo son esperados para tener alta resistencia a la digestión contra peptidasas in vivo, de tal forma que es muy posible que tales péptidos indigestibles exhiban totalmente sus funciones en organismos vivos, y que el hidrolizado de caseína tenga un alto contenido de péptidos que tienen buena capacidad de absorción in vivo, tales como dipéptidos y tripéptidos, de tal forma que el hidrolizado de caseína es capaz de exhibir totalmente varias funciones, tales como efecto hipotensivo, en organismo in vivo, para completar por lo mismo la presente invención. Además, en la presente invención se han hecho investigaciones para enzimas que producen ef cientemente el hidrolizado de caseína de la presente invención a partir, de varias enzimas conocidas para encontrar que una clase particular de enzimas es particularmente capaz de producir eficientemente el hidrolizado de caseína de la presente invención. De acuerdo a la presente invención, se proporciona un hidrolizado de caseína el cual comprende aminoácidos libres y péptidos obtenidos al hidrolizar caseína de leche animal para tener una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos. Más específicamente, la presente invención proporciona el hidrolizado de caseína mencionado anteriormente en donde los péptidos comprenden péptidos indigeribles in vivó que consisten de dipéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro y tripéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro-Pro, y en donde un contenido de los dipéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro no es menor a 5% en peso de una cantidad total de los péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado, y un contenido de los tripéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro-Pro no es menor a 1% en peso de una cantidad total de los péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado. · Como se usa en la presente, Xaa puede ser cualquier 8
aminoácido . De acuerdo a la presente invención, se proporciona también un método para preparar el hidrolizado de caseína mencionado anteriormente el cual comprende la etapa de (A) hidrolizar caseína de leche animal para tener una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 con un grupo .de enzimas capaz de digerir la caseína de leche animal en un hidrolizado de caseína que tiene una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos . De acuerdo a la presente invención, se proporciona un agente el cual tiene una actividad inhibitoria de ACE- o efecto hipotensivo el cual comprende el hidrolizado de caseína anterior como un ingrediente activo. De acuerdo a la presente invención, se proporciona además el uso del hidrolizado de caseína anterior en · la fabricación de medicina o alimentos funcionales que tienen actividad inhibitoria de ACE o efecto hipotensivo. ' El hidrolizado de caseína de la presente invención contiene aminoácidos libres y péptidos de bajo peso molecular tales como péptidos indigeribles in vivo, obtenidos al hidrolizar caseína de leche animal para tener una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos . De esta forma se espera que . el hidrolizado de caseína presente exhiba, por administración oral, excelente capacidad de absorción in vivo, y varias 9
funciones en organismos vivos, y que sea útil para varios alimentos, medicina y aditivos alimenticios funcionales. Por ejemplo, se espera usar el hidrolizado de caseína de la presente en un agente el cual tiene actividad inhibitoria dé ACE o efecto hipotensivo el cual contiene el hidrolizado presente como un ingrediente activo. El presente método incluye la etapa . (A) para hidrolizar la caseína de leche animal para tener una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 con un grupo de enzimas capaces de digerir la caseína de leche animal en un hidrolizado de caseína que tiene una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos. De esta forma, el método permite la producción fácil y eficiente del hidrolizado de caseína de la presente invención. Por consiguiente, el método presente es ¦ ventajoso en la producción industrial del hidrolizado de caseína de la presente invención. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica la cual muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de absorción in vivo en sangre y resistencia a la indigestión de Xaa-Pro y Xaa-Pro-Pro realizado en el Ejemplo 1. La Figura 2 es una gráfica la cual muestra los resultados del experimento para determinar el efecto hipotensivo dependiente a dosis de los polvos de hidrolizado , 10
de proteína preparados en el Ej emplo 1. La Figura 3 es una gráfica que muestra la relación entre el patrón de elusión de la proteina enlazada con. un gradiente lineal de 0 a 0.6 NaCl 0.6M de las fracciones absorbidas en la resina de intercambio de aniones y la actividad proteolitica en el análisis del ejemplo 1. La Figura 4 es una gráfica la cual muestra la relación entre el tiempo de digestión de la caseína con el grupo de enzimas y la actividad inhibitoria de ACE del hidrolizado de caseína resultante en el Ejemplo 3. La Figura 5 es una gráfica la cual muestra la relación entre la longitud de cadena promedio y la actividad inhibitoria de ACE del hidrolizado de caseína obtenido por hidrólisis de la caseína con el grupo de enzimas en el Ejemplo 3. MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN La presente invención será ahora explicada en detalle. El hidrolizado de caseína de la presente invención contiene aminoácidos libres y péptidos obtenidos ai. hidrolizar caseína de leche animal para tener un intervalo particular de la longitud de cadena promedio en términos del número de residuos de aminoácidos. La cantidad de los aminoácidos libres y los péptidos es preferentemente menor a 80% en peso, más preferentemente 80 a 90% en peso de la 11
cantidad total del hidrolizado de caseína. Es particularmente preferido que el hidrolizado tenga un contenido particular de péptidos indigeribles in vivo como los péptidos, compuestos de dipéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro y tripéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro-Pro. Los péptidos pueden ser sales de péptidos . Como se usa en la presente, la longitud de cadena promedio puede ser expresada como una proporción del número total de moles de los péptidos y los aminoácidos libres generados por hidrólisis de caseína de leche animal · con respecto al número de moles de todos los aminoácidos en el hidrolizado ácido de caseína del mismo peso. Aquí, el hidrolizado ácido de caseína es obtenido por digerir proteína de caseína en aminoácido sencillos. La longitud de cadena promedio puede ser determinada, por ejemplo, evaluando las concentraciones molares de los grupos amino en los hidrolizados por el método OPA usando un reactivo OPA (o-ptalaldehído) , el cual se colorea por reacción los grupos amino, y expresado como: Longitud de cadena promedio = (número de moles de grupos amino en hidrolizado ácido de caseína) / (número de moles de grupos amino en hidrolizado de enzima de caseína) .- - Como se usa en la presente, los péptidos indigeribles in vivo significan dipéptidos Xaa-Pro y tripéptidos Xaa-Pro-Pro que tienen Pro en la terminal 12
