PT1457498E - Novo péptido possuindo efeito inibitório da convertase da angiotensina. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVO PÉPTIDO POSSUINDO EFEITO INIBITÓRIO DA CONVERTASE DA ANGIOTENSINA"

Domínio Técnico A invenção presente diz respeito a um novo péptido e a um inibidor do enzima de conversão da angiotensina contendo o péptido. 0 inibidor do enzima de conversão da angiotensina pode ser utilizado em produtos alimentares, em alimentos compostos, e produtos farmacêuticos.

Estado da Técnica 0 enzima de conversão da angiotensina (ECA) é um enzima que actua sobre a angiotensina I a qual é gerada a partir do angiotensinogénio por digestão com renina que a transforma em angiotensina II por libertar dois aminoácidos do seu terminal C. 0 enzima de conversão da angiotensina não só actua por originar angiotensina II que tem um efeito hipertensivo forte, mas também inactiva a bradiquinina que tem um efeito hipotensivo. Por causa destas actuações, têm sido utilizados agentes inibidores do enzima de conversão da angiotensina como agentes terapêuticos contra a hipertensão, 2 e, por exemplo, o Captopril (produzido pela Sankyo Co., Lda.) e a Renivase (produzida pela Banyu Pharmaceutical Co., Lda.) têm sido conhecidos como fármacos comercialmente disponíveis. Para além disto, também se sabe que os inibidores do enzima de conversão da angiotensina têm como efeito fazer diminuir a hipertrofia cardíaca.

Por outro lado, têm sido encontrados péptidos possuindo efeitos inibitórios do enzima de conversão da angiotensina em produtos naturais, ou em produtos provenientes da degradação enzimática de proteínas animais tais como a caseína e a gelatina, de proteínas vegetais tais como as do trigo, do arroz e do milho, e das proteínas de peixe tais como as da sardinha. Por exemplo, incluem-se nos péptidos conhecidos que se encontram em produtos naturais, o teprótido (nonapéptido, SQ20881) e o metabolito IS83 da bactéria Actinomyces que pertence ao género Streptomyces (JP 58-177920 A). Para além disto, incluem-se nos péptidos conhecidos obtidos por degradação enzimática, os péptidos obtidos decompondo a caseína com tripsina (JP 58-109425 A, JP 59-44323 A, JP 59-44324 A, JP 61-36226 A, e JP 61-36227 A), os péptidos obtidos pela hidrólise de caseína com termolisina (JP 6-277090 A, JP 6-277091 A, JP 6-279491A, JP 7-101982 A, e JP 7-101985 A), os péptidos obtidos pela hidrólise da caseína ou produtos semelhantes com bactérias lácticas ou com uma mistura de proteinases e peptidases (JP 6-197786 A, JP 6-40944 A, e JP 2001-136995 A (que se designam doravante, neste documento, respectivamente como 3 "Referências 1, 2 e 3") . Os péptidos das Referências 1 a 3 são utilizados como alimentos com utilização específica para a saúde, possuindo efeito hipotensivo.

Entre os péptidos descritos acima, o péptido descrito na JP 7-101982 A (doravante designado, neste documento, como "Referência 4") apresenta a maior actividade inibidora do enzima de conversão da angiotensina, e tem a estrutura comparativamente simples de um tripéptido.

Descrição da Invenção

Tal como se descreveu acima, são conhecidos na técnica diversos péptidos inibidores do enzima de conversão da angiotensina. No entanto, estes péptidos ainda têm uma actividade inibidora do enzima de conversão da angiotensina que é insuficiente, a título de função em produtos alimentares. Tem portanto sido pretendido obter-se um péptido derivado de um produto natural, o qual apresente uma actividade inibidora mais forte do enzima de conversão da angiotensina, e que tenha também uma estrutura simples, bem como aplicar-se esse péptido em produtos alimentares, em produtos farmacêuticos, ou noutros semelhantes.

