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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer
(bzw. Inhibitor des Angiotensin-Converting-Enzyms), der eine Zusammensetzung
umfasst, die durch Verdauen von Fischfleisch mit einem Thermolysinenzym
erhaltene Peptide umfasst, welche nützlich als medizinische Zusätze, Lebensmittel,
Gesundheitslebensmittel, spezielle Lebensmittel für die Gesundheitsvorsorge
und ähnliches sind.
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Das
Angiotensin-Converting-Enzym ist ein Enzym, welches hauptsächlich in
der Lunge, den Gefäßendothelzellen
und den proximalen Tubuli der Niere vorhanden ist und auf Angiotensin
I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)
wirkt, um ein Dipeptid (His9-Leu10) an seinem C-Terminus zu spalten,
um Angiotensin II zu ergeben, welches eine starke Blutdruck steigernde
Wirkung hat. Außerdem
zersetzt dieses Enzym Bradykinin, das eine physiologisch hypotonische
(d. h. blutdrucksenkende) Substanz ist, um es zu inaktivieren, und
ist als solches eng in das Blutdruck steigernde System involviert.
Es wurde angenommen, dass die Hemmung des Angiotensin-Converting-Enzyms
den Blutdruck senken würde
und daher klinisch nützlich
für die
Vermeidung und die Behandlung von Hypertonie (Bluthochdruck) ist.
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In
der jüngsten
Zeit, da Captopril, ein Prolinderivat, synthetisiert wurde und herausgefunden
wurde, dass es hypotonische Aktivität hat, wurden starke Forschungsanstrengungen
für die
Synthese einer Vielzahl von Hemmstoffen des Angiotensin-Converting-Enzyms unternommen,
und es wurde ebenfalls versucht, derartige Substanzen aus natürlichen
Quellen zu isolieren.
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Dies
ist so, weil angenommen wird, dass Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer vom natürlichen Typ,
die aus Lebensmitteln oder Lebensmittelmaterialien erhältlich sind,
als anti-hypotonische Mittel mit geringer Toxizität und hoher
Sicherheit von Wert sind.
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Die
Erfinder offenbarten in der
japanischen
ungeprüften
Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 69397/1992 bereits
ein neuartiges Peptid, welches ein Leu-Lys-Pro-Gerüst enthält. In der
japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer
144696/1992 ist ein Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung
mit einem Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer offenbart, welcher
durch Hydrolyse eines Proteins mit Thermolysin erhalten wird. Ferner
wird in der
japanischen
ungeprüften
Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer
2449979/1993 ein Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung
mit Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmern offenbart, welche durch
hydrolysieren des Rückstands
erhalten wird, der hauptsächlich
wasserunlösliches
Protein enthält,
mit einer Protease nach Wärmebehandlung
von Fleisch in Wasser mit nicht weniger als 50°C, um wasserlösliches
Protein durch Extraktion auszuschließen.
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Obwohl
jedoch eine hemmende Aktivität
von neuartigen Peptiden, die in der vorher erwähnten
japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer
69397/1992 offenbart werden, sehr stark ist, erfordert
es eine Menge Aufwand und hohe Kosten, um in der Praxis die Peptide
aufzutrennen. Obwohl ebenfalls eine Zusammensetzung mit relativ
hoher hemmender Aktivität
durch die in der
japanischen
ungeprüften Patentanmeldung
Veröffentlichungsnummer
144696/1992 und
japanische
ungeprüfte
Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer
244979/1993 offenbarten Verfahren erhalten wird, ist die Aufnahmemenge
der Zusammensetzung leicht erhöht,
um eine Wirkung zu erhalten. Daher ist es erwünscht, dass eine Aufnahmemenge weiter
reduziert wird, um die Zusammensetzung leicht jeden Tag aufzunehmen.
Außerdem
sind, wenn getrockneter Bonito (Tunfisch) als Protein verwendet
wird, die vorhergehenden Zusammensetzungen nach wie vor offen für Verbesserungen
im Nachgeschmack obwohl die in Peptid spezifische Bitterkeit reduziert
wird.
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In
Bioscience Biotechnology Biochemistry, Japan Soc. For Bioscience,
Biotechnology And Agrochem., Tokio, JP (1992), 56 (10), S. 1541–1545 wurde
ein ungereinigter Überstand
von verdautem Bonito-Homogenat in einem ACE-Hemmtest verwendet, oder wurde weiterhin
einer Reinigung auf einer Oktadecyl-Silicium-(ODS)-Säule unterzogen,
mit HPLC gereinigt und wahlweise weiter durch ODS gereinigt, was
in reinen Peptiden resultierte, die in dem obigen Test zu verwenden
sind und eine starke ACE hemmende Aktivität aufweisen.