carboxilo, los cuales tienen resistencia alta a la digestión contra peptidasas in vivo cuando se absorben intestinalmente en organismos vivos. De acuerdo a la presente invención, la longitud- de cadena promedio del hidrolizado obtenido al hidrolizar caseína de leche animal no es mayor a 2.1, preferentemente 1.1 a 2.1, más preferentemente 1.3 a 2.1, en términos del número de residuos de aminoácidos. Con la longitud de cadena de promedio de más de 2.1, los contenidos de los dipeptidos y tripéptidos deseados asi como también los aminoácidos libres son bajos, y de esta forma el contenido de los péptidos indigeribles in vivo y absorbibles in vivo es bajo. El contenido de los dipéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro en el hidrolizado de caseína de la presente invención no es usualmente más de 5% en peso, preferentemente 5 a 25% en peso de la cantidad total de los dipéptidos y los aminoácidos libres del hidrolizado. Por lo menos 5% en peso, de la capacidad de absorción in vivo deseada es disminuida y la expresión de las funciones es insuficiente. El contenido de los tripéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro-Pro en el hidrolizado de caseína de la presente invención es usualmente no mayor a 1% en peso, preferentemente 1 a 5% en peso de la cantidad total de los péptidos y aminoácidos libres en el hidrolizado. Por lo menos 13
1% en peso, de capacidad de absorción in vivo deseada es disminuida y la expresión de las funciones es insuficiente. En el hidrolizado de caseína de la presente' invención, Xaa en los dipéptidos que tienen la secuencia Xaa-. Pro y en los tripéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro-Pro, puede ser cualquier aminoácido . El hidrolizado de caseína de la presente invención puede contener preferentemente lie-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro,-Gln-Pro, Met-Pro, y Tyr-Pro como los dipéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro, y Ser-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, y Val-Pro-Pro como los tripéptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro-Pro. El hidrolizado de caseína de la presente invención, cuando contiene tales dipéptidos y tripéptidos, exhibe efectivamente en particular la actividad inhibitoria de ACE y el efecto hipotensivo. El hidrolizado de caseína de ¦ la presente invención contiene aminoácidos libres además de los péptidos . El contenido de los aminoácidos libres es usualmente 35 a 50% en peso, preferentemente 40 a 45% en peso de la cantidad total de los péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado. El hidrolizado de caseína de la presente invención puede contener adicionalmente , además de los péptidos y los aminoácidos libres, por ejemplo, lípidos, cenizas, carbohidratos, fibras dietéticas, y agua, los cuales están usualmente contenidos en caseína ' de leche animal 14
comercialmente disponible, en una cantidad de aproximadamente 10 a 20% en peso. Algunos o todos los ingredientes pueden ser removidos como se desee . El hidrolizado de caseína de la presente invención puede ser preparado, por e emplo, por el método de . la presente invención incluyendo la etapa de (A) hidrolizar caseína de leche animal para que tenga una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 con un grupo de enzimas capaz de digerir la caseína de leche animal en un hidrolizado que tienen una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 eñ términos del número de residuos de aminoácidos. La caseína de leche animal es una proteína que tiene un alto contenido de Pro y confirmada como segura para uso en alimentos y similares, y puede ser, por ejemplo, caseína de leche de vaca, leche de caballo, leche de cabra, y leche de borrego, con caseína de leche de vaca que es particularmente preferida. La concentración de caseína al hidrolizar caseína de leche animal no está particularmente limitada, y puede preferentemente ser 3 a 19% en peso, para producción eficiente del hidrolizado de la presente invención. El grupo de enzimas usadas en el método de la presente invención puede ser cualquier grupo de enzimas en donde las enzimas capaces de digerir la caseína de leche animal en un hidrolizado que tiene una longitud de cadena 15
promedio de no más de 2.1 en términos del número de residuos de aminoácidos son adecuadamente seleccionados y combinados; Por ejemplo, un grupo de enzimas (X) que contiene peptidasas capaces de escindir el enlace de péptido Pro-Xaa en la terminación carboxilo de Xaa-Pro-Xaa o Xaa-Pro-Pro-Xaá, pueden ser usados preferentemente . El grupo de enzimas (X) puede contener preferentemente proteinazas séricas que tienen serina en el centro activo, o metaloproteinasas que tienen un metal en el centro activo. Las metaloproteinasas pueden ser proteasa I natural, proteasa II natural, o leucina amino peptidasa. Con por lo menos una de estas metaloproteinasas, el hidrolizádo objetivo puede ser obtenido eficientemente en un cortó tiempo, e incluso en una reacción de una etapa, de esta forma que es la preferida. Las peptidasas capaces de escindir el enlace de péptido Pro-Xaa puede preferentemente ser enzimas que tienen puntos isoelécricos en la región ácida. El grupo de enzimas o el grupo de enzimas (X) puede ser, por ejemplo, un grupo de enzimas extracelulares derivadas del hongo Ko i tal como Aspergillus oryzae. Tal grupo de enzimas extracelulares pueden ser aquellas obtenidas por cultivar el cuerpo celular en un medio apropiado, y extraer el agua con las enzimas que se producen extracelularmente . Un grupo de enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus oryzae que tienen puntos 16
isoeléctricos en la región cida son particularmente preferidos . El grupo de enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus oryzae, puede ser un producto comercial, tal como SUMIZYME FP, LP o MP (todas marcas registradas, por SHIN NIHON CHEMICAL CO. , LTD.), UMAMIZYME (marca registrada,' fabricada por AMANO ENZYME, INC.) Sternzyme B11024 y1 PROHIDROXY AMPL . (ambas marcas registradas, fabricadas por HIGUCHI INC.), ORIENTASE ONS (marca registrada, fabricada por HANKYU BIOINUDSTRY CO . ) , y DENAZYME AP (marca registrada, fabricada por NAGASE SEI AGAKU) , con SUMIZYME FP (marca registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.) que es particularmente preferida. Tales enzimas disponibles comercraímente usualmente tienen condiciones óptimas específicas. Las condiciones, tales como la cantidad de enzimas usadas y el tiempo, de reacción, pueden ser ajustados adecuadamente dependiendo del grupo de enzimas usadas de tal forma que el hidrolizado de caseína de la .presente invención puede ser obtenido. Para la hidrólisis, el grupo de enzimas puede ser, por ejemplo, agregado a una solución acuosa de caseína de leche animal en un grupo de proporción de enzimas/caseína de leche animal de no más de 1/1000, preferentemente 1/10 a 1/1000, más preferentemente 1/10 a 1/100, más preferentemente 1/10 a 1/40, en peso.
