WO2007091678A1 - 経口摂取用関節リウマチ抑制剤 - Google Patents

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WO2007091678A1
WO2007091678A1 PCT/JP2007/052368 JP2007052368W WO2007091678A1 WO 2007091678 A1 WO2007091678 A1 WO 2007091678A1 JP 2007052368 W JP2007052368 W JP 2007052368W WO 2007091678 A1 WO2007091678 A1 WO 2007091678A1
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casein
hydrolyzate
rheumatoid arthritis
amino acid
free amino
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PCT/JP2007/052368
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Michio Hatori
Kohji Ohki
Naomi Hashimura
Tatsuhiko Hirota
Kazuhito Ohsawa
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Calpis Co., Ltd.
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention is expected to be a rheumatoid arthritis inhibitor for oral intake containing a specific animal milk casein hydrolyzate that exhibits rheumatoid arthritis-inhibiting action such as chronic rheumatoid arthritis when taken orally, and the inhibitory action is expected. It relates to functional foods.
  • Rheumatoid arthritis (sometimes abbreviated as RA) is an autoimmune disease that causes chronic joint inflammation and causes joint swelling and deformation. I don't know.
  • Inflammation of RA is thought to involve prostaglandins (PGE), prostacyclin (PGI), kyunes such as histamine and bradycun, so NSAID (non-steroidal)
  • PGE prostaglandins
  • PPI prostacyclin
  • kyunes such as histamine and bradycun
  • NSAID non-steroidal
  • anti-inflammatory drugs represented by anti-inflammatory drugs
  • inflammatory sites such as TNFo ;, interleukin 1 (IL-1), IL-6, which are involved in immunomodulation through T lymphocytes and B lymphocytes
  • Anti-rheumatic drugs such as immunosuppressive drugs that suppress force-in and suppress overall immune immunity, and immunomodulators that suppress only abnormal immunity related to RA have been prescribed.
  • antirheumatic drugs are prescribed!
  • Patent Document 1 discloses that a specific product of enzymatic degradation products of milk proteins has a TNF a and IL-6 inhibitory action, and systemic inflammatory response syndrome. ndrome) and inflammatory reactions can be alleviated
  • Patent Document 2 discloses that free amino acids and peptides obtained by hydrolyzing animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues. It has been proposed that casein hydrolyzate containing thiols has angiotensin I converting enzyme inhibitory activity or blood pressure lowering action.
  • dairy ingredients that are known as food ingredients and have sufficient safety and their degradation products have an RA inhibitory effect.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-155751
  • Patent Document 2 WO2005—102542 pamphlet
  • An object of the present invention is to provide a rheumatoid arthritis inhibitor for oral intake that exhibits an inhibitory action against arthritis and the like associated with rheumatoid arthritis and is excellent in safety with less side effects and the like.
  • Another object of the present invention is to provide functional foods such as health foods and foods for specified health use that can be used on a daily basis, are excellent in safety, and can be expected to suppress arthritis and the like associated with rheumatoid arthritis. is there.
  • the present invention provides a rheumatoid arthritis inhibitor for oral ingestion comprising a free amino acid and peptide mixture contained in as an active ingredient.
  • casein hydrolyzate containing free amino acids and peptides obtained by hydrolyzing animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues, or contained in the hydrolyzate The functional food which has the rheumatoid arthritis inhibitory effect which contains the free amino acid and peptide mixture which are obtained as an active ingredient is provided.
  • free amino acid obtained by hydrolyzing animal milk power zein with an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues for producing a rheumatoid arthritis inhibitor for oral intake is obtained.
  • Casein hydrolysates comprising peptides, or use of free amino acids and peptide mixtures contained in the hydrolysates are provided.
  • casein hydrolyzate containing free amino acids and peptides obtained by hydrolysis of animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues, or the hydrolysis There is provided a method for suppressing rheumatoid arthritis, wherein an effective amount of a free amino acid and peptide mixture contained in the product is orally administered.
