DE60038350T2

DE60038350T2 - Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer

Info

Publication number: DE60038350T2
Application number: DE60038350T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Fujita
Original assignee: Nippon Supplement Inc
Current assignee: Nippon Supplement Inc
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-09-19
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2020-09-20
Also published as: CA2318494A1; CA2318494C; EP1092724A2; EP1092724A3; EP1092724B1; JP2001112470A; US7034002B1; JP3592593B2; DE60038350D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (bzw. Inhibitor des Angiotensin-Converting-Enzyms), der eine Zusammensetzung umfasst, die durch Verdauen von Fischfleisch mit einem Thermolysinenzym erhaltene Peptide umfasst, welche nützlich als medizinische Zusätze, Lebensmittel, Gesundheitslebensmittel, spezielle Lebensmittel für die Gesundheitsvorsorge und ähnliches sind.
Das Angiotensin-Converting-Enzym ist ein Enzym, welches hauptsächlich in der Lunge, den Gefäßendothelzellen und den proximalen Tubuli der Niere vorhanden ist und auf Angiotensin I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) wirkt, um ein Dipeptid (His9-Leu10) an seinem C-Terminus zu spalten, um Angiotensin II zu ergeben, welches eine starke Blutdruck steigernde Wirkung hat. Außerdem zersetzt dieses Enzym Bradykinin, das eine physiologisch hypotonische (d. h. blutdrucksenkende) Substanz ist, um es zu inaktivieren, und ist als solches eng in das Blutdruck steigernde System involviert. Es wurde angenommen, dass die Hemmung des Angiotensin-Converting-Enzyms den Blutdruck senken würde und daher klinisch nützlich für die Vermeidung und die Behandlung von Hypertonie (Bluthochdruck) ist.
In der jüngsten Zeit, da Captopril, ein Prolinderivat, synthetisiert wurde und herausgefunden wurde, dass es hypotonische Aktivität hat, wurden starke Forschungsanstrengungen für die Synthese einer Vielzahl von Hemmstoffen des Angiotensin-Converting-Enzyms unternommen, und es wurde ebenfalls versucht, derartige Substanzen aus natürlichen Quellen zu isolieren.
Dies ist so, weil angenommen wird, dass Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer vom natürlichen Typ, die aus Lebensmitteln oder Lebensmittelmaterialien erhältlich sind, als anti-hypotonische Mittel mit geringer Toxizität und hoher Sicherheit von Wert sind.
Die Erfinder offenbarten in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 69397/1992 bereits ein neuartiges Peptid, welches ein Leu-Lys-Pro-Gerüst enthält. In der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 144696/1992 ist ein Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung mit einem Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer offenbart, welcher durch Hydrolyse eines Proteins mit Thermolysin erhalten wird. Ferner wird in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 2449979/1993 ein Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung mit Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmern offenbart, welche durch hydrolysieren des Rückstands erhalten wird, der hauptsächlich wasserunlösliches Protein enthält, mit einer Protease nach Wärmebehandlung von Fleisch in Wasser mit nicht weniger als 50°C, um wasserlösliches Protein durch Extraktion auszuschließen.
Obwohl jedoch eine hemmende Aktivität von neuartigen Peptiden, die in der vorher erwähnten japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 69397/1992 offenbart werden, sehr stark ist, erfordert es eine Menge Aufwand und hohe Kosten, um in der Praxis die Peptide aufzutrennen. Obwohl ebenfalls eine Zusammensetzung mit relativ hoher hemmender Aktivität durch die in der japanischen ungeprüften Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 144696/1992 und japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 244979/1993 offenbarten Verfahren erhalten wird, ist die Aufnahmemenge der Zusammensetzung leicht erhöht, um eine Wirkung zu erhalten. Daher ist es erwünscht, dass eine Aufnahmemenge weiter reduziert wird, um die Zusammensetzung leicht jeden Tag aufzunehmen. Außerdem sind, wenn getrockneter Bonito (Tunfisch) als Protein verwendet wird, die vorhergehenden Zusammensetzungen nach wie vor offen für Verbesserungen im Nachgeschmack obwohl die in Peptid spezifische Bitterkeit reduziert wird.
