JP2002193997A - 蛋白質分解酵素によるローヤルゼリーの分解組成物とそれを含有する食品組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血圧降下作用を奏し、かつ、たとえば機能
性食品等として利用可能な安全性の高い食品用素材を提
供する。 【解決手段】ローヤルゼリーを、ペプシン並びにトリプ
シン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られる
分解組成物。そして、該分解組成物を含有してなる食品
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質酵素分解組
成物とそれを含有する食品組成物に関し、より詳細に
は、ローヤルゼリーの蛋白質分解酵素による分解組成物
とそれを含有する食品組成物に関する。本発明のローヤ
ルゼリー分解組成物（以下、「本分解組成物」とい
う。）は、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性にもと
づく血圧降下作用を奏するので、本分解組成物やそれを
含有する食品組成物は、高血圧の予防、改善等に有用で
ある。

【０００２】

【従来の技術】わが国における生活習慣病の重大な疾患
の一つとされる高血圧症は、心筋梗塞といった心疾患や
脳梗塞や脳閉塞といった脳血管疾患等のような重篤な疾
患の原因となり得ることが知られている。このため高血
圧症は、早期の改善が必要であり、軽症の段階から高血
圧発症の予防をするのが望ましい。高血圧症は、本態性
高血圧症とニ次性高血圧症とに大まかに分類される。こ
れら両者のうち高血圧症の約９０％を占める本態性高血
圧症は、食品からの食塩の過剰摂取や、レニン−アンジ
オテンシン−アルドステロン系やカリクレイン−キニン
−プロスタグランジン系の調節不全、カテコラミン分泌
過剰などの相互作用により発症する。また、生体内の血
圧維持機構には、昇圧系であるレニン−アンジオテンシ
ン系と降圧系であるカリクレイン−キニン系が深く関っ
ているとされ、特にレニン−アンジオテンシン系におい
て強力な昇圧物質であるアンジオテンシンＩＩの生成
は、昇圧に関して最も重要な因子であるとされている。

【０００３】従って、高血圧症の改善を図るためには、
臨床学的及び食品化学的にもアンジオテンシンＩＩの生
成とその作用を抑制することが重要である。このため、
高血圧症の改善のためには、アンジオテンシンＩをアン
ジオテンシンＩＩに変換することでアンジオテンシンＩ
Ｉの直接的な生成を担うアンジオテンシンＩ変換酵素
（以下、「ＡＣＥ」という）の活性を阻害することが有
力な方法のひとつとされている。このようなＡＣＥ活性
阻害作用を有する降圧薬としては、たとえば、カプトプ
リルが市販に供されている。しかしながら、従来、降圧
剤として市場に供されてきたこのような医薬品は、優れ
た薬効を奏する反面、多くの場合副作用等を有していて
安全性に問題があり、当該疾患を日常の食生活のなかで
予防、改善してゆくために使用することは困難であっ
た。一方、古来から栄養価が高く様々な効用をもたらす
ものとして珍重され、食されてきたものとしてローヤル
ゼリーがある。経験的には、ローヤルゼリーを摂取する
ことにより高血圧症を予防、改善できると言われている
が、その生理活性物質について解明した報告は少なく、
当該報告の多くは１０−ヒドロキシデセン酸の活性を報
告したものである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明では、
的確な血圧降下作用を奏し、かつ、たとえば機能性食品
等として利用可能な安全性の高い食品用素材を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ローヤルゼリ
ーを所定の蛋白質分解酵素で分解して得られた分解組成
物が優れた血圧降下作用、とくにアンジオテンシンＩ変
換酵素阻害活性、を奏することを見いだし、本発明を完
成するに至った。本発明の第１の態様によれば、ローヤ
ルゼリーを、ペプシン並びにトリプシン及び／又はキモ
トリプシンにより処理して得られる分解組成物（本分解
組成物）が提供される。なお、ここにいう「ペプシン並
びにトリプシン及び／又はキモトリプシンにより処理」
するとは、（１）ペプシンとトリプシンとによって処理
すること、（２）ペプシンとキモトリプシンによって処
理すること、（３）ペプシンとトリプシンとキモトリプ
シンとにより処理すること、の（１）、（２）及び
（３）の全ての場合を含む概念である。

【０００６】本発明の第２の態様によれば、上記第１の
態様において、ペプシンとトリプシンとキモトリプシン
とにより処理して得られる本分解組成物が提供される。
本発明の第３の態様によれば、上記第１又は２記載の態
様において、ペプシンにより処理された後、トリプシン
及び／又はキモトリプシンによって処理されたものであ
る本分解組成物が提供される。本発明の第４の態様によ
れば、上記第１乃至３のいずれかに記載の態様におい
て、Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, P
he-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr
-Phe,Phe-Asn-Pheおよびそれらの塩からなる群から選ば
れる少なくとも一のものを含有する本分解組成物が提供
される。

