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Bereich der
Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid und einen Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmer, der das Peptid enthält. Der Angiotensin Converting
Enzyme-Hemmer kann als Nahrungsmittelprodukt, Futterzusatz und Pharmazeutikum
verwendet werden.
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Stand der
Technik
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Angiotensin
Converting Enzyme (ACE) ist ein Enzym, welches auf Angiotensin I
wirkt, das aus Angiotensinogen durch Verdauung mit Renin erzeugt
wird, und wandelt es zu Angiotensin II durch Freisetzen von zwei
Aminosäuren
im C-Terminus davon um. Das Angiotensin Converting Enzyme wirkt
nicht nur bei der Herstellung von Angiotensin II, welches eine starke
blutdrucksteigernde Wirkung aufweist, sondern wirkt auch durch Inaktivieren
von Bradykinin, welches eine blutdrucksenkende Wirkung aufweist.
Wegen dieser Wirkungen wurden Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer
als therapeutische Mittel gegen Bluthochdruck verwendet und es sind
zum Beispiel Captopril (hergestellt von Sankyo Co., Ltd.) und Renivase
(hergestellt von Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.) als kommerziell
erhältliche
Arzneimittel bekannt. Zusätzlich
ist auch bekannt, dass die Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer
eine Wirkung beim Verursachen von Herzhypertrophieregression haben.
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Auf
der anderen Seite wurden Peptide mit Angiotensin Converting Enzyme-Hemmwirkungen
in natürlichen
Produkten oder in Enzym-abgebauten Produkten von Tierproteinen wie
Casein und Gelatine, Pflanzenproteinen wie jene von Weizen, Reis
und Mais, und Fischproteinen wie jene von Sardinen gefunden. Zum
Beispiel schließen
die bekannten Peptide, die in natürlichen Produkten gefunden
werden, Teprotid (Nonapeptid, SQ20881) und Metabolit IS83 vom Actinomyces-Bakterium,
welches zur Gattung Streptomyces gehört, ein (JP 58-177920 A).
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Zusätzlich schließen die
bekannten Enzym-abgebauten Produkte Peptide, die durch Zersetzen
von Casein mit Trypsin erhalten werden (JP 58-109425 A, JP 59-44323
A, JP 59-44324 A, JP 61-36226 A und JP 61-36227 A), Peptide, die
durch Hydrolysieren von Casein mit Thermolysin erhalten werden (JP
6-277090 A, JP 6-277091 A, JP 6-279491 A, JP 7-101982 A und JP 7-101985
A), Peptide, die durch Hydrolysieren von Casein oder dergleichen
mit Milchsäurebakterien
oder einer Kombination von Proteinasen und Peptidasen erhalten werden
(JP 6-197786 A, JP 6-40944 A und JP 2001-136995 A (welche hier jeweils
nachstehend als die „Druckschriften
1 bis 3" bezeichnet
werden), ein. Die Peptide der Druckschriften 1 bis 3 werden als
Nahrungsmittel für
eine spezifizierte Gesundheitsverwendung mit der blutdrucksenkenden
Wirkung verwendet.
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Unter
den vorstehend beschriebenen Peptiden zeigt das in JP 7-101982 A
(hier nachstehend als „Druckschrift
4" bezeichnet) beschriebene
Peptid die höchste
Hemmaktivität
gegen das Angiotensin Converting Enzyme und hat eine vergleichsweise
einfache Struktur eines Tripeptids.
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Offenbarung
der Erfindung
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Wie
vorstehend beschrieben, waren auf dem Fachgebiet verschiedene Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmpeptide bekannt. Jedoch sind jene Peptide
noch in der Hemmaktivität
gegen das Angiotensin Converting Enzyme als eine Funktion in Nahrungsmittelprodukten
ungenügend.
So war es gewünscht,
ein Peptid zu erhalten, welches von einem natürlichen Produkt abgeleitet
ist, mit einer höheren
Hemmaktivität
gegen Angiotensin Converting Enzyme und auch mit einer einfachen
Struktur, und ein solches Peptid in Nahrungsmittelprodukten, Pharmazeutika
oder dergleichen zu verwenden.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung führten umfangreiche Untersuchungen
durch, um das vorstehende Problem zu lösen, und als ein Ergebnis fanden
sie heraus, dass eine Hydrolyse von Casein mit einem speziellen
Enzym ein neues Peptid mit einer hohen Hemmaktivität gegen
Angiotensin Converting Enzyme im Hydrolysat bildet und dass das
Peptid eine Sequenz aufweist, die durch Met-Lys-Pro dargestellt
wird, und sie vervollständigten
damit die vorliegende Erfindung.
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Das
heißt,
die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, welches aus Met-Lys-Pro
besteht (hier nachstehend auch als „erfindungsgemäßes Peptid" bezeichnet).