  • the rheumatoid arthritis inhibitor for oral intake and functional food of the present invention contain, as active ingredients, a specific casein hydrolyzate known as a food material, or a free amino acid and peptide mixture contained in the hydrolyzate. Therefore, it is excellent in safety and can be expected to suppress arthritis related to rheumatoid arthritis. In particular, when these active ingredients in powders or tablets are added to functional foods, etc., they can be used on a daily basis.
  • FIG. 1 Plasma PGE measurement in the evaluation for adjuvant arthritis performed in Example 2
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measurement of plasma NO in the evaluation for adjuvant arthritis performed in Example 2.
  • the rheumatoid arthritis inhibitor and functional food of the present invention is preferably a mixture of free amino acids and peptides obtained by hydrolyzing animal milk casein so that the average chain length falls within a specific range as the number of amino acid residues.
  • a casein hydrolyzate containing 80% by weight or more, particularly preferably 80 to 90% by weight, or a mixture of free amino acids and peptides contained in the hydrolyzate as an active ingredient is contained with respect to the total amount of casein hydrolyzate.
  • the peptide preferably contains a dipeptide having an Xaa Pro sequence and a tripeptide-capable in vivo degradable peptide having an Xaa Pro Pro sequence in a specific ratio.
  • the peptide may be a peptide salt.
  • the average chain length is the sum of the peptides and free amino acids produced when hydrolyzing the same weight of animal milk casein with respect to the number of moles of total amino acids of the acid hydrolyzate in casein. It can be shown as a mole ratio.
  • the acid hydrolyzate in casein is casei Inprotein is decomposed into amino acids.
  • OPA o-phthalaldehyde
  • Z number of moles in the casein enzyme hydrolyzate
  • the average chain length of the degradation product obtained by hydrolyzing animal milk casein is 2.1 or less, preferably 1.1 to 2.1, particularly preferably, as the number of amino acid residues. 1. 3 to 2.1.
  • the average chain length exceeds 2.1, the ratio of desired dipeptides and tripeptides, and further free amino acids decreases, the bioabsorbability, and further the in vivo biodegradable peptide content decreases, The desired effect may not be obtained.
  • the content ratio of the dipeptide having the Xaa Pro sequence contained in the casein hydrolyzate is usually 5% by weight or more, preferably 5 to 25% by weight, based on the total of the peptides and free amino acids in the decomposed product. is there. If the content is less than 5% by weight, the desired action may be reduced.
  • the content ratio of the tripeptide having the Xaa Pro Pro sequence contained in the casein hydrolyzate is usually 1% by weight or more, preferably 1 to 5% by weight with respect to the total of peptides and free amino acids in the decomposed product. is there. If the content is less than 1% by weight, the desired action may be reduced.
  • the peptide in the casein hydrolyzate may be any amino acid and / or Xaa of the dipeptide having the Xaa Pro sequence and the tripeptide having the Xaa Pro Pro sequence.
  • dipeptides having Xaa Pro sequences include lie Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gin Pro, Met Pro, Tyr Pro, and tripeptides having Xaa Pro Pro sequences include Ser Pro Pro, lie Pro. Pro, Val Pro Pro.
  • casein brine hydrolyzate casein caro hydrolyzate containing at least one or all of the dipeptides and tripeptides exemplified above is preferred.
  • the casein hydrolyzate contains free amino acids in addition to the peptides, and the content of free amino acids is usually 35 to 50% by weight, preferably 40 to 40%, based on the total of the peptides and free amino acids in the decomposed products. 45% by weight.
  • the casein hydrolyzate contains about 10 to 20% by weight of lipid, ash, carbohydrate, dietary fiber, water, etc., which are usually contained in, for example, commercially available animal milk casein, in addition to the peptide and free amino acid. Alternatively, some or all of the appropriate components may be removed as necessary.
  • Animal milk casein is a protein that has been confirmed to be safe for use in foods that contain a large amount of Pro, such as casein such as milk, horse milk, goat milk, and sheep milk, and milk power zein is particularly preferred. Can be used.
  • the casein concentration at the time of hydrolyzing animal milk casein is not particularly limited, but is preferably 3 to 19% by weight in order to efficiently produce the hydrolyzate.
