CN113583087B - 一种螺旋藻免疫活性肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种提取自螺旋藻粉的免疫活性肽及其制备方法与应用。所述免疫活性肽为Asp‑Leu‑Pro‑Trp(C端为Trp，N端为Asp)、Asp‑Pro‑Phe(C端为Phe，N端为Asp)、Gly‑Phe‑Pro(C端为Pro，N端为Gly)。为了获取含有上述免疫活性肽的产品，本发明以螺旋藻粉为原料，采用碱提酸沉法提取螺旋藻粉的蛋白，再用胰蛋白酶酶解，酶解液经过超滤分离，得到0‑5KDa分子量的免疫多肽，最终得到免疫活性的多肽(DLPW、DPF、GFP)，有利于提高巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，具有免疫活性。

Description

一种螺旋藻免疫活性肽及其制备方法与应用

技术领域：

本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种提取自螺旋藻粉的免疫活性肽及其制备方法与应用。

背景技术：

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质(如病菌等)，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。免疫系统分为先天免疫和适应性免疫。先天免疫是非特异性的，主要通过机体的天然屏障(如皮肤和黏膜)、生理学防御(低pH、温度和化学介质)、细胞(如巨噬细胞、多形核白细胞、树突状细胞)和自然杀伤(NK)细胞或炎症因子(如细胞因子)提供第一道防御。适应性免疫对潜在危险的外来抗原具有高度特异性，可分为细胞免疫和抗体介导的体液免疫，而T淋巴细胞(T细胞)和B淋巴细胞(B细胞)是适应性免疫中最重要的细胞。免疫功能直接关系到机体能否抵御外来异物(包括微生物)的入侵，清除机体变性坏死和变异的细胞，在维持机体稳态方面发挥着不可替代的作用。

生物活性肽一直是生命和食品科学领域的研究热点之一。近年来，国内外诸多研究证实了免疫活性肽在细胞和动物水平均具有良好的免疫功能。免疫活性肽是一类具有促进淋巴细胞分化成熟、增强机体免疫机能等生物学功能的多肽。免疫活性肽的分子质量一般较低，在生物体内的含量也较少，具有促进淋巴细胞分化和成熟，增强巨噬细胞的吞噬功能的作用,它提高机体抵御外界病原体感染的能力，增强人体的免疫功能，在人类营养健康和疾病调节中发挥着不可替代的作用。到目前为止，科研工作者已从乳蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、鱼贝类蛋白、胶原蛋白等蛋白酶解物中分离出多种具有免疫活性的肽段，并将其应用于细胞、动物实验及临床研究，取得了显著效果。

钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是一种光养生丝状蓝绿色微藻，它主要的光合产物是蛋白质，碳水化合物，脂质，其中蛋白质含量所占比例最高。螺旋藻具有许多生理功能，如抗菌、抗癌、降血糖、降胆固醇、抗氧化剂、免疫调节和抗炎活性等一系列功能作用。已有研究表明，螺旋藻含有大量的蛋白质，由18种氨基酸组成，包含人体全部8种必需氨基酸，这为开发螺旋藻生物活性肽提供了良好的物质基础。

本研究以螺旋藻粉为原料，利用酶解法制备螺旋藻多肽，采用超滤等方法分离纯化螺旋藻蛋白酶解液，并测定其对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响，筛选出免疫活性高的螺旋藻多肽组分，对该螺旋藻多肽组分进行液质分析，确定螺旋藻多肽的氨基酸序列。利用计算机分析软件，依据多肽的氨基酸组成分析及库比对，确定免疫活性强的目标特征肽段，人工合成目标肽段并进行活性测定。

发明内容：

本发明提供的技术方案之一，是提取自螺旋藻粉的免疫活性肽，所述所述免疫活性肽的氨基酸序列为Asp-Leu-Pro-Trp(C端为Trp，N端为Asp)，以下简称DLPW；所述免疫活性肽的氨基酸序列为Asp-Pro-Phe(C端为Phe，N端为Asp)，以下简称DPF；所述免疫活性肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro(C端为Pro，N端为Gly)，以下简称GFP。

