CN101768209B

CN101768209B - 具有高体内活性的降血压肽及其制备和纯化方法

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Publication number: CN101768209B
Application number: CN2009100762042A
Authority: CN
Inventors: 鲁军; 任迪峰; 王建中; 鲁勇
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: ORDOS XINYULI SPIRULINA INDUSTRY GROUP Co.,Ltd.
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2009-01-05
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2029-01-05
Also published as: CN101768209A

Abstract

本发明公开了一种具有高体内降血压活性的降血压肽及其制备和纯化方法，所述降血压肽的序列为缬氨酸-谷氨酸-脯氨酸，C端为脯氨酸，N端为缬氨酸，以及这种降血压肽的制备和纯化方法。本发明以螺旋藻粉末为原料，采用超低温冻融与超声波破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再利用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行水解，通过检测体外血管紧张素转化酶抑制活性作为参考指标，确定最佳的酶解工艺参数。酶解后的螺旋藻活性肽混合液再通过超滤、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离等步骤，得到高纯度、高活性的螺旋藻降血压肽。所述降血压肽具有明显的降血压效果。

Description

具有高体内活性的降血压肽及其制备和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备、纯化方法，可应用于保健性功能食品及药品领域。

背景技术

目前全世界有将近十亿人口患高血压，高血压正成为严重威胁人类健康的疾病之一。虽然卡托普利(Captopril)等人工合成血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂具有显著的降血压效果，然而这类降血压药物属酶的竞争性抑制剂，它们对酶活性部位的抑制是可逆的，药物作用时间不长，停药后会使血压反弹；而且，这类药物被吸收和排泄的速度较快，经肾脏排出易损害肾功能，同时也会引起诸多的副作用，例如咳嗽、过敏、皮疹、水肿、心律失常和肾脏损害等，所以研发更为安全的天然来源ACE抑制剂十分必要。

ACE抑制肽的研究在国外从上世纪六、七十年代开始，而在国内则从九十年代后期开始才逐有报道。国内外研究者已从不同的天然食物来源中分离出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金枪鱼、酪蛋白等，不同来源的ACE抑制肽在氨基酸数目、序列和活性上均存在较大差异。

螺旋藻为蓝藻的一个属，含有多种营养成分，具有营养及医疗保健功能，被世界粮农组织(FAO)誉为21世纪人类最理想、最完美的食品。螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种，其中含有18种氨基酸，其中包括人体必需的全部8种氨基酸，是获得天然活性肽的潜在宝贵资源，但高纯度和高活性的螺旋藻源ACE抑制肽目前在国内外尚无报道。此外，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于其溶解性质的局限性，不利于人体吸收，使其应用受到一定的限制。本研究采用3种不同种类的酶及酶解提取、精制技术，获得了9种ACE抑制肽，其中缬氨酸(valine)-谷氨酸(glutamic acid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro，VEP)肽IC50＝27.36±0.14μM，Ki＝23.59±0.54μM，其成果可广泛应用于保健性功能食品及药品领域，具有巨大的实用价值和经济效益。

发明内容

本发明的目的是克服大分子蛋白质吸收性差以及目前活性肽品种混杂不清、活性和纯度不高方面的不足，获得一种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用超低温冻融与超声波破碎相结合的方法从螺旋藻粉末中提取蛋白，再利用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行不同条件的酶解，将以上3种酶水解所获产物经不同分子量大小的超滤膜MWCO 10000、5000、3000过滤，获得具有不同分子量多肽的滤液，以体外ACE抑制活性为指标，通过凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对所提取多肽进行纯化，纯化后的多肽使用PPSQ-31A/33A系列全自动蛋白多肽序列分析仪和Kratos Analytical Shimadzu质谱分析仪进行鉴定。活性肽的体内降血压效果通过动物实验进行验证，并应用分子生物学和免疫学等手段检测相关调控因子的基因和蛋白表达，分析其体内作用机制，证实具有良好的体内降血压效果，可应用于保健性功能食品及药品领域。

此种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备，也可利用肽自动合成仪通过多肽合成方法人工合成。

附图说明

下面对附图进行简要说明。

图1是Superdex Peptide HR 10/30凝胶过滤色谱图。横坐标轴表示分离各管的试管号，纵坐标表示各管在220nm处的吸光度值。

图2是Cosmosil MS-II C18柱反相高效液相色谱图，(a)表示第一次分离曲线图，(b)表示第二次分离曲线图。横坐标轴表示分离各管的试管号，纵坐标轴表示各管在220nm处的吸光度值。