In Bioscience Biotechnology Biochemistry, Japan Soc. For Bioscience, Biotechnology And Agrochem., Tokio, JP (1992), 56 (10), S. 1541–1545 wurde ein ungereinigter Überstand von verdautem Bonito-Homogenat in einem ACE-Hemmtest verwendet, oder wurde weiterhin einer Reinigung auf einer Oktadecyl-Silicium-(ODS)-Säule unterzogen, mit HPLC gereinigt und wahlweise weiter durch ODS gereinigt, was in reinen Peptiden resultierte, die in dem obigen Test zu verwenden sind und eine starke ACE hemmende Aktivität aufweisen.
Als ein Ergebnis einer intensiven Studie um die vorhergehenden Probleme zu lösen, haben die Erfinder das folgende gefunden und die vorliegende Erfindung vollendet. Sie haben einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (hiernach als „Hemmer" bezeichnet), definiert gemäß Anspruch 1, gefunden. Sie haben ebenfalls gefunden, dass der Hemmer eine hervorragende inhibitorische Aktivität und einen guten Farbton, keine Bitterkeit und einen guten Nachgeschmack hat und leicht aufzunehmen ist.
Das heißt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer, welcher eine Zusammensetzung ist, der Peptide enthält, die durch Verdauen von Fischfleisch mit Thermolysinenzym erhalten werdem, dessen Gehalt an einem Polypeptid-Inhaltsstoff mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 höchstens 10 Gew.-% ist.
In dem vorher erwähnten Hemmer umfasst die Peptide enthaltende Zusammensetzung bevorzugt wenigstens eines ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
In dem vorher erwähnten Hemmer, ist das Fischfleisch bevorzugt ein getrockneter Fisch.
In dem vorher erwähnten Hemmer, ist das Fischfleisch bevorzugt ein Rückstand aus der Extraktion von dem getrockneten Fisch mit kochendem Wasser.
In dem vorher erwähnten Hemmer, ist der getrocknete Fisch bevorzugt ein getrockneter Thunfisch (Bonito).
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich wie folgt erläutert.
Die erfindungsgemäße Peptid enthaltende Zusammensetzung kann durch Verdauen von Fischfleisch mit Thermolysin erhalten werden. Beispiele von Fischfleisch sind Rohfleisch von Skipjack, Makrele, Sardine, Dorsch (Kabeljau), Lachs (Salm), pazifischer Makrelenhecht, junger Gelbschwanzfisch (young yellowtail), Pferde- oder Stachelmakrele, getrocknetes Fleisch davon, der Rückstand davon, welcher durch heißes Wasser extrahiert wird, getrocknetes Fischfleisch, das durch Trocknen des extrahierten Rückstands oder durch zeitweise Zugabe von Schimmelpilzen dazu erhalten wird, und der Rückstand des getrockneten Fischfleischs extrahiert durch heißes Wasser. Bevorzugt wird der Rückstand des getrockneten, durch heißes Wasser extrahierten Fischfleisches verwendet. Ebenfalls wird von den vorher erwähnten getrockneten Fischfleischen bevorzugt getrockneter Bonito verwendet.
Ein Thermolysinenzym als Auflösungsenzym kann eine gereinigte Enzymlösung, eine gemischte Enzymlösung einiger anderer Enzyme oder eine auf dem Markt erhältliche Lösung wie etwa „Thermoase" (erhältlich von Daiwa Kasei K. K.) sein.
Wenn Fischfleisch mit einem Thermolysinenzym verdaut wird, wird das Fischfleisch durch Zugabe von Wasser und Thermolysinenzym dazu hydrolysiert. Bei der Hydrolyse kann Fischfleisch aufgrund seiner Eigenschaften vorbehandelt sein, und in diesem Fall wird Wasser oder warmes Wasser zu dem Fischfleisch gegeben und dann erfolgt ein Mischen und eine starke Homogenisierung. Die Menge an Thermolysinenzym reicht bevorzugt von 0,05 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugter von 0,1 bis 1,0 Gew.-% der Gesamtheit einer Menge an Fischfleisch und Wasser. Eine Thermolysinenzymmenge von weniger als 0,05 Gew.-% ist nicht bevorzugt, weil sie die Hydrolyse nicht genug fördern wird. Ebenfalls ist eine Thermolysinenzymmenge von mehr als 5 Gew.-% nicht bevorzugt, weil das Thermolysinenzym nur verschwendet wird.