所述免疫活性肽DLPW、DPF、GFP可通过人工合成的方式获得，也可通过对螺旋藻粉酶解筛选获得；

本发明还提供获取上述多肽的方法，具体如下：

本发明以螺旋藻粉为原料，采用碱提酸沉法提取螺旋藻粉的蛋白，再用胰蛋白酶酶解，酶解液经过超滤分离，得到不同分子量范围(0-5KDa、5-10KDa、>10KDa)的免疫多肽，检测它们对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响，得到超滤后吞噬中性红能力强的多肽组分(0-5KDa)。然后通过超滤纯化得到免疫活性最好的多肽组分并对其进行LC-MS/MS鉴定，确定多肽组分的氨基酸序列。利用计算机分析软件，依据多肽的氨基酸组成分析及库比对，确定免疫活性强的目标特征肽段，人工合成目标特征肽段并验证其活性，从而得到螺旋藻多肽中高免疫活性的短肽序列。

有益效果：

本发明提供了一种新型免疫活性肽，其免疫作用明显，且采用螺旋藻粉为原料，生产成本低，经济效益高。

基于试验结果，超滤酶解后的螺旋藻多肽，巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力测定结果为分子量在0-5KDa的螺旋藻多肽吞噬中性红能力最高，合成的短肽序列DLPW、DPF、GFP也被证明有较高的免疫活性。本发明有利于提高巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，具有免疫活性。

附图说明：

图1不同分子量多肽对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响；

图2螺旋藻多肽总离子流图；

图3螺旋藻多肽DLPW、DPF、GFP液质质谱图；

(A:DLPW；B:DPF；C:GFP)；

图4人工合成多肽DLPW、DPF、GFP对巨噬细胞RAW264.7增殖活性的影响；

(A:DLPW；B:DPF；C:GFP)；

图5人工合成多肽DLPW、DPF、GFP对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响；

(A:DLPW；B:DPF；C:GFP)；

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清晰明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明

实施例1：螺旋藻多肽的提取方法

(1)碱溶酸沉提取螺旋藻蛋白

利用碱提酸沉的方法从螺旋藻粉中提取螺旋藻蛋白。准确称取40g螺旋藻粉，将其溶解在800mL的超纯水中，常温下用磁力搅拌器搅拌30min，使其充分溶解，后将其放置与-20℃冰箱冷冻5h，再置于室温下解冻，反复冻融三次。后调节pH至10.0，在冰浴中进行超声破碎处理，在功率为570W超声波中超声20min(每间隔9s，超声6s)，超声完后立即取出，然后将其置于4℃条件下，8000r/min离心45min，取其上清蛋白液备用。用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节上清液的pH至4.0，室温下静置1h，在4000r/min条件下离心10min，最终得到螺旋藻蛋白沉淀，再用1mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，得到螺旋藻蛋白，沉淀物经过真空冷冻干燥后至恒重。

(2)胰蛋白酶酶解

将制备得到的螺旋藻蛋白冻干粉以1:20的料液比(w/v)与纯水混合，并在90℃条件下预煮30min。预煮结束后，待温度降至45℃，用1mol/L的NaOH溶液将pH值调至8.0，添加0.5％(w/w)胰蛋白酶水解螺旋藻蛋白溶液，保持温度37℃下水解4h。酶解结束后，95℃煮沸15min以终止酶促反应。后将其在6000r/min下离心(4℃，20min)，取上清液并将pH调至7.0，冻干后备用。

(3)螺旋藻多肽纯化方法

粗螺旋藻多肽→溶解→过超滤机→纯化液冻干保存。

将螺旋藻蛋白酶解物6000r/min离心15min取上清液，经过0.45μm的微滤膜过滤，后经10KDa超滤膜截流分离，保留残留液和滤液；将滤液再经5KDa超滤膜截流分离，保留残留液和滤液；从而依次制备分子量为>10KDa、5-10KDa、5KDa以下的螺旋藻多肽溶液。然后将不同分子量的多肽溶液进行真空冷冻干燥并保存。

实施例2超滤后不同分子量的螺旋藻多肽对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响。

按照试验分组进行处理，空白组：未添加多肽的溶液；LPS组：加入终质量浓度为10μg/mL的LPS；样品组：将不同组分的螺旋藻多肽样品终浓度设定为100μg/mL。

分为5个处理:

处理1：空白对照为未添加多肽的溶液；

处理2：阳性对照组为终质量浓度10μg/mL的LPS溶液；

处理3：100μg/mL的分子量0-5KDa的多肽溶液；

处理4：100μg/mL的分子量5-10KDa的多肽溶液；

处理5：100μg/mL的分子量>10KDa的多肽溶液；

分别按照巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的测定方法进行测定，每个处理重复三次，测定并计算不同处理的细胞吞噬指数。