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Als
ein Ergebnis einer intensiven Studie um die vorhergehenden Probleme
zu lösen,
haben die Erfinder das folgende gefunden und die vorliegende Erfindung
vollendet. Sie haben einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (hiernach
als „Hemmer" bezeichnet), definiert
gemäß Anspruch
1, gefunden. Sie haben ebenfalls gefunden, dass der Hemmer eine
hervorragende inhibitorische Aktivität und einen guten Farbton, keine
Bitterkeit und einen guten Nachgeschmack hat und leicht aufzunehmen
ist.
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Das
heißt,
die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer, welcher
eine Zusammensetzung ist, der Peptide enthält, die durch Verdauen von
Fischfleisch mit Thermolysinenzym erhalten werdem, dessen Gehalt
an einem Polypeptid-Inhaltsstoff mit einem Molekulargewicht von wenigstens
5000 höchstens
10 Gew.-% ist.
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In
dem vorher erwähnten
Hemmer umfasst die Peptide enthaltende Zusammensetzung bevorzugt
wenigstens eines ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus
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In
dem vorher erwähnten
Hemmer, ist das Fischfleisch bevorzugt ein getrockneter Fisch.
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In
dem vorher erwähnten
Hemmer, ist das Fischfleisch bevorzugt ein Rückstand aus der Extraktion von
dem getrockneten Fisch mit kochendem Wasser.
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In
dem vorher erwähnten
Hemmer, ist der getrocknete Fisch bevorzugt ein getrockneter Thunfisch (Bonito).
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Die
vorliegende Erfindung wird ausführlich
wie folgt erläutert.
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Die
erfindungsgemäße Peptid
enthaltende Zusammensetzung kann durch Verdauen von Fischfleisch mit
Thermolysin erhalten werden. Beispiele von Fischfleisch sind Rohfleisch
von Skipjack, Makrele, Sardine, Dorsch (Kabeljau), Lachs (Salm),
pazifischer Makrelenhecht, junger Gelbschwanzfisch (young yellowtail), Pferde-
oder Stachelmakrele, getrocknetes Fleisch davon, der Rückstand davon,
welcher durch heißes
Wasser extrahiert wird, getrocknetes Fischfleisch, das durch Trocknen
des extrahierten Rückstands
oder durch zeitweise Zugabe von Schimmelpilzen dazu erhalten wird,
und der Rückstand
des getrockneten Fischfleischs extrahiert durch heißes Wasser.
Bevorzugt wird der Rückstand
des getrockneten, durch heißes
Wasser extrahierten Fischfleisches verwendet. Ebenfalls wird von
den vorher erwähnten
getrockneten Fischfleischen bevorzugt getrockneter Bonito verwendet.
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Ein
Thermolysinenzym als Auflösungsenzym
kann eine gereinigte Enzymlösung,
eine gemischte Enzymlösung
einiger anderer Enzyme oder eine auf dem Markt erhältliche
Lösung
wie etwa „Thermoase" (erhältlich von
Daiwa Kasei K. K.) sein.
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Wenn
Fischfleisch mit einem Thermolysinenzym verdaut wird, wird das Fischfleisch
durch Zugabe von Wasser und Thermolysinenzym dazu hydrolysiert.
Bei der Hydrolyse kann Fischfleisch aufgrund seiner Eigenschaften
vorbehandelt sein, und in diesem Fall wird Wasser oder warmes Wasser
zu dem Fischfleisch gegeben und dann erfolgt ein Mischen und eine
starke Homogenisierung. Die Menge an Thermolysinenzym reicht bevorzugt
von 0,05 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugter von 0,1 bis 1,0 Gew.-% der
Gesamtheit einer Menge an Fischfleisch und Wasser. Eine Thermolysinenzymmenge
von weniger als 0,05 Gew.-% ist nicht bevorzugt, weil sie die Hydrolyse
nicht genug fördern
wird. Ebenfalls ist eine Thermolysinenzymmenge von mehr als 5 Gew.-% nicht
bevorzugt, weil das Thermolysinenzym nur verschwendet wird.
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Die
Reaktionstemperatur der Hydrolyse reicht bevorzugt von 10 bis 85°C, bevorzugter
von 40 bis 80°C.
Eine Reaktionstemperatur von niedriger als 10°C ist nicht bevorzugt, weil
sie die Hydrolyse nicht genug fördern
wird. Ebenfalls ist eine Reaktionstemperatur von über 85°C nicht bevorzugt,
weil die hemmende Wirkung des Thermolysinenzyms sehr beschädigt wird.
