JP2023551318A - 新規のアンジオテンシンｉ－変換酵素（ａｃｅ）阻害ペプチド - Google Patents

新規のアンジオテンシンｉ－変換酵素（ａｃｅ）阻害ペプチド Download PDF

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Abstract

本開示は、アルカリプロテアーゼサブチリシンを使用する魚肉の加水分解によるＡＣＥ阻害活性を有する魚由来ペプチド、および魚由来ペプチドを含むペプチド単離物、を製造する方法を提供する。本開示はまた、ペプチド単離物を含む医薬製品、栄養補助食品、および機能性食品、ならびに１つ以上の魚由来ペプチドを、対象に投与することによって、対象の血圧を低下させる方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明
〔背景〕
〔技術分野〕
本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する魚由来ペプチドの調製方法に関する。それは、医薬製剤、栄養補助食品中の活性成分として、または食品成分として使用され得る。
〔関連技術の説明〕
高血圧（hypertension）または高血圧（high blood pressure）は、収縮期血圧≧１４０ｍｍＨｇおよび拡張期血圧≧９０ｍｍＨｇとして定義される。高血圧は、最も共通の深刻な慢性健康状態と考えられており、脳卒中、冠動脈疾患、心不全、心房細動、および末梢血管疾患を含む心血管疾患（ＣＶＤ）の主要なリスク因子の１つである。高血圧の世界的な有病率は、２０２５年に１５億８０００万人までの成人患者が高血圧に罹患すると予想される（ＷＨＯ、２０１１年）。今日、高血圧は主に、生活様式の修正および降圧薬を用いた薬理学的治療によって治療されている（Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ、２０００年）。高血圧の原因は多く存在するが、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１５．１）であるアンジオテンシンＩ－変換酵素（ＡＣＥ）が、哺乳類における血圧の調節、ならびに体液と塩とのバランスのためのレニン－アンジオテンシン系およびカリクレイン－キニン系において、重要な役割を果たすことがよく知られている（Ｖｅｒｃｒｕｙｓｓｅら、２００５年）。アンジオテンシンＩ－変換酵素は、レニンアンギオテンシン系を介して、不活性デカペプチドアンギオテンシンＩから強力な血管収縮アンギオテンシンＩＩへと、ジペプチドＨｉｓ－Ｌｅｕを切断することによって血圧を上昇させる。さらに、アンジオテンシンＩ－変換酵素はまた、カリクレイン－キニン系を介して、血管拡張薬ブラジキニンを不活性ペプチドに変換する（Ｗａｎｇら、２００８年）。したがって、ＡＣＥ阻害活性は、高血圧を有する患者の死亡率を低下させる主要な標的である。食物由来ペプチドのＡＣＥ阻害能は、高血圧の治療に一般的に使用される薬物ほど大きくはないが、食物タンパク質源由来であることはもちろんのこと、薬物と比較して副作用が無く、より効き目が穏やかであり、より安全であると考えられる。したがって、食物タンパク質由来のＡＣＥ阻害ペプチドは、高血圧を予防するための、ならびに治療目的のための、新規の生理学的な機能性食品の開発において非常に有望である。
これまで、ますます多くの数のＡＣＥ阻害ペプチドが、動物タンパク質および植物タンパク質から調製されたタンパク質加水分解物において検出されている（ＩｗａｎｉａｋおよびＤｚｉｕｂａ、２００９年；ＭｕｒｒａｙおよびＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ、２００７年）。その中で、魚の筋肉タンパク質がＡＣＥ阻害ペプチドの優れた供給源であることは十分に確立されている（Ｃｈａｒｏｅｎｐｈｕｎ、Ｙｏｕｒａｖｏｎｇ、およびＣｈｅｉｒｓｉｌｐ、２０１３年；Ｃｈｅｎ、Ｗａｎｇ、Ｚｈｏｎｇ、Ｗｕ、およびＸｉａ、２０１２年；Ｗｉｊｅｓｅｋａｒａ、Ｑｉａｎ、Ｒｙｕ、Ｎｇｏ、およびＫｉｍ、２０１１年）。さらに、構造活性相関にアクセスするために、様々なタンパク質加水分解物に由来するＡＣＥ阻害ペプチドを同定し、特徴付ける試みが増加している。しかし、ＡＣＥ阻害ペプチドの構造活性相関は、異なるアミノ酸配列を有する多種多様なＡＣＥ阻害ペプチドが同定されているため、まだ確立されていない。これまでに、ＡＣＥ阻害活性および降圧活性を示す魚ペプチドが得られている。Ｎａｋａｊｉｍａら（２００９年）は、ペプシン、パンクレアチン、およびサーモリシンを用いて、タイセイヨウサケ、ギンザケ、スケトウダラ、およびミナミダラを含む魚由来の魚タンパク質加水分解物のＡＣＥ阻害活性を評価した。ＡＣＥは、サーモリシンで加水分解されたタイセイヨウサケおよびギンザケによって、それぞれ０．０７８ｍｇ／ｍＬおよび０．１３８ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値で阻害された。Ｗｕら（２００８年）は、プロテアーゼＳＭ９８０１１消化で得られたサメ肉の加水分解物が、未処理のサメスラリー（１０．５ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値）と比較して、高いＡＣＥ阻害活性（０．４ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値）を示したことを報告した。ＣＦ、ＥＹ、およびＦＥの配列は、それぞれ１．９６μＭ、２．６８μＭ、および１．４５μＭのＩＣ５０値を有する新規のＡＣＥ阻害ペプチドであることが確認された。これらは全てジペプチドであり、Ｃ末端の位置に疎水性アミノ酸残基のＰｈｅまたはＴｙｒを有する。Ｂａｌｔｉら（２０１０年）は、イカ（Ｓｅｐｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の筋肉加水分解物から単離されたＶＹＡＰ（配列番号１）、ＶＩＩＦ（配列番号２）およびＭＡＷ（それぞれ、６．１μＭ、８．７μＭおよび１６．３２μＭのＩＣ５０値）の配列のＡＣＥ阻害活性を示した。
消化管（ＧＩ）消化は、ＡＣＥ阻害ペプチドの生物学的利用能において、特に重要である。経口摂取の後、消化管酵素はペプチドを分解し、それによってそれらの活性を増加または減少させ得る。インビトロ消化モデルの目的は、口腔内、胃内、および小腸内で行われる消化プロセスを、単純な方法で模擬実験することである。消化管プロセスの後に生物活性および安定性を維持することができるＡＣＥ阻害ペプチドが必要とされている。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、脱イオン水で溶出された生の濃肉（ＲＤＭ）の加水分解物のサイズ排除クロマトグラムである。