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Las condiciones de reacción pueden ser seleccionadas adecuadamente dependiendo del grupo de enzimas usadas de tal forma que se obtiene el hidrolizado de caseína objetivo. La reacción puede ser usualmente afectada en 25 .a 60°C, preferentemente 45 a 55°C, en un pfí de 3 a 10.,, preferentemente 5 a 9, más preferentemente 5 a 8. El tiempo de reacción de las enzimas es usualmente 2 a 48 horas, preferentemente 7 a 15 horas. La reacción enzimática puede ser terminada al inactivar las enzimas. Usualmente, las enzimas son inactivadas en 60 a 110 °C para terminar la reacción. Después de la terminación de la reacción enzimática, el precipitado resultante puede ser removido preferentemente por centrifugación, o a través de varios filtros, como se desea. Además, el hidrolizado obtenido puede ser sometido a remoción de péptidos que tienen sabor u olor agrio, lo cual puede ser efectuado usando carbono activado, una resina hidrofóbica, o similares. Por ejemplo, 1 a 20% en peso de carbón activado con respecto a la cantidad de caseína usada puede ser agregada al hidrolizado, y reaccionado por 1 a 10 horas para eliminar tales componentes agrios y olorosos. El carbón activado puede ser removido por un método convencional, tal como centrifugación o filtración de membrana .
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El líquido de reacción que contiene el hidrolizado de caseína obtenido por la etapa (A) puede ser agregado como a productos líquidos tales como bebidas. Para mejorar la versatilidad del hidrolizado de caseína de la presente invención, el líquido de reacción puede ser concentrado preferentemente y secado en polvos . Tales polvos pueden ser usados como varios alimentos funcionales, aditivos para los mismos, medicina y un ingrediente activo de los mismos . Los polvos pueden opcionalmente ser mezclados con varios aditivos auxiliares para mejorar el equilibrio nutricional o sabor. Ejemplos de tales aditivos auxiliares pueden incluir varios carbohidratos, llpidos, vitaminas, minerales, edulcorantes,-, agentes saborizantes , pigmentos y mejoradores del sabor. Los polvos que contienen el hidrolizado de caseína de la presente invención pueden ser usados al agregar a, por ejemplo, bebidas, yogur, alimento líquido, gelatina, dulces, alimento de retorta, dulces en tabletas, galletas, pasteles esponjados, pan, bizcochos, chocolate, y similares, o por formular en cápsulas, tabletas y similares. Ya que el hidrolizado de caseína de la presente invención puede ser usado en la forma mencionada anteriormente, el hidrolizado presente puede ser usado efectivamente en la fabricación de alimento funcional tal como varias bebidas isotónicas, bebidas generales, alimentos 19 generales, complementos dietéticos, alimento funcional nutricional, que tienen el beneficio de salud incorporado en el mismo, o en la fabricación de medicina. El hidrolizado de caseína de la presente invención ha sido confirmado para tener actividad inhibitoria de ACE. y efecto hipotensivo en los Ejemplos a ser discutidos posteriormente, de tal forma que el hidrolizado presente puede ser usado, por ejemplo, como un agente para la fabricación de alimento funcional que tiene tal actividad y efecto, o como un agente para la fabricación de medicina. Cuando el hidrolizado de caseína de la presente invención es usado como un agente que tiene actividad inhibitoria de ACE y efecto hipotensivo, una dosis preferida del agente para administración oral a humano es usualmente tal como para permitir' la ingestión de 0.1 a 100 mg/kg, preferentemente 1 a 20 mg/kg de los pép idos y los aminoácidos libres en el hidrolizado de caseína por administración. De esta forma la cantidad del hidrolizado de caseína de la presente invención o el agente que tiene actividad inhibitoria de ACE y efecto hipotensivo, cuando se usa por agregar en varias bebidas, alimentos, o medicina, puede ser seleccionada adecuadamente en vista de la dosis anterior. De acuerdo al método de la presente invención, si se hidroliza la caseína de leche animal en una reacción de 20
una etapa con un grupo de enzimas que contienen el grupo de enzimas (X) mencionado anteriormente, pueden ser obtenidos Xaa-Pro-Pro contenidos en la caseína de leche animal, .en particular Ile-Pro-Pro y/o Val-Pro-Pro, del cual varias funciones que incluyen el efecto hipotensivo y efecto antiestrés, han sido confirmadas, en un rendimiento mayor cercano a la recuperación teórica, tal como pero no tan bajo como 60%, preferentemente no menos de 70%, comparado con los métodos convenc onales. De esta forma este método no solamente es un método para preparar un . hidrolizado de caseína de la presente invención, sino también un método efectivo para producir productos digeridos que contienen una cantidad considerable de Xaa-Pro-Pro objetivo, o productos purificados de los mismos, a partir de caseína de leche animal o proteína de alimento que tiene un alto contenido de Xaa-Pro-Pro. EJEMPLOS La presente invención será ahora explicada con más detalle con referencia a los Ejemplos, Ejemplo de análisis, y Ejemplos comparativos, los cuales, son ilustrativos solamente y no se proponen para limitar la presente invención. Ejemplo 1 y Ejemplos 1 a 8 comparativos Se agrega 1 g de caseína derivada de leche de vaca (fabricado por NIPPON NZMP) a 99 g de agua destilada en aproximadamente 80°C y se mezcla totalmente. Se agrega una 21