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Der
pH bei der Hydrolyse reicht bevorzugt von 6 bis 8. Ein pH von weniger
als 6 oder über
8 ist nicht bevorzugt, weil die Hydrolyserate gesenkt sein wird.
Da eine Lösung
vor dem Beginn der Hydrolysereaktion allgemein einen pH von 4 bis
5,5 hat, ist es bevorzugt, einen pH von 6 bis 8 bei Verwendung einer
alkalischen Lösung
(wie etwa Natriumchloridlösung)
einzustellen.
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Ein
Reaktionszeitraum reicht bevorzugt von 10 Minuten bis 30 Stunden,
bevorzugter von 3 bis 20 Stunden. Ein Reaktionszeitraum von weniger
als 10 Minuten ist nicht bevorzugt, weil eine Sammelrate der verdauten
Verbindung niedrig wird. Ebenfalls ist eine Reaktionsdauer von mehr
als 30 Stunden nicht bevorzugt, weil die Produktionseffizienz gesenkt
wird.
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Obwohl
ein Hydrolyseverhältnis
nicht besonders beschränkt
ist, wird das endgültige
Hydrolyseverhältnis
bevorzugt von 10 bis 60% und bevorzugter von 20 bis 50% eingestellt.
Ein Hydrolyseverhältnis
von weniger als 10% ist nicht bevorzugt, weil wenig Peptid erhalten
wird. Ebenfalls ist ein Hydrolyseverhältnis von mehr als 60% nicht
bevorzugt, weil eine Hydrolyse für
eine lange Zeit fortgesetzt werden muss und eine große Menge an
Thermolysin erforderlich ist, um ein Verhältnis von 60% zu erhalten.
Das Hydrolyseverhältnis
kann in Überstimmung
mit einem Verfahren, beschrieben in Journal of Agriculture and Food
Chemistry, Band 24, Nr. 6, S. 1090–1093 (1976), gemessen werden.
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Das
Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist, dass ein Gehalt an Polypeptid
mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000, welches in der peptidhaltigen
Zusammensetzung erhalten durch Auflösen mit dem vorhergehenden
Enzym enthalten ist, nicht mehr als 10 Gew.-% des Feststoffanteils
der Zusammensetzung ist.
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Speziell
wird von der oben erwähnten
verdauten Zusammensetzung, die 15 bis 30 Gew.-% eines Peptids mit
einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 enthält, das Peptid mit einem Molekulargewicht
von wenigstens 5000 entfernt, sodass ein Gehalt des Peptids mit
einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 höchstens 10 Gew.-% ist, bevorzugter
von 0,1 bis 5 Gew.-% Es ist nicht angemessen, wenn ein Gehalt des Peptids
mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 über 10 Gew.-% ist, weil das
die Nachteile ergibt, dass der Farbton gelb oder braun wird, ein
wenig Bitterkeit verbleibt und einen unnatürlichen Geschmack erzeugt,
und dass der Nachgeschmack für
eine lange Zeit verbleibt, wenn das Peptid zu schwach gewürzten Dingen
gegeben wird, und weiterhin, weil die hemmende Wirkung nicht verbessert
wird.
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In
der vorliegenden Erfindung wird das Molekulargewicht der Probe durch
eine Gelfiltrationschromatographie gemessen. Genauer wird unter
Verwendung eines Peptids und von Proteinen [Asp-Gly-Leu-Tyr-Pro (Molekulargewicht 563)],
Neurotensin (Molekulargewicht 1637), Ribonuklease (Molekulargewicht
13700) als Standardsubstanzen, welche bekannte Molekulargewichte
haben, ein Extrakt bei den folgenden Bedingungen eluiert, um eine
Retentionszeit zu bestimmen, und ein Molekulargewicht wird unter
Verwendung einer Eichkurve, erhalten durch logarithmisches Auftragen
der Molekulargewichte auf der Ordinate und den Retentionszeiten
auf der Abszisse, bestimmt. In der Erfindung wird ebenfalls eine
Menge „Gewichtsprozent" der Bestandteile mit
einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 als „Prozentfläche" der Peaks die den Bestandteilen mit
einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 entsprechen nach teilen
der Peaks an der Position des Molekulargewichts 5000 auf einem Elutionschromatogramm
dargestellt.
