ES2606954B1

ES2606954B1 - Procedimiento para la obtención de un hidrolizado de garras de pata de pollo con actividad antihipertensiva, hidrolizado obtenido y péptidos que contiene

Info

Publication number: ES2606954B1
Application number: ES201531372A
Authority: ES
Inventors: Francisca Isabel BRAVO VÁZQUEZ; Lluís AROLA FERRER; María Begoña MUGUERZA MARQUÍNEZ
Original assignee: Universitat Rovira i Virgili URV
Current assignee: Universitat Rovira i Virgili URV
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2017-12-18
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: WO2017050775A1; ES2606954A1

Abstract

La presente invención es un procedimiento para la obtención de un hidrolizado enzimático con actividad antihipertensiva que comprende la trituración de garras de pata de pollo y liofilización para obtener un material en polvo de un tamaño de partícula <2 mm; ajustar una disolución acuosa de este polvo a un pH distinto en un valor de 0,5 respecto del pH del polvo de partida y calentar entre 80 y 120ºC durante entre 10 y 120 min; enfriar la disolución anterior a una temperatura entre 45 y 55°C y realizar una hidrólisis enzimática durante un tiempo de entre 1 y 24 h, con enzimas seleccionadas evaluando y seleccionando la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina. La invención es también el uso del hidrolizado que se obtiene en el tratamiento de hipertensión, y la utilidad farmacológica de los péptidos que contiene el hidrolizado.

Description

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ES 2 606 954 A1

DESCRIPCION

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE UN HIDROLIZADO DE GARRAS DE PATA DE POLLO CON ACTIVIDAD ANTIHIPERTENSIVA, HIDROLIZADO OBTENIDO Y PEPTIDOS QUE CONTIENE

SECTOR TECNICO

El hidrolizado de garras de pollo de la presente invencion es de utilidad en el tratamiento de la hipertension, en el campo de la medicina o de la industria alimentaria. Los peptidos encontrados pueden ser de utilidad en dietetica como suplementos de productos alimenticios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El termino antihipertensivo designa toda sustancia o procedimiento que reduce la presion arterial (PA). Se conocen varios agentes antihipertensivos eficaces que se clasifican de acuerdo a su mecanismo de accion. Se identifican asl diureticos, bloqueadores adrenergicos beta, bloqueadores de los canales del calcio, inhibidores adrenergicos centrales y perifericos, inhibidores de los receptores de la angiotensina o los inhibidores de la Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA). La ECA cataliza la conversion de angiotensina I en angiotensina II, que es una hormona vasoconstrictora.

Los inhibidores de la ECA, o actividad inhibidora de la ECA (IECA), interfieren en la produccion de angiotensina II por el bloqueo de la enzima que la produce. Tal efecto no solo reduce la PA sino que disminuye el dano vascular provocado por la hipertension, lo que a su vez disminuye la incidencia de complicaciones en el paciente, en particular insuficiencia renal o insuficiencia cardlaca. Sin embargo, la experiencia muestra que no se puede establecer una correlation directa a priori entre observar una actividad IECA in vitro y obtener un efecto antihipertensivo in vivo correlativo en pacientes.

La publication WO 2007004876 A2 describe la secuencia de varios peptidos con actividad IECA in vitro obtenidos de un hidrolizado de protelnas de la leche. Los peptidos tienen una longitud de 2 a 14 aminoacidos y al menos uno de ellos presenta una identidad de secuencia del 66,7% con el peptido identificado por la SEQ.ID.NO: 1 de la presente invencion. Esta identidad es muy baja para poder establecer una

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relacion entre los dos peptidos, logicamente porque los dos sustratos son muy diferentes.

La solicitud WO 2007108554 A1 describe la obtencion a partir de colageno de pollo de un hidrolizado enzimatico con actividad IECA que muestra tambien propiedades antihipertensivas. Identifica un peptido de 3000 Da con dicha actividad. Sin embargo, utilizar solo colageno como material de partida excluye una serie de protelnas presentes en la piel de las garras del animal que si se incorporan en el hidrolizado de la presente invencion. Tambien excluye protelnas diferentes al colageno presentes en otros tejidos de las garras de pata de pollo, como el cartllago, huesos o unas. Los peptidos obtenidos en la presente invencion van a ser pues distintos.

JP H42 64098 A describe la obtencion de un hidrolizado de una protelna de carne magra de pollo tratada con termolisina que presenta actividad IECA in vitro. Al tratarse de carne magra de pollo, en el producto de partida predominaran protelnas tlpicas de tejido muscular, casi completamente ausentes en las garras de pollo y por tanto diferentes de las de la presente invencion. Quedan de nuevo excluidas otras protelnas mayoritarias de este sustrato. En el hidrolizado obtenido, el documento identifica el peptido identificado por la SEQ.ID.NO:10 como agente activo, que no guarda ninguna identidad con los peptidos de la invencion.

Cheng describe un hidrolizado con actividad antihipertensiva obtenido de la hidrolisis de la pata de pollo completa con alcalasa (Cheng, F. y col. “Determination of angiotensine-I converting enzyme inhibitory peptides in chicken leg bone protein hydrolysate with alcalase”. 2009. Anim. Sci. J. 80, 91-97). El procedimiento incluye someter al material de partida licuado a un tratamiento termico en “bano Marla” previo al tratamiento con el enzima. Se obtienen 10 peptidos de entre 5 y 10 aminoacidos con dicha actividad IECA in vitro, ninguno de los cuales presenta sin embargo una homologla significativa con los peptidos de la invencion; de nuevo porque el sustrato utilizado por Cheng incluye hueso y sobre todo tejido muscular, y quedan excluidos compuestos mayoritarios de las garras de pollo. Los peptidos obtenidos por la digestion de este sustrato con alcalasa son logicamente distintos, de forma que el procedimiento no sugiere los resultados obtenidos por la presente invencion.

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El documento de la tecnica que se considera mas cercano a la invention es la solicitud TW 201106955 A. Este documento describe la preparation de un hidrolizado enzimatico con actividad antihipertensiva a partir de las garras de pollo tomatero. El procedimiento de obtencion comprende la homogeneizacion del material de partida y un tratamiento termico en “bano Marla” seguido de una digestion con proteasa N. Despues de la digestion por la proteasa se filtra el producto obtenido, se liofiliza y se seleccionan aquellos hidrolizados que muestran actividad IECA. Sin embargo, el producto obtenido por la proteasa N es distinto del obtenido por las proteasas de la invencion. La diferencia fundamental respecto de la presente invencion es que el pretratamiento termico en esta ultima se realiza a pH modificado. Esta modification en el procedimiento no esta sugerida por el arte previo.

Segun el mejor conocimiento del Solicitante los peptidos de la invencion no han sido descritos como tales en la tecnica. Solamente el identificado por la SEQ.ID.NO.ID:2 esta descrito en varias publicaciones, aunque siempre formando parte de secuencias mas extensas. Varias de estas secuencias estan relacionadas con el tratamiento de la angiogenesis por ejemplo en la solicitud US 2012101029 A1, que contiene en su SEQ.ID.NO:18 el peptido de la invencion. Sin embargo, estos documentos no describen ni sugieren que se puedan considerar fragmentos de las secuencias mas extensas, ni en particular un fragmento que pueda corresponder con el peptido de la invencion.