図２は、分離されたペプチド画分の１ｍＭロイシン当量と同じ濃度でのＡＣＥ阻害活性を示す。
図３は、０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮで溶出された画分Ｂのクロマトグラムである。
図４は、０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮで溶出された画分Ｂ６のクロマトグラムである。
図５は、合成ペプチドＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）のα－アミノ基含有量に対するインビトロ消化管（ＧＩ）消化の効果を示す。
図６は、合成ペプチドＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）のＡＣＥ阻害活性に対するインビトロ消化管（ＧＩ）消化の効果を示す。
〔詳細な説明〕
本開示は、ＡＣＥ阻害活性を有する魚由来ペプチド、魚由来ペプチドを含むペプチド単離物、およびペプチド単離物を製造する方法を提供する。また、本明細書において、魚由来ペプチドを含む医薬製品、栄養補助食品、および機能性食品、ならびに魚由来ペプチドを使用して血圧を低下させる方法も提供される。
本明細書に提供される実施例において実証されるように、本開示の魚由来ペプチドは、強力なアンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有する。特に、最も強力なＡＣＥ阻害能を示す３つのペプチドは、０．２７μｇ／ｍｌ（または０．２４μＭ）のＩＣ５０を有するＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（配列番号５）、０．８９μｇ／ｍｌ（または０．９５μＭ）のＩＣ５０を有するＶＳＶＶＱＹＳＲ（配列番号４）、および０．９３μｇ／ｍｌ（または１．２４μＭ）のＩＣ５０を有するＮＬＬＰＨＲ（配列番号３）である。これらの３つの新規のペプチドは、報告されているＡＣＥ阻害のためのＡＣＥ阻害ペプチドおよび市販の栄養補助食品と比較して、ＡＣＥ阻害のためのより強力な可能性を有する。さらに、魚由来ペプチドＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（配列番号５）の消化管消化は、ＶＩＹ、ＶＩＹＳＲ（配列番号６）、ＩＮＣＲ（配列番号７）、およびＳＲＩＮＣＲ（配列番号８）を含むペプチドを製造する。ＡＣＥ阻害活性を有する魚由来ペプチド（これらのペプチドの消化管消化産物を含む）は、医薬製品、栄養補助食品、および機能性食品における血圧降下剤として使用され得る。
「魚由来ペプチド」は、魚から単離されたペプチド、または魚から単離されたペプチドの消化産物（例えば、消化管消化産物）を指す。魚は、硬骨魚類、ならびに軟骨魚類および無顎類の魚を含み、典型的には、幅広い尾ひれ、ひれ（存在する場合）の形態の肢、および酸素を供給するために胸部のえらを通して血液が送られる２つの室の心臓で終端する細長い形状の体を有する、冷血性の水生脊椎動物である。特定の実施形態では、魚は硬骨魚類である。硬骨魚類は、上綱硬骨魚類（Superclass Osteichthyes）の魚であり、淡水の硬骨魚類（例えば、マス、パーチ、ウォールアイ、カワカマス、ブリム、バス、コイ、および特定のサケ種など）を含む。塩水の硬骨魚類の例には、サケ（例えば、タイセイヨウサケ、マスノスケ、ベニザケ、ギンザケ、カラフトマス、およびシロザケ）、マグロ（例えば、水中から飛び上がる魚（skipjack）、クロマグロ、キハダ、およびビンナガマグロ）、タラ（例えば、タイセイヨウタラおよびマダラ）、オヒョウ、およびマヒマヒが含まれる。
特定の実施形態では、魚はマグロである。マグロは、サバ科（サバ類）のサブグループであるマグロ属に属する塩水の魚を指す。マグロ属は、以下の属を含む５つの属にわたって１５種を含む：細長いマグロとしても知られる、アロツナス（Allothunnus）；ヒラソウダとしても知られる、ソウダガツオ属（the genus Auxis）；小さなマグロとしても知られる、スマ属；カツオ（skipjack tunas）としても知られる、カツオ属（the genus Katsuwonus）；ならびに、ビンナガマグロおよび真のマグロ（true tunas）を含む、マグロ属。クロマグロとしても知られる、マグロ属亜属マグロ（マグロ）、およびキハダマグロとしても知られる、亜属マグロ（Neothunnus）。いくつかの実施形態では、マグロはカツオ属（すなわち、カツオ（skipjack tuna））である。
「魚肉」は、任意の種の魚の筋肉組織を指す。いくつかの実施形態では、肉は生である（すなわち、未調理である）。いくつかの実施形態では、肉は濃肉である。魚の濃肉は、調理時の魚肉の食感および風味に影響を与え得るミオグロビンのリッチな魚肉を指す。したがって、例えば、マグロの濃肉は一般に、その望ましくない風味および食感のために、マグロ加工において価値の低いマグロの副産物として考えられている。しかし、タンパク質またはペプチド抽出のための供給源として、マグロの濃肉は、その豊富さおよび低コストのために有利に位置する。
「ＡＣＥ阻害活性」は、アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の活性を阻害する能力を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の魚由来ペプチドまたは魚由来ペプチド単離物は、１００μｇ／ｍｌ以下のＡＣＥ阻害のＩＣ５０値を有する。ＡＣＥに対する阻害活性を測定する方法は、実施例５に記載の方法を含む。
いくつかの態様では、本開示はペプチド単離物を製造する方法を提供する。本方法は、魚肉を水と混合して水性混合物を製造する工程；前記水性混合物のｐＨを塩基性ｐＨ（すなわち、７を超えるｐＨ）に調整する工程；ならびに、前記水性混合物にアルカリ性プロテアーゼを添加すること、および加水分解物を製造するのに十分な条件下で前記水性混合物をインキュベートすることによって、前記魚肉を加水分解する工程を含み得る。
「ペプチド単離物」は、細胞もしくは組織に由来するペプチド抽出物もしくは精製ペプチド、または本明細書で定義される酵素加水分解を受けたペプチド抽出物もしくは精製ペプチド生成物を指す。
いくつかの実施形態では、水性混合物は、約１：１～約１：５の水に対する肉の比率を含む。いくつかの実施形態では、水性混合物は、約１：２～約１：５、１：２～約１：４、または約１：２～約１：３の水に対する肉の比率を含む。