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(Fraktionierungsbedingungen)
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- Säule:
Protein Pak60 (hergestellt durch Waters) 5 × 250 mm
- Mobile Phase: 50 Vol.-% wässrige
Acetonitrillösung
mit 0,1 Vol.-% TFA (Trifluoressigsäure)
- Durchflussgeschwindigkeit: 0,7 mL/Min
- Detektion: RI
- Probenmenge: 1 mg
(Relation zwischen Molekulargewicht der
Standardsubstanz und der Elutionszeit)
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-
Bei
den vorher erwähnten
Bedingungen wird, da eine Substanz mit einem Molekulargewicht von
5000 bei 29 Minuten eluiert wird, jede Substanz, die bei mehr als
29 Minuten eluiert wird, als ein Polypeptidbestandteil mit einem
Molekulargewicht von wenigstens 5000 angesehen.
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Im
Folgenden sind Beispiele für
ein Verfahren für
die Entfernung eines Polypeptidbestandteils mit einem Molekulargewicht
von wenigstens 5000.
- [1] Ein Verfahren für die Entfernung
von Fraktionen mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 mittels
einer Gelfiltrationschromatographie
- [2] Ein Verfahren für
die Entfernung von Fraktionen mit einem Molekulargewicht von wenigstens
5000 mittels einer Membranbehandlung
- [3] Ein Verfahren für
die Entfernung von Fraktionen mit einem hohen Molekulargewicht durch
eine Lösungsmittelextraktion
unter Verwendung eines polaren organischen Lösungsmittels, wie etwa Methanol,
Ethanol, Propanol, Butanol, Chloroform, Ethylacetat, Toluol, Hexan,
oder Benzol.
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Diese
Verfahren können
alleine oder in einer Kombinationsverwendung von zwei oder mehreren
davon verwendet werden.
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Die
Verfahren [1] bis [3] werden kurz erläutert. Bei dem Verfahren [1]
wird das vorher beschriebene Vorgehen als eine Molekulargewichtsanalyse
in einem industriellen Maßstab
durchgeführt.
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Bei
dem Verfahren [1] wird ein Extrakt durch eine Membran mit einem
Fraktionierungsmolekulargewicht von etwa 5000 (UF-Membran) wie etwa
UF-Membran „PLCC
(fractionation molecular weight 5000)" erhältlich
von Millipore, UF-Membran „AES-5
(fractionation molecular weight 5000)" erhältlich
von Advances Membrane Technology, UF-Membran „HFK-131 (fractionation molecular
weight 5000)" erhältlich von
Abco und UF-Membran „SEP1013
(fractionation molecular weight 3000)" erhältlich
von Asahi Chemical Industry Co., Ltd. filtriert.
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In
dem Verfahren [3] wird ein Extrakt in einem derartigen Ausmaß konzentriert,
dass keine Präzipitation
auftritt, die organische Lösungsmittelkonzentration
innerhalb dieses Systems ist 60 bis 99 Vol.-%, durch Zugabe von
5 bis 100 Volumen des organischen Lösungsmittels dazu wird jede
Substanz mit einem hohen Molekulargewicht präzipitiert.
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Der
erhaltene Hemmer (Hemmstoff) der vorliegenden Erfindung ist eine
Mischung von verschiedenen Oligopeptiden, etwas Nukleinsäure und
Protein, welches teilweise verdaut ist, und als das Oligopeptid
ist wenigstens eines der folgenden Peptide enthalten:
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Das
vorhergehende Leu ist Leucin, Lys Lysin, Pro Prolin, Asn Asparagin,
Met Methionin, Ile Isoleucin, Trp Tryptophan, Phe Phenylalanin,
Gln Glutamin, Tyr Tyrosin, Gly Glycin, His Histidin, Thr Threonin,
Ala Alanin, Val Valin, Arg Arginin und Asp Asparaginsäure. Alle
der vorhergehenden Aminosäuren
der vorliegenden Erfindung sind das L-Isomer.
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Der
Hemmer der vorliegenden Erfindung ist ein Pulver, das durch Zubereiten
einer verdauten Lösung erhalten
durch Hydrolyse mit der vorhergehenden Zusammensetzung nach Entfernen
einer Lösung
oder Wasser hergestellt wird. Als ein Entwässerungsverfahren wird ein
Konzentrationstrocknen, Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, Vakuumtrocknen und ähnliches
eingesetzt. Der Hemmer der vorliegenden Erfindung wird als Arzneimittel
und Gesundheitslebensmittel (Gesundheitszusatzlebensmittel) in der
Form einer Zubereitung verwendet, oder wird wie er ist zu Lebensmittelprodukten
zugesetzt.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
werden allgemein formuliert mit pharmazeutischen Trägern und
Hilfsstoffen verabreicht, welche allgemein in der pharmazeutischen
Industrie verwendet werden und gegenüber den Peptiden der Erfindung
reaktionsträge
sind. Zu derartigen Trägern
und Hilfsstoffen gehören
Lactose, Glucose, Mannitol, Dextrin, Cyclodextrin, Stärke, Saccharose,
Magnesiummetasilicataluminat, synthetisches Aluminiumsilicat, Carboxymethylcellulosenatrium,
Hydroxypropylstärke,
Carboxymethylcellulosecalcium, Ionenaustauscherharze, Methylcellulose,
Gelatine, Gummi arabicum, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, weiches Kieselsäureanhydrid,
Magnesiumstearat, Kalk, Tragant, Bentonit, B-Gummi, Titandioxid,
Sorbitanfettsäureester,
Natriumlaurylsulfat, Glycerin, Glycerinfettsäure, Ester, gereinigtes Lanolin,
Glycerogelatine, Polysorbat, Macrogole, pflanzliche Öle, Wachse,
flüssiges Parafin,
weiße
Vaseline, Fluorkohlenwasserstoff, nicht-ionische oberflächenaktive
Stoffe, Propylenglykol, Wasser und ähnliche.