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Ferner
stellt die vorliegende Erfindung einen Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer
bereit, welcher ein Peptid, das aus Met-Lys-Pro besteht, als Wirkstoff
einschließt.
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Ferner
stellt die vorliegende Erfindung ein blutdrucksenkendes Mittel bereit,
welches ein Peptid, das aus Met-Lys-Pro besteht, als Wirkstoff einschließt.
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
weist eine Sequenz auf, die durch Met-Lys-Pro dargestellt wird.
Zusätzlich
kann das erfindungsgemäße Peptid
die Salze des Peptids sein. In der vorliegenden Erfindung bezeichnet Met
eine L-Methioningruppe, Lys bezeichnet eine L-Lysingruppe und Pro
bezeichnet eine L-Prolingruppe.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
kann durch Hydrolysieren eines Proteins wie Casein mit einer geeigneten
Hydrolase hergestellt werden.
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Nachstehend
wird ein Verfahren zur Hydrolyse eines Proteins mit einer Hydrolase
beispielhaft dargestellt.
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Für die Hydrolyse
eines Proteins mit einem Enzym wird, obwohl die Weise der Behandlung
abhängig von
den Eigenschaften des Proteins variiert, ein Proteinmaterial in
kaltem Wasser oder erwärmtem
Wasser dispergiert und darin gelöst,
wenn das Protein löslich
ist. Wenn das Protein eine schlechte Löslichkeit aufweist, wird es
mit heißem
Wasser gemischt und während
starkem Rühren
homogenisiert.
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Das
Protein ist nicht speziell eingeschränkt, solange es eine Sequenz
enthält,
die durch Met-Lys-Pro dargestellt
wird, und das erfindungsgemäße Peptid
herstellt, wenn es mit einer geeigneten Hydrolase verdaut wird.
So kann jedwedes Protein, welches von einem Tier oder Bakterien
stammt, verwendet werden. Insbesondere ist Casein ein bevorzugtes
Protein, welches in Masse erhältlich
ist.
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Es
ist wünschenswert,
eine Lösung,
welche das Protein enthält,
bei 70 bis 90°C
für ungefähr 15 Sekunden
bis 10 Minuten zu sterilisieren, wegen dem Verhindern der Verschlechterung
durch bakterielle Verschmutzung.
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Anschließend ist
es bevorzugt, den pH-Wert der Protein-enthaltenden Lösung auf
einen optimalen pH-Wert für
eine verwendete Hydrolase oder einen pauschalen pH-Wert davon durch
Zugeben eines basischen Mittels oder eines sauren Mittels zu der
Lösung
einzustellen. Das basische oder saure Mittel, welches im Verfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jedwedes basische
oder saure Mittel sein, solange es in Nahrungsmittelprodukten oder
Pharmazeutika akzeptabel ist. Spezielle Beispiele der basischen Mittel
schließen
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Kaliumcarbonat ein und die sauren
Mittel schließen Salzsäure, Zitronensäure, Phosphorsäure und
Essigsäure
ein.
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Als
Nächstes
wird eine vorher bestimmte Menge einer Hydrolase zu der Proteinlösung gegeben,
um eine Umsetzung bei einer Temperatur von ungefähr 10 bis 85°C für 0,1 bis
48 Stunden durchzuführen.
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Die
Hydrolase ist bevorzugt eine Endopeptidase, obwohl sie nicht speziell
eingeschränkt
ist, solange die Hydrolase das Protein hydrolysieren kann, um das
erfindungsgemäße Peptid
zu erzeugen. Die Endopeptidasen schließen eine Protease, welche von
Bacillus-Bakterien stammt, und eine Protease, welche von Tierbauchspeicheldrüsen stammt,
ein. Jene Enzyme sind kommerziell erhältlich. Eine bevorzugte Protease,
welche von Bacillus-Bakterien stammt, kann beispielhaft dargestellt
werden durch Biopuraze sp-20 (hergestellt von Nagase Biochemical
Industry Inc.) und Protease N (hergestellt von Amano Enzyme Inc.),
während
eine bevorzugte Protease, welche von Tierbauchspeicheldrüsen stammt,
durch PTN6.0S (hergestellt von Novozymes Japan Ltd.) beispielhaft
dargestellt werden kann. Die Protease, welche von Bacillus-Bakterien
stammt, wird wünschenswerterweise
in einem Anteil von 100 bis 5000 aktiven Einheiten pro 1 Gramm Protein
zugegeben. Auf der anderen Seite wird die Protease, welche von Tierbauchspeicheldrüsen stammt,
wünschenswerterweise
in einem Anteil von 3000 bis 8000 aktiven Einheiten pro 1 Gramm
Protein zugegeben.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete Hydrolase kann eine Art
von Hydrolase oder eine Kombination von zwei oder mehr Arten sein.