Os inventores da invenção presente fizeram estudos extensivos para resolver o problema exposto acima, e como resultado verificaram que a hidrólise da caseína com um enzima específico permite obter no hidrolisado um novo 4 péptido que possui uma elevada actividade inibidora do enzima de conversão da angiotensina, e que o péptido referido apresenta a sequência Met-Lys-Pro, completando desta forma a invenção presente. A invenção presente diz portanto respeito a um péptido constituído por Met-Lys-Pro (doravante referido neste documento como o "péptido da invenção presente").

Para além disto, a invenção presente proporciona um inibidor do enzima de conversão da angiotensina que inclui o péptido constituído por Met-Lys-Pro a título de ingrediente eficaz.

Para além disto, a invenção presente proporciona um agente hipotensivo que inclui um péptido constituído por Met-Lys-Pro a título de ingrediente eficaz.

Doravante neste documento, descrever-se-á a invenção presente em pormenor. 0 péptido da invenção presente tem uma sequência representada por Met-Lys-Pro. Para além disto, o péptido da invenção presente pode ser um qualquer dos sais deste péptido. Na invenção presente, Met denota um resíduo de L-metionina, Lys denota um resíduo de L-lísina e Pro denota um resíduo de L-prolina. 5 0 péptido da invenção presente pode ser produzido hidrolisando uma proteína tal como a caseína, com uma hidrolase adequada.

Doravante, neste documento, exemplificar-se-á um método de hidrolisar uma proteína com uma hidrolase.

Para a hidrólise de uma proteína com um enzima, embora o processo de tratamento varie de acordo com as propriedades da proteína, dispersa-se um material proteico em água fria ou em água aquecida, dissolvendo-se nessa água quando a proteína for solúvel. Quando a solubilidade da proteína for pequena, ela mistura-se com água quente e homogeneíza-se enquanto se agita fortemente. Não existe qualquer limitação específica quanto ao material proteico, desde que ele contenha uma sequência representada por Met-Lys-Pro e dele resulte o péptido da invenção presente quando é submetido a uma digestão com uma hidrolase adequada. Desta forma, pode partir-se de uma qualquer proteína proveniente de animais ou bactérias. Em especial, uma proteína preferida é a caseína que se pode obter em grandes quantidades. É desejável proceder à esterilização de uma solução contendo a proteína, a entre 70 e 90°C durante entre cerca de 15 segundos e de 10 minutos, com o objectivo de evitar a sua deterioração por poluição bacteriana. 6

Em seguida, é preferível ajustar o pH da solução contendo a proteína a um valor óptimo de pH para a hidrolase que se utilizar, ou a um valor de pH próximo desse, adicionando à solução para esse efeito um agente básico ou um agente ácido. 0 agente básico ou ácido que se utilize no método da invenção presente pode ser um qualquer agente básico ou ácido, desde que ele seja aceitável em produtos alimentares ou farmacêuticos. Incluem-se nos exemplos específicos dos agentes básicos o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, e o carbonato de potássio, e nos dos agentes ácidos, o ácido clorídrico o ácido cítrico, o ácido fosfórico, e o ácido acético.

Em seguida, adiciona-se à solução proteica uma quantidade previamente determinada de uma hidrolase, para se levar a cabo a reacção a uma temperatura de entre cerca de 10 e 85°C, durante entre 0,1 e 48 horas. A hidrolase que se utiliza é de preferência uma endopeptidase, embora não haja limitação específica desde que essa hidrolase seja capaz de hidrolisar a proteína de forma a que se obtenha o péptido da invenção presente. Incluem-se nas endopeptidases uma protease proveniente de bactérias Bacillus e uma protease proveniente de pancreases animais. Estes enzimas encontram-se comercialmente disponíveis. A protease preferível proveniente de bactérias Bacillus pode ser exemplificada pela Biopuraze sp-20 7 (fabricada pela Nagase Biochemical Industry Inc.) e pela Protease N (fabricada pela Amano Enzyme Inc.), enquanto a protease preferível com origem em pancreases animais pode ser exemplificada pela PTN6.0S (fabricada pela Novozymes Japan Ltd.). A protease proveniente de bactérias Bacillus é adicionada, de forma preferível, a uma taxa de entre 100 e 5000 unidades de actividade por 1 grama de proteína. Por outro lado, a protease proveniente de pancreases animais é adicionada, de forma preferível, a uma taxa de 3000 a 8000 unidades de actividade por 1 grama de proteína. A hidrolase utilizada na invenção presente pode ser um tipo de hidrolase, ou uma mistura de dois ou mais tipos. Quando se utilizam dois ou mais tipos de hidrolases, as suas reacções enzimáticas podem ser levadas a cabo em simultâneo ou independentemente. Na invenção presente, é especialmente preferível utilizar-se uma mistura de Biopuraze sp-20, Protease N, e PTN6.0S.