El problema que se plantea pues en la tecnica es la obtencion de un hidrolizado alternativo de protelnas efectivo para el tratamiento de la hipertension. La solution propuesta por la presente invencion es un hidrolizado obtenido a partir de un procedimiento modificado de hidrolisis de un sustrato de garras de pollo.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion es un procedimiento para la obtencion de un hidrolizado enzimatico con actividad antihipertensiva que comprende la trituracion de garras de pata de pollo y liofilizacion para obtener un material en polvo de un tamano de partlcula <2 mm, ajustar una disolucion acuosa de este polvo a un pH entre 3 y 10 con la condicion de que es valor de pH sea distinto del correspondiente al material en polvo en al menos un valor de 0,5, y calentar entre 80 y 120°C durante entre 10 y 120 min, preferiblemente entre 60 y 90 min, enfriar la disolucion anterior a una temperatura

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entre 45 y 55°C y realizar una hidrolisis enzimatica durante un tiempo de entre 1 y 24 h, preferiblemente entre 2 o 24 h, mas preferiblemente 2 o 24 h, con enzimas seleccionadas entre el grupo compuesto por:

- enzimas proteollticas de Bacillus licheniformis y Bacillus

amyloliquefaciens identificadas como E.C. 3.4.21.62 y 3.4.24.28,

- una serinproteasa de Bacillus licheniformis identificada como E.C. 3.4.21.62,

- una metaloproteasa dependiente de Zinc de Bacillus amyloliquefaciens

identificada como E.C. 3.4.24,

- una aminopeptidasa de Aspergillus oryzae identificada como E.C. 3.4.11.1, y

- una mezcla entre ellas,

evaluando la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina segun el metodo descrito en Sentandreu, MN y Toldra F. 2006. Food Chem. 97, 546-554, y la selection de un hidrolizado con actividad > 80% en dilution acuosa al 50% v/v a partir de la evaluation anterior.

En el ambito de la presente solicitud, cuando se dice que el pH de la disolucion acuosa de la invencion es distinto del correspondiente al material en polvo en al menos un valor de 0,5, se refiere a que es distinto del pH del material el polvo medido tambien en disolucion acuosa. Evidentemente, esta ultima medicion puede realizarse sobre una disolucion para tal fin o en la disolucion que luego se va a ajustar de acuerdo al procedimiento de la invention.

En un aspecto preferible, las enzimas utilizadas en la hidrolisis son enzimas proteollticas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens, e identificadas como E.C. 3.4.21.62 y 3.4.24.28.

En un aspecto mas restrictivo, la invencion consiste en el procedimiento anterior.

En un aspecto muy preferible, la invencion es un procedimiento que comprende triturar garras de pata de pollo y liofilizar para obtener un material en polvo con tamano de partlcula <2 mm, ajustar una disolucion acuosa de este polvo a un pH de 7,5 en que este valor de pH es distinto del correspondiente al material en polvo de la etapa anterior en al menos 0,5, calentar a 100°C durante 90 min, enfriar la disolucion anterior

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a una temperatura de 50°C e hidrolizar durante un tiempo de 2 o 24 h con enzimas proteollticas obtenidas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens identificadas como E.C. 3.4.21.62 y 3.4.24.28, evaluation de la actividad inhibidora de enzima convertidora de angiotensina segun el metodo descrito en Sentandreu, MN y Toldra F. 2006. Food Chem. 97,546-554, y la selection de un hidrolizado con actividad >80% en dilution acuosa al 50% v/v a partir de la evaluacion anterior.

La materia prima son las Garras de Patas de Pollo (GPP), que es un subproducto de la industria carnica. El proceso de production del hidrolizado es barato y facil de industrializar.

El aspecto inventivo del procedimiento de la invencion es el pretratamiento del polvo de GPP a pH modificado para lograr la maxima solubilization y desnaturalizacion de la protelna, lo que optimiza su posterior hidrolisis. Este pretratamiento facilita el acceso de las enzimas a las protelnas.

La election de la enzima de hidrolisis en el procedimiento de la invention resulta determinante. Entre las innumerables enzimas que se pueden utilizar ninguna estaba particularmente sugerida en la tecnica. De forma aleatoria, la presente invencion eligio Protamex® (Novozyme) que en la fecha de la presente solicitud son las enzimas proteollticas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens (E.C. 3.4.21.62 y 3.4.24.28); Alcalase® 2,4 L, tambien denominada subtilisina Carlsberg, que es una serinproteasa de Bacillus licheniformis (E.C. 3.4.21.62); Neutrase® 0,8L que es una metaloproteasa dependiente de Zinc de Bacillus amyloliquefaciens (E.C. 3.4.24); y Flavourzyme® que es una aminopeptidasa de Aspergillus oryzae (E.C. 3.4.11.1) (Novozyme, Nordisk). Un aspecto de la invencion tambien comprenderla una mezcla de todas ellas.

Muchos de los hidrolizados obtenidos mostraron una buena actividad IECA y 3 de ellos una clara actividad antihipertensiva. En particular, la actividad antihipertensiva del hidrolizado obtenido con Protamex®, denominado en la presente solicitud como hidrolizado 1, fue sorprendentemente alta, lo cual representa una ventaja tecnologica definitiva con respecto de la tecnica.

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La invention tambien son los hidrolizados que se obtienen. De forma que otro aspecto muy preferible es un hidrolizado enzimatico que comprende los peptidos identificados por las SEQ.ID.NO:1-9, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos. Otro aspecto preferible es el uso de este hidrolizado enzimatico en la preparation de un medicamento para el tratamiento de la hipertension en un sujeto. O tambien, el hidrolizado para uso en el tratamiento de la hipertension en un sujeto. El sujeto es preferiblemente humano.

Un aspecto preferible mas es una composition farmaceutica en forma llquida o jarabe que comprende un hidrolizado enzimatico que contiene los peptidos identificados por SEQ.ID.NO:1-9, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos, y excipientes farmaceuticamente aceptables.

A partir de los hidrolizados de la invencion se obtuvieron una serie de peptidos bioactivos. En particular, los peptidos identificados por la SEQ.ID.NO:2 y 4 mostraron actividad IECA in vitro y ademas una actividad antihipertensiva sorprendente.

De forma que otro aspecto preferible de la invencion es un peptido identificado por una de las secuencias SEQ.ID.NO:1-9. Otro aspecto mas preferible es el uso de un peptido identificado por las SEQ.ID.NO:2 o 4, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos, o su combination en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de hipertension. O tambien, los peptidos identificados por las SEQ.ID.NO:2 o 4, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos, o su combinacion para uso en el tratamiento de hipertension.

Otra realization muy preferible son los peptidos identificados por las SEQ.ID.NO:2 o 4, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos, o su combinacion para uso como medicamento.

Otro aspecto muy preferible es una composicion farmaceutica que comprende un peptido identificado por la secuencia SEQ.ID.NO:2 o 4, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos o su combinacion, y excipientes farmaceuticamente aceptables. Un aspecto preferible mas es un suplemento alimenticio que comprende un peptido identificado por la secuencia SEQ.ID.NO:2 o 4, sus estereoisomeros y/o sales de los mismos o su combinacion, y aditivos alimentarios.

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Los resultados del Ejemplo 2 muestran como el pretratamiento en el procedimiento de obtencion afecta a la actividad IECA de los hidrolizados, haciendo que en la mayorla de los casos aumente y con frecuencia con valores superiores al 80%. Este pretratamiento no resulta excesivamente costoso ya que no emplea temperaturas demasiado altas.