Wenn zwei oder mehr Hydrolasen verwendet werden, können ihre
Enzymreaktionen gleichzeitig oder unabhängig durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung ist es besonders bevorzugt, ein Gemisch
von Biopuraze sp-20, Protease N und PTN6.0S zu verwenden.
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Eine
Lösung,
zu welcher ein Enzym gegeben wird, wird bei einer geeigneten Temperatur
abhängig vom
Typ des Enzyms gehalten, zum Beispiel 30 bis 60°C, bevorzugt 45 bis 55°C, um die
Hydrolyse des Proteins zu initiieren. Hinsichtlich der Reaktionszeit
der Hydrolyse wird die Umsetzung fortgeführt, bis ein bevorzugter Zersetzungsanteil
erreicht ist, während
der Zersetzungsanteil der Umsetzung überwacht wird. Zum Erhalten
des erfindungsgemäßen Peptids
ist ein Zersetzungsanteil von 20 bis 30% wünschenswert.
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Für ein Verfahren
zur Berechnung des Zersetzungsanteils des Proteins wird der Gesamtstickstoffgehalt
einer Probe durch das Kjeldahl-Verfahren (The Japanese Society for
Food Science and Technology, Herausg., „Food Analysis Method", Seite 102, KORIN
Publishing Co., Ltd., 1984) bestimmt und der Gehalt von Formolstickstoff
in der Probe wird durch das Formoltitrationsverfahren (Manda et
al., Herausg., „Laboratory Manuals
of Food Engineering",
erster Band, Seite 547, Yokendo Co., Ltd., 1970) bestimmt, gefolgt
vom Berechnen des Zersetzungsanteils mit der folgenden Gleichung
unter Verwendung von jenen Messungen. Zersetzungsanteil
(%) = (Formolstickstoffgehalt/Gesamtstickstoffgehalt) × 100
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Der
Abbruch der Enzymreaktion wird zum Beispiel durch Deaktivieren des
Enzyms in der Hydrolyselösung
durchgeführt.
Er kann durch Wärmedeaktivierung
unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens durchgeführt werden.
Die Bedingungen für
eine ausreichende Deaktivierung können in Bezug auf die Erwärmungstemperatur
und eine Retentionszeit der Wärmedeaktivierung
unter Berücksichtigung
einer thermischen Stabilität
des verwendeten Enzyms geeignet bestimmt werden. Zum Beispiel kann
sie in einem Temperaturbereich von 80 bis 130°C für eine Retentionszeit von 30
Minuten bis 2 Sekunden durchgeführt
werden.
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Aus
der vorstehenden Hydrolyselösung
wird bevorzugt das erfindungsgemäße Peptid
isoliert und gereinigt. Die Reinigung des Peptids wird im Allgemeinen
durch die gleiche Technik durchgeführt, wie die, welche bei der
Reinigung eines Oligopeptids verwendet wird, zum Beispiel durch
geeignetes Kombinieren von verschiedenen Arten von Chromatographie,
einschließlich
Ionenaustauschchromatographie, Absorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie,
Verteilungschromatographie und Gelfiltrationschromatographie, Lösungsmittelfällung, Extrahieren
unter Aussalzen, und Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen, usw. Zum Zeitpunkt
der Reinigung des erfindungsgemäßen Peptids
können
Fraktionen, welche Zielmaterialien enthalten, bezogen auf eine Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmwirkung bestimmt werden, was nachstehend beschrieben
wird. Wirkstoffe in jenen Fraktionen können durch Massenspektrometrie
identifiziert werden.
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Darüber hinaus
kann das erfindungsgemäße Peptid
auch durch chemische Synthese hergestellt werden. Die chemische
Synthese des erfindungsgemäßen Peptids
kann durch ein Flüssigphasenverfahren
oder ein Festphasenverfahren, welche im Allgemeinen zur Synthese
eines Oligopeptids verwendet werden, durchgeführt werden. Von dem synthetisierten
Peptid werden, falls erforderlich, Schutzgruppen entfernt und dann werden
nicht umgesetzte Reagenzien, Nebenprodukte und so weiter entfernt.