  • the enzyme group may be any enzyme group in which the average chain length of the casein degradation product is appropriately selected and combined with enzymes capable of degrading to 2.1 or less as the number of amino acid residues, for example, Xaa Pro Xa Preferred is an enzyme group (X) containing a peptidase capable of cleaving the Pro Xaa sequence at the carboxy terminus of a or Xaa Pro Pro Xaa.
  • the enzyme group (X) preferably contains a serine type proteinase having serine at the active center or a metal proteinase having metal at the active center.
  • metal proteinases include neutral protease I, neutral protease II, leucine aminopeptidase, and the like, and the inclusion of at least one of these further allows the desired hydrolyzate to be efficiently and in a short time. Is preferable in that it can be obtained by a one-step reaction.
  • the peptidase that can cleave the Pro Xaa sequence is preferably an enzyme having an isoelectric point in the acidic region.
  • Examples of the enzyme group or enzyme group (X) include an enzyme group derived from Aspergillus oryzae and the like. Such an enzyme group is a fungus in an appropriate medium. An enzyme group obtained by cultivating the body and extracting the produced enzyme with water, and the like, are particularly preferred. Among the enzyme groups derived from Aspergillus oryzae, the enzyme group in which the isoelectric point shows an acidic region is preferable.
  • As the enzyme group derived from Aspergillus oryzae commercially available products can be used.
  • Sumiteam FP, LP or MP registered trademark, manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd.
  • Ummamizym registered trademark, Amano
  • Sternzyme B11024 PROHIDROXY AMPL (trade name, manufactured by Higuchi Shokai Co., Ltd.)
  • Orientase ONS registered trademark, manufactured by Hankyu Bioindustry Co., Ltd.
  • Denateam AP registered trademark, Nagasesei
  • it is preferable to use Sumiteam FP registered trademark, manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd.
  • Sumiteam FP registered trademark, manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd.
  • the optimum conditions are usually set. However, the conditions such as the amount of enzyme used and the reaction time are set in the enzyme groups used so that the casein hydrolyzate can be obtained. It can be changed as appropriate.
  • the amount of enzyme group added when hydrolyzing animal milk casein is, for example, an aqueous solution in which animal milk casein is dissolved and enzyme group Z animal milk casein is lZiooo or more by weight, preferably iZiooo to iZio, Particularly preferably iZioo to iZio, more preferably 1Z40 to: LZ
  • the amount is such that the ratio is 10.
  • the reaction conditions can be appropriately selected depending on the enzyme group so that the desired casein hydrolyzate can be obtained.
  • the reaction temperature is usually 25 to 60 ° C, preferably 45 to 55 ° C
  • the pH is 3 to 10, preferably 5 to 9, particularly preferably 5 to 8.
  • the enzyme reaction time is usually 2 to 48 hours, preferably 7 to 15 hours.
  • the enzyme reaction can be terminated by inactivating the enzyme.
  • the enzyme can be inactivated at 60 to: L 10 ° C to stop the reaction.
  • Such removal of bitter components and odor components can be carried out using activated carbon or hydrophobic rosin. For example, it can be carried out by adding 1 to 20% by weight of activated carbon to the amount of casein used in the obtained hydrolyzate and reacting for 1 to 10 hours. .
  • the activated carbon used can be removed by a known method such as centrifugation or membrane treatment.
  • the obtained reaction liquid containing a casein hydrolyzate can be added to a liquid product such as a beverage as it is and used for a functional food. Moreover, in order to improve the versatility of the casein hydrolyzate, the reaction solution is concentrated and then dried to obtain a function-imparting agent that imparts a rheumatoid arthritis inhibitory action.
  • Such powders can contain various auxiliary additives in order to improve nutritional balance and flavor.
  • auxiliary additives include various carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, sweeteners, fragrances, pigments, and texture improvers.
  • the effective dosage of the rheumatoid arthritis inhibitor of the present invention is usually 0 as the dry amount of casein carohydrate hydrolyzate or the dry amount of peptide and free amino acid in casein hydrolyzate per day.
  • the period of administration of the rheumatoid arthritis inhibitor can be adjusted according to the symptoms and the like, and is usually 1 to 365 days, and regular intake is preferable.