La determination del IC50 de los hidrolizados mostro que la hidrolisis proteica con la enzima Protamex® producla hidrolizados con menores valores de IC50 a todos los tiempos de hidrolisis, es decir, con mas potente actividad IECA y por lo tanto con mayor potencial antihipertensivo. Los resultados de las Tablas I y II muestran que el pH utilizado en el pretratamiento, y no solamente la temperatura, influye en la actividad IECA. El tratamiento con modification de pH mejora la extraction de las protelnas y tambien aumenta su grado de desnaturalizacion, condicionando asl la hidrolisis posterior.

Ademas, se ha descartado que el hidrolizado antihipertensivo presente actividad hipotensiva mediante un estudio in vivo en el que se utilizaron ratas normotensas (Wistar-Kyoto) y a las que se les administro un hidrolizado de la invention, como se muestra en el Ejemplo 7. Esta actividad hipotensiva no es una actividad deseable ya que es la bajada de la PA de una persona o animal sano, mientras que la actividad antihipertensiva es la disminucion de la PA en una persona u animal hipertenso. Resulta de gran importancia que el hidrolizado de la invencion muestre un efecto terapeutico en las personas enfermas y no en las sanas.

De entre los peptidos de la presente invencion, el identificado por la SEQ.ID.NO:7 presenta los valores de actividad IECA mas bajos (IC50= 7,06 pg/mL) lo cual podrla indicar un posible efecto antihipertensivo; sin embargo no resulto asl debido probablemente a que el peptido se hidroliza por las enzimas del tracto digestivo y no puede absorberse como tal. De manera similar sucedio con el peptido SEQ.ID.NO:1, que a pesar de tener una actividad IECA mejor a la mostrada por el peptido SEQ.ID.NO:4 no presento actividad antihipertensiva. Los resultados mostrados en la presente solicitud demuestran que una actividad IECA potente no se corresponde de forma directa con un efecto de disminucion de la PA.

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De cualquier forma, en la actividad antihipertensiva del hidrolizado no se descarta que los peptidos que de forma individual no muestran actividad antihipertensiva, por ejemplo la SEQ.ID.NO:1 y 7, puedan actuar de forma sinergica al administrarlos conjuntamente con el resto de peptidos contribuyendo a la bajada de la PA atribuible al hidrolizado antihipertensivo de la invention.

De hecho, se ha descrito que el grado de hidrolisis producido por la digestion fisiologica de un determinado peptido, ademas de depender de su tamano y de su naturaleza, tambien depende de la presencia de otros peptidos en el medio (FitzGerald y col., "Hipotensive peptides from milk proteins". 2004. J. Nutr. 134(4), 980S - 988S). Esto podrla hacer que los peptidos que de forma individual no presentan actividad antihipertensiva no pierdan su bioactividad al administrarse de forma conjunta con otros peptidos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un cromatograma de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa del sobrenadante activo que se obtiene tras la centrifugation y ultrafiltracion, a traves de un membrana de 3.000 Da de tamano de poro, del hidrolizado 1 obtenido por hidrolisis enzimatica con Protamex®, 2h, a 50°C a partir de polvo de GPP. F.1 - F.8 corresponden a las ocho (8) fracciones recogidas.

La Figura 2 son dos cromatogramas de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa de las dos (2) fracciones mas activas (F.3 (A) y F.6 (B)) que se obtuvieron de la primera separation por HPLC del hidrolizado 1 de polvo de GPP, y el fraccionamiento realizado en cada una de ellas. En concreto, se recogieron seis (6) subfracciones de la F.3 (F.3.1-F.3.6) y ocho (8) subfracciones de la F.6 (F.6.1-F.6.8).

La Figura 3A es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial sistolica (PAS) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra

1,5 mL de agua (•), 5 mL/kg del hidrolizado 1 de polvo de GPP (Protamex®, 2h, a 50°C) (▲), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administration. Los datos representan la media ± ESM para un mlnimo de seis (6) animales. Salvo indication en contrario, todas las dosis indicadas en la presente solicitud se refieren al peso corporal del animal.

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La Figura 3B es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial diastolica (PAD) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra 1,5 mL de agua (•), 5 mL/kg del hidrolizado 1 de polvo de GPP (Protamex®, 2h, a 50°C) (A), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 4A es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial sistolica (PAS) obtenida en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY) que son el control normotenso de las ratas SHR a las que se administra 1,5 mL de agua (•) o 5 mL/kg de hidrolizado 1 de polvo de GPP (Protamex®, 2h, a 50°C) (A), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 4B es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial diastolica (PAD) obtenida en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY) que son el control normotenso de las ratas SHR a las que se administra 1,5 mL de agua (•) o 5 mL/kg de hidrolizado 1 de polvo de GPP (Protamex®, 2h, a 50°C) (A), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 5A es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial sistolica (PAS) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra

1,5 mL de agua (♦), 5 mL/kg del hidrolizado 2 de polvo de GPP (Protamex®, 24h, a 50°C) (•), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 5B es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial diastolica (PAD) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra 1,5 mL de agua (♦), 5 mL/kg del hidrolizado 2 de polvo de GPP (Protamex®, 24h, a 50°C) (•), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

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La Figura 6A es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial sistolica (PAS) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra

1,5 mL de agua (♦), 5 mL/kg del hidrolizado 3 de polvo de GPP (Neutrase®, 2h, a 50°C) (•), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 6B es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial diastolica (PAD) obtenida en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) a las que se administra 1,5 mL de agua (♦), 5 mL/kg del hidrolizado 3 de polvo de GPP (Neutrase®, 2h, a 50°C) (o), o 50 mg/kg de Captopril (■), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de seis (6) animales.

La Figura 7 es una grafica que muestra la disminucion de la presion arterial sistolica (PAS) obtenida en ratas SHR espontaneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (•), 10 mg/kg del peptido de SEQ.ID.NO:2 (■), o 10 mg/kg del peptido de SEQ.ID.NO:4 (A), en funcion del tiempo pasado tras la administracion. Los datos representan la media ± ESM para un minimo de cinco (5) animales.

EJEMPLOS

Con la intencion de mostrar la presente invencion de un modo ilustrativo aunque en ningun modo limitante, se aportan los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Procedimiento de obtencion de polvo de GPP.

Se lavaron 15 kg de garras de patas de pollo (GPP) gallus gallus domesticus con agua y se trituraron en una trituradora industrial Cato utilizando una placa de corte de 8 mm. Este triturado se congelo en capas finas (1-1,5 cm) y se liofilizo durante 5 dias. El liofilizado se molio con una batidora Fagor modelo BV-850 y el molido obtenido se tamizo con un tamiz de tamano de poro de 2 mm. Se obtuvo asi un polvo fino con tamano de particula <2 mm y un contenido de humedad <5 % (polvo de GPP). El polvo de GPP que presento un porcentaje de humedad superior al indicado se volvio a liofilizar o se dejo secar en una estufa a 50°C durante 15 h. Posteriormente, se guardo

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a -20°C en botes cerrados y rodeados de silica gel para evitar un aumento de la humedad de las muestra.

Ejemplo 2. Procedimiento de obtencion de hidrolizados a partir del polvo de GPP, sin pretratamiento.