Eine solche Peptidsynthese kann unter Verwendung eines kommerziell
erhältlichen
Peptidsynthezisers durchgeführt
werden. Die Herstellung des Zielpeptids kann bezogen auf eine Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmwirkung
bestätigt
werden.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
kann als Wirkstoff eines Angiotensin Converting Enzyme-Hemmers verwendet
werden. Das erfindungsgemäße Peptid
hat eine Hemmwirkung auf das Angiotensin Converting Enzyme und eine
unterdrückende
Wirkung auf die Bradykinin-Inaktivierung
und übt
eine blutdrucksenkende Wirkung aus. Deshalb kann es als ein vorbeugendes
Mittel oder ein therapeutisches Mittel gegen verschiedene Erkrankungen,
welche sich von Bluthochdruck ableiten, wie Hirnblutung, Hirninfarkt,
Angina pectoris, Myocardinfarkt und Niereninsuffizienz, verwendet
werden, genauer, es kann als ein blutdrucksenkendes Mittel oder
dergleichen verwendet werden. Zusätzlich ist bekannt, dass der
Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer auch Wirkungen auf den natürlichen
Bluthochdruck, dessen Ursache unbekannt ist, hat, so dass auch erwartet
wird, dass das erfindungsgemäße Peptid
eine therapeutische oder vorbeugende Wirkung auf den natürlichen
Bluthochdruck zeigt. Zusätzlich
kann er als ein therapeutischer oder vorbeugender Arzneistoff für andere
Erkrankungen wie Herzhypertrophie und Angina-Krankheit, bei welchen
man davon ausgeht, dass der Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer
wirksam ist, verwendet werden.
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Der
erfindungsgemäße Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmer kann entweder oral oder parenteral verabreicht
werden, aber die orale Verabreichung ist bevorzugt. Die parenterale
Verabreichung schließt
intravenöse
Injektion, intrarektale Verabreichung und Inhalation ein. Die pharmazeutischen
Formen für
die orale Verabreichung schließen
eine Tablettenform, eine Kapselform, eine Pastillenform, eine Sirupform,
eine Granulaform, eine Pulverform und eine Salbenform ein. Über eine
pharmazeutische Formulierung können
zusätzlich
zu einem Molkenproteinhydrolysat andere Bestandteile wie ein Exzipient,
ein pH-Regulator, ein farbgebendes Mittel und ein Aromastoff für Arzneimittel,
welche im Allgemeinen für
die herkömmliche
pharmazeutische Formulierung verwendet werden, verwendet werden.
Darüber
hinaus kann jedweder Arzneistoff, der auf dem Fachgebiet bekannt
ist oder der in der Zukunft gefunden wird, welcher eine Angiotensin
Convertin Enzyme-Hemmwirkung hat, auch zusammen verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
kann als ein Wirkstoff in einem Nahrungsmittelprodukt enthalten
sein und als eine Ausführungsform
des Angiotensin Converting Enzyme-Hemmers zu einem Nahrungsmittelprodukt
mit einer Angiotensin Converting Enzyme-Hemmwirkung verarbeitet
werden. Ungeachtet der Formen Flüssigkeit,
Paste, Feststoff und Pulver usw. schließen jene Nahrungsmittelprodukte
ein: zusätzlich
zu Bonbons, Flüssignahrungen
und Futterzusätzen
(einschließlich
jene für
Haustiere), Weizenmehlprodukte wie Brot, Makkaroni, Spaghetti, Nudeln,
Brotmischung, Pommes frites-Mischung und Brotkrume; Instant-Nahrungsmittel wie
Instant-Nudeln, Suppennudeln, Nahrungsmittel aus Retortenpackungen,
vorbereitete Nahrungsmittel, Nahrungsmittel in Dosen, Mikrowellenmahlzeiten,
Instant-Suppe oder
Eintopfgericht, Instant-Misosuppe oder Japanische Klare Suppe, Suppe
in Dosen, gefriergetrocknete Nahrungsmittel und andere Instant-Nahrungsmittel;
verarbeitete landwirtschaftliche Produkte wie landwirtschaftliche
Produkte in Dosen, Früchte
in Dosen, Marmelade oder Marmelade aus Zitrusfrüchten, Pickles, gekochte Bohnen,
trockene landwirtschaftliche Nahrungsmittel und Cerealien (aus Körnern zubereitete
Produkte); verarbeitete Meeresprodukte wie Meeresprodukte in Dosen,
Fischschinken oder -würste,
Fischpaste, Meeresproduktdelikatessen und Tsukudanis; verarbeitete
Produkte der Viehzucht wie Viehzuchtprodukte in Dosen, Pasten und
Fleischschinken oder -würste
aus der Viehzucht; Milch und Milchprodukte wie verarbeitete Milch,
Milchgetränke,
Yoghurt, Milchsäurebakteriengetränke, Käse, Eiscreme,
modifizierte Trockenmilch, Sahne und andere Milchprodukte; Fette
und fette Öle wie
Butter, Margarine und Pflanzenöle;
Grundwürzmittel
wie Sojasauce, Miso, Saucen, aus Tomaten zubereitete Würzmittel,
süße Reisweine
zum Kochen und Essig; komplexe Würzmittel
und Nahrungsmittel wie Kochmischung, Curryvormischung, Bratenfonds,
Dressings, Nudelsuppen, Gewürze
und andere komplexe Würzmittel;
gefrorene Nahrungsmittel wie gefrorene Nahrungsmittelmaterialien,
gefrorene halb vorbereitete Nahrungsmittel und kochfertige gefrorene
Nahrungsmittel; Süßigkeiten
wie Karamell, Bonbons, Kaugummis, Schokolade, Kekse, Biskuits, Kuchen,
Torten, Snacks, Cracker, Japanische Süßigkeiten, Reisbiskuits, Bohnensüßigkeit,
Desserts und andere Süßigkeiten;
Getränke
mit Geschmack wie Getränke
mit Kohlensäure,
natürliche Fruchtsäfte, Fruchtsaftgetränk, Softdrink,
welcher Fruchtsaft enthält,
Getränk
mit Fruchtfleisch, Fruchtgetränk, welches
Beeren enthält,
vegetarisches Getränk,
Sojabohnenmilch, Sojabohnenmilchgetränk, Kaffeegetränk, Teegetränk, Pulvergetränk, konzentriertes
Getränk,
Sportdrinks, Ernährungsgetränk und alkoholische
Getränke
und andere Getränke
mit Geschmack; und andere Nahrungsmittelprodukte auf dem Markt wie
Babynahrungsmittel, Fischmehl und gekochter Reis mit Teepaste.