Die Reaktionstemperatur der Hydrolyse reicht bevorzugt von 10 bis 85°C, bevorzugter von 40 bis 80°C. Eine Reaktionstemperatur von niedriger als 10°C ist nicht bevorzugt, weil sie die Hydrolyse nicht genug fördern wird. Ebenfalls ist eine Reaktionstemperatur von über 85°C nicht bevorzugt, weil die hemmende Wirkung des Thermolysinenzyms sehr beschädigt wird.
Der pH bei der Hydrolyse reicht bevorzugt von 6 bis 8. Ein pH von weniger als 6 oder über 8 ist nicht bevorzugt, weil die Hydrolyserate gesenkt sein wird. Da eine Lösung vor dem Beginn der Hydrolysereaktion allgemein einen pH von 4 bis 5,5 hat, ist es bevorzugt, einen pH von 6 bis 8 bei Verwendung einer alkalischen Lösung (wie etwa Natriumchloridlösung) einzustellen.
Ein Reaktionszeitraum reicht bevorzugt von 10 Minuten bis 30 Stunden, bevorzugter von 3 bis 20 Stunden. Ein Reaktionszeitraum von weniger als 10 Minuten ist nicht bevorzugt, weil eine Sammelrate der verdauten Verbindung niedrig wird. Ebenfalls ist eine Reaktionsdauer von mehr als 30 Stunden nicht bevorzugt, weil die Produktionseffizienz gesenkt wird.
Obwohl ein Hydrolyseverhältnis nicht besonders beschränkt ist, wird das endgültige Hydrolyseverhältnis bevorzugt von 10 bis 60% und bevorzugter von 20 bis 50% eingestellt. Ein Hydrolyseverhältnis von weniger als 10% ist nicht bevorzugt, weil wenig Peptid erhalten wird. Ebenfalls ist ein Hydrolyseverhältnis von mehr als 60% nicht bevorzugt, weil eine Hydrolyse für eine lange Zeit fortgesetzt werden muss und eine große Menge an Thermolysin erforderlich ist, um ein Verhältnis von 60% zu erhalten. Das Hydrolyseverhältnis kann in Überstimmung mit einem Verfahren, beschrieben in Journal of Agriculture and Food Chemistry, Band 24, Nr. 6, S. 1090–1093 (1976), gemessen werden.
Das Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist, dass ein Gehalt an Polypeptid mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000, welches in der peptidhaltigen Zusammensetzung erhalten durch Auflösen mit dem vorhergehenden Enzym enthalten ist, nicht mehr als 10 Gew.-% des Feststoffanteils der Zusammensetzung ist.
Speziell wird von der oben erwähnten verdauten Zusammensetzung, die 15 bis 30 Gew.-% eines Peptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 enthält, das Peptid mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 entfernt, sodass ein Gehalt des Peptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 höchstens 10 Gew.-% ist, bevorzugter von 0,1 bis 5 Gew.-% Es ist nicht angemessen, wenn ein Gehalt des Peptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 über 10 Gew.-% ist, weil das die Nachteile ergibt, dass der Farbton gelb oder braun wird, ein wenig Bitterkeit verbleibt und einen unnatürlichen Geschmack erzeugt, und dass der Nachgeschmack für eine lange Zeit verbleibt, wenn das Peptid zu schwach gewürzten Dingen gegeben wird, und weiterhin, weil die hemmende Wirkung nicht verbessert wird.
In der vorliegenden Erfindung wird das Molekulargewicht der Probe durch eine Gelfiltrationschromatographie gemessen. Genauer wird unter Verwendung eines Peptids und von Proteinen [Asp-Gly-Leu-Tyr-Pro (Molekulargewicht 563)], Neurotensin (Molekulargewicht 1637), Ribonuklease (Molekulargewicht 13700) als Standardsubstanzen, welche bekannte Molekulargewichte haben, ein Extrakt bei den folgenden Bedingungen eluiert, um eine Retentionszeit zu bestimmen, und ein Molekulargewicht wird unter Verwendung einer Eichkurve, erhalten durch logarithmisches Auftragen der Molekulargewichte auf der Ordinate und den Retentionszeiten auf der Abszisse, bestimmt. In der Erfindung wird ebenfalls eine Menge „Gewichtsprozent" der Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 als „Prozentfläche" der Peaks die den Bestandteilen mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 entsprechen nach teilen der Peaks an der Position des Molekulargewichts 5000 auf einem Elutionschromatogramm dargestellt.
(Fraktionierungsbedingungen)