【０００７】本発明の第５の態様によれば、上記第１乃
至４のいずれかに記載の態様において、アンジオテンシ
ンＩ変換酵素に対する阻害を目的として用いられるもの
である本分解組成物が提供される。本発明の第６の態様
によれば、上記第１乃至５のいずれかに記載の態様にお
いて、高血圧症の予防、改善又は治療を目的として用い
られるものである本分解組成物が提供される。本発明の
第７の態様によれば、上記第１乃至６のいずれかに記載
の態様における本分解組成物を含有してなる食品組成物
が提供される。本発明の第８の態様によれば、上記第７
の態様において、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果
を奏する量の本分解組成物を含有するものである、食品
組成物が提供される。

【０００８】なお、本明細書及び図面において、特に断
りがない限り、「％」は重量％をいうものとする。 ま
た、上記１０種のペプチドを示す式中の記号において、
Ｔｙｒはチロシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｐｈｅはフェ
ニルアラニンを、Ａｌａはアラニンを、Ｖａｌはバリン
を、Ｌｅｕはロイシンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｍ
ｅｔはメチオニンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ａｓｐはア
スパラギン酸を、Ｔｈｒはトレオニンを、そしてＡｓｎ
はアスパラギンを表す。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明に係るローヤルゼリー分解
組成物（本分解組成物）は、アンジオテンシンＩ変換酵
素の活性を阻害する性質を有していることから、アンジ
オテンシンＩ変換酵素の作用によって生じる疾患の予防
および改善に用いる食品類（例えば、機能性食品）の有
効成分として使用することができる。例えば、アンジオ
テンシンＩ変換酵素の機能が過剰に亢進しバランスが崩
れることによって生じる疾患としては、現在わかってい
るものだけでも、高血圧症、またこれから誘発される冠
動脈疾患や心筋梗塞といった心疾患、脳血管障害、腎障
害等があり、本発明に係るローヤルゼリー分解組成物
（本分解組成物）は、これら疾患の予防および改善に用
いることができる。

【００１０】本発明によれば、本発明に係るローヤルゼ
リー分解組成物（本分解組成物）は、ローヤルゼリーを
ペプシン、並びにトリプシンおよび/またはキモトリプ
シンで分解処理すること、即ち、前述の通り、（１）ロ
ーヤルゼリーをペプシンとトリプシンとによって処理す
ること、（２）ローヤルゼリーをペプシンとキモトリプ
シンによって処理すること、（３）ローヤルゼリーをペ
プシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処理する
こと、のいずれかにより製することができる。分解処理
に供するローヤルゼリーは、いかなるものであってもよ
く、女王蜂を育てるために蜜蜂が分泌するものを広く用
いることができる。また、このようにして収集した生ロ
ーヤルゼリーをそのまま用いても良く、或いは、生ロー
ヤルゼリーを適宜前処理して得た蛋白画分を用いても良
い。当該前処理した蛋白画分としては、たとえば、生ロ
ーヤルゼリーを遠心分離、アルコール沈殿、硫安処理、
加熱処理して採取した蛋白画分を好適に用いることがで
きる。それ故、本発明において「ローヤルゼリー」と称
するときは、上記生ローヤルゼリーそれ自体、およびこ
れから採取した蛋白画分のいずれをも包含するものと理
解されるべきものである。

【００１１】ローヤルゼリーの分解に供しうるペプシ
ン、トリプシンおよびキモトリプシンとしては、特に限
定はなく、たとえば一般に市販されているものをいずれ
も用いることができる。ペプシンとしては、たとえば、
豚、牛、羊等哺乳動物の胃粘膜由来のもの、トリプシン
およびキモトリプシンとしては、たとえば、豚、牛、羊
等哺乳動物の膵臓、脾臓由来のものなどを、何れも好適
に用いることができる。

【００１２】ローヤルゼリーの上記蛋白質分解酵素によ
る酵素処理は、常法にしたがい、例えば、水性溶媒中約
１５℃から約５０℃、好ましくは約２０℃から約４５℃
で、適宜実施することができる。また、この際、反応液
の液性は、使用する蛋白質分解酵素の種類に応じて、適
宜調整することができる。例えば、蛋白質分解酵素とし
て、ペプシンを用いた場合はｐＨ０．５から５で、トリ
プシン、キモトリプシンを用いた場合にはｐＨ６から１
０で適宜実施することができる。反応溶媒は、水性溶媒
であれば、特に制限はなく、たとえば含水アルコールを
適宜用いることができる。

【００１３】また、当該酵素処理は、ペプシンによる分
解処理と、トリプシン及び／又はキモトリプシンによる
分解処理と、のいずれを先に行うようにしてもよいが、
ペプシン分解処理の後にトリプシン及び/又はキモトリ
プシン分解処理を行うのがより好ましい。さらに、トリ
プシン及び／又はキモトリプシンによる酵素処理は、ト
リプシン又はキモトリプシンのいずれか少なくとも一種
を用いて行うことができるが、トリプシンとキモトリプ
シンとの両方を用いるようにすれば（即ち、この場合
は、ペプシンとトリプシンとキモトリプシンとにより処
理される。）、更に好ましい。