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Im
erfindungsgemäßen Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmer beträgt
der Gehalt des erfindungsgemäßen Peptids
bevorzugt mindestens 0,001 Gew.-% in Bezug auf die Endzusammensetzung
des Angiotensin Converting Enzyme-Hemmers.
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Die
Dosierung des erfindungsgemäßen Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmers variiert abhängig vom Alter, den Symptomen
und so weiter. Im Allgemeinen wird der Hemmer jedoch in einer Dosierung
von 0,001 bis 3000 mg/Tag, bevorzugt 0,01 bis 30 mg/Tag, verabreicht,
ferner kann er entweder einmal am Tag oder zwei- oder dreimal am
Tag verabreicht werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1 veranschaulicht
die Ergebnisse einer MS/MS-Analyse eines erfindungsgemäßen Peptids.
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Beste Weise
zur Durchführung
der Erfindung
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Als
Nächstes
wird die vorliegende Erfindung detaillierter mit Beispielen beschrieben.
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Beispiel 1 Herstellung
des Peptids durch Enzymabbau von Casein
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<1> Enzymabbau
von Casein
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900
g Wasser wurden zu 100 g kommerziell erhältlichem Casein (hergestellt
von New Zealand Dairy Board) gegeben und das Casein wurde gut darin
dispergiert. Dann wurde der pH-Wert der resultierenden Lösung auf
7,0 durch die Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt, um das Casein
vollständig
zu lösen,
und dabei wurde eine wässrige
Lösung
von Casein mit einer Konzentration von etwa 10% hergestellt. Die
wässrige
Lösung
von Casein wurde bei 85°C
für 10
Minuten wärme-sterilisiert
und dann auf eine Temperatur von 50°C eingestellt, gefolgt von Einstellen
des pH-Werts davon auf 9,5 durch die Zugabe von Natriumhydroxid.
Danach wurden 100.800 aktive Einheiten (1.200 aktive Einheiten pro
1 Gramm Protein) von Biopuraze sp-20 (hergestellt von Nagase Biochemical
Industry Inc.), 168.000 aktive Einheiten (2.000 aktive Einheiten
pro 1 Gramm Protein) von Protease N (hergestellt von Amano Enzyme
Inc.) und 588.000 aktive Einheiten (7.000 aktive Einheiten pro 1
Gramm Protein) von PTN6.0S (hergestellt von Novozymes Japan Ltd.)
zu der Lösung
gegeben, um eine Hydrolysereaktion zu initiieren. Als der Zersetzungsanteil
von Casein 24,1% erreicht hatte, wurde das Enzym durch Erwärmen auf
80°C für 6 Minuten
deaktiviert, um die Enzymreaktion abzubrechen, und es folgte Abkühlen auf
10°C. Diese
Hydrolyselösung
wurde durch eine Extrafiltrationsmembran (hergestellt von Asahi Kasei
Corporation) eines Fraktionsmolekulargewichts von 3.000 extra-filtriert
und dann wurde sie konzentriert und es folgte Gefriertrocknen, was
in 85 g eines gefriergetrockneten Produkts resultierte.
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<2> Isolierung
des Peptids durch HPLC
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Das
Caseinhydrolysat wurde durch Umkehrphasen-HPLC getrennt. Die Bedingungen
der HPLC werden in der nachstehend beschriebenen HPLC-Bedingung
1 beschrieben.
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[HPLC-Bedingung 1]
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- Säule:
CAPCELL PAK C18 (UG120, 5 μm)
- 20 mm I.D. × 250
mm (Shiseido Co., Ltd.)