Mantém-se uma solução à qual se adiciona um enzima a uma temperatura adequada, de acordo com o tipo de enzima, por exemplo a entre 30 e 60°C, de preferência a entre 45 e 55°C, para iniciar a hidrólise da proteína. No que toca ao período de tempo da hidrólise, continua-se a reacção até que se atinja uma taxa de decomposição preferida, enquanto se monitoriza a taxa de decomposição da mistura reaccional. Para se obter o péptido da invenção presente, é desejável uma taxa de decomposição de entre 20 e 30%. 8

Quanto ao método de calcular a taxa de decomposição, determina-se o conteúdo total de uma amostra em azoto pelo método de Kjeldahl (The Japanese Society for Food Science and Technology, Ed., "Food Analysis Method", página 102, KORIN Publishing Co., Ltd., 1984), e determina-se o conteúdo de azoto de formol na amostra pelo método de titulação com formol (Manda et al., Ed., "Laboratory Manuais of Food Engineering", Primeiro Volume, página 547, Yokendo Co., Ltd., 1970), e em seguida calcula-se a taxa de decomposição pela equação seguinte, utilizando os valores medidos.

Taxa de decomposição (%) - (Conteúdo em azoto de formol / Conteúdo total de azoto) X 100

Leva-se a cabo a terminação da reacção enzimática, por exemplo, desactivando o enzima na solução de hidrólise. Isto pode ser levado a cabo por desactivação térmica, utilizando o método geral. As condições para uma desactivação suficiente podem ser adequadamente determinadas no que toca à temperatura de aquecimento e ao período de retenção da desactivação térmica, tendo em consideração a estabilidade térmica do enzima que se utilizar. Por exemplo, ela pode ser levada a cabo a uma gama de temperaturas de entre 80 e 130°C, durante um período de retenção de entre 30 minutos e 2 segundos. 9

Isola-se o péptido da invenção presente, de preferência, a partir da solução de hidrólise acima. A purificação do péptido é em geral levada a cabo pela mesma técnica que se utilize na purificação de um oligopéptido, por exemplo, combinando de forma adequada diversos métodos cromatográficos incluindo cromatografia de permuta iónica, cromatografia de adsorção, cromatografia em fase reversa, cromatografia de distribuição e cromatografia de filtração em gel, precipitação a partir do solvente, extracção por salga, e distribuição entre duas fases liquidas, etc. Na altura de se purificar o péptido da invenção presente, podem determinar-se as fracções que contêm os materiais pretendidos com base no seu efeito inibitório sobre o enzima de conversão da angiotensina, tal como se descreve adiante. Podem identificar-se os ingredientes activos nessas fracções por espectrometria de massa.

Para além disto, também se pode produzir o péptido da invenção presente por síntese química. A síntese química do péptido da invenção presente pode ser levada a cabo por um método em fase líquida, ou por um método em fase sólida, os quais são em geral utilizados para a síntese de um oligopéptido. Desprotege-se o péptido sintetizado se tal for necessário, e depois retiram-se os reagentes que não reagiram, os subprodutos, e outras moléculas. Uma tal síntese peptídica pode ser levada a cabo utilizando um sintetizador de péptidos comercialmente disponível. A 10 produção do péptido pretendido pode ser confirmada com base no seu efeito de inibição do enzima de conversão da angiotensina.