【００１４】上記本発明によれば、アンジオテンシンＩ
変換酵素阻害活性にもとづく優れた血圧降下作用を奏す
るローヤルゼリー分解組成物（本分解組成物）を得るこ
とができる。例えば、ローヤルゼリー自体はなんらアン
ジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示さないが、本発明
に係るローヤルゼリー分解組成物は、後記実施例に示す
とおり、ペプシン単独処理して得られるローヤルゼリー
分解組成物と対比して、約４倍強力な同酵素阻害活性を
示すことができる。

【００１５】さらに、酵素処理で使用するペプシン、ト
リプシン、キモトリプシンはそれぞれ異なるペプチド切
断点をもつため、本発明に係るローヤルゼリー分解組成
物（本分解組成物）は、これら２乃至３種のプロテアー
ゼの併用によって生成する固有のペプチドを含有し、た
とえば、後記実施例記載の反応条件にしたがえば、Lys-
Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, Phe-Tyr,I
le-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe
-Asn-Phe等のジまたはトリペプチドを含むローヤルゼリ
ー分解組成物として得ることができる。

【００１６】後記実施例に示すとおり、これらのジペプ
チドまたはトリペプチドは各々優れたアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害活性を示す。しかし、これら活性成分の
生成比および生成量或いはさらにこれら活性成分のうち
の個々の成分の生成の有無は、使用原料の種類やその酵
素反応条件によって変動しうるものであるから、本発明
に係るローヤルゼリー分解組成物は、これら１０種ペプ
チドを全て含むものには限定されない。即ち、その酵素
処理条件を前記本発明の態様の範囲内で適宜選択して得
られるものであって、かつアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害活性を示す有効成分を含むものは本発明の範囲に含
まれるものであり、例えば、Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-
Lys-Tyr,Ile-Val-Tyr, Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-T
yr,Asp-Gly-Leu,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Pheからなる群か
ら選ばれる少なくとも一種のペプチドを含むものは、す
べて本発明の範囲に含まれるものである。

【００１７】本発明のローヤルゼリー分解組成物（本分
解組成物）としては、上記酵素処理で得られた溶液をそ
のまま用いることができ、或いはより好ましくは、上記
酵素処理溶液を蛋白変性処理（例えば、熱処理）して蛋
白質分解酵素を失活し、必要に応じてこれを乾燥粉末化
（例えば、凍結乾燥）したものとして使用する。また、
その際、当該分解組成物に含まれるペプチドは、必要に
応じて、生理的に許容しうる各種無機酸または有機酸と
の塩、例えば、塩酸塩等としておくこともできる。

【００１８】本発明に係るローヤルゼリー分解組成物
（本分解組成物）は、機能性食品、健康食品、健康志向
食品等のような食品組成物として使用することができ
る。当該用途に使用するに際しては、本発明のローヤル
ゼリー分解組成物をそのままこれらの食品組成物として
利用することができ、或いは、当該分解組成物を、例え
ば水、アルコール、ビタミン、ミネラル、でんぷん質、
蛋白質、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、着香料、着色
料、甘味料、調味料、香辛料、乳化剤、防腐剤、保存
料、防カビ剤、殺菌剤、酸化防止剤のごとき食品に通常
用いられる原料及び/又は素材の１または複数とともに
配合して使用することもできる。食品組成物の個々の使
用形態に応じて溶液状、懸濁液状、シロップ状、クリー
ム状、ペースト状、ゼリー状、粉末状、顆粒状、粒状、
チュアブル状、或いはそれ以外の所望の形状で、必要に
応じて成形して使用することもできる。

【００１９】本発明に係るローヤルゼリー分解組成物の
当該食品組成物への配合割合は、特に限定されず、当該
食品組成物の使用目的、使用形態および使用量に応じ、
適宜選択することができる。なお、当該食品組成物が、
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を奏する量の本分
解組成物を含有するようにするには、通常、タンパク質
由来の加水分解物量に換算して、食品組成物１００重量
部あたり０．ｌから９０重量部の範囲内である。