- Detektion: UV 215 nm
- Fließrate:
16 ml/min
- Eluent A: 1%ige wässrige
Acetonitril-Lösung,
welche 0,05% TFA enthält
- Eluent B: 25%ige wässrige
Acetonitril-Lösung,
welche 0,05% TFA enthält
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Unter
der linearen Gradienten-Bedingung von 100% Eluent A zu 100% Eluent
B nach 40 Minuten wurde ein Hydrolysat getrennt. Für jede eluierte
Fraktion wurde das Angiotensin Converting Enzyme-Hemmvermögen durch
das später
beschriebene Verfahren bestimmt. Als ein Ergebnis wurde ein Peptid
mit dem Angiotensin Converting Enzyme-Hemmvermögen bei einer Retentionszeit
von 22 Minuten eluiert. Zum Reinigen des Peptids wurde es weiter
durch HPLC gereinigt. Diese Bedingung ist nachstehend als HPLC-Bedingung
2 bereitgestellt.
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[HPLC-Bedingung 2]
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- Säule:
CAPCELL PAK C18 (UG300, 5 μm)
- 2,0 mm I.D. × 250
mm (Shiseido Co., Ltd.)
- Detektion: UV 215 nm
- Fließrate:
0,2 ml/min
- Eluent A: 1%ige wässrige
Acetonitril-Lösung,
welche 0,05% TFA enthält
- Eluent B: 10%ige wässrige
Acetonitril-Lösung,
welche 0,05% TFA enthält
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Unter
der linearen Gradienten-Bedingung von 100% Eluent A zu 100% Eluent
B nach 15 Minuten wurde das starke Angiotensin Converting Enzyme-Hemmvermögen bei
einem Peak mit einer Retentionszeit von 13 Minuten beobachtet. Das
Angiotensin I Converting Enzyme-Hemmvermögen bei diesem Peak war so,
dass der IC50-Wert [eine Konzentration (μg/ml), die
zur Hemmung von 50% der Angiotensin Convertin Enzyme-Aktivität erforderlich
ist] = 0,18 μg/ml
war.
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Die
Verbindung in dem vorstehenden Aktivitätspeak wurde durch die Proteinsequenziervorrichtung (Modell
473A) von Applied Biosystems Ltd. identifiziert. Als ein Ergebnis
wurde gefunden, dass die Verbindung eine neue Struktur von Met-Lys-Pro
hatte. Darüber
hinaus wurde das Molekulargewicht (M) als 374,2 unter Verwendung
des Massenspektrometers LCQ von Thermoquest Co., Ltd. identifiziert
und Tochterionen von m/z = 260, 215 und 129 usw. wurden durch die
MS/MS-Analyse mit einem Molekülion
von m/z = 375,2 (MH+) nachgewiesen, wie in 1 gezeigt.
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Folglich
wurde aufgeklärt,
dass die Struktur des Peptids mit einem Angiotensin Converting Enzyme-Hemmvermögen H-Met-Lys-Pro-OH
war. 42,5 mg eines Tripeptids Met-Lys-Pro waren in dem gefriergetrockneten
Produkt (85 g) enthalten.
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Beispiel 2 Chemische Synthese
des Peptids
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Unter
Verwendung einer Peptidsynthetisiervorrichtung (Modell 433A, Applied
Biosystems Ltd.) und auch unter Verwendung von Fmoc-L-Met (Applied
Biosystems Ltd.), Fmoc-Lys (Boc) (Applied Biosystems Ltd.) und Fmoc-Pro-TrtA-PEG
Harz (Watanabe Kagaku Kogyo K. K.) als Rohmaterialien wurde ein
Tripeptid Met-Lys-Pro durch ein Festphasensyntheseverfahren synthetisiert.
Der Vorgang wurde gemäß der Anleitung von
Applied Biosystems Ltd., gefolgt vom Entfernen der Schutzgruppen,
durchgeführt.
Das Peptid wurde unter der vorstehend beschriebenen HPLC-Bedingung
1 gereinigt. Als ein Ergebnis der Messung des Angiotensin Convering
Enzyme-Hemmvermögens
unter Verwendung dieses Materials wurde nahezu der gleiche Wert (IC50-Wert = 0,19 μg/ml) erhalten, wie der von
einem Material, welches aus dem Casein-abgebauten Produkt, das in
Beispiel 1 erhalten worden war, extrahiert wurde.
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Das
Molekulargewicht (M) des erhaltenen Tripeptids wurde durch Massenspektrometrie
zu 374,2 bestimmt. Nahezu das gleiche Spektrum wie in 1 wurde
durch die MS/MS-Analyse mit dem Molekülion m/z = 375,2 (MH+) erhalten.