结果如图1所示，经过超滤处理得到不同分子量(0-5KDa、5-10KDa、>10KDa)的螺旋藻多肽组分，将三种不同分子量的多肽组分终浓度设定为100μg/mL，测定它们对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力。根据之前的实验研究结果得知，浓度为100μg/mL的不同分子量多肽对细胞增殖没有抑制作用。由图1所示，与空白对照组相比，三种分子量的多肽组分均能够提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力，其中，0-5KDa螺旋藻多肽的吞噬指数为1.30±0.04，显著高于5-10KDa和>10KDa的螺旋藻多肽吞噬指数1.24±0.01和1.18±0.02；因此，0-5KDa分子量的多肽组分促进效果最佳。

实施例3螺旋藻多肽(0-5KDa)氨基酸组成分析

准确称取0.1g样品于水解管中，向其加入10mL、50％的盐酸，将水解管封口，然后将其置于电热鼓风干燥箱(110℃)中水解22h，冷却至室温，过滤、冲洗，将其定容至50mL，振荡混匀。准确吸取1mL滤液于瓶中，于55℃真空干燥箱中干燥4h，后转移至仪器进样瓶中，采用L8900氨基酸自动分析仪进行分析。

表1螺旋藻多肽(0-5kDa)的氨基酸组成及含量

0-5KDa分子量的螺旋藻多肽组分氨基酸组成分析结果如表1所示。由表1可知，螺旋藻多肽含有丰富的不同氨基酸种类。必需氨基酸和非必需氨基酸分别占总氨基酸的42.93％、57.07％，其中必需氨基酸量与非必需氨基酸量之间的比值为0.75，这两个值均稍高于WHO/FAO规定的参考蛋白模式(必需氨基酸量/总氨基酸量＝40％，必需氨基酸量/非必需氨基酸量＝0.6)。

实施例4螺旋藻多肽液质质谱分析

还原烷基化：

取10μL 0-5KDa组分样品，加入50mmol/L NH₄HCO₃溶液90μL，加入DTT溶液使其终浓度为10mmol/L，于37℃水浴中还原4h；加入IAA溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。

质谱分析：

毛细管液相色谱条件：预柱：Acclaim

C18，300μm×5mm，5μm，

分析柱：75μm×150mm，Acclaim

C18，3μm，

检测波长：220nm；流动相A：0.1％甲酸，2％乙腈；流动相B：0.1％甲酸，80％乙腈；柱温：30℃；流速：300nL/min。液相色谱洗脱梯度见表3。

表2液相色谱洗脱梯度

质谱条件：

一级质谱参数：

Resolution：70000AGC；AGC target：3e6；Maximum IT：40ms；Scan range：100-1500m/z；

二级质谱参数：

Resolution：75000；AGC target：1e5；Maximum IT：60ms；Top N：20；NCE/steppedNCE：27；Scan range：50-1500m/z；

图2是螺旋藻多肽0-5KDa组分的总离子流图，通过液质结构分析，得到的多肽数量为800个。

实施例4计算机软件分析

利用BIOPEP数据库(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)用来检索之前已确定过为免疫活性肽的相类似序列。采用Peptide Ranker软件(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)来预测肽潜在的生物活性，该软件对肽的评分为从0到1，评分越高意味着肽具有生物活性的可能性越高。该预测基于以下事实：生物活性肽具有特定结构特征和氨基酸序列，这使肽具有了特定的生物活性。

使用AllerTOP v.2.0软件(http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html)可以预测潜在的肽过敏原，该软件根据其理化性质将肽分为可能的过敏原或非过敏原。使用ToxinPred软件(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)评估肽的毒性和理化性质，例如疏水性，亲水性，位阻和两亲性。主要根据多肽的氨基酸组成和位置来预测肽的毒性。

表3 Peptide Ranker评分>0.5的多肽序列的理化性质、毒性和致敏性的计算机预测。

根据多肽氨基酸组成分析以及LC-MS/MS鉴定得到的所有多肽序列，通过PeptideRanker软件分析，筛选出评分大于0.5的多肽(82条)，然后通过ToxinPred软件分析发现它们都无毒性，后又通过AllerTOP v.2.0软件分析，将多肽分为过敏原(33条)和非过敏原(49条)。为了进一步验证多肽的活性，根据库比对以及计算机分析结果，选择无毒性且无过敏原，活性评分高的多肽，因此选取DLPW、DPF、GFP作为研究对象，其液相质谱图分别如图3所示。