solución de hidróxido de sodio 1 N (fabricada por A O PURÉ CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) a la mezcla para ajustar el pH a 7.0. Se ajusta la temperatura a 20°C, para preparar Una solución substrato. Se agrega a la solución substrato de esta forma obtenida, cada una de las varias enzimas mostradas en la Tabla 1 se agregan de tal forma que la proporción de enzima/caseína es 1/25 en peso. Se hace reaccionar la mezcla en 50°C por 14 horas, y después se somete a autoclave en 110°C por 10 minutos para inactivar las enzimas, por lo mismo para obtener una solución de productos de digestión enzimática de caseína. La solución obtenida de productos dé digestión enzimática es secada por aspersión, para preparar polvos . Los polvos obtenidos de esta forma son sometidos a análisis de ingredientes . Se determina la proteína por el método jeldahl, y los aminoácidos con un analizador de aminoácidos . La cantidad obtenida al substraer la cantidad de aminoácidos a partir de la cantidad de proteína es tomada como la cantidad de péptídos . Además, la cantidad de lípidos es determinada por el método con hidrólisis acida, cenizas por ignición directa, y agua por el método de horno de aire. La cantidad de cada ingrediente es substraída de 100%, del cual se toma el equilibrio como la cantidad de carbohidrato. Como un resultado, se determina que los polvos contienen 22
35.8% en peso de aminoácidos, 45.7% en peso de péptidos, 6.6% en peso de agua, 0.2% en peso de lípidos, 4.1% en peso de cenizas y 7.6 % en peso de carbohidratos. Medición de longitud de cadena promedio Se determina la longitud de cadena promedio de los aminoácidos y los péptidos contenidos en los polvos obtenidos midiendo el número de moles usando un reactivo OPA, el cual reacciona con grupos amino de los aminoácidos libres y los péptidos en los polvos, similarmente midiendo el número de moles de un hidrolizado ácido de caseína, y evaluar la proporción de estos dos . Se muestran los resultados en la Tabla 1. Se disuelven 40 mg de o-ftalaldehído (reactivo garantizado para análisis de fluorescencia, fabricado por NACALAI TESQUE, INC.), en 1 mi de metanol, y se agregan 100 µ? de ß-mercaptoetanol . Se diluye la solución de · o-ftalaldehido a 25 mi con 25 mi de una solución de tetraborato de sodio 100 mM previamente mezclada con 2.5 mi de dodecilsulfato de sodio al 20%, y además a 50 mi con agua destilada, para preparar un reactivo OPA. Cada muestra de polvo de un hidrolizado de enzima de caseína al 1% obtenido por reacción con cada enzima. (Tabla 1) es disuelta en un solvente apropiado en una concentración apropiada, y se centrífuga en 15000 rpm por 10 minutos. Se toman 50 µ? del sobrenadante. Después 1 mi del reactivo' OPA preparado anteriormente es agregado, totalmente agitado, y dejado en temperatura ambiente por 5 minutos. La absorbancia en 340 nm se mide usando un medidor de absorción (Marca Ubest -35, fabricado por JASCO CORPORATION) . Se prepara un hidrolizado ácido de caseína al 1%, diluido apropiadamente, y sometido a la misma medición para obtener una curva de calibración, a partir de la cual se determina la relación entre la absorbancia y concentración molar. Se calcula la longitud de cadena promedio de acuerdo con la siguiente fórmula: Longitud de cadena promedio = (concentración molar de hidrolizado ácido de caseína al 1%) / (concentración molar de cada muestra de hidrolizado de enzima de caseína al 1%) . TABLA 1
1), 3), 8), 9): fabricado por SHIN NIHON CHEMICAL CO. , LTD. ; 2) fabricado por HIGÜCHI, INC. : 4) fabricado por AMANO ENZYME, INC.; 5) fabricado por NAGASE & CO. , LTD.; 6) 24
fabricado por DAIWA KASEI K. .; 7) fabricado por NOVOZYME JAPAN. Medición de aminoácidos que constituyen los péptidos Los polvos preparados en el Ejemplo 1 son disueltos en una cantidad adecuada de agua destilada, y analizados usando un analizador de péptidos automático (marca PPSQ-10, fabricado por SHIMADZU CORPORATION) , para determinar los residuos de aminoácidos a partir de la terminación N en los polvos. Se muestran los resultados en la Tabla 2. Incidentalmente, el analizador automático de péptidos no detecta los aminoácidos libres . La cantidad total de los cinco residuos aminoácidos es 120 pmoles, y la cantidad total de los seis residuos de aminoácidos es 100 pmol. A partir de estos resultados, se encontró que la mayoría de los péptidos contenidos en los polvos son dipéptidos y tripéptidos. Se encontró también que el porcentaje de péptidos que tienen Pro en el segundo residuo es 49.5%, el cual es remarcablemente alto, y el porcentaje de péptidos que tiene Pro en el tercer residuo es 29,8%, el cual es también alto. De esta forma se espera que los polvos contengan una cantidad considerable de Xaa-Pro- y Xaa-Pro-Pro, los cuales son altamente resistentes contra la digestión enzimática con proteasas in vivo, de tal forma que estos péptidos son óptimos para uso como péptidos funcionales .