いくつかの実施形態では、水性混合物は、約１％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖ（ｇタンパク質／ｍｌ水）の範囲のタンパク質濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性混合物は、約１％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖ、約５％（ｗ／ｖ）～約２０％（ｗ／ｖ）、または約５％（ｗ／ｖ）～約１５％（ｗ／ｖ）の範囲のタンパク質濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性混合物は、約１０％ｗ／ｖのタンパク質濃度を含む。タンパク質濃度は、当技術分野で公知の技術によって（例えば、２８０ｎｍ分光光度法で吸光度を測定することによって）測定することができる。
前述のように、本方法は、ｐＨを塩基性ｐＨ（すなわち、７を超えるｐＨ）に調整する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、塩基性ｐＨは、約７～約１１の範囲である。いくつかの実施形態では、塩基性ｐＨは、約７～約９、または約８～約８．５の範囲である。
前述のように、本方法は、水性混合物にアルカリ性プロテアーゼを添加すること、および加水分解物を製造するのに十分な伝導下で水性混合物をインキュベートすることによって、魚肉を加水分解する工程を含み得る。
「加水分解物」は、酵素加水分解の生成物を指す。酵素加水分解は、酵素の存在下、水の存在下での、（例えば、細胞または組織試料中での）化合物の分解である。加水分解物は、外因的に提供される酵素の添加に基づく酵素加水分解の生成物を指してもよく、または内因性酵素の酵素活性に基づく酵素加水分解の生成物を指してもよい。内因性酵素の酵素活性に基づく酵素加水分解は、自己分解と呼ぶことができる。
「プロテアーゼ」は、タンパク質をより小さなポリペプチドまたは単一のアミノ酸に分解するペプチド結合の分解であるタンパク質分解を触媒する酵素である。プロテアーゼは、７つの群に分類することができる：反応求核剤としてセリンアルコールを使用する、セリンプロテアーゼ；求核剤としてシステインチオールを使用する、システインプロテアーゼ；求核剤としてトレオニン第二級アルコールを使用する、トレオニンプロテアーゼ；アスパラギン酸カルボン酸を使用する、アスパラギン酸プロテアーゼ；グルタミン酸カルボン酸を使用する、グルタミン酸プロテアーゼ；金属、しばしば亜鉛を使用する、メタロプロテアーゼ；および脱離反応（水を必要としない）を行うためにアスパラギンを使用するアスパラギンペプチドリアーゼ。
「アルカリプロテアーゼ」は、アルカリ性ｐＨ（すなわち、７を超えるｐＨ）で酵素活性を有するプロテアーゼを指す。アルカリプロテアーゼは、多くの場合、約１１までの塩基性ｐＨで活性を有する。アルカリ性プロテアーゼの例には、プロテイナーゼＫ、スブチリシン、およびオリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、アルカリプロテアーゼは、セリンプロテアーゼを含む。「セリンプロテアーゼ」は、タンパク質中のペプチド結合を切断する酵素を指し、セリンは、（酵素の）活性部位で、求核性アミノ酸として働く。スブチリシンは、特定の土壌細菌（例えば、枯草菌およびリケニホルミス菌など）から得ることができるセリンプロテアーゼである。アルカラーゼ（Alcalaseis）は、リケニホルミス菌に由来するスブチリシンの市販の形態である。
いくつかの実施形態では、加水分解物を製造するのに十分な条件は、水性混合物をアルカリ性プロテアーゼと共に少なくとも約１時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、期間は、約２時間～約５時間の範囲である。
いくつかの実施形態では、加水分解物を製造するのに十分な条件は、水性混合物をアルカリ性プロテアーゼと共にインキュベートすることを含み、約４０℃～約７０℃の範囲の温度でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、加水分解ステップの後に、加水分解物から細胞残屑を除去するステップをさらに含む。
「細胞残屑を除去する」は、可溶性生成物（例えば、細胞抽出物からの上清など）の単離を指す。細胞残屑は、例えば、遠心分離および濾過によって除去され得る。いくつかの実施形態では、細胞残屑を除去することは、加水分解物を遠心分離および濾過して、上清を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、加水分解ステップは、加水分解物を生成するのに十分な条件下で水性混合物をインキュベートした後に、加水分解物を約８０℃～約１００℃の範囲の温度に加熱することによって、加水分解反応を停止させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、加水分解反応は、約１０分～約２０分の範囲の時間、約８０℃～約１００℃の範囲の温度で、加水分解物をインキュベートする工程を含む。例えば、加水分解物は、約９０℃に約１５分間加熱され得る。加水分解反応の終了後、加水分解物は４０℃未満の温度（例えば、約１０℃～約３０℃の範囲の温度）に冷却され得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、加水分解物をクロマトグラフィーに供するステップ、およびＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含む１つ以上のクロマトグラフィー画分を回収するステップをさらに含む。
「クロマトグラフィー」とは、混合物を、溶液もしくは懸濁液中、または蒸気（ガスクロマトグラフィー中）として、成分が異なる速度で移動する媒体中に通過させることによる混合物の分離を指す。サイズ排除クロマトグラフィーは、溶液中の分子が、分子のサイズ、および場合によっては分子量によって分離されるクロマトグラフィー法である。逆相クロマトグラフィーは、疎水性固定相を使用する任意のクロマトグラフィー法を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ペプチド単離物を酵素的に消化して、ペプチドの１つ以上の消化産物を製造するステップをさらに含む。
「酵素的に消化する」とは、酵素の活性に基づいて、高分子をより小さな化合物に分解することを指す。