图3是ACE抑制肽的质谱图。

图4是抑制剂类型图。(a)表示Lineweaver-Burk图，横坐标轴表示基质浓度的倒数，纵坐标轴表示反应速度的倒数；(b)表示Dixon图，横坐标轴表示抑制剂的浓度，纵坐标轴表示反应速度的倒数。

图5是Hydrosphere C18柱反相高效液相色谱图。(a)表示未经消化酶消化的色谱图，(b)表示经胃蛋白酶消化的色谱图，(c)表示经胰凝乳蛋白酶消化的色谱图，(d)表示经胰蛋白酶消化的色谱图，(e)表示经胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化的色谱图。横坐标轴表示时间，纵坐标轴表示吸光度值。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：

1.蛋白提取及含量测定：经喷雾干燥获得的螺旋藻粉20g悬浮在160ml Milli-Q水中，悬浮液经液氮25-30℃水浴法冻融五次，再用超声波破碎3分钟，以破碎螺旋藻壁使其中的蛋白质游离出来。4℃下以6000g的速率离心30min，离心后去除沉淀，得到蛋白上清液。以牛血清白蛋白(BSA，SIGMA-ALDRICH公司)作为标准物，Bio-Rad Protein Assay法测定蛋白质含量。上清液迅速真空冷冻干燥得到螺旋藻的蛋白粉。

2.选择不同的酶进行酶解：

1)在30ml的螺旋藻蛋白液中加入终浓度为2.0mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，5.0mM L-半胱氨酸，300mM氯化钠和5.0单位木瓜蛋白酶(Sigma，USA)。于60℃的温度条件下，调节pH值至7.0，水解9小时。

2)底物浓度为2％(相当于20mg/ml)的蛋白质溶液，调节pH值至8.5，加入Alcalase 2.4L酶(酶与底物的比例为0.04(v/v))，混合均匀后，于50℃的温度条件下水解10小时。

3)底物浓度为2％的蛋白质溶液，调节pH值至8.0，加入嗜热菌蛋白酶(Wako，Japan)，加酶量0.1％(w/v)混合均匀后，于70℃的温度条件下水解6小时。

3.不同分子量活性液获得：水解物在6000g、4℃条件下经10000MWCO Vivascience超滤膜(Sartorius Co.，Germany)离心过滤去除酶，得到具有生物活性的下液。下液经过不同分子量大小的超滤膜(MWCO10000、5000、3000)过滤，获得具有不同分子量的滤液，并测定各部分滤液的体外ACE抑制活性。滤液采用真空冷冻干燥保存。

4.ACE抑制剂活性测定：ACE抑制剂活性测定采用荧光共振能量转移(FRET)基质Abz-FRK(Dnp)P-OH，在带有磁力转子的2ml比色皿中加入1975μl 1×assay缓冲液(包括0.1M Tris-HCl(pH 7.0)、50mMNaCl、10μM ZnCl₂，0.001单位ACE和100μL抑制剂溶液)，磁力转子在37℃下转动均匀加热。5分钟后，由微量进样器加入15μL FRET基质，使其在2ml比色皿中终浓度达4.5μM，在2分钟内连续记录RF-5300-PC荧光分光光度计(Shimadzu Corporation，Japan，激发光波长320nm，发射光波长420nm)的数值。

抑制率可由下式计算：

其中：A代表在抑制剂溶液中添加FRET基质2分钟后的荧光值；B代表在抑制剂溶液中尚未添加FRET基质前的荧光值；C代表以10mM Tris-HCl(pH 7.0)替代抑制剂溶液，添加FRET基质2分钟后的荧光值；D代表以10mM Tris-HCl(pH 7.0)替代抑制剂溶液，尚未添加FRET基质前的荧光值。以上条件下能抑制50％ACE酶活性的抑制剂浓度(μM)被定义为这种抑制剂的IC50，由ACE抑制率(％)与抑制剂浓度回归获得。IC50数值越小，说明此种抑制剂效果越强。

5.凝胶过滤分离：具有最高ACE抑制剂活性的冻干粉溶解在10ml10mM Tris-HCl(pH7.0)中，并经脱气及0.22μm Supor膜(Pall Co.USA) 过滤处理，然后经AKTA系统(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)凝胶过滤纯化。

流动相为：10mM Tris-HCl(pH7.0)、150mM NaCl。色谱柱条件：Superdex Peptide HR 10/30柱(10mm×30cm；Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)，流速为1ml/min，柱压低于1.5Mpa。整个设备系统的实验在4℃下进行。洗脱峰在220nm波长处进行检测并收集，其活性最高的管的收集液迅速进行冷冻干燥。