实施例5人工合成多肽的免疫活性

肽段的合成采用Fmoc固相合成法，根据氨基酸序列合成肽段，经切割、析出、纯化后得到粉末状多肽。合成过程委托南京源肽生物科技有限公司。肽段DLPW、DPF、GFP的纯度均大于95％。分别测定DLPW、DPF、GFP对巨噬细胞RAW264.7增殖活性和吞噬中性红能力的影响。

图4-5A分别显示了空白组(加入100μL培养液)、LPS组(加入终质量浓度为10μg/mL的LPS)以及样品组(加入终质量浓度分别为25、50、100、200μg/mL的多肽)对巨噬细胞RAW264.7增殖活性和吞噬中性红能力的影响。可知，DLPW在不同的浓度下均对细胞增殖无抑制作用和毒害作用，并且都在不同程度上促进了细胞吞噬中性红的能力，当浓度为100μg/mL时，吞噬指数最高，为1.52±0.01，表明DLPW具有免疫活性。

图4-5B分别显示了空白组(加入100μL培养液)、LPS组(加入终质量浓度为10μg/mL的LPS)以及样品组(加入终质量浓度分别为25、50、100、200μg/mL的多肽)对巨噬细胞RAW264.7增殖活性和吞噬中性红能力的影响。可知，DPF在不同的浓度下均对细胞增殖无抑制作用和毒害作用，并且都在不同程度上促进了细胞吞噬中性红的能力，随着多肽浓度的增加，免疫活性逐渐增强，当浓度为200μg/mL时，吞噬指数为1.49±0.01，表明DPF具有免疫活性。

图4-5C分别显示了空白组(加入100μL培养液)、LPS组(加入终质量浓度为10μg/mL的LPS)以及样品组(加入终质量浓度分别为25、50、100、200μg/mL的多肽)对巨噬细胞RAW264.7增殖活性和吞噬中性红能力的影响。可知，GFP在不同的浓度下均对细胞增殖无抑制作用和毒害作用，并且都在不同程度上促进了细胞吞噬中性红的能力，随着多肽浓度的增加，免疫活性逐渐增强，当浓度为200μg/mL时，吞噬指数为1.48±0.01，表明GFP具有免疫活性。

实施例6本发明巨噬细胞RAW264.7增殖活性的测定

将RAW264.7细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素)并在37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时，用0.25％胰酶(含0.01％EDTA)消化，DMEM培养基洗涤、离心，PBS重新洗涤、离心后接种到培养皿中，按不同的实验目的进行培养。

利用MTT法测定细胞的增殖活性。将对数生长期的RAW264.7细胞按照1×10⁵/孔接种于96孔板，每个孔100μL，在96孔板的最外围加入PBS溶液液封，于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养12h，待细胞贴壁后，弃去上清液。按照试验分组进行处理，空白组：加入100μL培养液；LPS组：加入终质量浓度为10μg/mL的LPS；样品组:加入终质量浓度分别为25、50、100、200μg/mL的多肽，每组6个复孔，培养24h后，用MTT法测定细胞活力，每孔加入20μL的5mg/mLMTT，在相同条件下继续孵育4h，后弃去孔内液体，加入100μL DMSO，振荡10min。使用酶标仪测定OD_570nm值。细胞的增殖能力的计算按下列公式：

实施例7本发明巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的测定

将对数生长期的RAW264.7细胞按照1×10⁵/孔接种于96孔板，每个孔100μL，在96孔板的最外围加入PBS溶液液封，于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养12h，待细胞贴壁后，弃去上清液。按照试验分组进行处理，空白组：加入100μL培养液；LPS组：加入终质量浓度为10μg/mL的LPS；样品组：将不同组分的螺旋藻多肽样品终浓度设定为100μg/mL或者加入终质量浓度分别为25、50、100、200μg/mL的多肽，每组6个复孔，培养24h后，用PBS溶液洗涤细胞1次，依次加入200μL培养液、20μL中性红染色液，在细胞培养箱中孵育2h后，除去孔内液体，然后用PBS溶液洗涤2次，加入200μL细胞裂解液，放置于室温摇床上10min，酶标仪测定OD_540nm值。按下列公式计算中性红吞噬指数：

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (1)

1.一种免疫活性肽在制备促进巨噬细胞吞噬中性红产品中的应用，其特征在于，所述免疫活性肽，氨基酸序列为Asp-Leu-Pro-Trp，C端为Trp，N端为Asp；氨基酸序列为Asp-Pro-Phe，C端为Phe，N端为Asp；氨基酸序列为Gly-Phe-Pro，C端为Pro，N端为Gly；

多肽浓度为25-200μg/mL，所述巨噬细胞为RAW264.7。

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