En un tubo de plastico de fondo redondo se peso 0,1 g de polvo de GPP se le anadio

4,5 mL de agua destilada y se agito en el vortex durante 20 seg. El pH inicial de estas muestras estaba comprendido entre 6 y 9. Posteriormente, se le anadio la enzima en un volumen de 0,5 mL a una concentration de enzima/protelna de 0,4 AU (Unidades Anson), y de 80 LAPU en el caso de Flavourzyme®. Se probaron 4 tipos de enzimas Alcalase® 2,4 L, Neutrase® 0,8 L, Protamex® y Flavourzyme® 1000 L (Novozyme) por separado. Estas enzimas tienen actividades diferentes (2,4; 0,8; 1,5 AU/g y 1000 LAPU/g, respectivamente) por lo que el volumen anadido de enzima vario dependiendo de la enzima y de la concentracion de enzima/protelna ensayada. Se preparo as! una disolucion en agua destilada con una concentracion de enzima tal que al tomar 0,5 mL de esta disolucion tuviera la concentracion de enzima/protelna necesaria para realizar la hidrolisis. De esta manera se unifico el volumen final a anadir de todas ellas (0,5 mL). La enzima Protamex®, de venta en estado solido, se reconstituyo en agua destilada a la concentracion deseada antes de anadlrsela al polvo de GPP. Una vez anadida la enzima, el pH de las mezclas se ajusto a 7. Las hidrolisis se realizaron a 25 o 50°C en agitation constante a 250 rpm en orbital, durante 2, 4 o 24 h. Como control se tomaron muestras en las que el tiempo de hidrolisis fue de 0 h. Finalizada la hidrolisis, las enzimas se inactivaron por calor en un bano de agua a 85°C durante 10 min. Las muestras se enfriaron en hielo durante 10 min y se centrifugaron a 10000 x g, 20 min, 4°C. Los sobrenadantes obtenidos son los hidrolizados, que se filtraron con filtros de 0,45 pm y congelaron a -20°C.

Ejemplo 3. Procedimiento de obtencion de hidrolizados a partir del polvo de GPP, con pretratamiento.

En otras muestras, una vez obtenido el polvo de GPP se procedio a un pretratamiento de la protelna con cambios de pH y de temperatura. En tubos de plasticos de fondo redondo se pesaron 0,1 g de polvo de GPP, se les adiciono un volumen de agua destilada y se les ajusto el pH a 3, 7,5 o 10 con NaOH (0,1 M) o HCl (0,1 M) para un volumen final de 4 mL, con la condition de que el pH final de la muestra fuera al menos un valor de 0,5 distinto del valor inicial determinado en el Ejemplo 2.

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Posteriormente, los tubos se introdujeron en un bano de agua a una temperatura de 50 o 100°C, y se dejaron en agitacion 90 min. Transcurrido este tiempo, las muestras pretratadas a 100°C se dejaron enfriar hasta 50°C, se ajusto el pH del caldo obtenido a 7 con HCl 0,1M o NaOH 1 M, en todos los casos y se procedio entonces a realizar la hidrolisis enzimatica. Tras este pretratamiento, a las muestras de GPP obtenidas se les anadieron 0,5 mL de una disolucion de enzima Alcalase® 2,4 L, Neutrase® 0,8 L, Protamex® o Flavourzyme® 1000 L, a una concentration de enzima/protelna de 0,4 AU, y de 80 LAPU en el caso de Flavourzyme®. La preparation de la disolucion de la enzima se realizo de igual forma que en el ejemplo anterior. El volumen final de reaction en todos los casos tambien fue de 5 mL por lo que se ajustaron los volumenes con agua destilada. Una vez anadida la enzima, el pH de las mezclas se ajusto a 7. Las hidrolisis se realizaron a 25 o 50°C en agitacion constante a 250 rpm en orbital, durante 2, 4 o 24 h. Como control se tomaron muestras en las que el tiempo de hidrolisis fue de 0 h. Finalizada la hidrolisis, las enzimas se inactivaron por calor en un bano de agua a 85°C durante 10 min. Las muestras se enfriaron en hielo durante 10 min y se centrifugaron a 10000 x g, 20 min, 4°C. Los sobrenadantes obtenidos son los hidrolizados, que se filtraron con filtros de 0,45 mm y se congelaron a -20°C.

Ejemplo 4: Selection de los hidrolizados obtenidos a partir del polvo de GPP de acuerdo a su actividad IECA

Con el fin de seleccionar los hidrolizados de polvo de GPP (sobrenadantes filtrados) con actividad IECA se les realizo la determination de la citada actividad como se describe en el Ejemplo 5, desechando aquellos hidrolizados con actividad inferior al 80% cuando se ensayaba el hidrolizado diluido a la mitad. Solo se seleccionaron los hidrolizados cuyo sobrenadante diluido a la mitad mostraba un porcentaje de inhibition mayor del 80%, que resultaron ser cuarenta (40) hidrolizados. Como muestra de la variabilidad de porcentajes de actividades IECA mostrada por los hidrolizados obtenidos, en la Tabla I se recogen la actividad IECA de veintiocho (28) de ellos. En concreto, se muestran los resultados correspondientes a una hidrolisis con una dosis fijada de enzima de 0,4 AU para Alcalase , Neutrase , y Protamex y 80 LAPU para Flavourzyme y un tiempo y temperatura de hidrolisis tambien fijos de 24 horas y en el que varla unicamente el pretratamiento, comparandose muestras sin pretratamiento respecto de muestras a las que se han aplicado diferentes pretratamientos durante 90 min (diferentes pH: 3, 7,5 y 10 y diferentes temperaturas: 50 y 100°C). Los hidrolizados obtenidos a temperatura de hidrolisis de 25°C no resultaron interesantes

independientemente de las condiciones de pretratamiento, tal como muestran los valores de IC50 obtenidos en cada caso (Tabla I).

Tabla I. Actividad IECA (%) de hidrolizados de polvo de GPP obtenidos con 5 Alcalase®, Neutrase®, Protamex® (0,4 AU) y Flavourzyme® (80 LAPU) a 25°C

durante 24 h sin y con tratamiento previo a la hidrolisis durante 90 min a 50°C (A) o 100°C (B).

A

Enzima: Sin ' pretratamiento Tratamiento previo hidrolisis (90 min, 50°C)

pH 3: IECA (%) pH 7,5 pH 10 pH 3 1C50 (mL) pH 7,5 pH 10

Alcalase®: 19,51 70,61 29,57 63,86 N.D N.D N.D

Neutrase®: 37,10 88,82 85,43 79,53 1,62 1,82 2,40

Protamex®: 65,76 89,74 57,33 74,34 2,79 N.D 2,38

Flavourzyme®: 20,20 70,24 32,73 26,49 N.D N.D N.D

10 n= 6 por cada muestra N.D: No determinado

B

Enzima: Tratamiento previo hidrolisis (90 min, 0 0 0 O

pH 3: IECA (%) pH 7,5 pH 10 pH 3 IC50 (mL) pH 7,5 pH 10

Alcalase®: 83,52 83,66 86,92 1.88 1,45 1,86

Neutrase®: 87,93 91,49 91,46 1,49 1,40 1,69

Protamex®: 92,31 90,05 96,37 1,13 1,10 1,01

Flavourzyme®: 71,24 68,10 67,44 N.D N.D N.D

n= 6 por cada muestra 15 N.D: No determinado

En la Tabla II se muestran algunos de los hidrolizados con mejores actividades IECA obtenidos y la cantidad necesaria de sobrenadante necesario para producir una 20 disminucion enzimatica del 50% (IC50) expresada en pL/mL.