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TABLA 2
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Evaluación de capacidad de absorción y resistencia a la digestión de Xaa-Pro y Xaa-Pro-Pro en organismos vivos Con el fin de evaluar la capacidad de absorción y resistencia a la digestión en organismos vivos de los péptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro o Xaa-Pro-Pro contenida en los polvos del hidrolizado de enzima de caseína preparado en el Ejemplo 1 y mostrado en la Tabla 1, la absorción de los péptidos en sangre después de la administración se prueba en ratas como sigue. A dos ratas SD de seis semanas de edad (Sprague
Dawley) , se administran oralmente 500 mg/animal cada uno de Val-Pro-Pro como un ejemplo de Xaa-Pro-Pro y Gly-Gly como un dipéptido el cual no tiene Pro. Se toman muestras de sangre a partir de la vena porta en intervalos, y la absorción de cada péptido en sangre se determina. Se muestran los resultados en la Figura 1. A partir de la Figura 1, se confirma que Gly-Gly es digerido fácilmente in vivo, de tal forma que se detecta Gly, mientras que se absorbe Val-Pro-Pro en sangre relativamente en forma estable. ? partir de estos resultados, se espera que los dipéptidos y tripéptidos que tienen las secuencias Xaa-Pro y Xaa-Pro-Pro, respectivamente, exhiben alta capacidad de absorción y resistencia a la digestión en el organismo vivo. Evaluación del efecto hipotensivo Cada uno de los polvos de hidrolizado de caseína 27
preparados en el Ejemplo y Ejemplos comparativos mostrados en la Tabla 1 son administrados oralmente a cinco ratas ipertensivas espontáneamente de 27 semanas de edad (SHR por sus siglas en inglés) (macho) en una dosis de 32 mg/kg de peso corporal. Se mide la presión sanguínea antes de la administración y 5 horas después de la administración por método de cola manguito (tail-cuff) y 5 horas después de la administración por método de cola manguito con Taxi cuff PB-98 (fabricado por SOFTRON) para evaluar el cambio en la presión sanguínea. Como un control, se administra la caseína en lugar de los polvos, y se hace la misma evaluación. Antes de la medición de la presión sanguínea, se calientan las ratas en una caja precalentada (fabricada por CSI JAPAN) en 45°C por 8 minutos. Se muestran los resultados en la Tabla 3. A partir de la Tabla 3, se encontró que no se observa cambio en la presión sanguínea con caseína como control, mientras que se observa el efecto hipotensivo con la administración de los polvos del Ejemplo 1. Por otra parte, no se observan cambios en la presión sanguínea con ninguno de los Ejemplos comparativos. Se demuestra de esta forma que el hidrolizado de caseína del Ejemplo 1 que contiene una cantidad particular de Xaa-Pro y Xaa-Pro-Pro y que tiene una longitud de cadena promedio de no más de 2.1 tiene excelente efecto hipotensivo. Además, de acuerdo con el método anterior, se 28
prueba un efecto hipotensivo dependiente a dosis usando los mismos polvos de hidrolizado de caseína preparados en. el Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la Tabla 4 y Figura 2. Evaluación de Actividad Inhibitoria de la ACB Se disuelve ACE derivada de pulmón bovino (fabricado por A O PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) en un amortiguador de borato 0.1 M en pH 8.3, en una cantidad de 0.1 U, para obtener una solución de ACE. Se preparan 80 µ? de una solución de hidrolizado de enzima diluida preparada por diluir polvos de cada hidrolizado de enzima mostrado en la Tabla 1 por 50 veces con agua destilada, 200 µ? de una solución de hipuril-histidil-leucina 5 mM (fabricada por SIGMA) , y 20 µ? de la solución de ACE preparada anteriormente se introducen en un tubo, y se hacen reaccionar en 37°C por 30 minutos. Subsecuentemente, se termina la reacción por agregar 250 µ? de ácido clorhídrico 1 N, se agrega entonces 1.7 mi de acetato de etilo, y se agitan. Se toma 1.4 mi de la capa de acetato de etilo, se coloca en otro tubo y se evapora en 120 °C por aproximadamente 60 minutos para obtener un producto seco. Se disuelve el producto seco en 1 mi de agua destilada, y se mide la absorbancia en -228 nm de ácido hipúrico extraído con acetato de etilo. En cuanto a los controles, se mide la absorbancia de una solución sin la solución de hidrolizado de enzima diluida y una solución 29
sin la solución de hidrolizado de enzima diluida y la solución ACE. A partir de la absorbancia obtenida, se calcula la actividad inhibitoria de ACE de acuerdo con la siguiente fórmula. Se muestran los resultados en la Tabla 3. Actividad inhibitoria de ACE (%) =[(A-B/A]xlOO A: (absorbancia de solución sin solución de hidrolizado de enzima diluida pero con solución ACE);-(Absorbancia de solución sin solución de hidrolizado de enzima diluida y solución de ACE) . B : (Absorbancia de solución con solución de hidrolizado de enzima diluida y solución ACE) - (Absorbancia de solución con solución de hidrolizado de enzima diluida pero sin solución de ACE) . TABLA 3
Hidrolizado Actividad inhibitoria Caída de la presión de enzimas de ACE (% íq) sanguínea (promedio + SD) Ej emplo 1 4.1 -25.0 + 4.3*** Ej . 1 comp. 0.8 -4.3 + 5.3 Ej . 2 com . 1.2 - Ej . 3 comp . 1.4 -3.7 + 6.4 Ej . 4 comp . 1.0 2.8 + 5.2 Ej . 5 comp. 1.1 - Ej . 6 comp . 0.9 2.9 + 5.4 Ej . 7 comp. 0.7 -5.1 + 7.0 Ej . 8 com . 1.1 -4.6 + 6.9 Control - -2.5 + 7.5 30
TABLA 4
Determinación de péptidos en hidrolizado de enzimas
Se disuelven los polvos del hidrolizado de enzimas del Ejemplo 1 mostrado en la Tabla 1 en agua destilada en una concentración de 10 mg/ml. Por otra parte, se preparan 25 µg/ml, 50 µg/ml y 100 µg ml de soluciones de cada péptido estándar sintetizado químicamente que tiene la secuencia mostrada en la Tabla 5. Estas soluciones son analizadas por LC/MS bajo las condiciones posteriores. Entre los picos indicados en el análisis de la solución de polvo, los picos que corresponden a los pesos moleculares y tiempos de retención idénticos con aquellos de los péptidos estándares son identificados como que representan las mismas secuencias como los péptidos estándar. Los picos de la solución en polvo son comparados con aquellos de los péptidos estándar, para determinar el contenido de cada péptido mostrado en la Tabla 31