【００２０】また、本発明に係るローヤルゼリー分解組
成物（本分解組成物）を添加・配合して調製しうる食品
組成物の具体的形態としては、例えば、飲料類（清涼飲
料（コーヒー、ココア、ジュース、ミネラル飲料、茶飲
料、緑茶、紅茶、烏龍茶等）、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨ
ーグルト飲料、炭酸飲料、酒類（日本酒、洋酒、果実
酒、はちみつ酒等）等）、スプレッド（カスタードクリ
ーム、バタークリーム、ピーナツクリーム、チョコレー
トクリーム、チーズクリーム等）、ペースト（フルーツ
ペースト、野菜ペースト、ゴマペースト、海藻ペースト
等）、洋菓子（チョコレート、ドーナツ、パイ、シュー
クリーム、エクレア、マフィン、ワッフル、ガム、グ
ミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビス
ケット、スナック菓子、ケーキ、プリン等）、和菓子
（飴、煎餅、かりんとう、あられ、団子、おはぎ、大
福、豆もち、餅、餡、饅頭、カステラ、あんみつ、羊か
ん等）、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シ
ャーベット、かき氷等）、レトルト食品（カレー、牛
丼、中華丼、雑炊、おかゆ、味噌汁、スープ、ミートソ
ース、デミグラスソース、ミートボール、ハンバーグ、
おでん種、赤飯、焼き鳥、茶碗蒸し等）、即席食品（即
席ラーメン、即席うどん、即席そば、即席焼きそば、即
席スパゲティ、即席ワンタン麺、即席しるこ、味噌汁の
素、粉末スープの素、粉末ジュースの素、ホットケーキ
ミックス等）、瓶詰・缶詰、ゼリー状食品（ゼリー、寒
天、テリーヌ、ゼリー状飲料等）、調味料（食塩、天然
塩、醤油、みりん、酢、砂糖、蜂蜜、味噌、ドレッシン
グ、旨味調味料、複合調味料、ソース、マヨネーズ、ケ
チャップ、ふりかけ、天つゆ、麺つゆ、だしの素、中華
スープの素、中華の素（麻婆豆腐の素、チンジャオロー
スの素）、ブイヨン、焼肉のたれ、冷しゃぶのたれ、カ
レールー、シチューのルー等）、養蜂産品（はちみつ、
ローヤルゼリー、プロポリス、花粉荷（花粉だんご）、
蜂の子等）、乳製品（牛乳、チーズ、ヨーグルト、生ク
リーム等）、加工果実（ジャム、マーマレード、シロッ
プ漬、干し果実等）、加工野菜（野菜ジャム等）、穀類
加工食品（麺、パスタ、パン、ビーフン等）、漬物（た
くあん、奈良漬、キムチ漬、福神漬、らっきょう漬、白
菜漬、からし漬、しば漬、浅漬け、ピクルス等）、漬物
の素（即席漬けのもと、キムチ漬のもと等）、魚肉製品
（かまぼこ、ちくわ、はんぺん等）、畜肉製品（ハム、
ソーセージ、サラミ、ベーコン等）、珍味（さきする
め、さきタラ、ウニの塩辛、イカの塩辛、タコの塩辛、
カワハギのみりんぼし、フグのみりんぼし、イカの薫
製、コノワタの塩漬等）、乾物（味付け海苔等）、惣菜
類（あえもの、揚げ物、炒め物、焼き物、煮物、酢の物
等）、冷凍食品（エビフライ、コロッケ、春巻き、とん
かつ、シューマイ、餃子、ハンバーグ、たこ焼き、今川
焼き（回転焼き）、肉まん、あんまん等）、油脂食品
（サラダオイル、マーガリン、バター）等を挙げること
ができる。さらに、本分解組成物を添加・配合して調製
しうる食品組成物は、食品（飲料水を含む。）に添加す
るための食品添加用組成物として用いてもよい。本発明
のローヤルゼリー分解組成物を添加・配合して調製しう
る食品組成物は、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養
補助食品、サプリメント、特定保健用食品（厚生労働
省、特別用途食品の一種）、病者用食品・病者用組合わ
せ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者
用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよ
く、その場合であれば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タ
ブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセル
とのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタ
イプ等とすることもできる。 本発明に係るローヤルゼ
リー分解組成物を添加・配合した食品組成物の調製は、
それ自体公知の方法で行うことができる。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を具体的に説明するために、実
施例及び試験例を挙げる。しかしながら、本発明は、か
かる実施例等によって何ら制限されるものではない。

【００２２】実施例１ 生ローヤルゼリー1.0ｇを10ｍｌの脱イオン水に溶解さ
せ、ボルテックス（商標、Scientific Industries社
製）で攪拌した後、4℃、12,000rpmで20分間遠心分離を
行なった。その上清を凍結乾燥したものを試料Ｎ-ＲＪ
（Native Royal Jelly）とした。Ｎ−ＲＪ 3ｇを30ｍｌ
の脱イオン水に溶解し、ボルテックスで攪拌後、その攪
拌された液に20％塩酸を加えてpHを1.2に調整した。そ
のｐＨ１．２に調整された液に、対基質（Ｎ−ＲＪ 3
ｇ）に0.4重量％となるようにペプシン（ブタ胃粘膜由
来、ナカライテスク社製）12mgを加え、37℃で4時間イ
ンキュベートした。