Säule: Protein Pak60 (hergestellt durch Waters) 5 × 250 mm
Mobile Phase: 50 Vol.-% wässrige Acetonitrillösung mit 0,1 Vol.-% TFA (Trifluoressigsäure)
Durchflussgeschwindigkeit: 0,7 mL/Min
Detektion: RI
Probenmenge: 1 mg (Relation zwischen Molekulargewicht der Standardsubstanz und der Elutionszeit)

Bei den vorher erwähnten Bedingungen wird, da eine Substanz mit einem Molekulargewicht von 5000 bei 29 Minuten eluiert wird, jede Substanz, die bei mehr als 29 Minuten eluiert wird, als ein Polypeptidbestandteil mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 angesehen.
Im Folgenden sind Beispiele für ein Verfahren für die Entfernung eines Polypeptidbestandteils mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000.

[1] Ein Verfahren für die Entfernung von Fraktionen mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 mittels einer Gelfiltrationschromatographie
[2] Ein Verfahren für die Entfernung von Fraktionen mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 mittels einer Membranbehandlung
[3] Ein Verfahren für die Entfernung von Fraktionen mit einem hohen Molekulargewicht durch eine Lösungsmittelextraktion unter Verwendung eines polaren organischen Lösungsmittels, wie etwa Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Chloroform, Ethylacetat, Toluol, Hexan, oder Benzol.

Diese Verfahren können alleine oder in einer Kombinationsverwendung von zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Die Verfahren [1] bis [3] werden kurz erläutert. Bei dem Verfahren [1] wird das vorher beschriebene Vorgehen als eine Molekulargewichtsanalyse in einem industriellen Maßstab durchgeführt.
Bei dem Verfahren [1] wird ein Extrakt durch eine Membran mit einem Fraktionierungsmolekulargewicht von etwa 5000 (UF-Membran) wie etwa UF-Membran „PLCC (fractionation molecular weight 5000)" erhältlich von Millipore, UF-Membran „AES-5 (fractionation molecular weight 5000)" erhältlich von Advances Membrane Technology, UF-Membran „HFK-131 (fractionation molecular weight 5000)" erhältlich von Abco und UF-Membran „SEP1013 (fractionation molecular weight 3000)" erhältlich von Asahi Chemical Industry Co., Ltd. filtriert.
In dem Verfahren [3] wird ein Extrakt in einem derartigen Ausmaß konzentriert, dass keine Präzipitation auftritt, die organische Lösungsmittelkonzentration innerhalb dieses Systems ist 60 bis 99 Vol.-%, durch Zugabe von 5 bis 100 Volumen des organischen Lösungsmittels dazu wird jede Substanz mit einem hohen Molekulargewicht präzipitiert.
Der erhaltene Hemmer (Hemmstoff) der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung von verschiedenen Oligopeptiden, etwas Nukleinsäure und Protein, welches teilweise verdaut ist, und als das Oligopeptid ist wenigstens eines der folgenden Peptide enthalten:
Das vorhergehende Leu ist Leucin, Lys Lysin, Pro Prolin, Asn Asparagin, Met Methionin, Ile Isoleucin, Trp Tryptophan, Phe Phenylalanin, Gln Glutamin, Tyr Tyrosin, Gly Glycin, His Histidin, Thr Threonin, Ala Alanin, Val Valin, Arg Arginin und Asp Asparaginsäure. Alle der vorhergehenden Aminosäuren der vorliegenden Erfindung sind das L-Isomer.
Der Hemmer der vorliegenden Erfindung ist ein Pulver, das durch Zubereiten einer verdauten Lösung erhalten durch Hydrolyse mit der vorhergehenden Zusammensetzung nach Entfernen einer Lösung oder Wasser hergestellt wird. Als ein Entwässerungsverfahren wird ein Konzentrationstrocknen, Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, Vakuumtrocknen und ähnliches eingesetzt. Der Hemmer der vorliegenden Erfindung wird als Arzneimittel und Gesundheitslebensmittel (Gesundheitszusatzlebensmittel) in der Form einer Zubereitung verwendet, oder wird wie er ist zu Lebensmittelprodukten zugesetzt.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden allgemein formuliert mit pharmazeutischen Trägern und Hilfsstoffen verabreicht, welche allgemein in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden und gegenüber den Peptiden der Erfindung reaktionsträge sind. Zu derartigen Trägern und Hilfsstoffen gehören Lactose, Glucose, Mannitol, Dextrin, Cyclodextrin, Stärke, Saccharose, Magnesiummetasilicataluminat, synthetisches Aluminiumsilicat, Carboxymethylcellulosenatrium, Hydroxypropylstärke, Carboxymethylcellulosecalcium, Ionenaustauscherharze, Methylcellulose, Gelatine, Gummi arabicum, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, weiches Kieselsäureanhydrid, Magnesiumstearat, Kalk, Tragant, Bentonit, B-Gummi, Titandioxid, Sorbitanfettsäureester, Natriumlaurylsulfat, Glycerin, Glycerinfettsäure, Ester, gereinigtes Lanolin, Glycerogelatine, Polysorbat, Macrogole, pflanzliche Öle, Wachse, flüssiges Parafin, weiße Vaseline, Fluorkohlenwasserstoff, nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, Propylenglykol, Wasser und ähnliche.
Die Dosierungsform kann eine Tablette, Kapsel, Körnchen, Pulver, Sirup, Suspension oder injizierbare Lösung sein. Diese Zubereitungen können durch die etablierten pharmazeutischen Vorgehensweisen hergestellt werden.
Das vorher zubereitete Medikament oder Gesundheitslebensmittel wird zum Zweck der Vermeidung von Blutdruckabfall, myocardialer Vergrößerung und Apoplexie verwendet.
Da der erfindungsgemäße Hemmer ebenfalls eine geringe Bitterkeit und einen guten Nachgeschmack hat, kann er für Lebensmittel, wie etwa verarbeitete landwirtschaftliche oder aus dem Meer stammende (marine) Lebensmittel, Milchprodukte, Süßwaren, Gewürze, Getränke, gefriergetrocknete Lebensmittel und steril verpackte Lebensmittel (retort-packed foods), Gesundheitslebensmittel, die Gesundheit unterstützende Lebensmittel oder Lebensmittelzusatzstoffe verwendet werden.
Ein Hemmer der vorliegenden Erfindung kann zu einem Lebensmittelprodukt, wie dem Folgenden, ohne spezifische Beschränkung zugesetzt werden.
(1) Verarbeitete landwirtschaftliche und Meeresprodukte