Pode utilizar-se o péptido da invenção presente como um ingrediente eficaz num inibidor de enzima de conversão da angiotensina. O péptido da invenção presente tem um efeito inibidor sobre o enzima de conversão da angiotensina e um efeito de suprimir a inactivação da bradiquinina, exibindo um efeito hipotensivo. Ele pode portanto ser utilizado como agente de prevenção ou como agente terapêutico, contra diversas doenças derivadas da hipertensão, tais como a hemorragia cerebral, o enfarte cerebral, a angina de peito, o enfarte do miocárdio, e a insuficiência renal, e mais especificamente, ele pode ser utilizado como um agente hipotensivo, ou algo semelhante. Para além disto, sabe-se que os inibidores de enzima de conversão da angiotensina também têm efeitos contra a hipertensão instintiva, cuja causa é desconhecida, e portanto também é de esperar que o péptido da invenção presente possua um efeito terapêutico ou profilático contra a hipertensão instintiva. Para além disto, ele também pode ser utilizado como um fármaco terapêutico ou profilático para outras doenças, tais como a hipertrofia cardíaca e a doença de angina, para as quais é considerado eficaz utilizar-se um inibidor do enzima de conversão da angiotensina. 11 0 inibidor de enzima de conversão da angiotensina da invenção presente pode ser administrado quer pela via oral quer pela parentérica, mas é preferível a administração por via oral. Na administração por via parentérica inclui-se a administração por injecção endovenosa, a administração intra rectal, e a inalação. Incluem-se nas formas farmacêuticas para administração por via oral, uma forma de comprimido, uma forma de trocisco, uma forma de cápsula, uma forma de xarope, uma forma de grânulos, uma forma em pó, e uma forma como unguento. Para a formulação farmacêutica, podem utilizar-se para além de um hidrolisado de proteína de soro de leite, outros ingredientes tais como um excipiente, um regulador do pH, um corante, e um agente saborizante para os fármacos, os quais são em geral utilizados nas formulações farmacêuticas habituais. Para além disto, pode também ser utilizado em conjunto com ele qualquer fármaco conhecido na técnica, que possua um efeito inibidor do enzima de conversão da angiotensina. 0 péptido da invenção presente pode estar contido a título de ingrediente eficaz, num produto alimentar, constituindo uma concretização de um inibidor do enzima de conversão da angiotensina, sendo processado a um alimento que possui um efeito inibidor do enzima de conversão da angiotensina. Independentemente das formas que assumirem, de líquido, de sólido, de pasta, e de pó, etc., incluem-se nesses produtos alimentares: para além de rebuçados, dietas líquidas, e alimentos compostos (incluindo os que se 12 destinam a animais de companhia), produtos de farinha de trigo tais como pão, macarrão, esparguete, massas, massas para pastelaria, pomos para fritar, e pão ralado; alimentos prontos a comer, tais como massas instantâneas, massas para sopa, conservas na embalagem, alimentos preparados, alimentos enlatados, refeições para micro ondas, sopa ou guisado instantâneos, sopa de miso instantânea ou caldo claro Japonês, sopa enlatada, alimentos liofilizados e outros alimentos prontos a comer; produtos agrícolas processados tais como produtos vegetais enlatados, frutos enlatados, compota ou doces, pickles, feijões cozidos, produtos agrícolas secos, e cereais (produtos de grãos processados); produtos marinhos processados, tais como produtos marinhos enlatados, fiambres ou salsichas de pescado, pasta de peixe, aperitivos feitos de produtos marinhos, e aperitivos de produtos marinhos marinados em molho de soja (tsukudanis); produtos agrícolas de criação processados, tais como produtos agrícolas de criação enlatados, pastas, e fiambres ou salsichas de produtos agrícolas de criação; leite e lacticínios tais como leite processado, bebidas lácteas, iogurte, bebidas de bactérias lácticas, queijo, gelados, leite em pó modificado, nata e outros produtos lácteos; gorduras e óleos tais como manteiga, margarina, e óleos vegetais; temperos de base tais como molho de soja, miso, molhos, temperos com base em tomate processado, vinhos doces de arroz para cozinhar, e vinagre; temperos complexos e alimentos tais como mistura para cozinhar, mistura prévia para caril, molhos para forno, 13 temperos, sopas de massa, especiarias e outros temperos complexos; alimentos congelados tais como alimentos congelados materiais, alimentos congelados semi-preparados, e alimentos congelados previamente congelados; doces tais como caramelos, rebuçados, gomas de mascar, chocolates, bolachas, biscoitos, bolos, empadas, snacks, bolachas de água e sal, doces Japoneses, biscoitos de arroz, pastéis de feijão, sobremesas e outros produtos de pastelaria; bebidas com sabores tais como bebidas carbonatadas, sumos de fruta naturais, bebidas de sumo de fruta, bebidas não alcoólicas contendo sumo de fruta, bebidas de polpa, bebida de frutos que contenha pequenos frutos vermelhos, bebida vegetal, leite de soja bebida de leite de soja, bebida de café, bebida de chá, bebidas em pó, bebidas concentradas, bebidas para desportistas, bebidas nutritivas, e bebidas alcoólicas e outras bebidas com sabor; e outros produtos alimentares existentes no mercado tais como alimentos para bebés, farinha de peixe, e chá fervido com pasta de chá.

