CN101570568B - 一种发酵乳中的ace抑制肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法，它涉及一种酶的抑制肽及其制备方法。要解决目前化学ACE抑制剂副作用大，生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵及产品有苦味的问题。发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。制备：一、制备发酵乳；二、过滤、灭酶、离心、超滤；三、冷冻干燥。本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性。制备本发明发酵乳中的ACE抑制肽的方法具有生产条件要求低、生产工艺简单、不需要昂贵设备、成本低、安全性高及产品无苦味等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶的抑制肽及其制备方法。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)是一种含锌的二肽羧基肽酶，存在于各种组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中；具有肽键专一性，需要阴离子催化，其中氯离子是最有效的激活剂。ACE在人体肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)中具有调节血压的作用，ACE的底物(特别是天然底物中的血管紧张素I和舒缓激肽)会诱发ACE产生血管收缩活性，导致血压升高危害人体健康。
抑制ACE成为又一控制血压升高的有效途径。但是，目前化学ACE抑制剂副作用大，而生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵以及产品有苦味的缺陷。
发明内容
本发明要解决目前化学ACE抑制剂副作用大，生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵及产品有苦味的问题。而提供的一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法。
本发明发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。
发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
本发明发酵乳中的ACE抑制肽主要由4种短链肽混合组成，本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性，因此可将其作为功能因子制成各类保健食品，或者直接作为食品配料使用。
本发明采用微生物发酵技术生产发酵乳中的ACE抑制肽，其中所用的发酵菌株瑞士乳杆菌L03-1和干酪乳杆菌SL5是从内蒙古传统发酵乳制品(牛奶酒曲)中分离得到的，经16rRNA序列鉴定和生化鉴定为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其新陈代谢产物主要以多肽、氨基酸和乳酸为主，对人体没有任何有害作用，因此食用安全性高。
本发明方法制备的干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％、盐分含量在0～1.6％之间。制备本发明发酵乳中的ACE抑制肽的方法具有生产条件要求低、生产工艺简单、不需要昂贵设备、成本低、安全性高及产品无苦味等优点。经检测本发明制备出的发酵乳中的ACE抑制肽的抑制活性大于70％。
本发明制备发酵乳中的ACE抑制肽所用的发酵菌株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年12月15日，保藏号为CGMCC No.2805。本发明制备发酵乳中的ACE抑制肽所用的发酵菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年12月15日，保藏号为CGMCC No.2806。
附图说明
图1是具体实施方式四所制备的发酵乳中ACE抑制肽的质谱分析结果图；
图2是具体实施方式四中分子量为634.37Da小分子肽的质谱分析结果图；图3是具体实施方式四中分子量为677.38Da小分子肽的质谱分析结果图；图4是具体实施方式四中分子量为750.37Da小分子肽的质谱分析结果图；图5是具体实施方式四中分子量为921.48Da小分子肽的质谱分析结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。
本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽可以采用本发明方法制备获取；本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽中还包括少量其它小分子多肽(如图1所示)，其干物质含量＜10％。
本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽也可以由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽直接按30％～40％∶30％～40％∶10％～20％∶10％～20％的质量比百分混合而成，其中包括不可避免的杂质多肽。
本实施方式干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％、盐分含量在0～1.6％之间，无苦味。
具体实施方式二：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
本实施方式中所用的发酵菌株瑞士乳杆菌L03-1和干酪乳杆菌SL5是从内蒙古传统发酵乳制品(牛奶酒曲)中分离得到的；本实施方式中瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1经16S rRNA鉴定与瑞士乳杆菌的同源性达到99％。本实施方式中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5经16S rRNA鉴定与干酪乳杆菌的同源性达到99％。
本实施方式所制备的发酵乳中的ACE抑制肽主要由4种短链肽组成，干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％(4种短链肽的质量占干物质含量的80％以上)、盐分含量在0～1.6％之间。本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤四冷冻干燥控制含水率＜5％。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％的脱脂乳中，然后置于37℃条件下发酵60～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90℃条件下灭酶15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为5×108～6×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为5×108～6×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa，超滤压为15MPa。
对本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽进行质谱分析，分析结果如图1所示。图1中有四个主要的吸收峰，分子量分别为634.37Da、677.38Da、750.37Da和921.48Da，说明本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽中主要含有四种小肽，且这四种小分子肽分子量小于1000Da。对这四种小分子肽(分子量为634.37Da、677.38Da、750.37Da和921.48Da)分别进行质谱分析，分析结果如图2～5所示。采用仪器软件4700Explorer自带的分析工具，DeNovo Explorer进行氨基酸测序，发酵乳中的ACE抑制肽的氨基酸序列分别为KPAGDF(634.37Da)、KAALSGM(677.38Da)、KKAAMAM(750.37Da)和LDHVPGGAR(921.48Da)。
按现有记载测量方法计算ACE抑制肽抑制活性。
对比试验：
在不同发酵温度条件下所制备的发酵乳中的ACE抑制肽的肽含量及ACE抑制活性如表1所示。
表1
| 发酵温度(℃) | 肽含量(mg/mL) | ACE抑制活性(％) |
| 37℃ | 5.07±0.05a | 73.85±0.31m |
| 42℃ | 4.42±0.11b | 50.03±0.43n |
注：Duncan，a＝0.01.字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
选用不同规格的超滤膜过滤上清液，所得到的发酵乳中的ACE抑制肽的肽含量及ACE抑制活性如表2所示。
表2
| 超滤膜 | 肽含量(mg/mL) | ACE抑制活性(％) |
| 发酵乳清液 | 4.74±0.04bc | 58.10±0.14a |
| 10kDa浓缩液 | 5.57±0.03d | 49.96±0.07b |
| 10kDa超滤液 | 4.39±0.04a | 68.86±0.25c |
| 10kDa～3kDa超滤液 | 4.84±0.06c | 64.38±0.08d |
| 3kDa超滤液 | 4.57±0.03ab | 73.85±0.31e |
注：Duncan，a＝0.01.字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
将本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽经胃蛋白酶作用90min后其ACE抑制活性几乎无变化(P＞0.05)；将本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽经胰蛋白酶(在反应液中的酶活浓度为5000U/mL)作用240min后其ACE抑制活性仍能保持原ACE抑制活性的94.32％(ACE抑制活性从73.85％降至69.65％)。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法
<160>4
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的六肽，分子量为634.37Da。
<400>1
Lys Pro Ala Gly Asp Phe
1 5
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的七肽，分子量为677.38Da。
<400>2
Lys Ala Ala Leu Ser Gly Met
1 5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的七肽，分子量为750.37Da。
<400>3
Lys Lys Ala Ala Met Ala Met
1 5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的九肽，分子量为921.48Da。
<400>4
Leu Asp His Val Pro Gly Gly Ala Arg
1 5
Claims (4)
1.一种发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽，其特征在于发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成；
且按以下步骤制备：一、将保藏号为CGMCC No.2805的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1和保藏号为CGMCC No.2806的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
2.权利要求1所述发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽的制备方法，其特征在于发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽按以下步骤制备：一、将保藏号为CGMCC No.2805的瑞士乳杆菌L03-1和保藏号为CGMCC No.2806的干酪乳杆菌SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
3.根据权利要求2所述的发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤三冷冻干燥控制含水率＜5％。
4.根据权利要求2所述的发酵乳中的血管紧张素转换酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤一中的发酵温度为37℃。
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