Gelatinenudeln, Mus von pürierten süßen roten Bohnen, ein gelatinehaltiges Lebensmittel hergestellt aus Devil's-Tongue Stärke, Brot, Nudeln (Instantnudeln, Pasta, rohe Nudeln, getrocknete Nudeln), Reiskuchen, Cerealien (Getreideprodukte), verarbeitete Sojabohnenprodukte (Tofu, Sojabohnenmilch, Natto, getrockneter Bohnenquark), verarbeitete Meeresprodukte [gekochte Fischpaste, (mit Krabbengeschmack versehene) Fischstrangwürstchen, (Fisch-)Schinken, (Fisch)Wurst, (Fisch)Wiener, Reisgarnierung, Meersalatflocken für Reis mit Tee], in Dosen verpackte Lebensmittel (Dosenthunfisch, Ölsardinen, Yakitorispieße), steril verpackte Lebensmittel (Curry, Stew, Spaghettisoße).

[2] Molkereiprodukte

Milch, verarbeite Milch, Milchsäure vergärte Getränke, Butter, Käse, Kondensmilch, Milchpulver.

[3] Süßwaren

Kuchen, Mousse, (pulverisiertes) Dessert, Eiskrem, Bonbons, Schokolade, Gummibonbons, Kekse, Waffeln, Gelee

[4] Gewürze

Miso (fermentierte Sojabohnenpaste), Sojasoße, Aromastoffe und Gewürze, (pulverisiertes) natürliches Gewürz, Soße, Dressing, Grillsoße, süßes Sakegewürz, Curry, Stew, scharfe und milde Gewürze, Joghurt

[5] Getränke

Erfrischungsgetränke (Getränke mit Kohlensäure, Fruchtsaft, Sportergänzungsgetränke, Gesundheitsgetränke), Luxusgetränke (Kaffee, Kakaotrunk, Gerstengetränk), Misosuppe, klare Suppe