【００２３】その後、そのインキュベートされた液に、
20％水酸化ナトリウム溶液を加えて、その溶液のｐＨを
6.8に調整した。次いでｐＨを6.8に調整された溶液の上
清３ｍｌを分取し、これを凍結乾燥させてローヤルゼリ
ーのペプシン分解組成物を得た。該溶液の残分に対基質
0.2重量％となるようにキモトリプシン６ｍｇ及びトリ
プシン６ｍｇ（いずれもウシ脾臓由来、ベーリンガーマ
ンハイム社製）を添加し、それを37℃で4時間インキュ
ベートした。その37℃で4時間インキュベートされた溶
液を98℃で15分間加熱処理し、その加熱処理された溶液
を10,000rpmで15分間遠心分離した。その遠心分離され
た溶液の上清を凍結乾燥して、ローヤルゼリーのペプシ
ン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組
成物）を得た。

【００２４】実施例２ 実施例１の方法により得られたペプシン分解組成物およ
びペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物
（本分解組成物）のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活
性を、Lieberman変法（山本 節子、戸井田 一郎、岩
井 和郎、日胸疾会誌１８（５）、ｐ２９７−３０
３．、１９８０）に準じて測定した。

【００２５】測定の実際は、まず上記のようにして得ら
れた分解組成物（ペプシン分解組成物とペプシン・トリ
プシン・キモトリプシン分解組成物（本分解組成物）と
のそれぞれ）を脱イオン水に溶解させて調製した分解組
成物サンプル25μl及び前述のほう酸緩衝液（０．２Ｍ
ほう酸、０．０５Ｍ四ほう酸ナトリウム、ｐＨ８．３）
に溶解した25ｍＵウサギ肺由来アンジオテンシンＩ変換
酵素（ＡＣＥ、シグマ社製）50μlを穏やかに混合し、3
7℃で5分間プレインキュベートした後、12.5ｍＭの擬似
基質hippuryl−Ｌ−histidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、
ペプチド研究社製）を50μｌを添加することによって反
応を開始した。37℃で1時間インキュベートした後、0.5
Ｍ塩酸125μｌの添加によって反応を停止した。次に、
酢酸エチル750μｌを加える事によって、生成した馬尿
酸を抽出し、228ｎｍでの吸光度を測定した。そして阻
害率ＩＣ（％）を、以下に示す式に従って算出した。

【００２６】 ＩＣ（％）＝｛（Ｃ−Ｂ）−（Ｓ−ＳＢ）／（Ｃ−Ｂ）｝×100 （式１） （ただし、式中、 Ｃ：コントロールの吸光度 Ｂ：ブランクの吸光度 Ｓ：ペプチドサンプルの吸光度 ＳＢ：サンプルブランクの吸光度 である。）なお、ここでコントロールとは分解組成物サ
ンプルを加えず、正常活性を有するＡＣＥを用いて反応
させたもの、ブランクとは分解組成物サンプルを加え
ず、失活させたＡＣＥを用いて反応させたもの、サンプ
ルブランクとは分解組成物サンプルを加えて、失活させ
たＡＣＥを用いて反応させたもの、をそれぞれ意味す
る。

【００２７】これらのコントロール、ブランク及びサン
プルブランクについては、次のようにして測定した。ま
ずコントロールは、前述する分解組成物サンプルの反応
において、脱イオン水に溶解した分解組成物サンプル25
μlに代えて脱イオン水25μlを用いる以外は同様にして
反応させ、得られた反応液から抽出した馬尿酸の吸光度
（228ｎｍ）を測定した。またブランクは、前述する分
解組成物サンプルの反応において、脱イオン水に溶解し
た分解組成物サンプル25μlに代えて脱イオン水25μlを
用いて、これを同様に25ｍＵのＡＣＥ50μlと混合し、3
7℃で5分間プレインキュベートした後、直ちに０．５Ｍ
塩酸１２５μlを加えてＡＣＥを失活させる操作を行っ
た。次いでこれに12.5ｍＭの擬似基質hippuryl−Ｌ−hi
stidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、ペプチド研究社製）を5
0μｌを添加し、分解組成物サンプルの場合と同様にし
て反応させて、得られた反応液から抽出した馬尿酸の吸
光度（228ｎｍ）を測定した。そしてサンプルブランク
は、分解組成物サンプル25μlを25ｍＵのＡＣＥ50μlと
混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、直ち
に０．５Ｍ塩酸１２５μlを加えてＡＣＥを失活させる
操作を行った。次いでこれに12.5ｍＭの擬似基質hippur
yl−Ｌ−histidyl−Ｌ−leucine（ＨＨＬ、ペプチド研
究社製）を50μｌを添加し、分解組成物サンプルの場合
と同様にして反応させて、得られた反応液から抽出した
馬尿酸の吸光度（228ｎｍ）を測定した。