6.反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离：具有最高活性的收集液冻干粉，溶解于流动相A中，并经脱气及0.22μm Supor膜过滤处理，然后经AKTA系统反相高效液相色谱柱分离纯化。

流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)溶解于1％乙腈(ACN)/水(v/v)；流动相B：0.1％TFA溶解于90％ACN/Water(v/v)。

色谱柱条件：COSMOSIL MS-II C18柱(4.6mm×250mm，5μm，Nacalai tesque Co.Japan)，流速为1.5ml/min。洗脱峰在215nm处进行检测并收集。其活性最高的管的收集液迅速进行冷冻干燥，再通过相同的RP-HPLC条件进行分离纯化。

7.质谱分析：纯化后的抑制剂的分子量通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS，KRATOS ANALYTICAL SHIMADZU，Japan)进行检测。0.5μl样品溶液与0.5μl基质(5mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸，溶剂为等体积混合的ACN和0.1％TFA)形成的共结晶薄膜，在激光的照射下获得的电离离子。未知样品溶液浓度为1-10pmol/μl以确保精确测定。

8.氨基酸序列测定：纯化后的抑制剂的氨基酸序列通过PPSQ-31A/33A系列全自动蛋白/多肽序列仪(SHIMADZU，Japan)测定。15μl的未知样品溶液(超过50pmol)加到PVDF膜上经自然干燥，采用Edman降解法从蛋白质的N端按顺序将氨基酸切下，切下的氨基酸与异硫氰酸苯(PITC)反应，生成易于检测的PTH氨基酸，再采用柱前衍生的液相色谱分析，从而进行蛋白质的氨基酸序列分析。

实施例

实施例1：

经喷雾干燥获得的螺旋藻粉20g悬浮在160ml Milli-Q水中，经液氮冻融、25-30℃水浴法冻融五次，再用超声波破碎3分钟，获得蛋白质。4℃下以6000g速率离心30分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白上清液并测定蛋白质含量，上清液迅速真空冷冻干燥。

在30ml底物浓度为2％的螺旋藻蛋白液中加入终浓度为2.0mM的乙二胺四乙酸，5.0mM L-半胱氨酸，300mM氯化钠和5.0单位木瓜蛋白酶。于60℃的温度条件下，调节pH值至7.0，水解9小时。

水解液在6000g、4℃条件下经MWCO 10000 Vivascience超滤膜过滤去除酶，下液再经过不同分子量大小的超滤膜(MWCO 10000、5000、3000)过滤在4℃、6000g下超滤，测定各部分滤液的ACE抑制活性(见表1)。滤液迅速真空冷冻干燥。

表1各部分滤液的ACE抑制活性

具有最高ACE抑制剂活性的分子量低于3000的冻干粉溶解在10ml 10mM Tris-HCl(pH7.0)中，并经脱气及0.22μm Supor膜过滤处理，然后通过Superdex Peptide HR 10/30柱平衡2循环体积(CV)，洗脱1.5CV，洗脱峰在220nm处进行检测并收集测定ACE抑制活性，其结果见附图1。收集液迅速真空冷冻干燥。

具有最高活性的第26-29管，溶解于流动相A中，经反相高效液相色谱进一步分离纯化，色谱柱用100％的流动相A平衡2CV，逐渐升高流动相B的浓度进行梯度分离纯化(0-50％，12CV；50-100％，3CV)，分离结果及ACE抑制活性检测值见附图2。收集液迅速真空冷冻干燥。抑制率最高的第22管再次反相高效液相色谱纯化，梯度条件为流动相A对B 0-15％，1CV；15-20％，15CV；20-100％，2CV。分离结果及ACE抑制活性检测值见附图3。

纯化后的多肽经质谱分析及氨基酸测序，其氨基酸序列为缬氨酸(valine)-谷氨酸(glutamic acid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro，VEP)，N端为疏水性氨基酸，C端为脯氨酸，具有典型的ACE抑制肽的特征，其结果见附图3。

实施例2：

实施例1中纯化的降血压肽以不同浓度(0、3、7、11和15μM)各取100μL，如“发明内容”中所述方法在2ml的比色皿中加入1×assay缓冲液、ACE酶，在37℃下均匀加热5分钟。

5分钟后往反应液中加入不同浓度(1.05，1.67和4.00μM)的FRET基质，反应开始，如“发明内容”中所述方法连续记录2分钟内的荧光值。

应用双倒数式，以反应速度倒数(1/v)对FRET基质浓度的倒数(1/[s])作图，得到Lineweaver-Burk图(附图4(a))；以1/v对抑制剂浓度([I])作图，得到Dixon图(附图4(b))。从图中结果可知，本发明所得的降血压肽为ACE酶的非竞争性抑制剂，这种抑制使得V_max变小，但K_m不变。抑制剂不仅与游离酶结合，也可以与酶-底物复合物结合。