[6] Gesundheitslebensmittel

1] Lebensmittel, die Saponin enthalten (Lebensmittel mit Panax Ginsengwurzel, Lebensmittel, die Acanthopanax Senticosus Harms enthalten)
2] Lebensmittel mit Saccharid [Oligosaccharid (Lebensmittel mit Fructooligosaccharid, Lebensmittel mit Isomaltoligosaccharid, Lebensmittel mit Galaktooligosaccharid), Polysaccharid (Lebensmittel] mit Cortinellus Shiitake, Mucosaccharid, Lebensmittel mit Protein, Lebensmittel mit Chondoitinsulfat, Lebensmittel mit Gandoderma Lucidium (Reishi), Lebensmittel mit Chitin/Chitosan)
3] Lebensmittel mit Mineralien (Lebensmittel mit Calcium, Lebensmittel mit Alfalfa, Lebensmittel mit Pflaumenextrakt, Lebensmittel mit β-Karotin)
4] Lebensmittel mit Fett (Fett mit Vitamin E [Weizen- und Tränengraskeimöl, Sojabohnenkeimöl, Reiskernöl], Lebensmittel mit Eicosapentaensäure, Lebensmittel mit Sojabohnenlecithin, Lebensmittel mit γ-Linolensäure (Nachtkerzenöl, Borageöl), Lebensmittel mit Docosahexaensäure)
5] Lebensmittel mit Protein (Lebensmittel mit Sojabohnenprotein, Kasein, verarbeitete Karpfenlebensmittel)
6] Lebensmittel mit Taurinauster, verarbeitete Körbchenmuschel, verarbeitete grüne Seemuschel

[7] Andere

Verarbeitete Weichschildkröte, an Aminosäuredysbolismus orientiertes Lebensmittel, flüssiges Lebensmittel (Patienten Mahlzeit)

Verabreichungs-(Aufnahme-)Menge der Menge des Hemmers der vorliegenden Erfinder, welche auf Grund des Verabreichungsverfahrens, im Zustand oder Alter eines Patienten und ähnlichen differiert, reicht gewöhnlich von 0,001 bis 3000 mg einmal, bevorzugt von 0,01 bis 1000 mg ein- bis dreimal am Tag. Der Hemmer der vorliegenden Erfindung kann in diesen Zubereitungen der Lebensmittelprodukte in einem Verhältnis von wenigstens 0,01 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 80 Gew.-% enthalten sein. Diese Zubereitungen oder Lebensmittelprodukte können andere medizinisch wirksame Bestandteile enthalten.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in Einzelheiten auf der Grundlage von Beispielen konkret erläutert, aber ist nicht darauf beschränkt. In den Beispielen beziehen sich „Gewichtsteile" und „Gew.-%" auf „Teile" und bzw.„
BEISPIEL 1
Zu 120 Teilen getrockneten Thunfisch (Bonito) wurden 1000 Teile Wasser hinzugegeben und die Mischung wurde mit warmem Wasser bei 90°C für eine Stunde extrahiert und durch ein Siebgewebe filtriert, um einen Rückstand zu ergeben. Zu 500 Teilen des Rückstands (Feststoffgehalt 20%) wurden 5 Teile Thermolysinenzym und 900 Teile Wasser gegeben. Die Mischung wurde mit 1% Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt und bei einer Verdauungsrate von 40% bei 60°C für 15 Stunden hydrolysiert. Nach Filtration wurden 100 Teile (E-1)(Feststoffgehalt 40%) einer konzentrierten Lösung erhalten.
Die konzentrierte Lösung wurde mit einer Membran bei den folgenden Bedingungen behandelt und 50 Teile einer Membran konzentrierten Fraktion (E-2)(Feststoffgehalt 40%) wurden entfernt, um 50 Teile einer Membran durchtretenen Fraktion (E-3)(Feststoffgehalt 40%) zu erhalten.
(Membranbehandlungsbedingungen)

Instrumente: CROSS FLOW UF-Membran Test Modul (hergestellt durch Millipore)
Membran: SEP1013(Fraktionierungsmolekulargewicht 3000, erhältlich von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
Druckbedingungen: Unter 1,5 kg/cm² mit Stickstoffgas
Lineare Geschwindigkeit: 1 m/sec

In der vorher erwähnten Membran durchtretenen Fraktion (E-3) wurden Oligopeptide beobachtet, die Ile-Tyr, Phe-Gln-Pro, Ile-Leu-Tyr, Ile-Tyr-Ala, Ile-Lys-Trp, Leu-Lys-Tyr-Pro, Ile-Val-Arg-Asp, Leu-Lys-Pro-Asn-Met, Ile-Trp-His-His-Thr, Ala-Leu-Pro-His-Ala, Ile-Lys-Pro-Leu-Asn-Tyr, Asp-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro enthalten. Zunächst wurde eine geringe Menge jedes der vorhergehenden Oligopeptide synthetisiert und dann als jeweilige Standardproben verwendet. Die Fraktion, die die gleiche Retentionszeit wie die Standardprobe hat, wurde unter Verwendung von Umkehrphase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (reversed Phase high Performance liquid chromatography; RP-HPLC) fraktioniert. Dieses Vorgehen wurde dreimal wiederholt und eine Sequenz der Peptide in der Fraktion mit der gleichen Retentionszeit wurde unter Verwendung einer Proteinsequenziervorrichtung bestimmt.
Eine Menge eines Polypeptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 war 3
Die Angiotensin-Converting-Enzymhemmaktivität in jeder Fraktion (E-1, E-2 und E-3) wurde wie im Folgenden beschrieben bestimmt.
Untersuchung der Hemmwirkung für das Angiotensin-Converting-Enzym