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Beispiel 3 Angiotensin
Converting Enzyme-Hemmwirkung des Peptids
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Die
Messung der Angiotensin Convering Enzyme-Hemmung wurde gemäß dem Verfahren
von Cushman et al. [Biochemical Pharmacology Bd. 20, Seiten 1637–1648 (1971)]
durchgeführt.
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Als
Proben wurden die Peptide (Met-Lys-Pro), die in Beispiel 1 und Beispiel
2 erhalten wurden, die Peptide (Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro), die in
den Druckschriften 1 bis 3 beschrieben werden, und das Peptid (Leu-Leu-Trp),
das in der Druckschrift 4 beschrieben wird, verwendet. Jedes jener
Peptide wurde chemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 synthetisiert.
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Die
Probe wurde in einem 0,1 M Borat-Puffer (der 0,3 M NaCl enthielt,
pH-Wert 8,3) gelöst
und 0,08 ml davon wurden dann in ein Röhrchen gegeben. Danach wurden
0,2 ml eines Enzymsubstrats (Hippuryl-histidyl-leucin, hergestellt
von Sigma Co., Ltd.), das mit dem 0,1 M Borat-Puffer (der 0,3 M
NaCl enthielt, pH-Wert 8,3) auf 5 mM eingestellt worden war, zugegeben
und dann wurde bei 37°C
für 3 Minuten
inkubiert. Dann wurden 0,02 ml des Kaninchenlungen-Angiotensin Converting
Enzyme (hergestellt von Sigma Co., Ltd.), welches durch Zugeben
von destilliertem Wasser auf 0,1 U/ml eingestellt worden war, zugegeben
und dann wurde bei 37°C
für 30
Minuten umgesetzt.
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Darauffolgend
wurde die Umsetzung durch Zugeben von 0,25 ml 1 N Salzsäure abgebrochen.
Dann wurden 1,7 ml Ethylacetat zugegeben und das Gemisch wurde für 20 Sekunden
stark gerührt
und es wurde eine Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 Minuten durchgeführt, gefolgt
von Sammeln von 1,4 ml einer Ethylacetat-Schicht. Nach dem Entfernen
eines Lösungsmittels
durch Erwärmen
der erhaltenen Ethylacetat-Schicht wurden 1,0 ml destilliertes Wasser
zugegeben und die Absorption (228 nm Extinktion) der extrahierten
Hippursäure
wurde gemessen und als eine Enzymaktivität definiert.
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Durch
die folgende Gleichung wurde die Hemmaktivität berechnet und dann wurde
der IC50-Wert [die Konzentration (μg/ml oder μM), die zur
Hemmung von 50% Angiotensin Converting Enzyme-Aktivität erforderlich
ist] definiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Hemmrate
= (A – B)/(A – C) × 100
- A:
Enzymaktivität
(228 nm Extinktion) im Falle, dass keine Probe (Peptid) enthalten
ist.
- B: Enzymaktivität
(228 nm Extinktion), als die Probe zugegeben wurde.
- C: Enzymaktivität
(228 nm Extinktion), als das Enzym und die Probe nicht zugegeben
wurden.
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Beispiel 4 Blutdrucksenkende
Wirkung des Peptids beim Tier
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<1> Testverfahren
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Zwölf 10 Wochen
alte männliche
SHR/Hos-Ratten (gekauft von Japan SLC, Inc.) wurden vorbereitend für 1 Woche
vorgehalten und dann wurden die Blutdrucke der Ratten unter Verwendung
des nicht invasiven automatischen Blutdruckmessgeräts für ein kleines
Tier (MK-2000, hergestellt von Muromachi Kikai Co., Ltd.) gemessen.
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Die
Ratten wurden in zwei Gruppen, welche jeweils 6 Tiere einschlossen,
bezogen auf einen systolischen Blutdruck eingeteilt, das heißt, dass
der systolische Blutdruck von jeder Gruppe vor der Verabreichung nahezu
beim gleichen Wert liegen sollte. Danach ließ man die Ratten für etwa 16
Stunden fasten. Für
die Testgruppe wurde das Enzym-abgebaute Produkt von Casein, das
im Abschnitt <1> von Beispiel 1 erhalten
worden war, in Wasser für
Injektion gelöst
und dann oral mit einer Rate von 10 ml/kg Körpergewicht verabreicht (100 mg/kg
Körpergewicht
für das
Enzym-abgebaute Produkt von Casein und 0,05 mg/kg Körpergewicht
für das
erfindungsgemäße Peptid
(Met-Lys-Pro)). Der Blutdruck der Ratten wurde 2 Stunden nach der
Verabreichung gemessen. Für
die Kontrollgruppe wurde das gleiche Volumen an Wasser für Injektion
oral anstelle der wässrigen
Lösung,
welche das Enzym-abgebaute Produkt von Casein enthielt, verabreicht.