No inibidor de enzima de conversão da angiotensina da invenção presente, o conteúdo em péptido da invenção presente é de preferência de pelo menos 0,0001%, em peso, em relação à composição final contendo o inibidor de enzima de conversão da angiotensina. A dosagem do inibidor do enzima de conversão da angiotensina da invenção presente varia de acordo com as idades, os sintomas, e outros factores. Em geral, no 14 entanto, administra-se o iníbidor a uma dosagem de entre 0,001 e 3000 mg/dia, de preferência entre 0,01 e 30 mg/dia, e para além disso, ele pode ser administrado uma, duas, ou três vezes ao dia.

Breve Descrição do Desenho A Fig. 1 ilustra resultados de uma análise de um péptido da invenção presente por MS/MS.

Melhor Maneira de se Levar a Cabo a Invenção

Em seguida, descreve-se em mais pormenor a invenção presente, por intermédio de exemplos.

Exemplo 1 Produção do Péptido por Degradação Enzimática de Caseína <1> Degradação Enzimática de Caseína

Adicionaram-se 900 g de água a 100 g de caseína disponível no comércio (fabricada pelo New Zealand Dairy Board), e dispersou-se bem a caseína na água. Ajustou-se então o pH da solução resultante a 7,0 pela adição de hidróxido de sódio, para dissolver completamente a caseína , obtendo-se desta forma uma solução aquosa de caseína a cerca de 10%. Esterilizou-se a solução aquosa de caseína obtida pelo calor, aquecendo-a a 85°C durante 10 minutos, e depois 15 ajustou-se a sua temperatura a 50°C e em seguida o seu pH a 9,5 pela adição de hidróxido de sódio. Em seguida, adicionaram-se à solução para se dar inicio a uma reacção de hidrólise, 100.800 unidades activas (1.200 unidades activas por 1 grama de proteína) de Biopuraze sp-20 (fabricado pela Nagase Biochemical Industry Inc.), 168.000 unidades activas (2.000 unidades activas por 1 grama de proteína) de Protease N (fabricado pela Miano Enzyme Inc.), e 588.000 unidades activas (7.000 unidades activas por 1 grama de proteína) de PTN6.0S (fabricado por Novozymes Japan Ltd.). Quando a taxa de decomposição da caseína atingiu os 24,1%, desactivaram-se os enzimas aguecendo a mistura a 80°C durante 6 minutos, para terminar a reacção enzimática, e em seguida arrefeceu-se a 10°C. Fez-se em seguida uma ultrafiltração da solução de hidrólise através de uma membrana de ultrafiltração (fabricada pela Asahi Kasei Corporation) com um corte a uma fracção de massa molecular 3.000, e depois concentrou-se o filtrado e em seguida líofilizou-se, obtendo-se desta forma 85 g de um produto liofilizado.

<2> Isolamento do Péptido por HPLC

Utilizou-se uma HPLC em fase reversa para separar as componentes da caseína hidrolisada. As condições em que se levou a cabo a HPLC estão descritas nas Condições e HPLC 1, adiante.

[Condições de HPLC 1] 16

Coluna: CAPCELL PAK C18 (UG120, 5 μτα) 20 iran de D.I. x 250 mm (Shiseido Co., Lda.)