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Tabla II. Actividad IECA (porcentaje de inhibicion e IC50) de los hidrolizados de polvo de GPP con mayores inhibiciones, obtenidos con Neutrase® y Protamex® (0,4 AU) a 50°C durante 0, 2, 4 y 24 h de hidrolisis.

: Tiempo Hidrolisis (h) Tratamiento previo hidrolisis (90 min, 100°C)

Enzima: pH3 IECA (%) pH 7,5 pH 10 pH3 icsd (mL) pH 7,5 pH 10

: 0 82,96 70,99 80,84 2,72 3,42 2,01

Neutrase®: 2 93,77 93,77 94,04 0,90 0,89 1,01

4: 101,57 91,40 91,79 0,99 1,26 1,44

: 24 91,03 93,02 93,13 0,98 0,83 1,10

Protamex®: 0 81,63 82,58 85,21 4,07 2,60 3,14

: 2 94,81 93,89 94,79 0,75 0,63 0,65

: 4 94,65 95,81 96,45 0,69 0,58 0,59

: 24 93,12 95,77 97,43 0,50 0,51 0,54

Se seleccionaron 3 hidrolizados como representantes de todos aquellos hidrolizados que mostraron un IC50 <1 pL.

• El hidrolizado obtenido con Protamex® durante 2 h a 50°C pH 7 con

pretratamiento previo a la hidrolisis de 100°C durante 90 min a pH 7,5

(IC50=0,63 pL de hidrolizado o 29 pg de protelna/mL de hidrolizado), al que

denominamos hidrolizado 1.

• El hidrolizado obtenido con Protamex® durante 24 h a 50°C pH 7 con pretratamiento previo a la hidrolisis de 100°C durante 90 min a pH 7,5 (IC50 =0,51 pL de hidrolizado o 9.56 pg de protelna/mL de hidrolizado), al que denominamos hidrolizado 2.

• El hidrolizado obtenido con Neutrase® durante 2 h a 50°C pH 7 con

pretratamiento previo a la hidrolisis de 100°C durante 90 min a pH 7,5 (IC50 =0,89 pL de hidrolizado o 46,27 pg de protelna/mL de hidrolizado), al que denominamos hidrolizado 3.

Ejemplo 5: Medida de la actividad IECA de los hidrolizados y peptidos

La medida de la actividad IECA se realizo segun el metodo descrito por Sentrandreu y Toldra (Sentrandreu, MN, y Toldra F. "A rapid simple and sensitive fluorescence method for the assay of angiotensin-I converting enzyme”. 2006. Food Chem. 97, 546-

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554) y modificado posteriormente por Quiros y col. (Quiros, A. y col. “Stability to gastrointestinal enzymes and structure-activity relationship of beta-casein-peptides with antihypertensive properties” 2009. Peptides, 30, 1848-1853). Es un metodo fluorimetrico en el que se utiliza como sustrato de la ECA la o-aminobenzoilglicil-p- nitrophenilalanilprolina (o-Abz-Gly-p-Phe(NO2)-Pro-OH). La fluorescencia generada por la liberacion del grupo aminobenzoilglicina se midio utilizando una longitud de onda de excitacion de 350 nm y una de emision de 420 nm. El porcentaje de inhibicion (% Inhibicion) se calculo aplicando la siguiente formula:

(Blanco) - (Blanco de muestra)

% Inhibicion = 1- ___________=_________________ x 100

(Control) - (Blanco de sustrato)

La concentracion de protefna de los hidrolizados para determinar el valor de IC50 se determino por el metodo Kjeldahl (FIL-IDF. “Milk. Determination of nitrogen content (Kjeldahl method). Standard 20B”. 1993. Int. Dairy Fed. Bruselas, Belgica) multiplicando el porcentaje de nitrogeno de la muestra por 6,25.

Ejemplo 6: Aislamiento, identificacion y sintesis de peptidos con actividad IECA

Se utilizaron equipos de cromatograffa liquida de alta eficacia (HPLC) analftica y semipreparativa, asi como un equipo de espectrometria de masas (MS) en tandem que permitio la secuenciacion de los peptidos. Se realizaron las etapas que se mencionan a continuacion.

6.A. Obtencion de la fraccion soluble del hidrolizado 1 de polvo de GPP Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 se obtuvieron 250 mL del hidrolizado proteico denominado hidrolizado 1, cuyo sobrenadante se centrifugo nuevamente en dispositivos de filtrado (Centripep, Amicon Inc) con membrana hidrofflica de 3000 Da de tamano de poro. El permeado (fraccion menor de 3000 Da) obtenido se recogio, liofilizo y guardo -20°C hasta su posterior fraccionamiento.

6.B Fraccionamiento por HPLC en fase reversa a escala semipreparativa El HPLC semipreparativo empleado fue de la serie 1260 de Agilent (Agilent Technologies) que consta de una bomba cuaternaria, un controlador de gradiente, un inyector, un detector de dispositivo de diodos (diode array), un colector de fracciones y

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un software de adquisicion y procesado de datos (Agilent OpenLab CDS ChemStation Edition for LC & LC/MS systems A.01.04).

Se disolvio en agua el permeado liofilizado obtenido en apartado 6A a una concentracion de 10 mg/mL y se procedio a la separacion de los peptidos por cromatografla en fase reversa utilizando una columna C18 (Europa peptide, 120 A°, 25 x 1.0 mm, 5 pm; Teknokroma). Los disolventes utilizados fueron una mezcla de agua: acido trifluoroacetico (1000:1) y acetonitrilo: acido trifluoroacetico (1000:0,8), disolventes A y B respectivamente, y la elucion se realizo a un flujo de 4 mL/min utilizando los siguientes gradientes en el orden de aparicion: 0 a 40 % del disolvente B en 50 min), 40-45 % de B en 1 min, 45-90 % de B en 4 min, 90-0 % de B en 1 min. El volumen de muestra inyectado fue de 750 pL y la absorbancia del disolvente se monitorizo a 214 nm.

Se recogieron 8 fracciones diferentes (Figura 1) denominadas F.1 - F.8 a partir del hidrolizado proteico denominado hidrolizado 1, las cuales se liofilizaron y se reconstituyeron en agua a diferentes volumenes. El contenido proteico de estas fracciones reconstituidas se determino por el metodo del acido bicinconlnico (BCA™ Protein Assay Kit, Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. A dichas fracciones se les determino la actividad IECA segun el protocolo descrito en el Ejemplo 5 (Tabla IV). A aquellas fracciones con un porcentaje de actividad IECA superior al 80 % se les determino el IC50, observandose que las fracciones con menor valores fueron la F.3 y la F.6, con 1,99 y 1,24 pg/mL de protelna, respectivamente.

Tabla IV. Contenido proteico, porcentaje de actividad IECA e IC50 de las fracciones obtenidas por HPLC en fase inversa a partir del permeado de tamano < 3000 Da obtenido del hidrolizado proteico denominado hidrolizado 1.