いくつかの実施形態では、酵素的に消化することは、インシリコ消化管消化を含む。「消化管消化」は、消化管に天然に存在する酵素によって行われる酵素消化を指す。消化管に天然に存在する酵素の例には、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンが含まれる。インシリコ消化管消化は、消化管から単離された酵素を用いた、消化管外（例えば、試験管内など）の消化管酵素による酵素消化を指す。
いくつかの態様では、本開示が本明細書に記載のペプチド単離物と、さらなる成分（例えば、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤など）とを含む製剤化された製品を提供する。このような製品は対象に投与されてもよいし、または対象によって消費されてもよく、医薬製品（「医薬組成物」とも言う）および非医薬製品（例えば、栄養補助食品および機能性食品などの「非医薬組成物」とも言う）を含む。該製品の適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
製剤化された製品は、それが固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるべきかどうかに応じて、異なる種類のキャリア、賦形剤または希釈剤を含み得る。
本明細書に記載の製剤（および任意の追加の活性剤）は、静注、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹膜内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、口腔内、局所的に、局部的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入法）、注射、注入、持続注入、局在化された灌流水浴標的細胞を、直接的に、カテーテルを介して、洗浄によって、クリーム中、脂質組成物中（例えば、リポソーム）によって、または他の方法もしくは通常の当該技術分野（例えば、参照として本明細書に組み込まれている、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th EdMack Printing Company,1990を参照のこと）のうちの１つで知られている以下のいずれかの組み合わせによって、投与することができる。特定の実施形態では、製品は経口投与用に製剤化される。
医薬製品は、疾患、障害もしくは状態の治療において使用するための製品、または疾患、障害もしくは状態の１つ以上の症状を治療するための製品を指す。非医薬製品は、医薬製品以外の製剤（例えば、栄養補助食品または機能性食品など）を指す。
「機能性食品」（「栄養補助食品」とも呼ばれる）は、食品中に典型的にまたは伝統的に存在しない新しい成分（例えば、先に記載のような１つ以上のペプチド単離物）を組み込むことによって付与される追加の機能を有する食品を指す。
いくつかの態様では、本開示は、前述のペプチド単離物またはペプチド単離物を含む製剤化された製品を使用する方法を提供する。
「哺乳動物」には、ヒトならびに家畜（例えば、実験動物および家庭用ペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）など）の両方、ならびに野生生物などの非家畜が含まれる。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ある特定の実施形態では、哺乳動物はペット（例えば、イヌまたはネコなど）である。
前述の実施形態のいずれかによる「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象はヒトである。
「治療」、「治療すること」または「改善すること」は、症状を低減もしくは取り除くため、持続時間を短縮するため、または状態、疾患、もしくは障害の開始もしくは進行を遅らせるための、対象（例えば、患者）の状態、疾患、もしくは障害の医学的管理を指す。
「有効量」は、所望の生理学的変化（例えば、高血圧の低下など）を提供するペプチド単離物の量を指す。特定の実施形態では、有効量は治療有効量である。例えば、所望の生理学的変化は、疾患の症状の低減、または疾患の症状の重症度の低減であってもよく、または疾患の症状の進行の低減であってもよい。特定の実施形態では、所望の生理学的変化は、疾患の治療を伴わない。
特定の実施形態では、本方法は、対象における高血圧を低減することを含み、対象に前述のペプチド単離物、前述の医薬製品、または前述の栄養補助食品もしくは機能性食品を投与することを含む。
「高血圧（Hypertension）」は、高血圧（high blood pressure）を指す。心臓が拍動すると、動脈、静脈および毛管を含む、血管のネットワークを通って血液を押し出す圧力が生じる。これらの管を通って血液を押し出す圧力は、２つの力、すなわち、血液が心臓から循環系の一部である動脈内に送り出される時に生じる収縮期圧と、心臓が拍動間に静止するときに生じる拡張期圧との結果である。高血圧の治療方法は、上昇した血圧（elevated blood pressure）または高血圧（hypertension）を低下させること、および上昇した血圧または高血圧を発症する可能性を低下させることを含み得る。いくつかの実施形態では、上昇した血圧または高血圧は、収縮期の読み取り値について、少なくとも１ｍｍＨｇの低下、少なくとも５ｍｍＨｇの低下、もしくは少なくとも１０ｍｍＨｇの低下；および／または、拡張期の読み取り値について、少なくとも１ｍｍＨｇの低下、少なくとも５ｍｍＨｇの低下、もしくは少なくとも１０ｍｍＨｇの低下を含む。上昇した血圧は、収縮期の読み取り値については１２０ｍｍＨｇ以上、拡張期の読み取り値については８０ｍｍＨｇ超、またはその両方を含む血圧の読み取り値を指し得る。高血圧は、収縮期の読み取り値については１３０ｍｍＨｇ以上、拡張期の読み取り値については８０ｍｍＨｇ超、またはその両方を含む血圧の読み取り値を指し得る。
特定の実施形態では、本方法は、対象に、請求項２０～２６のいずれかに記載のペプチド単離物、または請求項２７に記載の医薬製品、または請求項２８に記載の栄養補助食品もしくは機能性食品を投与することを含む、対象において健康な血圧を促進することを含む。健康な血圧は、収縮期の読み取り値については１２０ｍｍＨｇ未満、および拡張期の読み取り値については８０ｍｍＨｇ未満の血圧読み取り値を指す。
本発明における実験研究を以下に示す。
〔実施例〕
実施例１
ＡＣＥ阻害活性を有するマグロの生の濃肉の加水分解物の調製