Detecção: UV a 215 nm

Taxa de fluxo: 16 mL/min

Eluente A: solução aquosa de acetonitrilo a 1% contendo 0,05% de TFA

Eluente B: solução aquosa de acetonitrilo a 25% contendo 0,05% de TFA

Utilizou-se um gradiente de evolução linear, desde 100% de Eluente A a 100% de Eluente B ao fim de 40 minutos, para se separar um hidrolisado. Em cada fracção separada, determinou-se a capacidade de inibição do enzima de conversão da angiotensina pelo método que se descreve adiante. Como resultado, foi eluido um péptido que possuía capacidade inibitória do enzima de conversão da angiotensina a um período de retenção de 22 minutos. Para se purificar o péptido, ele foi purificado em seguida por HPLC. As condições em que se levou a cabo esta operação estão descritas adiante como Condições de HPLC 2.

[Condições de HPLC 2] 17

Coluna: CAPCELL PAK C18 (UG300, 5 μια) 20 mm de D.I. x 250 mm (Shiseido Co., Lta.)

Detecção: UV a 215 nm

Taxa de fluxo: 0,2 mL/min

Eluente A: solução aquosa de acetonitrilo a 1% contendo 0,05% de TFA

Eluente B: solução aquosa de acetonitrilo a 10% contendo 0,05% de TFA

Nas condições de gradiente de evolução linear, desde 100% de Eluente A a 100% de Eluente B ao fim de 15 minutos, observou-se uma forte capacidade de inibição do enzima de conversão da angiotensina para um pico com um período de retenção de 13 minutos. A capacidade de inibição do enzima de conversão de angiotensina I evidenciada por este pico era tal que o seu valor de IC50 [a concentração em μg/mL necessária para inibir 50% da actividade do enzima de conversão da angiotensina] = 0,18 pg/mL.

Identificou-se o composto que correspondia ao pico de actividade referido acima com um sequenciador de proteínas (Modelo 473A) da Applied Biosystems Lda. Como 18 resultado, determinou-se que o composto apresentava a estrutura nova, Met-Lys-Pro. Para além disto, a sua massa molecular foi identificada como sendo de 374,2 utilizando um espectrómetro de massa LCQ da Thermoquest Co., Lda., com iões filhos a m/z = 260, 215, e 129, etc. que foram detectados por uma análise MS/MS para o ião original com m/z = 375,2 (MH+) , tal como se ilustra na Fig. 1.

Foi consequentemente elucidada a estrutura do péptido que possuía uma capacidade inibitória do enzima de conversão da angiotensina, e que era H-Met-Lys-Pro-OH. No produto liofilizado (85 g) existiam 42,5 mg do tripéptido Met-Lys-Pro.

Exemplo 2 Síntese Química do Péptido

Utilizando o sintetizador de péptidos (Modelo 433A, Applied Biosystems Lda.) e partindo também de Fmoc-L-Met (Applied Biosystems Lda.), Fmoc-Lys(Boc) (Applied Biosystems Lda.), e de Resina Fmoc-Pro-TrtA-PEG (Watanabe Kagaku Kogyo K.K.) como matérias-primas, sintetizou-se um tripéptido Met-Lys-Pro pelo método da síntese em fase sólida. Levou-se a cabo a operação de acordo como manual da Applied Biosystems Lda., seguindo-se a desprotecção. Purificou-se o péptido nas Condições de HPLC 1 que se descreveram acima. Em resultado da medição da capacidade de inibição do enzima de conversão da angiotensina apresentada por este material, verificou-se ser um valor quase igual 19 (IC5o = Ο, 19 μg/mL) ao que se havia determinado para o produto extraído da caseína degradada que se obtivera no Exemplo 1. A massa molecular (M) do tripéptido que se obteve foi medida como sendo 374,2 por espectrometria de massa. Quando se levou a cabo uma análise por MS/MS obteve-se um espectro praticamente igual ao da Fig. 1, com o ião principal a m/z = 375,2 (MH+) .

Exemplo 3 Efeito Inibitório do Péptido sobre o Enzima de Conversão da Angiotensina A determinação da inibição do enzima de conversão da angiotensina foi levada a cabo de acordo com o método de Method de Cushman et al. [Biochemical Pharmacology vol. 20, páginas 1637-1648 (1971)].