【００２８】なお、上記反応条件で、アンジオテンシン
Ｉ変換酵素の活性を50％阻害したとき（即ち、ＩＣ
（％）＝５０のとき）の反応液中での分解組成物濃度を
ＩＣ50値として定義した。ＩＣ50値の具体的な求め方
は、各分解組成物それぞれについて、いくつか異なる濃
度のサンプルで上記式１よりＩＣ（％）を得て、縦軸に
阻害率ＩＣ（％）をとり、横軸に反応液中の分解組成物
の濃度（μＭ）をとり、検量線を作成する。その検量線
から５０％活性が阻害された分解組成物濃度を読みと
り、その分解組成物のＩＣ50値とした。また、Ｎ−ＲＪ
についても、上記と同様にＩＣ（％）を得て、縦軸に阻
害率ＩＣ（％）をとり、横軸に反応液中の分解物の濃度
（ｍｇ／ｍｌ）をとり、検量線を作成する。その検量線
から、酵素阻害活性を測定した。結果を、次の表１に示
す。

【００２９】 表１ Ｎ−ＲＪおよびローヤルゼリー分解組成物のＩＣ50値 試 料 ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ） Ｎ−ＲＪ ＡＣＥ活性阻害なし Ｎ―ＲＪ蛋白質画分 同上 ペプシン分解組成物 １．２４ ペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物 ０．３５

【００３０】表１から、Ｎ−ＲＪとその蛋白質画分（Ｎ
−ＲＪをトリクロロ酢酸処理して採取した蛋白質画分）
にはＡＣＥ阻害作用は全く認められないことが明らかと
なった。一方、Ｎ−ＲＪをペプシンによる酵素処理する
ことでＡＣＥ阻害作用が発現するが、ペプシン分解組成
物をさらにトリプシンとキモトリプシンで酵素処理する
ことで、ＡＣＥ阻害作用が著しく上昇することが判明し
た（ペプシン分解組成物と対比して、後者がほぼ４倍の
ＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０＝０．３５３ｍｇ／ｍｌ）を
有している）。

【００３１】実施例３ 実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン
分解組成物（本分解組成物）から、Superdex Peptide H
R カラム（Bio-Rad社製、φ10ｍｍ×300ｍｍ）を用いた
GPC（ゲル浸透クロマトグラフィー）-HPLCの高速液体ク
ロマトグラフィーにより、ジペプチド及びトリペプチド
の粗画分を分離した。この分離条件は以下の通りであ
る。移動相には、0.1％トリフルオロ酢酸と30％アセト
ニトリルを含む含水有機溶媒（トリフルオロ酢酸とアセ
トニトリルと水との混合溶媒）を用い、流速0.3ml／
分、35℃のカラム温度で分画を行ない、溶出は、220ｎ
ｍでモニターし、約100分間実施した。このときの溶出
曲線を図１に示す。図１の横軸は溶出時間（単位：分）
を、縦軸は吸光度（220ｎｍ）を示す。ジペプチド及び
トリペプチドを含む粗画分として、溶出時間が約５０〜
７０分の画分を採取した（図１中、矢印Ａの範囲）。こ
の粗画分に含まれるジペプチド及びトリペプチドの産生
率は、最初のＮ−ＲＪサンプルの3.3％であった。

【００３２】なお、上記採取画分（溶出時間が約５０〜
７０分の画分）は、分子量マーカーとしてＧｌｙ−Ｇｌ
ｙ（最小分子量マーカー）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ（最大分子量
マーカー）、アンジオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）を用
いて、上記と同じ条件でＧＰＣ−ＨＰＬＣを行い、最小
分子量マーカーであるＧｌｙ−Ｇｌｙから最大分子量マ
ーカーであるＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐまでの全てのジペ
プチド及びトリペプチドが溶出する時間から決定した。
この結果を検量曲線として図２に示す。図２の横軸は溶
出時間（分）、縦軸は分子量の対数値（ｌｏｇ．Ｍ．
Ｗ．）を示している。

【００３３】さらにこのジペプチド及びトリペプチドを
含む粗画分を、まず、ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラム（ナカ
ライテスク社製、φ4.6ｍｍ×250ｍｍ）を用い、つい
で、ＯＤＳ−ＡＲＩＩカラム（ナカライテスク社製、φ
4.6ｍｍ×250ｍｍ）を用いた2段階の逆相高速液体クロ
マトグラフにかけ、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペ
プチドを単離した。この分離条件は以下の通りである。
まず、ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムによる分離について
は、移動相には、アセトニトリル濃度が1から40％の濃
度勾配となるようにアセトニトリル−水の混合溶媒を用
い、流速0.3ｍｌ／分、常温のカラム温度で分画を行な
い、溶出は、220ｎｍで状況をモニターしながら、約60
分間実施した。次に、ＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムによる分
離については、移動相は、0.1％トリフルオロ酢酸とア
セトニトリル濃度が5から35％の濃度勾配となるように
アセトニトリル−水の混合溶媒を用い、流速0.3ｍｌ／
分、常温のカラム温度で分画を行ない、溶出は、220ｎ
ｍで状況をモニターしながら約60分間実施した