マグロの生の濃肉（ＲＤＭ）を、３ｍｍの切断ヘッドを有する切断機によって粉砕した。粉砕したＲＤＭを、１０％ｗ／ｖ（ｇタンパク質／ｍｌ水）の濃度で調製し、ＮａＯＨを用いて、ｐＨ８．５に調整した。アルカラーゼ２．４Ｌを、４％（ｗ／ｗ）のタンパク質基質の濃度で混合物に添加した。加水分解は、６０℃で４時間行った。加水分解した混合物を、９５℃で１０分間加熱し、次いで９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清は、ＲＤＭ加水分解物と称した。この加水分解条件から得られるＲＤＭ加水分解物は、全固形含有量～８％およびタンパク質回収率～７５％を有する。ＲＤＭ加水分解物は、ＡＣＥ阻害活性についてＩＣ５０を評価し、６１．５８μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する優れたＡＣＥ阻害能を示した。カラムクロマトグラフィー、すなわちサイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相高速クロマトグラフィーを用いることによって、ＡＣＥ阻害ペプチドを含有するＲＤＭ加水分解物を精製した。
実施例２
ＡＣＥ阻害ペプチドの精製
ＲＤＭ加水分解物を最初に精製し、高速タンパク質液体クロマトグラフィーに接続した。ペプチドを、０．４ｍｌ／分の流速で、アイソクラティックモードで、脱イオン水を用いて、溶出させた。溶出液を、０．６ｍｌ画分中に回収し、図１に示すようにプールした。各々のプールした画分を、ＴＮＢＳ法（Ａｄｌｅｒ－Ｎｉｓｓｅｎ、１９７９年）によって、α－アミノ基の含有量（ロイシン当量として表す）を決定し、同じ濃度の１ｍＭロイシン当量で、ＡＣＥ阻害活性についても分析した。ＲＤＭ加水分解物は、５つの画分（画分Ａ～Ｅ、図１）に分離され、画分Ｂが最も高いＡＣＥ阻害活性を示し（ｐ＜０．０５、図２）、同等のＡＣＥ阻害活性を示した画分ＡおよびＥがそれに続いた（ｐ＞０．０５、図２）。したがって、画分Ｂをさらなる精製ステップ、すなわち逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）のために選択した。多くの文献が、ＡＣＥ阻害活性は、ペプチドの分子量の減少に伴って著しく増加したことを報告している（ＢｙｕｎおよびＫｉｍ、２００２年；Ｎａｔｅｓｈら、２００３年；Ｄａｒｅｗｉｃｚら、２０１４年）。しかし、加水分解物中のペプチドのアミノ酸配列および組成は、ＡＣＥ阻害活性の制御において、より重要な役割を果たす可能性がある。
第２の精製、最も活性な画分Ｂの凍結乾燥粉末を脱イオン水に溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステムに接続したＳＯＵＲＣＥ（商標）１５ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）を用いることによって分離した。０．１％トリフルオロ酢酸（０～１００％）を含有するアセトニトリルの直線勾配によって、０．５ｍｌ／分の流速で、ペプチド溶出を行った。図３に示すように、０．５－ｍｌ画分を回収し、プールした。各々のプールした画分のα－アミノ基含有量（ロイシン当量として表す）およびＡＣＥ阻害活性を決定した。画分Ｂを疎水性に基づいて分離し、６つの主要な画分へ回収した（Ｂ１～Ｂ６、図３）。逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）に基づいて、極性タンパク質／ペプチドを最初に溶出した一方で、非極性タンパク質／ペプチドはカラムに結合する。結合した疎水性タンパク質／ペプチドの溶出は、有機溶媒の濃度を増加させることによって達成された（Ｇａｕｒａｖ Ｐｒａｔａｐら、２０１６年）。ＲＰＣの原理および特異的阻害活性に基づいて、最も高い疎水性を有する画分Ｂ６が、最も強力なＡＣＥ阻害活性を示した（表１を参照のこと）。より高い純度のＡＣＥ阻害ペプチドを得るために、画分Ｂ６をＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラムでさらに精製した。
第３の精製、最も高いＡＣＥ阻害活性を示す画分Ｂ６（５０μｌ）を、ＨＰＬＣシステムに連結したカラム（３．５μｍ粒度、４．６×１５０ｍｍ）に適用した。０．１％トリフルオロ酢酸（０～１００％）を含有するアセトニトリルの直線勾配によって、０．５ｍｌ／分の流速で、ペプチド溶出を行った。図４に示すように、０．５－ｍｌ画分を回収し、プールした。各々のプールした画分のα－アミノ基含有量（ロイシン当量として表す）およびＡＣＥ阻害活性を決定した。画分Ｂ６を３つの画分に明確に分離した（画分Ｂ６－Ｉ、Ｂ６－ＩＩ、およびＢ６－ＩＩＩ、図４）。ＡＣＥに対するペプチド画分の特異的阻害活性を考慮すると、画分Ｂ６－ＩＩが最も強い阻害活性を示した（表２を参照のこと）。
優れたＡＣＥ阻害活性を示す精製ペプチド画分において含有するペプチド配列を得るために、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いることによるペプチド配列決定用に選択された精製ペプチド画分は、ＡＣＥ阻害活性が高く、ペプチド収率が高いために、第１の精製からの画分Ｂ２およびＢ４であり、ＡＣＥ阻害能が最も高いために、第２の精製からの画分Ｂ６－ＩＩであった。
実施例３
ＡＣＥ阻害ペプチドの同定
画分Ｂ２、Ｂ４、およびＢ６－ＩＩからの精製ペプチド画分のアミノ酸配列を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いて同定した。同定されたペプチドのＡＣＥ阻害活性を検証し、構造活性相関の理解をより良好に得るために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳから同定されたペプチドを表３に示すように選択し、固相ペプチド合成法を用いて化学合成した。合成されたペプチドの純度を、ＨＰＬＣ分析によって決定すると、９８％超であった。合成されたペプチドの分子量は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して、製造業者によって確認された。各々の合成されたペプチドのＡＣＥ阻害活性を決定した。合成されたペプチドのアミノ酸配列を、ＢＩＯＰＥＰデータベース（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/BIOPEP）を用いた、インシリコＡＣＥ阻害活性の解析に供した。
１ｍｇ／ｍｌの同じペプチド濃度での全ての合成ペプチドは、ＡＣＥ阻害活性を示した（表３を参照のこと）。ペプチド中のアミノ酸配列の異なる配列は、異なるＡＣＥ阻害能をもたらした。これらのペプチドは、６００～１０００Ｄａの範囲の異なる分子量を有する小さなペプチドであることが見出され、ペプチド断片内に５～１０個のアミノ酸を含有した。