Der Blutdruck der Ratte wurde 2 Stunden nach der Verabreichung gemessen.
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<2> Testergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich
ist, wurde bei der Testgruppe ein Abfall beim Blutdruck beobachtet.
Auf der anderen Seite wurde keiner bei der Kontrollgruppe beobachtet. Deshalb
wurde gefunden, dass das Enzym-abgebaute Produkt von Casein, welches
das erfindungsgemäße Peptid
(Met-Lys-Pro) enthielt, eine blutdrucksenkende Wirkung auf ein Tier
hatte.
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Beispiel 5 Blutdrucksenkende
Wirkung des Peptids beim Menschen
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<1> Testverfahren
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Neun
Empfänger
waren männliche
Freiwillige im Alter von 30 oder höher und niedriger als 58, die
unter einem leichten Bluthochdruck litten, wobei sie systolische
Blutdrucke von 140 bis 165 mmHg zum Zeitpunkt eines Durchmusterungstests
(medizinische Untersuchung durch einen Arzt) 3 Wochen vor dem Beginn
der Einnahme zeigten, und die keine Behandlung mit einem blutdrucksenkenden
Mittel erhielten.
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Die
Empfänger
wurden in die Gruppe zur Aufnahme einer Testprobe mit fünf Empfängern und
die Kontrollgruppe mit vier Empfängern
aufgeteilt, so dass die Blutdruckwerte, die zum Zeitpunkt des Durchmusterungstests
gemessen wurden, eine Rauchgewohnheit und das Alter zwischen den
Gruppen ausgeglichen sein sollten.
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3
g des Enzym-abgebauten Produkts von Casein, welches im Abschnitt <1> von Beispiel 1 erhalten wurde
(das 1,5 mg des erfindungsgemäßen Peptids
(Met-Lys-Pro) enthielt), wurden als eine Testprobe einmal am Tag
genommen und 3 g Dextrin wurden als eine Kontrolle einmal am Tag
genommen. Die Blutdruckmessung (0. bis 3. Woche) wurde nahezu zur
gleichen Zeit durchgeführt.
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Die
erhaltenen Zahlenwerte (systolischer Blutdruck) sind in den Tabellen
3 und 4 gezeigt.
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Die
erhaltenen Zahlenwerte (systolischer Blutdruck) wurden in Bezug
auf den wesentlichen Unterschied davon durch die Einwegvariationsanalyse
(siehe zum Beispiel Kiyoshi Ichihara, „Statistics for Bioscience", fünfte Ausgabe,
Nankodo Co., Ltd., 20. November 1991, S. 150–151) mit einem Signifikanzlevel
von 5% unter Verwendung der statistischen Analysesoftware SPSS (hergestellt
von SPSS Inc.) analysiert. Wenn ein signifikanter Unterschied in
den Werten vorlag, wurden mittlere Werte durch das Dunnett's-Mehrfachvergleichsverfahren (siehe zum
Beispiel Kei Takeuchi und 13 andere Personen, Herausg., „Statistics
Dictionary", Toyo
Keizai Inc., 4. Dezember 1989, S. 399) verglichen.
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Tabelle
3 Ergebnisse der Gruppe zur Aufnahme einer Testprobe (Einheit des
systolischen Blutdrucks mmHg)
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Tabelle
4 Ergebnisse der Kontrollgruppe (Einheit des systolischen Blutdrucks
mmHg)
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<2> Testergebnisse
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Als
Ergebnisse der Analyse mit der statistischen Analysesoftware SPSS
wurde kein signifikanter Unterschied in der Kontrollgruppe bei allen
der 1., 2. und 3. Wochen nach der Verabreichung in Bezug auf vor
der Verabreichung (0. Woche) gefunden, während die Ergebnisse erhalten
wurden, dass es signifikante Unterschiede bei den 2. und 3. Wochen
nach der Verabreichung in der Gruppe zur Aufnahme einer Testprobe
gab. Deshalb wurde nachgewiesen, dass das Enzym-abgebaute Produkt
von Casein, welches das erfindungsgemäße Peptid (Met-Lys-Pro) enthielt,
eine blutdrucksenkende Wirkung beim Menschen hatte.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein neues Peptid bereitgestellt, welches als ein
Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer nützlich ist. Das erfindungsgemäße Peptid
ist von einem natürlichen
Produkt abgeleitet und zeigt eine niedrige Toxizität und eine
hohe Sicherheit. So kann das erfindungsgemäße Peptid auch als Wirkstoff
in Nahrungsmittelprodukten enthalten sein und als eine Ausführungsform
des blutdrucksenkenden Mittels zu Nahrungsmittelprodukten mit blutdrucksenkenden
Wirkungen verarbeitet werden.