【００３４】第１乃至第１０のペプチドの単離方法につ
いて以下詳述する。まず、第１及び第２のペプチドの単
離について説明する。上記ジペプチド及びトリペプチド
を含む粗画分（図１、Ａ画分）を、前述の条件のもとＯ
ＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フによって分画し、図３に示す溶出曲線を得た。図３
中、▲及びそれを結ぶ点線は右軸であり、○及びそれを
結ぶ実線は、左軸を示す。この溶出成分のうち溶出時間
３９分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤ
Ｓ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、図４に示す溶出曲線を得た。図４の各ピーク
について、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列
分析を行った。その結果、溶出時間４８．３分の画分が
第１のペプチドたるＬｙｓ−Ｐｈｅであることが判明
し、溶出時間６０．５分の画分が第２のペプチドたるＡ
ｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕであることが判明した。

【００３５】次いで、第３、第４および第５のペプチド
の単離について説明する。第１及び第２のペプチドの単
離の場合と同様に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間
４３分の画分を採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤ
Ｓ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフに
かけ、図５に示すような溶出曲線を得た。図５の各ピー
クについて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配
列分析を行った。その結果、溶出時間４６．７分の画分
が第３のペプチドたるＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒであるこ
と、溶出時間５６．７分の画分が第４のペプチドたるＩ
ｌｅ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒであること、溶出時間５９．７分
の画分が第５のペプチドたるＰｈｅ−Ｔｙｒであること
が判明した。

【００３６】そして第６のペプチドの単離について説明
する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、
図３に示す溶出曲線のうち溶出時間４８分の画分を採取
し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラム
を用いた高速液体クロマトグラフにかけ、図６に示すよ
うな溶出曲線を得た。図６の各ピークについて、後述す
るアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。そ
の結果、溶出時間５９．７分の画分が第６のペプチドた
るＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒであることが判明した。

【００３７】さらに、第７のペプチドの単離について説
明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様
に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間５２分の画分を
採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図７
に示すような溶出曲線を得た。図７の各ピークについ
て、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を
行った。その結果、溶出時間６６．７分の画分が第７の
ペプチドたるＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕであることが判明
した。

【００３８】次いで、第８のペプチドの単離について説
明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様
に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間６０分の画分を
採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図８
に示すような溶出曲線を得た。図８の各ピークについ
て、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を
行った。その結果、溶出時間７０．１分の画分が第８の
ペプチドたるＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅであることが判明
した。

【００３９】第９のペプチドの単離について説明する。
第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様に、図３に
示す溶出曲線のうち溶出時間６８分の画分を採取し、引
き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用い
た高速液体クロマトグラフィーにかけ、図９に示すよう
な溶出曲線を得た。図９の各ピークについて、後述する
アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。その
結果、溶出時間７６．１分の画分が第９のペプチドたる
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅであることが判明した。

【００４０】最後に、第１０のペプチドの単離について
説明する。第１及び第２のペプチドの単離の場合と同様
に、図３に示す溶出曲線のうち溶出時間４６分の画分を
採取し、引き続き前述の条件のもとＯＤＳ−ＡＲＩＩカ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、図１
０に示すような溶出曲線を得た。図１０の各ピークにつ
いて、後述するアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析
を行った。その結果、溶出時間６０．１分の画分が第１
０のペプチドたるＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであることが
判明した。なお、上記した高速液体クロマトグラフィー
操作は、いずれも島津製作所社製ＬＣ−9ＡＨＰＬＣシ
ステムを用いて行った。以上のようにして、分解物（分
解組成物）からペプチドの単離を高速クロマトグラフィ
ーによって行い、第１〜１０のペプチドそれぞれの画分
を採取した。

【００４１】上記第１乃至第１０のペプチドの同定に用
いた前記アミノ酸組成分析及び前記アミノ酸配列分析に
ついて簡単に説明しておく。アミノ酸組成分析は、常法
に従ってサンプルを６Ｎ塩酸で１１０℃で２４時間、加
水分解した後、ＬＣ−１０Ａアミノ酸アナライザー（島
津製作所社製）によって分析した。アミノ酸配列分析
は、ＰＰＳＱ−２１プロテインシーケンサー（島津製作
所社製）を用いて、常法に従って自動エドマン分解法に
より分析を行った。これらの分析結果から、ペプチドの
構造を決定した。

【００４２】このようにして得た第１〜１０のペプチド
のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性（ＩＣ50値）を
実施例２記載の方法に準拠して求めた。結果は、次の表
２に示すとおりである。

【００４３】 表２ 第１〜１０のペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性（ＩＣ50 値） ペプチドの種類 ＩＣ50（μＭ） Ｐｈｅ−Ｔｙｒ １．７ Ｌｙｓ−Ｐｈｅ １２０ Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ ０．５ Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ ７．１ Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ ２．３ Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ １．８ Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ ８．８ Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ ２．２ Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ２．７ Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ ６．９

【００４４】 処方例１ ドリンク剤： （ドリンク剤１本分の組成） 実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物 １．０ｇ レモン果汁 ２０ｍｌ プロポリス ０．３ｇ ビタミンＣ ０．２ｇ はちみつ １３ｇ 上記の５成分を水に溶解させ、全量を１００ｍｌとし
た。