Die Bestimmung der Hemmwirkung für das Angiotensin-Converting-Enzym wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Cheung und Cushman (Biochemical Pharmacology, 20, 1637 (1971)) unter den folgenden Bedingungen bestimmt.

Substrat:	Bz(benzyl)-Gly-His-Leu (86 mg verdaut in 8 ml Wasser-8 ml Phosphatpuffer (500 mM, pH 8,3) mit 1,5 mM NaCl)
Enzym:	Kaninchenlungenacetonpulver (erhältlich von Sigma) (1 g pulverisiert in 10 ml mM Phosphatpuffer pH 8,3 und zentrifugiert; der Überstand wurde verwendet)

Einhundert μl des vorhergehenden Substrats wurden mit 12 μl der Enzymlösung gemischt und eine vorbestimmte Menge des Peptids in der Mischung wurde mit Wasser aufgefüllt, um 250 μl zu ergeben. Die Reaktion erfolgte bei 37°C für 30 Minuten.
Die Reaktion wurde mit 250 μl 1N-HCl abgeschreckt.
Nach Abschluss der Reaktion wurden 1,5 ml Ethylacetat zu der Reaktionsmischung gegeben und die gesamte Mischung wurde in einem Vortex-Mischer für 15 Sekunden gerührt, wonach sie zentrifugiert wurde. Ein Aliquot mit 1,0 ml der Ethylacetatschicht wurde genommen und das Ethylacetat abdestilliert. Der Rückstand wurde in 1 ml destilliertem Wasser verdaut und die Absorption der extrahierten Hippursäure wurde bei 228 nm (OD₂₂₈) bestimmt.
Die Hemmwirkung wurde als die 50%-hemmende Konzentration [IC₅₀(μg/ml)] des Hemmers (erfindungsgemäßes Peptid) mit dem OD₂₂₈-Wert in der Abwesenheit des Hemmers genommen als 100% Angiotensin-Converting-Enzymaktivität und dem OD₂₂₈-Wert des Reaktionssystems bei der Reaktionszeit 0 als 0% ausgedrückt.
Ferner wurde der erhaltene Hemmer nach der folgenden Konzentrationstrocknung im Bezug auf Farbton, Bitterkeit von 1% Lösung und Geschmack wie folgt bewertet.
(Farbton)

⦿ reines weiß
O nahezu weiß
Δ leicht gelb
x gelb

(Bitterkeit)

⦿ nicht bitter
O ein bisschen bitter
Δ bitter
x zu bitter

(Geschmack) hinterlässt keinen Nachgeschmack sondern einen

O angenehmen Geschmack
⦿ hinterlässt einen leichten Nachgeschmack
Δ hinterlässt einen leichten schlechten Nachgeschmack
x hinterlässt einen schlechten Nachgeschmack

TABELLE 1

Fraktion Ausbeute* (%) IC₅₀ (μm/ml) Farbton Bitterkeit Geschmack

E-1 33,3 80 Δ Δ x

E-2 16,7 300 Δ x x

E-3 16,7 30 ⦿ ⦿ ⦿

* Relativer Wert für jede Fraktion auf der Grundlage des Gewichts des Ausgangsmaterials (getrockneter Bonito) welcher durch Konzentration bis zur Trockenheit erhalten wurde.