4 en la solución en polvo. Se muestran los resultados en la Tabla 5. Se encontró que la cantidad de los péptidos y los aminoácidos libres en la solución preparada al disolver . los 5 polvos con agua destilada es 8.15 mg/ml, la cantidad de péptidos es 4.57 mg/ml, y la cantidad de Xaa-Pro en los ¦ · péptidos es 514.5 µg, de tal forma que el porcentaje de Xaa- Pro con respecto a la cantidad total de los péptidos y los aminoácidos libres en los polvos es 6.3% en peso. Además, 0 la cantidad de Xaa-Pro-Pro en los péptidos es 116.5 µg, de tal forma que el porcentaje de Xaa-Pro-Pro con respecto a la cantidad total de los péptidos y loé aminoácidos libres en los polvos es 1.4% en peso. Aparato usado 5 Cromatografía de líquidos de alta resolución- espectrómetro de masa: LCMS-2010 Controlador de sistema: SCL- iOAdvp,- Inyector Automático: SIL-10advp; bomba dé suministro de solvente: LC-10Advp x 2; Horno de la 0 columna: CT-lOAvp; Detector de disposición de fotodiodo: SPD- 10AVP, desgasante online: DGU-14A (todas las marcas, fabricadas por SHIMADZU CORPORATION): Columna: Develosil C30-UG-3 (2.0 mml.D. x 150 mml) (fabricado por NOMURA CHEMICAL CO., LTD.) . 5 32
Condiciones para Medición Fase A móvil: solución acuosa de 0.1% en peso de ácido fórmico: Fase móvil B: 100% de solución de acetonitrilo ; programa de tiempo: 0% B (0 minutos) -7.5% B (30 minutos) - 80% B (30.01 minutos) -100% B (35 minutos) -0% B(35.1 minutos) -DETENCIÓN (45 minutos ) ; Cantidad de muestra por inyección: 5 µ? ; temperatura de la columna: 50°C; longitud de onda de detección: 200 a 300 nm modo de ionización: ESI (+); velocidad de flujo de gas atomizado; 4.5 1/min; voltaje aplicado: 4.5 kV; temperatura de CDL ; 250 ° C ; temperatura del calentador de bloque: 200°C; voltaje CDL: 0.0 V; voltaje de disposicón Q, SCAN; modo de análisis; medición SIM; intervalo analizado: EP (m/z= 245.2), IP (m/z=229.3), MP (m/z=247.3) , QP (m/z=244.2), RP (m/z= 272.3), SPP (m/z=300.3), VPP (m/z=312.1), IPP (m/z=326.1), tiempo de ingestión: 0.5 seg/Ch.
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TABLA 5
Ejemplo 1 de análisis Identificación de las enzimas Entre las enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus oryzae usadas en el Ejemplo 1, las enzimas necesarias para obtener el hidrolizado de caseína de la presente invención se analizan en el siguiente método. Incidentalmente, todas las siguientes operaciones 34
son realizadas en 4°C a menos que se especifique otra forma. Los reactivos usados son todos reactivos garantizados fabricados por AKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. A menos que se especifique otra cosa. Impacto de varios agentes de inhibición de las enzimas Se disuelven 2000 mg de SUMIZYME FP (marca registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO. , LTD) en 10 mi de un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2, y se remueve el producto insoluble a través de la membrana de acetato de celulosa (DISMIC-25 es, diámetro de poro 0.45 µt?, fabricado por ADVANTEC) , para obtener una solución de enzima sin purificar. Esta solución de enzima sin purificar " se hace reaccionar con caseína al 1% en la misma forma como en el ejemplo 1. Cuando se agrega un inhibidor de metaloproteasa, EDTA (ácido etilendiamintetraacético) , o se agrega un inhibidor de serina proteasa, PMSF (fluoruro de fenil metan sulfonilo) al sistema de reacción, la longitud de la cadena promedio es más grande, y el hidrolizado objetivo no puede ser obtenido. Esto sugiere que la metaloproteasa o serina proteasa juega un papel importante en la producción del hidrolizado de caseína de la presente invención. Aislamiento con resina de intercambio de iones 20 mi de una resina de intercambio de aniones, DEAÉ 35
sephacel (fabricada por AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.) se activa, equilibrado con un amortiguador de fosfato 50 mM en' el pH 7.2, y empacado en una columna de vidrio de 1.5 cm de diámetro x 12 cm. Mientras que todo el efluente se recolecta como muestra no adsorbida, se somete la solución de enzima sin purificar a adsorción en una velocidad de flujo de .1.0 ml/min. Después la columna se lava totalmente con un amortiguador de fosfato de 50 mM en pH 7.2 en una cantidad de 10 veces el volumen del gel, y se eluye con 200 mi de un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2 que contiene un gradiente lineal de NaCl (0 a 600 mM) . Se fracciona el eluido en.100 fracciones de 5 mi cada una. La absorbancia en 280 nm, la actividad de la proteinaza, y la actividad inhibitoria de ACE son medidas para cada fracción. Medición de la actividad de la proteinaza Se disuelven 25 mg de un material fluorescente, (isotiocianato de fluoresceina) - caseína etiqueada (FITC-caseina, fabricada por SIGMA.) en 5 mi de un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2,, para preparar una solución de substrato. Se mezclan 10 µ? de cada fracción con 20 µ? de la solución de substrato, y se hace reaccionar en 55°C por 10 minutos. La reacción se termina por agregar 120 µ? de una solución de tricloroacetato al 5% y el liquido de la reacción resultante se centrífuga en 1500 rpm. Se toman 60 µ? del sobrenadante, mezclado con 3 mi de un trishidrocloruro 0.5 M 36
en pH 8.5, y se somete a medición usando un fluorómetro (F-1300, fabricado por HITACHI, LTD.) para determinar- la longitud de onda de excitación en 485 nm y la longitud de onda de fluorescencia en 525 nm. A partir de los resultados de la medición de absorbancia en 280 nm de cada fracción de eluato de DEAE sephacel, se confirma que aproximadamente 73% de la proteína se absorbe en la resina de intercambio de iones . La Figura 3 muestra el patrón de elusión de la proteína enlazada con un ingrediente lineal de 0 a 0.6 de NaCl y la actividad proteolítica . Las fracciones 21 a 60 contienen una cantidad particularmente grande de proteínas eluidas en la misma. Además, la solución de enzimas eluidas de cada fracción se evalúa para la actividad para generar componentes inhibitorios de ACE en caseína hidrolizada. Como un resultado, las fracciones 20 a 60 son principalmente confirmadas para tener la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE. Por otra parte, la actividad de la proteinaza medida con la FITC-caseína como el substrato es observada principalmente en fracciones 19 a 27 (en NaCl 0.1 M a 0.2 M) , lo cual indica que la actividad de la proteinaza tiene una función importante en la generación de componentes inhibitorios de ACE. A partir de estos resultados, se 37