先行研究は、ほとんどのＡＣＥ阻害ペプチドが、２～１２個の残基の小さなペプチドであり、３０００Ｄａ未満の分子量であり、それによりＡＣＥ活性部位においてより容易に適合し、したがって阻害活性を主張し得ることを報告している（Ｓｕｎら、２０１９年）。
高度に強力なＡＣＥ阻害活性を有するジペプチドまたはトリペプチドが広く報告されているが、より長いペプチドも強いＡＣＥ阻害活性を有することが見出された。例えば、オボアルブミンからのＦＦＧＲＣＶＳＰ（配列番号９）、ニワトリの筋肉からのＦＫＧＲＹＹＰ（配列番号１０）、ヒトの筋原線維タンパク質からのＮＧＴＷＦＥＰＰ（配列番号１１）、および乾燥されたカツオ（bonito）の筋肉からのＬＫＰＮＭ（配列番号１２）が発見された（Ｆｕｊｉｔａら、２０００年；ＦｕｊｉｔａおよびＹｏｓｈｉｋａｗａ、１９９９年；Ｇｈａｓｓｅｍら、２０１１年）。
本明細書に記載の合成ペプチドの中で、最も強力なＡＣＥ阻害活性を示す最初の３つのペプチドは、０．２７μｇ／ｍｌ（または０．２４μＭ）のＩＣ５０を有するＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（配列番号５）、次いで０．８９μｇ／ｍｌ（または０．９５μＭ）のＩＣ５０を有するＶＳＶＶＱＹＳＲ（配列番号４）、および０．９３μｇ／ｍｌ（または１．２４μＭ）のＩＣ５０を有するＮＬＬＰＨＲ（配列番号３）であった。これらの３つの合成ペプチドは、血圧を低下させるための市販の栄養補助食品であるカツオ（bonito）ペプチドに由来するＰｅｐｔＡＣＥ（登録商標）（ＩＣ５０＝１４４±８μｇ／ｍｌ、Ｌｉｕら、２０１２年）よりも強い阻害を行ったことに留意すべきである。
ＡＣＥ阻害ペプチドの生物学的利用能を評価するために、これら３つの合成ペプチドを、インビトロ消化管（ＧＩ）消化に関するさらなる研究のために選択した。さらに、表３に示すペプチドのアミノ酸配列を、様々なタンパク質源からの潜在的なＡＣＥ阻害ペプチドが報告されているＢＩＯＰＥＰデータベースと比較した。ペプチドの大部分は、それらの配列内に潜在的なＡＣＥ阻害ペプチドを含有した。さらに、本発明から同定されたペプチドは、新規のＡＣＥ阻害ペプチドであることが見出された。
ＡＣＥ阻害ペプチドの構造活性相関は、まだ完全には確立されていないが、ＡＣＥ阻害ペプチドのうちのいくつかの共通の構造的特徴が報告されている。ペプチドのＣ末端は、典型的には疎水性アミノ酸残基を含む、ＡＣＥの活性部位でのＳ１、Ｓ’１、およびＳ’２のサブサイトとの相互作用を介したＡＣＥ阻害活性の制御因子であることが示唆されている（ＯｎｄｅｔｔｉおよびＣｕｓｈｍａｎ、１９８２年）。さらに、Ｎ末端での分岐脂肪族アミノ酸は、ＡＣＥのペプチド結合活性を増加させるのに最も効果的であることが、報告されている（ＢｙｕｎおよびＫｉｍ、２００２年）。この研究は、Ｃ末端位置にＡｒｇ（Ｒ）を有するペプチドが、Ｗａｎｇら（２０２０年）と一致したＡＣＥ阻害活性において、重要な役割を果たす可能性があることを見出した。Ｃ末端の正荷電アミノ酸（ＬｙｓおよびＡｒｇ）は、ＡＣＥ阻害ペプチドの効力を増加させることが示唆されている（ＧｕａｎｇおよびＰｈｉｌｉｐｓ、２００９年；Ｔｏｏｐｃｈａｍら、２０１５年）。さらに、Ｎ末端に、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、およびＭｅｔ（Ｍ）を含む芳香族または分岐鎖を有する疎水性アミノ酸の存在は、これらの合成ペプチドのＡＣＥ阻害活性に、正の影響を及ぼすと思われた。
実施例４
強力なＡＣＥ阻害ペプチドのインビトロ消化管（ＧＩ）消化
ＡＣＥ阻害ペプチドが血流に吸収され得るように、ＧＩ管においてＡＣＥ阻害ペプチドの活性を保持することが必要であり、ここで、ペプチド阻害剤は、それらの降圧効果を示し得る。インビトロ消化管の消化は、経口投与下でペプチドの抗高血圧活性を模倣する容易なプロセスを提供する。最も強いＡＣＥ阻害を示す３つの合成ペプチド、すなわちＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）を、ＧＩ酵素（ペプシンおよびパンクレアチン）に対するＡＣＥ阻害ペプチドの安定性を評価するために選択した。インビトロＧＩ消化は、Ｚｈｕら（２００８年）の方法に従って、いくつかの改変を加えて模擬実験した。１ｍｇの各々の試料を、０．５ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌ－ＨＣｌに溶解し、ｐＨを、６Ｍ ＨＣｌを用いて、２．０に調整した。ペプシン（１％酵素／基質、ｗ／ｗ）を加え、３７℃の振盪水浴中で１時間インキュベートし、ｐＨをｐＨ７．５に調整した。続いて、パンクレアチン（２％酵素／基質、ｗ／ｗ）を加え、混合物をさらに３７℃の振盪水浴中で２時間インキュベートした。酵素反応は、９５℃で１０分間加熱することによって終了させた。消化物を、室温まで冷却し、体積を同じレベルに調整し、８０００×ｇで２０分間、遠心分離した。インビトロＧＩ消化前後のペプチドのＡＣＥ阻害活性およびα－アミノ基含有量を測定した。模擬実験を行ったＧＩ消化の後、ペプシンおよびパンクレアチン酵素の作用による小ペプチドの放出により、全ての合成ペプチドのα－アミノ基含有量が増加した（図５）。さらに、より長いペプチドは、より高いα－アミノ基含有量が示されたため（図５）、ＧＩ酵素によって容易に消化され得る。ＧＩ消化後のペプチドＮＲ６、ＶＲ８、およびＶＲ９のＡＣＥ阻害活性は、それぞれ約３０％、１９％、および１４％減少した（図６）。これらの３つのペプチドは、ＧＩ酵素によって消化することができ、それらの阻害活性は減少したが、ＡＣＥ阻害能は依然として高かった。
実施例５
強力な合成されたペプチドのインシリコ消化管（ＧＩ）消化
ＧＩ消化後のペプチド断片の放出されたアミノ酸配列を予測するために、ペプチドＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）のインシリコＧＩ消化を、フリーウェブアプリケーション（free web application）、すなわちＦｅｐｔｉｄｅＤＢを使用することによって行った。ＦｅｐｔｉｄｅＤＢは、食品に由来する化合物の生物活性ペプチドの発見を援助するためのｗｅｂアプリケーションである。このウェブベースの情報センターは、ユーザがインシリコ酵素消化物として適切な酵素を選択することを可能にする（Ｐａｎｙａｙａｉら、２０１９年）。本実施例において、インシリコでペプチド配列を切断するために使用される選択されたＧＩ酵素は、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンであった。ＧＩ酵素の切断部位に基づいて、ペプチドＮＲ６、ＶＲ８、およびＶＲ９の劣化から得られる可能性のある加水分解生成物を、表４に示した。予測されたアミノ酸配列を、ＡＣＥ阻害ペプチドに関する生物活性ペプチドデータベースに対しても調査した。ペプチドＶＩＹのみが、ＡＣＥ阻害剤と報告されている。予測されたペプチドの阻害活性を検証するために、ＶＲ９から放出される全ての予測されたペプチドを、ＡＣＥ阻害活性の決定のために選択した。表５の結果は、ペプチドＶＩＹだけでなく、他のインシリコ消化ペプチドも、ＡＣＥ阻害活性を発揮することを示した。ペプチドＶＩＹＳＲ（配列番号６）、ＩＮＣＲ（配列番号７）、およびＳＲＩＮＣＲ（配列番号８）は、ペプチドＶＩＹよりも著しく強い阻害能を示した。この結果は、Ｎ末端の疎水性アミノ酸およびＣ末端のＡｒｇ（Ｒ）の存在が、ペプチドの阻害能を増強する可能性があることを示唆した。
アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性ＡＣＥ阻害活性の決定
ＡＣＥ阻害活性アッセイは、ＣｕｓｈｍａｎおよびＣｈｅｕｎｇ（１９７１年）およびＷｕら（２００２年）の方法に従って、いくつかの改変を加えて行った。５０μＬの加水分解物またはペプチド、１５０μＬの８．３ｍＭ Ｈｉｐｐｕｒｙｌ－Ｌ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ－Ｌ－ロイシン（ＨＨＬ）、および５０μＬのＡＣＥ（２５ｍＵ／ｍｌ）を含有する反応混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、２５０μＬの１Ｍ ＨＣｌを加えて、反応を停止させた。放出された馬尿酸（ＨＡ）を、２．５ｍｌの酢酸エチルを加えることによって抽出し、混合物を、ボルテックスを用いて１分間混合し、室温で１時間放置した。次いで、２ｍｌの上層をビーカーに移し、８０℃で乾燥させ、酢酸エチルを除去した。最後に、１ｍｌの脱イオン水を添加して、ＨＡを溶解した。吸光度を、２２８ｎｍで測定した。ＡＣＥ阻害の割合は、以下のように計算した：
式中、Ａは、加水分解物を含まないＡＣＥを含む反応の２２８ｎｍにおける吸光度であり；Ｂは、加水分解物の非存在下でＨＣｌを添加することによって、予め不活性化されたＡＣＥを含む反応の２２８ｎｍにおける吸光度であり；Ｃは、ＡＣＥおよび加水分解物の存在下での反応の２２８ｎｍにおける吸光度であり；ならびに、Ｄは、加水分解物の存在下でＨＣｌを添加することによって、予め不活性化されたＡＣＥを含む反応の２２８ｎｍにおける吸光度である。ＩＣ５０は、５０％のＡＣＥ活性を阻害するのに必要な阻害剤の濃度として定義した。特異的阻害活性は、ＡＣＥ阻害（％）を総ペプチド含有量（ｍｇ）で割って計算した。
α－アミノ基含有量の決定
α－アミノ基の含有量は、Ａｄｌｅｒ－Ｎｉｓｓｅｎ（１９７９年）に従って行った。精製ペプチド画分（５０μｌ）を、０．２１２５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．２（０．５ｍｌ）および０．０５％ＴＮＢＳ試薬（０．５ｍｌ）と混合した。反応混合物を、水浴中で、５０℃で、１時間インキュベートした。続いて、０．１Ｍ ＨＣｌ（１ｍｌ）を加えて反応を停止させた。混合物を、室温で３０分間放置した後、４２０ｎｍでの吸光度を観察した。ロイシンを基準として使用した。α－アミノ基の含有量は、ロイシン当量として表した。
前述の種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するように組み合わされることが可能である。本明細書において言及され、および／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、さらに別の実施形態を提供するために、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を採用して、修正することができる。
これらおよび他の変更は、前述の詳細な説明に照らして、実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではない。しかし、該用語は、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲が権利を有する当量物の全ての範囲と共に、含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
図１は、脱イオン水で溶出された生の濃肉（ＲＤＭ）の加水分解物のサイズ排除クロマトグラムである。 図２は、分離されたペプチド画分の１ｍＭロイシン当量と同じ濃度でのＡＣＥ阻害活性を示す。 図３は、０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮで溶出された画分Ｂのクロマトグラムである。 図４は、０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮで溶出された画分Ｂ６のクロマトグラムである。 図５は、合成ペプチドＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）のα－アミノ基含有量に対するインビトロ消化管（ＧＩ）消化の効果を示す。 図６は、合成ペプチドＮＬＬＰＨＲ（ＮＲ６、配列番号３）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（ＶＲ８、配列番号４）、およびＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（ＶＲ９、配列番号５）のＡＣＥ阻害活性に対するインビトロ消化管（ＧＩ）消化の効果を示す。

Claims (31)

  1. 以下のステップを含む、ペプチド単離物の製造方法：
    魚肉を水と混合して、水性混合物を製造するステップ；
    前記水性混合物のｐＨを、塩基性ｐＨに調整するステップ；
    前記水性混合物にアルカリ性プロテアーゼを添加すること、および加水分解物を製造するのに十分な伝導下で、前記水性混合物をインキュベートすることによって、前記魚肉を加水分解するステップ。