【００４５】 処方例２ ドレッシング： （ドレッシング１人分量の組成） 実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物 １．０ｇ 醤油 ２．５ｇ 酢 ２．０ｇ サラダ油 ２．５ｇ 味噌 ０．１ｇ はちみつ １．０ｇ 野菜エキス １．４ｇ 旨味調味料 ０．５ｇ 香辛料 適量 計 １１．０ｇ 上記の各成分を常法に従い充分に混合し、使用前にも充
分攪拌して用いる。

【００４６】 処方例３ 飴： （飴１個分の組成） 実施例１で得たペプシン・トリプシン・キモトリプシン分解組成物 １０ｍｇ 水飴 ６００ｍｇ 砂糖 ５０００ｍｇ 計 ５６１０ｍｇ 上記各原料を用いて、常法に従い飴を作成した。

【００４７】

【発明の効果】本発明に係るローヤルゼリー分解組成物
は、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するとと
もに、その成分が主に比較的小さなペプチド分子である
ため粘膜や皮膚等を経由して効率よく吸収される。さら
に、ローヤルゼリーを蛋白質分解酵素によって分解して
得られるものであるため、優れた安全性を有するという
特徴を有する。従って、本発明に係るローヤルゼリー分
解組成物それ自体および同組成物を添加・配合した食品
組成物は、機能性食品等として、高血圧の予防や改善な
どを効率よくかつ安全に実現することができる。また、
本発明に係るローヤルゼリー分解組成物および同組成物
を添加・配合した食品組成物は、アンジオテンシンＩ変
換酵素の活性を阻害する性質を有しているので、アンジ
オテンシンＩ変換酵素の作用に基づく各種疾患、例え
ば、高血圧症、これから誘発される冠動脈疾患や心筋梗
塞といった心疾患、脳血管障害、腎障害などの予防に効
果的に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】加水分解物の試料（本分解組成物）を高速液体
クロマトグラフィーにより分画する際の溶出曲線であ
る。

【図２】加水分解物の試料（本分解組成物）を高速液体
クロマトグラフィーにより分画する際の採取する画分の
溶出時間を決定するためのグラフである。

【図３】ＯＤＳ−Ｐｈｅ修飾カラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィーによる溶出曲線である。

【図４】第１及び第２のペプチドの単離のためのＯＤＳ
−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
による溶出曲線である。

【図５】第３、第４および第５のペプチドの単離のため
のＯＤＳ−ＡＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーによる溶出曲線である。

【図６】第６のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩ
Ｉカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶
出曲線である。

【図７】第７のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩ
Ｉカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶
出曲線である。

【図８】第８のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩ
Ｉカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶
出曲線である。

【図９】第９のペプチドの単離のためのＯＤＳ−ＡＲＩ
Ｉカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる溶
出曲線である。

【図１０】第１０のペプチドの単離のためのＯＤＳ−Ａ
ＲＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
る溶出曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 9/12 9/12 13/12 13/12 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B018 MD76 ME04 MF12 4C084 AA01 AA02 BA02 BA43 CA43 DC09 NA14 ZA36 ZA42 ZC20 4C087 AA01 AA02 BB22 CA16 NA14 ZA36 ZA42 ZC20 4H045 AA10 AA30 BA11 BA12 CA51 DA57 EA01 EA24 FA16

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ローヤルゼリーを、ペプシン並びにトリプ
   シン及び／又はキモトリプシンにより処理して得られる
   分解組成物。
2. 【請求項２】ペプシンとトリプシンとキモトリプシンと
   により処理して得られる、請求項１に記載の分解組成
   物。
3. 【請求項３】ペプシンにより処理された後、トリプシン
   及び／又はキモトリプシンによって処理されたものであ
   る、請求項１又は２に記載の分解組成物。
4. 【請求項４】Lys-Phe,Ala-Val-Leu,Thr-Lys-Tyr,Ile-Va
   l-Tyr, Phe-Tyr,Ile-Met-Tyr,Gly-Leu-Tyr,Asp-Gly-Le
   u,Leu-Thr-Phe,Phe-Asn-Pheおよびそれらの塩からなる
   群から選ばれる少なくとも一のものを含有するものであ
   る、請求項１乃至３のいずれかに記載の分解組成物。
5. 【請求項５】アンジオテンシンＩ変換酵素に対する阻害
   を目的として用いられるものである、請求項１乃至４の
   いずれかに記載の分解組成物。
6. 【請求項６】高血圧症の予防、改善又は治療を目的とし
   て用いられるものである、請求項１乃至５のいずれかに
   記載の分解組成物。
7. 【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載の分解組
   成物を含有してなる食品組成物。
8. 【請求項８】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を奏
   する量の前記分解組成物を含有するものである、請求項
   ７に記載の食品組成物。