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Die
Dosierungsform kann eine Tablette, Kapsel, Körnchen, Pulver, Sirup, Suspension
oder injizierbare Lösung
sein. Diese Zubereitungen können
durch die etablierten pharmazeutischen Vorgehensweisen hergestellt
werden.
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Das
vorher zubereitete Medikament oder Gesundheitslebensmittel wird
zum Zweck der Vermeidung von Blutdruckabfall, myocardialer Vergrößerung und
Apoplexie verwendet.
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Da
der erfindungsgemäße Hemmer
ebenfalls eine geringe Bitterkeit und einen guten Nachgeschmack hat,
kann er für
Lebensmittel, wie etwa verarbeitete landwirtschaftliche oder aus
dem Meer stammende (marine) Lebensmittel, Milchprodukte, Süßwaren,
Gewürze,
Getränke,
gefriergetrocknete Lebensmittel und steril verpackte Lebensmittel
(retort-packed foods), Gesundheitslebensmittel, die Gesundheit unterstützende Lebensmittel
oder Lebensmittelzusatzstoffe verwendet werden.
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Ein
Hemmer der vorliegenden Erfindung kann zu einem Lebensmittelprodukt,
wie dem Folgenden, ohne spezifische Beschränkung zugesetzt werden.
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(1) Verarbeitete landwirtschaftliche und
Meeresprodukte
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- Gelatinenudeln, Mus von pürierten süßen roten Bohnen, ein gelatinehaltiges
Lebensmittel hergestellt aus Devil's-Tongue Stärke, Brot, Nudeln (Instantnudeln,
Pasta, rohe Nudeln, getrocknete Nudeln), Reiskuchen, Cerealien (Getreideprodukte),
verarbeitete Sojabohnenprodukte (Tofu, Sojabohnenmilch, Natto, getrockneter
Bohnenquark), verarbeitete Meeresprodukte [gekochte Fischpaste,
(mit Krabbengeschmack versehene) Fischstrangwürstchen, (Fisch-)Schinken,
(Fisch)Wurst, (Fisch)Wiener, Reisgarnierung, Meersalatflocken für Reis mit
Tee], in Dosen verpackte Lebensmittel (Dosenthunfisch, Ölsardinen,
Yakitorispieße),
steril verpackte Lebensmittel (Curry, Stew, Spaghettisoße).
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[2] Molkereiprodukte
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- Milch, verarbeite Milch, Milchsäure vergärte Getränke, Butter, Käse, Kondensmilch,
Milchpulver.