Fraccion: Concentracion de protelna (pg/mL) Actividad IECA (%) IC50 (pg/mL)

F.1: 59,38 66,88 ± 1,91

F.2: 126,18 93,07 ± 1,18 12,08

F.3: 30,56 80,45 ± 1,36 1,99

F.4: 31,43 69,64 ± 1,34

F.5: 37,61 80,33 ± 2,81 3,59

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F.6: 45,22 89,55 ± 0,80 1,24

F.7: 13,59 36,27 ± 4,05

F.8: 32,25 0

n=3 por fraccion

Las fracciones F.3 y F.6 con mayor actividad IECA se sometieron a un segundo fraccionamiento por HPLC en fase inversa a escala semipreparativa utilizando el mismo equipo, columna y disolventes pero eluyendo la muestra con un gradiente lineal del 10-20% del disolvente B en A en 40 minutos y del 20 al 30% del disolvente B en A en 40 minutos para F.3 y F.6, respectivamente. Se recogieron 6 subfracciones a partir de la fraccion F.3 (F.3.1, F.3.2, F.3.3, F.3.4, F.3.5, F.3.6) y 8 de la subfraccion F.6 (F.6.1, F.6.2, F.6.3, F.6.4, F.6.5, F.6.6, F.6.7, F.6.8) (Figura 2A y 2B). A todas estas subfracciones se les determino la actividad IECA siguiendo el metodo ya descrito en el Ejemplo 5 y la concentracion de protelna por el metodo BCA (BCATM Protein Assay Kit, Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante (Tablas V y VI). A aquellas fracciones con un porcentaje de actividad IECA superior al 75% se les determino tambien el IC50. A partir de estos resultados, se seleccionaron las subfracciones con un menor IC50, en concreto la F.3.3 y la F.6.6 con valores de IC50 de 0,83 y 0,86 pg/mL respectivamente. Ambas subfracciones eluian aproximadamente entre los minutos 12 y 16, utilizando el metodo de separacion descrito anteriormente (12,5-15,5 min y 13-14 min para F.3.3 y F.6.6, respectivamente). Las dos subfracciones, que contenlan peptidos con actividad IECA, se recogieron, liofilizaron y se mantuvieron a -20°C hasta la posterior identification de los peptidos responsables de dicha actividad.

Tabla V. Contenido proteico, actividad IECA e IC50 de las subfracciones obtenidas por HPLC en fase inversa a partir de la fraccion F.3.

Subfraccion: Concentracion de protelna (pg/mL) Actividad IECA (%) IC50 (pg/mL)

F.3.1: 36,06 67,68 ± 4,41 11,23

F.3.2: 42,25 82,37 ± 1,22 5,64

F.3.3: 20,96 91,75 ± 4,72 0,83

F.3.4: 19,93 81,45 ± 3,83 1,97

F.3.5: 65,07 81,56 ± 0,44 11,77

F.3.6: 38,03 72,99 ± 0,37 12,01

n= 3 por fraccion

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Tabla VI. Contenido proteico, actividad IECA e IC50 de las subfracciones obtenidas por HPLC en fase inversa a partir de la fraccion F.6.

F.6.1: 26,67 44,74 ± 2,15

F.6.2: 26,67 12,75 ± 0,05

F.6.3: 26,67 80,71 ± 4,29 6,24

F.6.4: 26,67 84,03 ± 1,99 4,73

F.6.5: 26,67 88,28 ± 2,81 3,90

F.6.6: 26,67 91,66 ± 0,86 0,86

F.6.7: 26,67 75,17 ± 6,18 4,62

F.6.8: 26,67 76,93 ± 1,55 5,01

n= 3 por fraccion

6.C. Identification de peptidos con actividad IECA por espectrometrla de masas en tandem (MS/MS)

Para la identificacion de los peptidos responsables de la actividad IECA de las subfracciones F.3.3 y F.6.6 obtenidas por HPLC semipreparativo a partir del hidrolizado 1 y posteriormente de las fracciones 3 y 6, respectivamente, se utilizo un espectrometro de masas LTQ Orbitrap Velos (ThermoFisher Scientific) dotado de una fuente de ionization nano (Proxeon) conectada on-line a un nano-HPLC Easy-LC (Proxeon, ThermoFisher Scientific). Para lo cual, se reconstituyeron en agua y se diluyeron las fracciones con TFA 0,1% hasta una concentration de protelna de 0,1 pg/pl. La separation de los peptidos de las fracciones se realizo utilizando una precolumna C18 EASY-Column, 2 cm, ID 100pm, 5 pm y una columna C18 EASY- Column, 10 cm, ID 75 pm, 3 pm, (Thermo Scientific) en la que se inyectaron 10 pL de las fracciones diluidas. Las fases moviles utilizadas fueron 0,1 % acido formico: 2% acetonitrilo (fase A) y 0,1 % de acido formico en 100 % de acetonitrilo (solvente B) y la velocidad del flujo fue de 400 nL/min. Para la fraccion F.3.3. Los gradientes utilizados fueron: 0-45 % B en 80 min, de 45-100 % B en 20 min y 100 % B durante 10 min. Para la fraccion F.6.6 se utilizo un gradiente de 0-35 % B en 40 min, 35-100 % B en 10 min y 100 % B durante 10 min.

Todos los espectros de masas se adquirieron en modo ion positivo. El escaner (m/z 50-2000) se adquirio con un valor dirigido de 1000000 en una resolucion de 30000 a 400 m/z y los 20 iones mas intensos se seleccionaron para fragmentation de disociacion inducida por colision en el LTQ con un valor dirigido de 10000 y una 5 energla de colision de 35 %. Para la identification de las secuencias peptldicas se utilizo el programa Proteome Discoverer 1.4.288 (Thermo) con MASCOT 2.4.1.0 y se realizo la busqueda de las secuencias en una base de datos de protelnas de pollo en las que se inclulan 25992 secuencias (IPI_chicken_3.81). Se identificaron los peptidos que se recogen en la Tabla VII.

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Tabla VII. Peptidos identificados en las subfracciones F.3.3 y F.6.6

Subfraccion: SEQ. ID. NO: Masa Teorica Masa experimental

F.3.3: 1 1146,38 1162,60

F.3.3: 2 1162,38 1162,60

F.3.3: 3 1211,39 1211,62

F.3.3: 4 1075,17 1075,47

F.6.6: 5 647 647,36

F.6.6: 6 746,91 747,44

F.6.6: 7 622 640,44

F.6.6: 8 1106,58 1107,59

F.6.6: 9 1068 1068,53

15 6.D Sintesis de los peptidos con actividad IECA

Los peptidos de la invention se enviaron a sintetizar qulmicamente a Caslo ApS (Lyngby, Dinamarca) y se obtuvieron preparados con los siguientes valores de pureza: SEQ.ID.NO:1 = 99,68%, SEQ.ID.NO:2 = 90,19%, SEQ.ID.NO:3 = 98,09%,

SEQ.ID.NO:4 = 99,10%, SEQ.ID.NO:5 = 99,33%, SEQ.ID.NO:6 = 99,71%,

20 SEQ.ID.NO:7 = 99,71%, SEQ.ID.NO:8 = 99,64% y SEQ.ID.NO:9 = 98,39%.

Una vez sintetizados se les determino la actividad IECA con el fin de conocer cual o cuales de los peptidos identificados en las subfracciones F.3.3 y F.6.6 eran el o los responsables de dicha actividad en las fracciones. En la Tabla VII se muestra los

resultados obtenidos en la determination de la citada actividad representada como IC50 (pM)..