Utilizaram-se como amostras, os péptídos (Met-Lys-Pro) obtidos no Exemplo 1 e no Exemplo 2, os péptidos (Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro) descritos nas Referências 1 a 3, e o péptido (Leu-Leu-Trp) descrito na Referência 4. Cada um destes péptidos foi sintetizado por via química, da mesma forma que se utilizou no Exemplo 2.

Dissolveu-se a amostra num tampão de borato 0.1 M (contendo NaCl 0,3 M, pH 8,3) e adicionou-se 0,08 mL deste tampão a um tubo. Em seguida, adicionou-se 0,2 mL de um 20 substrato do enzima (Hipuril-histidil-leucina, fabricado pela Sigma Co., Lda.) ajustado a 5 mH com o tampão de borato 0,1 M (contendo NaCl 0,3 M, pH 8,3), e incubou-se a 37°C durante 3 minutos. Em seguida adicionou-se 0,02 mL de enzima de conversão da angiotensina de pulmão de coelho (fabricado pela Sigma Co., Lda.) ajustado a 0,1 U/mL por adição de água destilada, e depois deixou-se reagir a 37°C durante 30 minutos.

Em seguida terminou-se a reacção adicionando 0,25 mL de ácido clorídrico 1 N. Adicionaram-se então 1,7 mL de acetato de etilo, e agitou-se vigorosamente a mistura durante 20 segundos, levando-se a cabo uma centrifugação a 3.000 rpm durante 10 minutos, e em seguida recolhendo-se 1,4 mL de uma fase de acetato de etilo. Depois de se retirar o solvente por aquecimento da fase de acetato de etilo, adicionou-se 1,0 mL de água destilada e mediu-se a absorvância (absorvância a 228 nm) do ácido hipúrico extraido, que se definiu como uma actividade enzimática.

Da equação seguinte, calculou-se a actividade inibidora e em seguida definiu-se o valor de IC50 [a concentração em μg/mL ou em μΜ que é necessária para inibir 50% da actividade do enzima de conversão da angiotensina]. Listam-se os resultados na Tabela 1.

Taxa de Inibição = (A - B) / (A - C) x 100% 21 A: Actividade enzimática (absorvância a 228 nm) quando não existe amostra (péptido). B: Actividade enzimática (absorvância a 228 nm) quando se adiciona a amostra. C: Actividade enzimática (absorvância a 228 nm) quando não se adicionaram nem o enzima nem a amostra.

Tabela 1 Péptido IC só (PM) Péptido do Exemplo 2 (Met-Lys-Pro) 0,5 Val-Pro-Pro 6 Ile-Pro-Pro 4 Leu-Leu-Trp 2,2

Exemplo 4 Efeito Hipotensivo do Péptido em Animais <1> Método do Teste

Doze ratos machos SHR/Hos com 10 semanas de idade (adquiridos à Japan SLC, Inc.) foram preliminarmente mantidos durante 1 semana, e depois mediram-se as tensões sanguíneas dos ratos utilizando um esfigmomanómetro automático, não invasivo, para animais pequenos (MK-2000, fabricado por Muromachi Kikaí Co., Lda.). 22

Repartiram-se os ratos por dois grupos cada um dos quais continha 6 animais, com base na tensão sanguínea sistólica, de forma a que o valor médio da tensão sistólica em cada grupo fosse quase igual, antes da administração. Em seguida jejuaram-se os ratos durante cerca de 16 horas. Para o grupo em teste, dissolveu-se o produto de caseína degradada proveniente da secção <1> do Exemplo 1 em água para injecção, e depois administrou-se por via oral a uma taxa de 10 mL/kg massa corporal (100 mg/kg de massa corporal, para o produto da degradação enzimática da caseína, e 0,05 mg/kg de massa corporal para o péptido (Met-Lys-Pro) da invenção presente). Mediu-se a tensão sanguínea dos ratos 2 horas depois da administração. Para o grupo de controlo, administrou-se por via oral o mesmo volume de água para injecção em vez da solução aquosa contendo o produto resultante da degradação da caseína. Mediu-se a tensão sanguínea dos ratos 2 horas depois da administração. <2> Resultados do Teste