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[3] Süßwaren
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- Kuchen, Mousse, (pulverisiertes) Dessert, Eiskrem, Bonbons,
Schokolade, Gummibonbons, Kekse, Waffeln, Gelee
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[4] Gewürze
-
- Miso (fermentierte Sojabohnenpaste), Sojasoße, Aromastoffe
und Gewürze,
(pulverisiertes) natürliches
Gewürz,
Soße,
Dressing, Grillsoße,
süßes Sakegewürz, Curry,
Stew, scharfe und milde Gewürze,
Joghurt
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[5] Getränke
-
- Erfrischungsgetränke
(Getränke
mit Kohlensäure,
Fruchtsaft, Sportergänzungsgetränke, Gesundheitsgetränke), Luxusgetränke (Kaffee,
Kakaotrunk, Gerstengetränk),
Misosuppe, klare Suppe
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[6] Gesundheitslebensmittel
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- 1] Lebensmittel, die Saponin enthalten (Lebensmittel
mit Panax Ginsengwurzel, Lebensmittel, die Acanthopanax Senticosus
Harms enthalten)
- 2] Lebensmittel mit Saccharid [Oligosaccharid (Lebensmittel
mit Fructooligosaccharid, Lebensmittel mit Isomaltoligosaccharid,
Lebensmittel mit Galaktooligosaccharid), Polysaccharid (Lebensmittel]
mit Cortinellus Shiitake, Mucosaccharid, Lebensmittel mit Protein,
Lebensmittel mit Chondoitinsulfat, Lebensmittel mit Gandoderma Lucidium
(Reishi), Lebensmittel mit Chitin/Chitosan)
- 3] Lebensmittel mit Mineralien (Lebensmittel mit Calcium, Lebensmittel
mit Alfalfa, Lebensmittel mit Pflaumenextrakt, Lebensmittel mit β-Karotin)
- 4] Lebensmittel mit Fett (Fett mit Vitamin E [Weizen- und Tränengraskeimöl, Sojabohnenkeimöl, Reiskernöl], Lebensmittel
mit Eicosapentaensäure,
Lebensmittel mit Sojabohnenlecithin, Lebensmittel mit γ-Linolensäure (Nachtkerzenöl, Borageöl), Lebensmittel
mit Docosahexaensäure)
- 5] Lebensmittel mit Protein (Lebensmittel mit Sojabohnenprotein,
Kasein, verarbeitete Karpfenlebensmittel)
- 6] Lebensmittel mit Taurinauster, verarbeitete Körbchenmuschel,
verarbeitete grüne
Seemuschel
-
[7] Andere
-
- Verarbeitete Weichschildkröte, an Aminosäuredysbolismus
orientiertes Lebensmittel, flüssiges
Lebensmittel (Patienten Mahlzeit)
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Verabreichungs-(Aufnahme-)Menge
der Menge des Hemmers der vorliegenden Erfinder, welche auf Grund
des Verabreichungsverfahrens, im Zustand oder Alter eines Patienten
und ähnlichen
differiert, reicht gewöhnlich
von 0,001 bis 3000 mg einmal, bevorzugt von 0,01 bis 1000 mg ein-
bis dreimal am Tag. Der Hemmer der vorliegenden Erfindung kann in
diesen Zubereitungen der Lebensmittelprodukte in einem Verhältnis von wenigstens
0,01 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 80 Gew.-% enthalten sein. Diese
Zubereitungen oder Lebensmittelprodukte können andere medizinisch wirksame
Bestandteile enthalten.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird weiterhin in Einzelheiten auf der Grundlage
von Beispielen konkret erläutert,
aber ist nicht darauf beschränkt.
In den Beispielen beziehen sich „Gewichtsteile" und „Gew.-%" auf „Teile" und bzw.„
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BEISPIEL 1
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Zu
120 Teilen getrockneten Thunfisch (Bonito) wurden 1000 Teile Wasser
hinzugegeben und die Mischung wurde mit warmem Wasser bei 90°C für eine Stunde
extrahiert und durch ein Siebgewebe filtriert, um einen Rückstand
zu ergeben. Zu 500 Teilen des Rückstands
(Feststoffgehalt 20%) wurden 5 Teile Thermolysinenzym und 900 Teile
Wasser gegeben. Die Mischung wurde mit 1% Natriumhydroxid auf pH
7,5 eingestellt und bei einer Verdauungsrate von 40% bei 60°C für 15 Stunden
hydrolysiert. Nach Filtration wurden 100 Teile (E-1)(Feststoffgehalt
40%) einer konzentrierten Lösung
erhalten.
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Die
konzentrierte Lösung
wurde mit einer Membran bei den folgenden Bedingungen behandelt
und 50 Teile einer Membran konzentrierten Fraktion (E-2)(Feststoffgehalt
40%) wurden entfernt, um 50 Teile einer Membran durchtretenen Fraktion
(E-3)(Feststoffgehalt 40%) zu erhalten.
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(Membranbehandlungsbedingungen)
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- Instrumente: CROSS FLOW UF-Membran Test Modul (hergestellt
durch Millipore)
- Membran: SEP1013(Fraktionierungsmolekulargewicht 3000, erhältlich von
Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
- Druckbedingungen: Unter 1,5 kg/cm2 mit
Stickstoffgas
- Lineare Geschwindigkeit: 1 m/sec
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In
der vorher erwähnten
Membran durchtretenen Fraktion (E-3) wurden Oligopeptide beobachtet,
die Ile-Tyr, Phe-Gln-Pro,
Ile-Leu-Tyr, Ile-Tyr-Ala, Ile-Lys-Trp, Leu-Lys-Tyr-Pro, Ile-Val-Arg-Asp, Leu-Lys-Pro-Asn-Met,
Ile-Trp-His-His-Thr,
Ala-Leu-Pro-His-Ala, Ile-Lys-Pro-Leu-Asn-Tyr, Asp-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro enthalten.