  2. 前記水性混合物が、約１：２～約１：３の水に対する肉の比率を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記水性混合物が、約５％（ｗ／ｖ）～約１５％（ｗ／ｖ）（ｇタンパク質／ｍｌ水）の範囲でタンパク質濃度を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記塩基性ｐＨが、７超～約１１の範囲である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記アルカリプロテアーゼが、セリンプロテアーゼを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 加水分解物を製造するのに十分な条件は、約２時間～約５時間の範囲の時間インキュベートする工程を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記加水分解物を製造するのに十分な条件は、約４０℃～約７０℃の範囲の温度でインキュベートする工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記方法は、前記加水分解のステップの後に、前記加水分解物から細胞残屑を除去するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞残屑を除去する工程が、前記加水分解物を遠心分離および濾過して、上清を得る工程を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記加水分解ステップが、前記加水分解物を製造するのに十分な条件下で前記水性混合物をインキュベートする工程の後に、前記加水分解物を約８０℃～約１００℃の範囲の温度で加熱することによって、加水分解反応を停止させる工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記加水分解反応を停止させる工程が、約８０℃～約１００℃の範囲の前記温度で、約１０分～約２０分の範囲の時間、前記加水分解物をインキュベートする工程を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記加水分解反応を停止させる工程が、前記加水分解物を加熱する工程の後に、前記加水分解物を約１０℃～約３０℃の範囲の温度に冷却する工程をさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記方法は、前記加水分解物をクロマトグラフィーに供するステップ、およびＡＣＥ阻害活性を有する前記ペプチドを含む１つ以上のクロマトグラフィー画分を回収するステップをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記クロマトグラフィーが、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相高速クロマトグラフィーから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ペプチド単離物を酵素的に消化して、前記ペプチドの１つ以上の消化産物を製造するステップをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記酵素的に消化する工程が、インシリコで消化管消化する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記魚肉が、生の魚の濃肉を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記魚肉が、挽いた魚肉を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記魚肉が、マグロの肉を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記魚肉が、カツオ（skipjack tuna）の肉を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法によって製造される、ペプチド単離物。
  22. ＡＣＥ阻害活性を有する１つ以上の魚由来ペプチドを含む、ペプチド単離物。
  23. ＡＣＥ阻害活性を有する前記１つ以上の魚由来ペプチドが、１００μｇ／ｍｌ以下のＡＣＥ阻害のＩＣ５０値を有する、請求項２１または２２に記載のペプチド単離物。
  24. 前記１つ以上の魚由来ペプチドが、ＧＰＬＹＨＳ（配列番号１３）、ＬＩＨＡＩＬ（配列番号１４）、ＳＦＬＭＲＫ（配列番号１５）、ＶＩＹＳＲＩＮＣＲ（配列番号５）、ＶＬＭＳＱＶＦＫＱＴ（配列番号１６）、ＷＴＩＨＴＰ（配列番号１７）、ＬＰＰＧＫＩＶ（配列番号１８）、ＩＦＥＲＬ（配列番号１９）、ＦＤＱＦＬＰＩＨ（配列番号２０）、ＮＧＰＳＧＱＴＧ（配列番号２１）、ＬＬＤＨＲＡＮＬ（配列番号２２）、ＡＰＰＨＩＦ（配列番号２３）、ＨＦＡＡＳＧＫ（配列番号２４）、ＬＥＱＶＳＡＧＴＴ（配列番号２５）、ＮＬＬＰＨＲ（配列番号３）、ＶＱＳＶＰＡＴ（配列番号２６）、ＶＥＷＫＥＲＡＴＥ（配列番号２７）、ＬＬＨＡＫＰＬＮ（配列番号２８）、ＶＳＶＶＱＹＳＲ（配列番号４）、ＩＫＶＧＧＥＲＦ（配列番号２９）、ＫＫＬＥＫＫＴＴ（配列番号３０）、ＧＶＰＧＩＨＧＳ（配列番号３１）、ＱＧＰＰＧＮＰＧ（配列番号３２）、およびＭＴＧＬＰＧＰＴＧＰ（配列番号３３）から選択される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のペプチド単離物。
  25. 前記１つ以上の魚由来ペプチドの消化産物を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のペプチド単離物。
  26. 前記消化産物が、ＶＩＹＳＲ（配列番号６）、ＩＮＣＲ（配列番号７）、およびＳＲＩＮＣＲ（配列番号８）のうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載のペプチド単離物。
  27. 前記消化産物が、ＶＩＹＳＲ（配列番号６）、ＩＮＣＲ（配列番号７）、およびＳＲＩＮＣＲ（配列番号８）を含む、請求項２５に記載のペプチド単離物。
  28. 請求項２１～２７のいずれか一項に記載のペプチド単離物と、少なくとも１つの賦形剤と、を含む、医薬製品。
  29. 請求項２１～２７のいずれか一項に記載のペプチド単離物と、少なくとも１つの追加の成分と、を含む、栄養補助食品または機能性食品。
  30. 請求項２１～２７のいずれか一項に記載のペプチド単離物、または請求項２８に記載の医薬製品、または請求項２９に記載の栄養補助食品もしくは機能性食品を、対象に投与する工程を含む、対象における高血圧を治療する方法。
  31. 請求項２１～２７のいずれか一項に記載のペプチド単離物、または請求項２８に記載の医薬製品、または請求項２９に記載の栄養補助食品もしくは機能性食品を、前記対象に投与する工程を含む、対象における健康な血圧を促進する方法。
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