Der Bestandteil des Polypeptids mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 war 20% in der E-1.
BEISPIEL 2
Zu 100 Teilen der konzentrierten Lösung (E-1) (Feststoffgehalt 40%), die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden 95 Vol.-% Ethanol hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen und ein gebildetes Präzipitat wurde als 85 Teile der Fraktion (E-4) (Feststoffgehalt 40 ) durch Filtration entfernt und das Ethanol in dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, um 15 Teile der Fraktion (E-5) (Feststoffgehalt 40%) zu erhalten. Die vorhergehende Fraktion (E-5) umfasste das gesamte in Beispiel 1 beobachtete Oligopeptid. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 waren 5 Eine hemmende Aktivität wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Farbton, Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der Tabelle 2 gezeigt bewertet. TABELLE 2

Fraktion Ausbeute* (%) IC₅₀ (μm/ml) Farbton Bitterkeit Geschmack

E-1 33,3 80 Δ Δ x

E-4 28,3 200 x Δ x

E-5 5,0 40 ⦿ ⦿ ⦿

BEISPIEL 3
In Beispiel 1 wurden 1000 Teile Wasser zu 120 Teilen des so homogenisierenden getrockneten Bonito gegeben. Zu der resultierenden Mischung wurden 5 Teile Thermolisinenzym gegeben, um sie in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 zu hydrolisieren, und dann wurden 100 Teile einer konzentrierten Lösung (E-6) (Feststoffgehalt 45%) erhalten.
Die konzentrierte Lösung wurde mit einer Membran bei der gleichen Bedingung wie in Beispiel 1 behandelt, und 50 Teile einer membrankonzentrierten Fraktion (E-7) (Feststoffgehalt 45%) wurden entfernt, um 50 Teile einer durch die Membran tretenden Fraktion (E-8) (Feststoffgehalt 45%) zu erhalten.
Die vorhergehende Fraktion (E-8) umfasste alle in Beispiel 1 beobachteten Oligopeptide. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 waren 4% in der Fraktion (E-8).
Eine hemmende Aktivität wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Farbton, Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der Tabelle 3 gezeigt bewertet. TABELLE 3

Fraktion Ausbeute* (%) IC₅₀ (μm/ml) Farbton Bitterkeeit Geschmack

E-6 37,5 110 x x x

E-7 18,8 310 Δ x x

E-8 18,8 35 ⦿ ⦿ ⦿

Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5000 waren 25% in E-6.
BEISPIEL 4
Zu 100 Teilen der konzentrierten Lösung (E-6) (Feststoffgehalt 45%) erhalten in Beispiel 1 wurden 95 Vol.-% Ethanol gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen und ein gebildetes Präzipitat wurde als 80 Teile der Fraktion (E-9) (Feststoffgehalt 45%) durch Filtration entfernt, und Ethanol in dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, um 20 Teile der Fraktion (E-10) (Feststoffgehalt 45%) zu erhalten. Die vorhergehende Fraktion (E-10) umfasste alle in Beispiel 1 beobachteten Oligopeptide. Die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von 5000 waren 2% in der Fraktion (E-10).
Eine hemmende Wirkung wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Farbton, Bitterkeit und Geschmack wurden wie in der Tabelle 4 gezeigt bewertet. TABELLE 4

Fraktion Ausbeute* (%) IC₅₀ (μm/ml) Farbton Bitterkeit Geschmack

E-6 37,5 110 x x x

E-9 30,0 200 Δ x x

E-10 7,0 50 ⦿ ⦿ ⦿

Claims

Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer, welcher eine Zusammensetzung ist, die Peptide enthält, die durch Verdauen von Fischfleisch mit einem Thermolysinenzym erhalten werden, wobei der Enzymhemmer erhältlich ist durch Filtrieren der Zusammensetzung durch eine Membran, die ein Fraktionierungsmolekulargewicht von etwa 3000 hat, sodass der Gehalt an Polypetid-Inhaltsstoffen mit einem Molekulargewicht von wenigstens von 5000 höchstens 10 Gew.-% ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Peptide enthält, die wenigstens eines umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 1, wobei das Fischfleisch ein getrockneter Fisch ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 2, wobei das Fischfleisch ein getrockneter Fisch ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 1, wobei das Fischfleisch ein Rückstand von der Extraktion von dem getrocknetem Fisch mit kochendem Wasser ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 2, wobei das Fischfleisch ein Rückstand von der Extraktion von dem getrocknetem Fisch mit kochendem Wasser ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 3, wobei der getrocknete Fisch ein getrockneter Thunfisch ist.
Angiotensin-Converting-Enzyme-Hemmer nach Anspruch 4, wobei der getrocknete Fisch ein getrockneter Thunfisch ist.
Angiotensin-Converting-Enyzme-Hemmer nach Anspruch 5, wobei der getrocknete Fisch ein getrockneter Thunfisch ist.
Angiotensin-Converting-Enyzme-Hemmer nach Anspruch 6, wobei der getrocknete Fisch ein getrockneter Thunfisch ist.