Mostram-se os resultados na Tabela 2. Tal como é evidente na Tabela 2, observou-se uma diminuição da tensão sanguínea no grupo em teste. Por outro lado, esta diminuição não foi observada no grupo de controlo. Verificou-se portanto que o produto da degradação enzimática da caseína, contendo o péptido (Met-Lys-Pro) da invenção presente, possuía um efeito hipotensivo sobre um animal. 23

Tabela 2

Tensão sanguínea Tensão sanguínea sistólica antes da sistólica depois da administração (mm de administração (mm Hg) de Hg) Grupo em teste 182 140 Grupo de controlo 184 177

Exemplo 5 Efeito Hipotensivo do Péptido em Humanos <1> Método do Teste

Os nove sujeitos voluntários eram do sexo masculino com idade de 30 anos ou mais, e com menos de 58 anos, que sofriam de hipertensão moderada, evidenciando tensões sanguíneas sistólicas de entre 140 e 165 mm de Hg na altura do teste de despiste (exame médico por um médico), 3 semanas antes de se iniciar a administração, e que não estavam a tomar qualquer tratamento com agentes hipotensivos.

Repartiram-se os sujeitos entre um grupo para administração em teste, com cinco sujeitos, e um grupo de controlo com quatro, de modo a que os valores médios das tensões sanguíneas medidos na altura do teste de despiste, o hábito de fumar, e as idades, resultassem iguais em ambos os grupos. 24

Foram administrados 3 g do produto de degradação enzimática da caseína, obtido na secção <1> do Exemplo 1 (contendo 1,5 mg do péptido (Met-Lys-Pro) da invenção presente), a título de amostra em teste, uma vez ao dia, e 3 g de dextrina foram administrados como controlo, também uma vez ao dia.

As medições da tensão sanguínea (semanas 0 a 3) foram feitas praticamente em simultâneo.

Listam-se os valores numéricos obtidos (tensões sanguíneas sistólicas) nas Tabelas 3 e 4.

Analisaram-se os valores obtidos (tensão sanguínea sistólíca) com respeito às suas diferenças significativas, por análise de variância num sentido (veja-se, por exemplo, Kiyoshi Ichihara, "Statistics for Bioscience", Quinta Edição, Nankodo Co., Lda., 20 de Novembro de 1991, páginas. 150-151), com um nível de significância de 5% utilizando o programa de análise estatística SPSS (fabricado pela SPSS Inc.). Quando existia uma diferença significativa de valores, comparavam-se os valores médios pelo método de comparação múltipla de Dunnett (veja-se, por exemplo, Kei Takeuchi e 13 outras pessoas, Ed., "Statistics Dictionary", Toyo Keizai Inc., 4 de Dezembro de 1989, pág. 399). 26 conjunto das Ia, 2a e 3a semanas após o início da administração, em relação aos valores anteriores à administração 8semana 0) , enquanto os resultados obtidos para o grupo a que se administraram amostras em teste mostravam que existiam diferenças significativas nas 2a e 3a semanas. Provou-se portanto que o produto de degradação enzimática de caseína contendo o péptido (Met-Lys-Pro) da invenção presente possuía um efeito hipotensivo em seres humanos.

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a invenção presente, proporciona-se um novo péptido útil como inibidor do enzima de conversão da angiotensina. 0 péptido da invenção presente é proveniente de um produto natural e evidencia uma baixa toxicidade e uma elevada segurança. O péptido da invenção presente pode portanto também estar contido como ingrediente activo em produtos alimentares e, a título de concretização do agente hipotensivo, ser processado de modo a integrar produtos alimentares, possuindo efeitos hipotensivos.

Lisboa, 2 de Maio de 2007

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Ura péptido constituído por Met-Lys-Pro.
2. 2. Ura inibidor de enzima de conversão da angiotensina que inclua um péptido constituído por Met-Lys-Pro a título de ingrediente activo.
3. 3. Um agente hipotensivo que inclua um péptido constituído por Met-Lys-Pro a título de ingrediente activo. Lisboa, 2 de Maio de 2007