encontró que la actividad de la proteinaza juega un papel importante en la actividad enzimática para purificar los componentes inhibitorios ACE a partir de la caseína. Identificación de proteinazas contenidas A partir de las fracciones eluidas de DEAE sephacel, las fracciones 21 a 35 que tienen la actividad de proteinaza se recolectan, y se dializan contra 5 litros de un amortiguador de fosfato 5 mM en pH 7.2. Se suspende Sephacryl S-300 HR (fabricado por AMERSHAM BIOSCIENCES .K.) en un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2 el cual contiene NaCl 200 mM, totalmente desgasado, y se empaca en una columna de vidrio de 18 cm de diámetro x 100 cm. Esta columna está totalmente equilibrada con un amortiguador de fosfato en pH 7.2 el cual contiene NaCl 200 mM en una relación de flujo constante de 2 ml/min. Se aplica la muestra dializada a esta columna, y se recuperan 100 fracciones de 10 mi cada una. La absorbancia en 280 nm y la actividad de la proteinaza usando FITC-caseína como un substrato son medidos para cada fracción. Electroforesis de gel de poliacrilamida Se toman 10 µ? de cada fracción, se mezclan con 10 µ? de un amortiguador de muestra compuesto de un amortiguador Tris 0.125 M en pH 6.8, SDS al 3%, ß-mercaptoetanol al 5%, glicerol al 10%, y azul de bromofenol al 0.01%, se calienta a 95°C por 5 minutos, y se enfría a temperatura ambiente. Se 38
somete la muestra resultante a una electroforesis de acuerdo al método Laemmli (Nature, 227, 680 (1970)), usando una mini-tabla (fabricada por ATTO CORPORATION) y un gel de poliacrilamida en una concentración designada bajo las condiciones de 30mA por gel. Después de la terminación de lá electroforesis , se enjuaga el gel en una solución de tinción de Azul Brillante de Coomassie compuesta de Azul brillante de Coomassie al 0.25% R-250, metanol al 50%, y ácido acético al 7.5% por 10 minutos, y se infiltra en un decolorante compuesto de metanol al 5% y ácido acético al 7.5% hasta que se decolora completamente la base . Se figura el peso molecular por calculación a partir de la movilidad de cada banda de proteína, usando marcadores de peso molecular (fabricados por AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.) . Las fracciones adsorbidas en la resina de intercambio de aniones que tienen la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE, se someten a filtración de gel a través de resina de Sephacryl S-300, y se observa la actividad en fracciones que corresponden al peso molecular de aproximadamente 45 kDa. Se analizan estas fracciones por gel de electroforesis de SDS-poliacrilamida en un gel al 12.5% para observar substancialmente una sola banda en 44 kDa y 40 kDa. Se cortan estas bandas, y se someten a análisis de las secuencias N terminales . Se revela que la banda en 44 kDa tiene una secuencia que es altamente homologa a una 39
proteasa neutral conocida I de hongo Koji (Aspergillus) , y la banda en 40 kDa tiene una secuencia que es altamente homologa a una proteasa neutral II conocida del hongo Koji (Aspergillus) . A partir de estos resultados, se determina que las proteinazas adsorbidas en la resina de intercambio de aniones que genera componentes inhibitorios de ACE para cada caseína,, contienen por lo menos dos proteinazas, proteasa I neutral y proteasa II neutral . Para hidrol-izar además los componentes generados por hidrólisis de caseína con proteinazas, peptidasas, las cuales actúan en péptidos, se analizan en el siguiente método . Con el fin de identificar las enzimas para producir, péptidos .que tienen contenidos superiores de Xaa-Pro y Xaa-Pro-Pro, los cuales son la característica principal de la presente invención, varios péptidos precursores para Val-Pro-Pro son sintetizados, y su capaciad de procesamiento en Val-Pro-Pro es evaluada. Purificación de enzimas para procesar terminales amino A partir de estas fracciones eluidas de DEAE sephacel, se recolectan las fracciones 21 a 37 que tienen la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE, y se dializan contra 5 litros de un amortiguador de fosfato 5 40
mM en pH 7.2. Se suspende la hidroxiapatita (fabricada por AKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) en un amortiguador de fosfato 5 mM en pH 7.2, totalmente desgasado, y se empaca en una columna de plástico de 1.5 cm en diámetro x 12 era. Se lava esta columna con un amortiguador de fosfato 5 mM en pH 7.2 en una cantidad no menor de 10 veces la cantidad de la hidroxiapatita. Las fracciones dializadas que tienen la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE son aplicadas a esta columna de hidroxiapatita, y todas las fracciones que pasan a través de la columna son recolectadas. Medición de actividad aminopeptidasa Se mide la actividad de la aminopeptidasa por el siguiente método. Se disuelve el péptido sintetizado Val-Val-Val-Pro-Pro en un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2 en una concentración de 50 µg/ml para preparar una solución de substrato. Se mezclan 45 µ? de esta solución de substrato con 5 µ? de la fracción enzimática, y se hace reaccionar en un incubador en 55°C por 30 minutos. Se termina la reacción por calentar en 98°C por 5 minutos. Se toma una cantidad apropiada de este liquido de reacción, y se somete a análisis en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución-espectrómetro de masa (fabricado por SHIMADZU CORPORATION) para evaluar la cantidad de Val-Pro-Pro generada. Las fracciones adsorbidas en la resina de intercambio de aniones que tienen la actividad para generar 41
los componentes inhibitorios ACE son sometidos .a electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida en un gel al 10%,. y se corta la banda en 32 kDa. Se extrae la proteína principal, y se purifica en una proteína substancialmente sencilla de 32 kDa. La secuencia en la terminal N de la proteína se analiza para revelar que la secuencia hasta el décimo residuo a partir de la N terminal es homologa a la secuencia de aminopeptidasa de leucina conocida del hongo kohi (Aspergillus) . Se concluye que las fracciones que tienen la actividad confirmada para generar los componentes inhibitorios de ACE contienen aminopeptidasa de leucina. A partir de estos resultados, se entiende que las fracciones adsorbidas en la resina de intercambio de aniones que tienen la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE contienen por lo menos la leucina aminopeptidasa que tiene actividad de aminopeptidasa, la cual juega un papel importante en la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE.
