CN101570568A - 一种发酵乳中的ace抑制肽及其制备方法 - Google Patents

一种发酵乳中的ace抑制肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法，它涉及一种酶的抑制肽及其制备方法。要解决目前化学ACE抑制剂副作用大，生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵及产品有苦味的问题。发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。制备：一、制备发酵乳；二、过滤、灭酶、离心、超滤；三、冷冻干燥。本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性。制备本发明发酵乳中的ACE抑制肽的方法具有生产条件要求低、生产工艺简单、不需要昂贵设备、成本低、安全性高及产品无苦味等优点。

Description

一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种酶的抑制肽及其制备方法。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)是一种含锌的二肽羧基肽酶，存在于各种组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中；具有肽键专一性，需要阴离子催化，其中氯离子是最有效的激活剂。ACE在人体肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)中具有调节血压的作用，ACE的底物(特别是天然底物中的血管紧张素I和舒缓激肽)会诱发ACE产生血管收缩活性，导致血压升高危害人体健康。
抑制ACE成为又一控制血压升高的有效途径。但是，目前化学ACE抑制剂副作用大，而生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵以及产品有苦味的缺陷。
发明内容
本发明要解决目前化学ACE抑制剂副作用大，生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵及产品有苦味的问题。而提供的一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法。
本发明发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。
发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
本发明发酵乳中的ACE抑制肽主要由4种短链肽混合组成，本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性，因此可将其作为功能因子制成各类保健食品，或者直接作为食品配料使用。
本发明采用微生物发酵技术生产发酵乳中的ACE抑制肽，其中所用的发酵菌株瑞士乳杆菌L03-1和干酪乳杆菌SL5是从内蒙古传统发酵乳制品(牛奶酒曲)中分离得到的，经16rRNA序列鉴定和生化鉴定为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其新陈代谢产物主要以多肽、氨基酸和乳酸为主，对人体没有任何有害作用，因此食用安全性高。
本发明方法制备的干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％、盐分含量在0～1.6％之间。制备本发明发酵乳中的ACE抑制肽的方法具有生产条件要求低、生产工艺简单、不需要昂贵设备、成本低、安全性高及产品无苦味等优点。经检测本发明制备出的发酵乳中的ACE抑制肽的抑制活性大于70％。
本发明制备发酵乳中的ACE抑制肽所用的发酵菌株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年12月15日，保藏号为CGMCC No.2805。本发明制备发酵乳中的ACE抑制肽所用的发酵菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年12月15日，保藏号为CGMCC No.2806。
附图说明
图1是具体实施方式四所制备的发酵乳中ACE抑制肽的质谱分析结果图；图2是具体实施方式四中分子量为634.37Da小分子肽的质谱分析结果图；图3是具体实施方式四中分子量为677.38Da小分子肽的质谱分析结果图；图4是具体实施方式四中分子量为750.37Da小分子肽的质谱分析结果图；图5是具体实施方式四中分子量为921.48Da小分子肽的质谱分析结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。
本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽可以采用本发明方法制备获取；本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽中还包括少量其它小分子多肽(如图1所示)，其干物质含量＜10％。
本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽也可以由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽直接按30％～40％∶30％～40％∶10％～20％∶10％～20％的质量比百分混合而成，其中包括不可避免的杂质多肽。
本实施方式干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％、盐分含量在0～1.6％之间，无苦味。
具体实施方式二：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
本实施方式中所用的发酵菌株瑞士乳杆菌L03-1和干酪乳杆菌SL5是从内蒙古传统发酵乳制品(牛奶酒曲)中分离得到的；本实施方式中瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1经16S rRNA鉴定与瑞士乳杆菌的同源性达到99％。本实施方式中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5经16S rRNA鉴定与干酪乳杆菌的同源性达到99％。