Zunächst
wurde eine geringe Menge jedes der vorhergehenden Oligopeptide synthetisiert
und dann als jeweilige Standardproben verwendet. Die Fraktion, die
die gleiche Retentionszeit wie die Standardprobe hat, wurde unter
Verwendung von Umkehrphase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (reversed
Phase high Performance liquid chromatography; RP-HPLC) fraktioniert.
Dieses Vorgehen wurde dreimal wiederholt und eine Sequenz der Peptide
in der Fraktion mit der gleichen Retentionszeit wurde unter Verwendung
einer Proteinsequenziervorrichtung bestimmt.
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Eine
Menge eines Polypeptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens
5000 war 3
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Die
Angiotensin-Converting-Enzymhemmaktivität in jeder Fraktion (E-1, E-2
und E-3) wurde wie im Folgenden beschrieben bestimmt.
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Untersuchung
der Hemmwirkung für
das Angiotensin-Converting-Enzym
-
Die
Bestimmung der Hemmwirkung für
das Angiotensin-Converting-Enzym
wurde in Übereinstimmung
mit dem Verfahren von Cheung und Cushman (Biochemical Pharmacology,
20, 1637 (1971)) unter den folgenden Bedingungen bestimmt.
Substrat: | Bz(benzyl)-Gly-His-Leu
(86 mg verdaut in 8 ml Wasser-8 ml Phosphatpuffer (500 mM, pH 8,3)
mit 1,5 mM NaCl) |
Enzym: | Kaninchenlungenacetonpulver
(erhältlich
von Sigma) (1 g pulverisiert in 10 ml mM Phosphatpuffer pH 8,3 und
zentrifugiert; der Überstand
wurde verwendet) |
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Einhundert μl des vorhergehenden
Substrats wurden mit 12 μl
der Enzymlösung
gemischt und eine vorbestimmte Menge des Peptids in der Mischung
wurde mit Wasser aufgefüllt,
um 250 μl
zu ergeben. Die Reaktion erfolgte bei 37°C für 30 Minuten.
-
Die
Reaktion wurde mit 250 μl
1N-HCl abgeschreckt.
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Nach
Abschluss der Reaktion wurden 1,5 ml Ethylacetat zu der Reaktionsmischung
gegeben und die gesamte Mischung wurde in einem Vortex-Mischer für 15 Sekunden
gerührt,
wonach sie zentrifugiert wurde. Ein Aliquot mit 1,0 ml der Ethylacetatschicht
wurde genommen und das Ethylacetat abdestilliert. Der Rückstand
wurde in 1 ml destilliertem Wasser verdaut und die Absorption der
extrahierten Hippursäure
wurde bei 228 nm (OD228) bestimmt.
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Die
Hemmwirkung wurde als die 50%-hemmende Konzentration [IC50(μg/ml)]
des Hemmers (erfindungsgemäßes Peptid)
mit dem OD228-Wert in der Abwesenheit des
Hemmers genommen als 100% Angiotensin-Converting-Enzymaktivität und dem
OD228-Wert des Reaktionssystems bei der
Reaktionszeit 0 als 0% ausgedrückt.
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Ferner
wurde der erhaltene Hemmer nach der folgenden Konzentrationstrocknung
im Bezug auf Farbton, Bitterkeit von 1% Lösung und Geschmack wie folgt
bewertet.
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(Farbton)
-
- ⦿ reines
weiß
- O nahezu weiß
- Δ leicht
gelb
- x gelb
-
(Bitterkeit)
-
- ⦿ nicht
bitter
- O ein bisschen bitter
- Δ bitter
- x zu bitter
-
(Geschmack) hinterlässt keinen Nachgeschmack sondern
einen
-
- O angenehmen Geschmack
- ⦿ hinterlässt einen
leichten Nachgeschmack
- Δ hinterlässt einen
leichten schlechten Nachgeschmack
- x hinterlässt
einen schlechten Nachgeschmack
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TABELLE 1
Fraktion | Ausbeute*
(%) | IC50 (μm/ml) | Farbton | Bitterkeit | Geschmack |
E-1 | 33,3 | 80 | Δ | Δ | x |
E-2 | 16,7 | 300 | Δ | x | x |
E-3 | 16,7 | 30 | ⦿ | ⦿ | ⦿ |
- * Relativer Wert für jede Fraktion auf der Grundlage
des Gewichts des Ausgangsmaterials (getrockneter Bonito) welcher
durch Konzentration bis zur Trockenheit erhalten wurde.
-
Der
Bestandteil des Polypeptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens
5000 war 20% in der E-1.