Medición de capacidad de procesamiento de la terminal carboxilo de las enzimas Se disuelve el péptido sintetizado Val-Pro-Pro-Phe-Leu en un amortiguador de fosfato 50 mM en pH 7.2 en una concentración de 45 g/ml para preparar una solución 42
substrato. 50 µ? de esta solución de substrato es mezclada con 5 µ? de cada solución de enzima, y se hace reaccionar en un incubador en 55°C por 30 minutos. Se termina la reacción por calentamiento en 98 °C por 5 minutos. Se toma una cantidad apropiada de este líquido de reacción, y se somete a análisis en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución-espectrómetro de masa (fabricado por SHIMADZU CORPORATION) para evaluar la concentración de Val-Pro-Pro generada. La capacidad de procesamiento de la terminal carboxilo de cada fracción eluida por DEAE sephacel es evaluada para encontrar que las fracciones 30a 50 tienen actividad para convertir la Val-Pro-Pro-Phe-Leu a Val-Pro-Pro . Ejemplo 2 Confirmación de Actividad inhibitoria de ACE de hidrolizado de caseína por combinación de enzima purificada A partir de este Ejemplo 1 de análisis, se confirma que la actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE de las fracciones adsorbidas' en la resina de intercambio de aniones de la enzima extracelular derivada de Aspergillus oryzae (SUMIZYME FP (marca registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.)) incluyen cuatro actividades enzimáticas, es decir, las actividades de proteinaza que incluyen aquellas de por lo menos proteasas I y II neutral, la actividad de la aminopeptidasa que incluye aquella de la 43
leucina aminopeptidasa, y la actividad para' escindir . la terminación carboxilo en inmediatamente después de la-prolina. · . ; A partir de las fracciones adsorbidas (ver la Figura 3) , Fracción I que tiene actividad de proteinaza alta (fracciones 1 a 35 en la Figura 3) , la Fracción II que tiene alta actividad para escindir la terminal carboxilo . en inmediatamente después de la prolina (fracciones 36 a 55 en la Figura 3) , Fracción III después de esto (fracciones 56 a 100 en la Figura 3) , y se proporcionan fracciones no adsorbidas que tienen actividad de proteinaza. Se agrega cada fracción, sola o en combinación como se muestra en la Tabla 6, a 1 mi de una solución al 1% de caseína derivada de leche de vaca, reaccionada en 55 °C por 13 horas para preparar un hidrolizado de caseína. Después de la terminación de la reacción, se mide cada uno de los hidrolizados de caseína obtenidos por la actividad inhibitoria de ACE y la longitud de cadena promedio de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1. Como un control, se somete la solución de la enzima sin purificar en 1/10000 la cantidad sometida a purificación es sometida a las mismas mediciones. Se muestran los resultados en la Tabla 6.
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TABLA 6
A partir de la Tabla 6, se encontró que los componentes que tienen fuerte actividad inhibitoria de ACE están contenidos en las fracciones no adsorbidas, las fracciones que tienen alta actividad de proteinaza, y hasta 45
las fracciones que tienen la actividad para escindir la terminación carboxilo en inmediatamente después de la prolina. Se encontró también que el grupo de enzimas eluidás en aproximadamente NaCl 300 mM genera los componentes inhibitorios de ACE, de tal forma que no es necesaria la Fracción III . La longitud de cadena promedio del hidrolizado de caseína obtenida por hidrólisis con cada fracción que exhibe la fuerte actividad para generar los componentes inhibitorios de ACE, se mide y se compara. Se encontró que las longitudes de cadena promedio para las fracciones no adsorbidas, Fracción I, y Fracción II son arriba de 2.1, pero por combinar estas fracciones, se obtiene un hidrolizado de caseína el cual tiene la longitud de cadena promedio de no más de 2.1. Ejemplo 3 Se agregan 15 g de caseína derivada de leche de vaca (fabricada por NIPPON NZMP) a 85 g de agua destilada en aproximadamente 80°C y se mezcla totalmente. Se agrega una solución de hidróxido de sodio 1N a la mezcla para ajustar el pH a 7.0. Se ajusta la temperatura a 20°C para preparar una solución substrato. A la solución substrato obtenida de esta forma, se agrega SüMIZYME FP (marca registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.), el cual es enzimas extracelular 46
derivada de Aspergillus oryzae, como el grupo de enzimas de tal forma que la proporción enzima/caseína es 1/25 en peso.-Se hace reaccionar la mezcla en 50°C por 20 horas, mientras que el liquido de reacción es muestreado en intervalos para evaluar la actividad inhibitoria de ACE y la longitud de cadena promedio contra el tiempo en la misma forma como en el Ejemplo 1. Se muestran los resultados en las Figuras 4 y 5. La solución digerida con enzimas tomada después de 12 horas de la reacción, la cual exhibe la actividad inhibitoria de ACE máxima, es secada por aspersión para obtener los polvos de la mezcla de péptidos . A partir de las Figuras 4 y 5, se confirma que la actividad inhibitoria de ACE se incrementa con el incremento en el tiempo de reacción, y disminuye después de 12 horas de reacción. Se confirma también a partir de la evaluación de la cantidad de péptido que la actividad inhibitoria de ACE se incrementa en la longitud de cadena promedio de aproximadamente 1.3 a 2.1. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.