实施例3：

实施例1中纯化的降血压肽分别通过胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶三种消化酶按以下步骤进行体外稳定性试验。

1)胃蛋白酶：0.2mL的1.5mM肽溶液(干燥后的粉末溶解于Milli Q水中)加入0.2mL的0.05％(w/v)胃蛋白酶液(SIGMA，溶解于0.1M KCl-HCl，pH 2.0)中，在37℃下酶解6小时，加入1N NaOH调节pH值至7.0以停止反应。

2)胰凝乳蛋白酶：0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的 0.05％(w/v)胰凝乳蛋白酶液(SIGMA，溶解于0.1M K₃PO₄，pH8.0)中，在37℃下酶解6小时，加入6N HCl调节pH值至7.0以停止反应。

3)胰蛋白酶：0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的0.05％(w/v)胰蛋白酶液(SIGMA，溶解于0.1M K₃PO₄，pH8.0)中，在37℃下酶解6小时，加入6N HCl调节pH值至7.0以停止反应。

4)胃蛋白酶→胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶：0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的0.05％(w/v)胃蛋白酶液(溶解于0.1M KCl-HCl，pH 2.0)中，在37℃下酶解6小时，加入1N NaOH调节pH值至7.0以停止反应。然后，在真空冷冻干燥后，加入0.2mL 0.025％胰凝乳蛋白酶+0.025％胰蛋白酶混合酶液(溶解于0.6ml的0.1M K₃PO₄，pH8.0)中，在37℃下酶解6小时，加入6N HCl调节pH值至7.0以停止反应。

上述反应停止后的混合液分别使用10,000 MWCO超滤膜在4℃下以6,000g离心去除酶，取0.2mL进样RP-HPLC系统。流动相A：0.1％TFA溶解于1％ACN/Water(v/v)；流动相B：0.1％TFA溶解于90％ACN/Water(v/v)。色谱柱条件：Hydrosphere C18柱(4.6mm×150mm，5μm，YMC Co.，Ltd，Japan)，流速为1ml/min，柱压低于15Mpa。柱子用流动相A平衡15分钟，然后流动相A对B 0-100％梯度洗脱30分钟。洗脱峰与未消化前的降血压肽洗脱峰相比较，经不同酶处理后的降血压肽液，在相同保留时间峰高和峰面积变化值均小于5％。

其中A是未经酶消化的肽液的峰高或峰面积值；B是经过酶消化的肽液的峰高或峰面积值。经不同酶处理后降血压肽液IC 50值进行了测定，其值变化也不大，说明此种肽经消化酶消化是稳定的，结果如附图5(a，b，c，d，e)所示。

实施例4：

根据实施例1中纯化的降血压肽的序列，通过PPSM-8肽自动合成仪(SHIMADZU，Japan)使用固相法合成相应的多肽。合成肽的纯度使用反相高效液相色谱和质谱检验，纯度＞95％。实施例1中所示序列的多肽按10mg/kg(溶解于0.9％生理盐水中，每只大鼠灌服量为1ml)通过胃管每日上午11:00灌服8周龄雄性原发性高血压大鼠(SHR，Charles River，Japan)，时间持续一周。每日灌服前及第一日灌服后2、4、6、8、24小时的尾部动脉收缩压、舒张压采用尾部套管法(BP-98A-L，Softron，Japan)检测。如表2所示，首日灌服后4、6、8小时的收缩压和舒张压显著低于负对照组(灌服等量的0.9％生理盐水)，和正对照组(灌服降血压药物Captoporil，10mg/kg)结果相近，说明本发明的降血压肽具有显著的体内短期降血压效果。

表2

*与负对照组差异显著，p＜0.05。

另外，从第三日起，灌服前处理组的血压显著地低于负对照组(表3)，说明本发明的降血压肽具有中长期稳定降血压的效果。

表3

*与负对照组差异显著，p＜0.05。

Claims

1.一种具有高体内活性的降血压肽，所述降血压肽的序列为缬氨酸-谷氨酸-脯氨酸，其中C端为脯氨酸，N端为缬氨酸。

2.如权利要求1所述的降血压肽的制备方法，其特征在于所述降血压肽可利用肽自动合成仪通过合成方法人工合成。

3.如权利要求1所述的具有高体内活性的降血压肽在制备具有降血压作用的保健功能性食品或药剂中的应用。