本实施方式所制备的发酵乳中的ACE抑制肽主要由4种短链肽组成，干燥的发酵乳中的ACE抑制肽中干物质含量＞90％(4种短链肽的质量占干物质含量的80％以上)、盐分含量在0～1.6％之间。本发明发酵乳中的ACE抑制肽为具有生物活性的乳蛋白肽，对人体无副作用，可以食用、安全性高，无苦味；而且可耐受90℃的高温不变性。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤四冷冻干燥控制含水率＜5％。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％的脱脂乳中，然后置于37℃条件下发酵60～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90℃条件下灭酶15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为5×108～6×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为5×108～6×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa，超滤压为15MPa。
对本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽进行质谱分析，分析结果如图1所示。图1中有四个主要的吸收峰，分子量分别为634.37Da、677.38Da、750.37Da和921.48Da，说明本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽中主要含有四种小肽，且这四种小分子肽分子量小于1000Da。对这四种小分子肽(分子量为634.37Da、677.38Da、750.37Da和921.48Da)分别进行质谱分析，分析结果如图2～5所示。采用仪器软件4700 Explorer自带的分析工具，DeNovo Explorer进行氨基酸测序，发酵乳中的ACE抑制肽的氨基酸序列分别为KPAGDF(634.37Da)、KAALSGM(677.38Da)、KKAAMAM(750.37Da)和LDHVPGGAR(921.48Da)。
按现有记载测量方法计算ACE抑制肽抑制活性。
对比试验：
在不同发酵温度条件下所制备的发酵乳中的ACE抑制肽的肽含量及ACE抑制活性如表1所示。
表1
发酵温度(℃)   肽含量(mg/mL) ACE抑制活性(％)
    37℃     5.07±0.05a     73.85±0.31m
    42℃     4.42±0.11b     50.03±0.43n
注：Duncan，a＝0.01.字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
选用不同规格的超滤膜过滤上清液，所得到的发酵乳中的ACE抑制肽的肽含量及ACE抑制活性如表2所示。
表2
 超滤膜     肽含量(mg/mL)     ACE抑制活性(％)
 发酵乳清液     4.74±0.04bc     58.10±0.14a
 10kDa浓缩液     5.57±0.03d     49.96±0.07b
 10kDa超滤液     4.39±0.04a     68.86±0.25c
 10kDa～3kDa超滤液     4.84±0.06c     64.3 8±0.08d
 3kDa超滤液     4.57±0.03ab     73.85±0.31e
注：Duncan，a＝0.01.字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
将本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽经胃蛋白酶作用90min后其ACE抑制活性几乎无变化(P＞0.05)；将本实施方式制备的发酵乳中的ACE抑制肽经胰蛋白酶(在反应液中的酶活浓度为5000U/mL)作用240min后其ACE抑制活性仍能保持原ACE抑制活性的94.32％(ACE抑制活性从73.85％降至69.65％)。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种发酵乳中的ACE抑制肽及其制备方法
<160>4
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的六肽，分子量为634.37Da。
<400>1
Lys Pro Ala Gly Asp Phe
1               5
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的七肽，分子量为677.38Da。
<400>2
Lys Ala Ala Leu Ser Gly Met
1               5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的七肽，分子量为750.37Da。
<400>3
Lys Lys Ala Ala Met Ala Met
1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>发酵乳中ACE抑制肽中的九肽，分子量为921.48Da。
<400>4
Leu Asp His Val Pro Gly Gly Ala Arg
1               5

Claims (4)

1、一种发酵乳中的ACE抑制肽，其特征在于发酵乳中的ACE抑制肽主要由氨基酸序列为KPAGDF、KAALSGM、KKAAMAM和LDHVPGGAR的四种小分子肽组成。
2、权利要求1所述发酵乳中的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于发酵乳中的ACE抑制肽按以下步骤制备：一、将瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)L03-1和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SL5接种于蛋白质质量浓度为11％～12％的脱脂乳中，然后置于35～39℃条件下发酵36～72h，得到发酵乳；二、在转速为4000r/min的条件下离心发酵乳30min，取上清液过滤，滤液在90±1℃条件下灭酶10～15min，然后再次以4000r/min的条件下离心30min，之后用超滤膜过滤上清液，得到透过液；三、将透过液进行冷冻干燥，即得到发酵乳中的ACE抑制肽；其中，步骤一中瑞士乳杆菌L03-1的接种量为4×108～8×108cfu/L，干酪乳杆菌SL5接种量为4×108～8×108cfu/L；步骤二中超滤膜截留分子量为3kDa。
3、根据权利要求2所述的发酵乳中的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于步骤四冷冻干燥控制含水率＜5％。
4、根据权利要求2所述的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于步骤一中的发酵温度为37℃。
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