Tabla VIII. Valores de IC50 de los peptidos identificados de 5 las subfracciones F.3.3 y F.6.6 con mejor actividad IECA

obtenidas del hidrolizado antihipertensivo denominado hidrolizado 1

Subtraction: Peptido IC50 (pM)

F.3.3: SEQ.ID.NO: 1 29,71

F.3.3: SEQ.ID.NO: 2 11,01

F.3.3: SEQ.ID.NO: 3 >137,6

F.3.3: SEQ.ID.NO: 4 44,75

F.6.6: SEQ.ID.NO: 5 >515,4

F.6.6: SEQ.ID.NO: 6 80,91

F.6.6: SEQ.ID.NO: 7 7,06

F.6.6: SEQ.ID.NO: 8 >150

F.6.6: SEQ.ID.NO: 9 >150

n= 4 por peptido

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La medida de la actividad IECA de los peptidos sintetizados mostro que de los 9 peptidos ensayados, 5 de ellos presentaron la citada actividad, observandose concentraciones de IC50 inferiores a 100 pM. En concreto, los peptidos identificados como SEQ.ID.NO:2 y 7 fueron los que presentaron mayor actividad IECA (menor valor 15 IC50), que estaban presentes en las subfracciones F.3.3 y F.6.6, respectivamente.

Ambos se seleccionaron para determinarles su actividad antihipertensiva en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) y en ratas Wistar-Kyoto (WHY).

Ejemplo 7: Medida de la actividad antihipertensiva en ratas del hidrolizado 1 de 20 polvo de GPP.

Se selecciono el hidrolizado obtenido con Protamex 2h a 50°C con pretratamiento de 100°C, pH 7.5 durante 90 min, ya que presentaba una buena actividad IECA, para estudiar el efecto de este hidrolizado sobre la PA en ratas espontaneamente hipertensas (SHR) y en ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de

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las ratas SHR. El hidrolizado proteico de polvo de GPP denominado hidrolizado 1 se preparo segun el procedimiento descrito en el Ejemplo 4.

Para realizar estos estudios, se utilizaron ratas macho SHR y WKY de 17-20 semanas de vida y peso comprendido entre 300 y 360 g, procedentes de Charles River Laboratories Espana S.A. Las ratas permanecieron con una temperatura ambiental estable de 23°C, y con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposition. La medida de la PA en estos animales se llevo a cabo con una modification de la tecnica del manguito en la cola (tail-cuff), originalmente descrita por Bunag (Bunag RD. “Validation in awake rats of a tail-cuff method for measuring systolic pressure”. 1973. J. Appl. Physiol. 34, 279-282). En el presente ejemplo se evaluaron la modificacion de la presion arterial sistolica (PAS) y de la presion arterial diastolica (PAD) producida por la administration aguda del hidrolizado proteico obtenido a partir de polvo de GPP. Antes de colocar el manguito en la cola de las ratas, estas se exponlan a una temperatura proxima a los 37°C para facilitar la dilatation de la arteria caudal. Para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbraban al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo.

La administracion del hidrolizado 1 a ensayar se realizo por sonda intragastrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 h y las 10 h de la manana. Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenlan en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 192 y 212 mm Hg, y entre 140 y 180 mm Hg. Las ratas WKY utilizadas para el estudio tenlan en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 110 y 140 mm Hg, y entre 90 y 110 mm Hg. Se tomaron medidas de la PAS y de la PAD en los animales periodicamente, cada 2 horas, hasta 48 horas post-administracion de los productos a ensayar utilizando un medidor de PA para ratas modelo Le50001 (Letica). La cantidad de hidrolizado administrada fue de 5 mL/kg de peso corporal del animal. El procedimiento realizado en los animales fue aprobado por el Comite Etico de la Universitat Rovira i Virgili.

Como control negativo para establecer la variacion circadiana de la PAS y de la PAD en ratas sondadas se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a las que se les administraba por sonda intragastrica 1,5 mL de agua. Como control positivo para establecer el efecto sobre la PAS y sobre la PAD de un farmaco IECA prototipo, tal como Captopril, se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD

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obtenidas en ratas a las que se les administraba por sonda intragastrica 50 mg /kg de Captopril. Esta dosis de Captopril se administraba a cada rata en un volumen de 1,5 mL.

Los resultados obtenidos se agruparon y se obtuvo la media ± el error estandar de la media (ESM) para un mlnimo de 6 ensayos homogeneos. Los datos de los tres grupos de animales se compararon en un analisis de la varianza de 2 vlas (ANOVA) utilizando el test de Tukey en cada tiempo de post-administracion con el programa estadlstico SPSS (IBM SPSS Statistics software version 20.0) y se considero significativa la diferencia para valores de p<0,05.

Las Figuras 3A y 3B muestran, respectivamente, la disminucion de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administration de hidrolizado de polvo de GPP con Protamex®, 2h, a 50°C (hidrolizado 1). Dichas figuras incluyen, ademas, la disminucion de la PAS y de la PAD observada tras la administracion de Captopril. Como era previsible, el Captopril produjo una pronunciada disminucion de la PAS y de la PAD en las ratas SHR. La disminucion de la PAS y de la PAD fueron maximas a las 6 horas despues de la administracion del farmaco. Este hidrolizado de polvo de GPP produjo una disminucion significativa de la PAS y de la PAD en los animales a las 6 horas despues de su administracion que fue significativamente igual a la producida por el Captopril en ese mismo tiempo. A partir de las 2 horas del consumo del hidrolizado comienza a disminuir la PAS y la PAD de los animales tratados pero esta bajada de presion no fue significativamente diferente a la producida por ratas no tratadas hasta llegar a las 6 horas. Los valores de la PAS y de la PAD observados 24 horas despues de las distintas administraciones eran semejantes a los que tenlan los animales antes de las mismas.

Las Figuras 4A y 4B muestran respectivamente los cambios de la PAS y de la PAD obtenidos en ratas WKY a distintos tiempos, tras la administracion del hidrolizado 1 de polvo de GPP. Puede apreciarse que el hidrolizado no modifico ni la PAS ni la PAD de los animales tratados. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables en el hidrolizado ensayado sobre la PA de sujetos normotensos.

Ejemplo 8: Medida de la actividad antihipertensiva en ratas del hidrolizado 2 de polvo de GPP

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La determination de la actividad antihipertensiva in vivo en ratas SHR del hidrolizado obtenido de polvo de GPP denominado hidrolizado 2 (Hidrolisis con Protamex® 24h a 50°C con pretratamiento de 100°C, pH 7.5 durante 90 min) se realizo siguiendo el metodo y procedimiento descrito en el ejemplo 7. La concentration ensayada del hidrolizado fue 5 mL/kg y tambien se ensayaron agua (1,5 mL) y captopril (5 mg/kg) como controles negativo y positivo, respectivamente.

Las Figuras 5A y 5B muestran la variation de la PAS y de la PAD, respectivamente, de ratas SHR tras la administration via intragastrica del hidrolizado 2, de agua y de captopril a las dosis anteriormente citadas. Estas curvas de PA muestran como a medida que transcurre el tiempo desde que el animal ingirio el hidrolizado 2 fue disminuyendo tanto la PAS como la PAD hasta alcanzar la maxima bajada a las 8h de post-administration (26 y 34 mm HG, respectivamente). Posteriormente, el efecto antihipertensivo comienza a revertir. Los efectos observados sobre la PA tras la administration de agua o captopril son los esperados como se describen en el ejemplo 7.

Ejemplo 9: Medida de la actividad antihipertensiva en ratas del hidrolizado 3 de polvo de GPP.

La determination de la actividad antihipertensiva in vivo en ratas SHR del hidrolizado obtenido de polvo de GPP denominado hidrolizado 3 (Hidrolisis con Neutrase® 24h a 50°C con pretratamiento de 100°C, pH 7.5 durante 90 min) se realizo siguiendo el metodo y procedimiento descrito en el ejemplo 7. La concentration ensayada del hidrolizado 3 fue 5 mL/kg y tambien se ensayaron agua (1,5 mL) y captopril (5 mg/kg) como controles negativo y positivo, respectivamente.