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BEISPIEL 2
-
Zu
100 Teilen der konzentrierten Lösung
(E-1) (Feststoffgehalt 40%), die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden
95 Vol.-% Ethanol hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht
stehen gelassen und ein gebildetes Präzipitat wurde als 85 Teile
der Fraktion (E-4) (Feststoffgehalt 40 ) durch Filtration entfernt
und das Ethanol in dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck abdestilliert,
um 15 Teile der Fraktion (E-5) (Feststoffgehalt 40%) zu erhalten.
Die vorhergehende Fraktion (E-5) umfasste das gesamte in Beispiel
1 beobachtete Oligopeptid. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht
von wenigstens 5000 waren 5 Eine hemmende Aktivität wurde
in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Farbton,
Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der Tabelle 2 gezeigt bewertet. TABELLE 2
Fraktion | Ausbeute*
(%) | IC50 (μm/ml) | Farbton | Bitterkeit | Geschmack |
E-1 | 33,3 | 80 | Δ | Δ | x |
E-4 | 28,3 | 200 | x | Δ | x |
E-5 | 5,0 | 40 | ⦿ | ⦿ | ⦿ |
- * Relativer Wert für jede Fraktion auf der Grundlage
des Gewichts des Ausgangsmaterials (getrockneter Bonito) welcher
durch Konzentration bis zur Trockenheit erhalten wurde.
-
BEISPIEL 3
-
In
Beispiel 1 wurden 1000 Teile Wasser zu 120 Teilen des so homogenisierenden
getrockneten Bonito gegeben. Zu der resultierenden Mischung wurden
5 Teile Thermolisinenzym gegeben, um sie in der gleichen Art und
Weise wie in Beispiel 1 zu hydrolisieren, und dann wurden 100 Teile
einer konzentrierten Lösung
(E-6) (Feststoffgehalt 45%) erhalten.
-
Die
konzentrierte Lösung
wurde mit einer Membran bei der gleichen Bedingung wie in Beispiel
1 behandelt, und 50 Teile einer membrankonzentrierten Fraktion (E-7)
(Feststoffgehalt 45%) wurden entfernt, um 50 Teile einer durch die
Membran tretenden Fraktion (E-8) (Feststoffgehalt 45%) zu erhalten.
-
Die
vorhergehende Fraktion (E-8) umfasste alle in Beispiel 1 beobachteten
Oligopeptide. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens
5000 waren 4% in der Fraktion (E-8).
-
Eine
hemmende Aktivität
wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Farbton, Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der Tabelle 3 gezeigt
bewertet. TABELLE 3
Fraktion | Ausbeute*
(%) | IC50 (μm/ml) | Farbton | Bitterkeeit | Geschmack |
E-6 | 37,5 | 110 | x | x | x |
E-7 | 18,8 | 310 | Δ | x | x |
E-8 | 18,8 | 35 | ⦿ | ⦿ | ⦿ |
- * Relativer Wert für jede Fraktion auf der Grundlage
des Gewichts des Ausgangsmaterials (getrockneter Bonito) welcher
durch Konzentration bis zur Trockenheit erhalten wurde.
-
Die
Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 waren
25% in E-6.
-
BEISPIEL 4
-
Zu
100 Teilen der konzentrierten Lösung
(E-6) (Feststoffgehalt 45%) erhalten in Beispiel 1 wurden 95 Vol.-%
Ethanol gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht
stehen gelassen und ein gebildetes Präzipitat wurde als 80 Teile
der Fraktion (E-9) (Feststoffgehalt 45%) durch Filtration entfernt,
und Ethanol in dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck abdestilliert,
um 20 Teile der Fraktion (E-10) (Feststoffgehalt 45%) zu erhalten.
Die vorhergehende Fraktion (E-10) umfasste alle in Beispiel 1 beobachteten
Oligopeptide. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von 5000
waren 2% in der Fraktion (E-10).
-
Eine
hemmende Wirkung wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen. Farbton, Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der
Tabelle 4 gezeigt bewertet. TABELLE 4
Fraktion | Ausbeute*
(%) | IC50 (μm/ml) | Farbton | Bitterkeit | Geschmack |
E-6 | 37,5 | 110 | x | x | x |
E-9 | 30,0 | 200 | Δ | x | x |
E-10 | 7,0 | 50 | ⦿ | ⦿ | ⦿ |
- * Relativer Wert für jede Fraktion auf der Grundlage
des Gewichts des Ausgangsmaterials (getrockneter Bonito) welcher
durch Konzentration bis zur Trockenheit erhalten wurde.
SEQUENZPROTOKOLL