Las Figuras 6A y 6B muestran, respectivamente, la disminucion de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administration de hidrolizado de polvo de GPP con Neutrase®, 2h, a 50°C (hidrolizado 3). La ingesta del hidrolizado 3 mostro un efecto antihipertensivo a partir de las 2h de su administration oral, siendo maxima a las 6 h. Se observaron valores de bajada de PAS y PAD similares a los producidos por el farmaco captopril a esa hora. Las curvas de la PAS y PAD de las ratas SHR tratadas con agua y con captopril mostraron el efecto esperado como se describe en el ejemplo 7.

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Ejemplo 10: Medida de la actividad antihipertensiva en ratas de los peptidos con actividad IECA identificados en el hidrolizado 1 antihipertensivo

Una vez identificados los peptidos presentes en el hidrolizado antihipertensivo (Tabla VII) y de determinar cuales de ellos presentaban actividad IECA (Tabla VIM) se procedio a determinar la actividad antihipertensiva in vivo de los peptidos mas activos. Durante la digestion, los peptidos ingeridos se pueden hidrolizar por las proteasas del tracto digestivo y perder su actividad o bien no ser capaces de atravesar la barrera intestinal y por lo tanto no ser absorbidos. Es por ello que es necesario, realizar estudios in vivo para evaluar la actividad antihipertensiva de los mismos una vez son digeridos. El grado de hidrolisis producido por la digestion fisiologica de un determinado peptido va a depender de su tamano, de su naturaleza, y de la presencia de otros peptidos en el medio (FitzGerald y col., "Hipotensive peptides from milk proteins". 2004. J. Nutr. 134(4), 980S - 988S).

La actividad antihipertensiva de los peptidos que presentaron la mayor actividad IECA (SEQ.ID.NO:1, 2, 4, 6 y 7) se realizo en ratas macho SHR de 17-20 semanas de vida siguiendo el mismo metodo descrito en el Ejemplo 5. Las condiciones de mantenimiento y alimentacion de los animales fueron tambien las mismas a las descritas en el Ejemplo 7. De igual manera, se utilizaron como control negativo y positivo, agua y captopril (50 mg/kg), respectivamente y en el caso de los peptidos, se testaron individualmente, administrandole a cada animal un volumen de 1,5 mL del peptido disuelto en agua a una concentracion de 10 mg/kg, ya que dicho volumen era equiparable al volumen de hidrolizado 1 que recibla cada animal. Estos peptidos se sintetizaron qulmicamente como se describe en el apartado 4D.

Los resultados obtenidos se agruparon y se obtuvo la media ± el ESM para un mlnimo de 5 ensayos homogeneos. Los resultados mas prometedores fueron los obtenidos con los peptidos denominados como SEQ.ID.NO: 2 y 4. Los datos de los tres grupos de animales (tratados con agua, con el peptido SEQ.ID.NO:2 y con el peptido SEQ.ID.NO:4) se compararon en un analisis de la varianza de 2 vlas (ANOVA) y de 1 via, en este ultimo caso, para comprobar el efecto de los peptidos sobre la PA a las horas de estudio (0, 2, 4, 8 y 24 h) de forma individual. En ambos casos se utilizo el test de Tukey y los analisis se realizaron con el programa estadlstico SPSS (IBM SPSS Statistics software version 20.0). Se considero significativa la diferencia para valores de p<0,05.

Segun los resultados que se muestran en la Figura 7 la ingesta de los peptidos SEQ.ID.NO:2 y 4 produjo una disminucion de la PAS, a las 4 6 6 h despues de su administration, respectivamente. En ambos casos, la maxima bajada se produjo a las 5 6 h despues de su administracion, observandose un efecto antihipertensivo

significativamente superior (P<0,01) con el peptido de SEQ.ID.NO:4. La PAS recupero sus valores iniciales a las 8 o 24 horas posteriores a su ingesta.

Las administraciones individuales de los peptidos SEQ.ID.NO:1, 6 y 7 a las ratas SHR 10 no produjeron una significativa disminucion de la PAS (datos no mostrados).

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtencion de un hidrolizado enzimatico con actividad antihipertensiva, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) triturar garras de pata de pollo y liofilizar para obtener un material en polvo con tamano de partlcula <2 mm;

b) ajustar una disolucion acuosa del polvo anterior a un pH entre 3 y 10, y calentar entre 80 y 120°C durante entre 60 y 90 min,

con la condicion de que dicho valor de pH sea distinto del correspondiente al material en polvo de la etapa anterior en al menos 0,5;

c) enfriar la disolucion anterior a una temperatura entre 45 y 55°C y realizar una hidrolisis enzimatica durante un tiempo de entre 1 y 24 h con enzimas proteollticas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens identificadas como E.C. 3.4.21.62 y 3.4.24.28;

d) evaluacion de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina segun el metodo descrito en Sentandreu, MN y Toldra F.
2006. Food Chem. 97, 546-554; y

e) selection de un hidrolizado con actividad > 80% en disolucion acuosa al 50% v/v a partir de la evaluation anterior.
2. Un procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, caracterizado por que el tiempo de hidrolisis de la etapa c) es de entre 2 y 24 h.
3. Un procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) triturar garras de pata de pollo y liofilizar para obtener un material en polvo con tamano de partlcula <2 mm;

b) ajustar una disolucion acuosa del polvo a un pH de 7,5 y calentar a 100°C durante 90 min, en que dicho pH de 7,5 es distinto del correspondiente al material en polvo de la etapa anterior en al menos un valor de 0,5;

c) enfriar la disolucion anterior a una temperatura de 50°C e hidrolizar durante un tiempo de 2 o 24 h con enzimas proteollticas obtenidas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens identificadas como E.C.
3.4.21.62 y 3.4.24.28;

d) evaluacion de la actividad inhibidora de enzima convertidora de angiotensina segun el metodo descrito en Sentandreu, MN y Toldra F.
2006. Food Chem. 97,546-554; y

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e) selection de un hidrolizado con actividad > 80% en dilution acuosa al 50% v/v a partir de la evaluation anterior.
4. Hidrolizado enzimatico caracterizado por que comprende los peptidos identificados por SEQ.ID.NO:1-9 o sales de los mismos.
5. Uso del hidrolizado enzimatico de la reivindicacion 4, en la preparation de un medicamento para el tratamiento de la hipertension en un sujeto.
6. Uso de acuerdo a la reivindicacion 5, caracterizado por que dicho sujeto es humano.
7. Composition farmaceutica que comprende un hidrolizado enzimatico que contiene los peptidos identificados por SEQ.ID.NO:1-9 o sales de los mismos, y excipientes farmaceuticamente aceptables,

en que dicha composicion esta en forma llquida o jarabe.
8. Peptido identificado por una de las secuencias SEQ.ID.NO:2 o 4.
9. Uso de un peptido identificado por las SEQ.ID.NO:2 o 4 o sales de los mismos, o la combination de ellos en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de hipertension.
10. Composicion farmaceutica que comprende un peptido identificado por la secuencia SEQ.ID.NO:2 o 4 o sales de los mismos o la combinacion de ellos, y excipientes farmaceuticamente aceptables.
11. Suplemento alimenticio que comprende un peptido identificado por la secuencia SEQ.ID.NO:2 o 4 o sales de los mismos o la combinacion de ellos, y aditivos alimentarios.