  • the administration method of the rheumatoid arthritis inhibitor of the present invention is oral administration, and the form thereof is a form of a preparation for oral administration, for example, tablet, pill, hard capsule, soft capsule, microcapsule, A powder, a granule, a liquid agent etc. are mentioned.
  • the formulation may be carried out, for example, as necessary, as a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant, excipient, excipient, preservative, stabilizer, binder, PH regulator, buffer, thickener. It can be manufactured in a unit dosage form that is generally required for the practice of the formulation, using agents, gelling agents, preservatives, antioxidants, etc.
  • the functional food of the present invention can be a health food, a food for specified health use, or the like that can display or promote the efficacy for suppressing rheumatoid arthritis.
  • the amount of intake for obtaining a rheumatoid arthritis inhibitory effect is that, in view of the fact that functional foods can be used continuously and taken regularly for a long period of time, in the case of humans,
  • dry amount or dry amount of peptide and free amino acid mixture in casein hydrolyzate usually 0.04 ⁇ : LOOg, especially about 0.2 ⁇ 20g
  • the intake per functional food can be made lower than the above amount.
  • the ingestion period of the functional food of the present invention is not particularly limited, and it is preferable to ingest for a long time. However, in order to obtain the above-mentioned effects, it is usually 1 day or more, particularly about 20 days to 12 months, and is regularly used. I prefer to take it.
  • the functional food of the present invention contains other components used for food and drink as necessary, for example, Additives such as sugars, proteins, lipids, vitamins, minerals, flavors, or mixtures thereof can also be added.
  • the form of the functional food / beverage product of the present invention can be obtained by adding the casein hydrolyzate or the peptide and free amino acid in the casein hydrolyzate as they are or as powders or granules to various foods / beverage products, It can be in any form of gel or liquid, for example, beverage, yogurt, liquid food, jelly, candy, retort food, tablet confectionery, cookie, castella, bread, biscuit, chocolate, etc. it can.
  • Milk-derived casein manufactured by NZMP, Japan
  • 1N sodium hydroxide made by Wako Pure Chemical Industries
  • the substrate solution was prepared by adjusting the pH to 7.0 and adjusting the temperature to 20 ° C.
  • the obtained substrate solution is derived from Aspergillus oryzae and contains commercially available enzymes (registered trademark “Sumiteam FP” Were added so that the weight ratio of the enzyme Z casein was 1Z25, and the mixture was reacted at 50 ° C for 14 hours. Subsequently, the enzyme was inactivated by autoclaving at 110 ° C. for 10 minutes to obtain a casein enzyme degradation product solution. Next, the obtained enzyme degradation product solution was dried with a spray dryer to prepare a powder. The components contained in the obtained powder were analyzed. Protein was measured by the Kjeldahl method, and amino acids were measured by an amino acid analyzer. In addition, the amount of protein was determined by subtracting amino acid as the amount of peptide.
  • lipid was measured by acid decomposition method, ash was measured by direct ashing method, and moisture was measured by atmospheric pressure heating drying method. The remainder after subtracting each component from 100% was taken as the amount of carbohydrates.
  • 35.8% by weight of amino acids 45.7% by weight of peptides, 6.6% by weight of water, 0.2% by weight of lipids, 4.1% by weight of ash and 7.6% by weight of carbohydrates Met.
  • the average chain length of amino acids and peptides contained in the obtained powder was measured by the number of moles using an OPA reagent that reacts with the free amino acids and peptide amino groups contained therein, and the number of moles of caseinate hydrolyzate measured in the same manner. The ratio was evaluated.
  • 0-phthalaldehyde (special grade reagent for fluorescence analysis, manufactured by Nacalai Testa) was dissolved in 1 ml of methanol, and j8-mercaptoethanol 100 1 was prepared. Using 25 ml of 100 mM sodium tetraborate solution prepared in advance and 2.5 ml of 20% sodium dodecyl sulfate, the above dissolved 0-phthalaldehyde is diluted to 25 ml and further distilled water. The OPA reagent was prepared by adjusting to 50 ml.
  • a 1% casein enzyme hydrolyzate powder sample reacted with the enzyme was dissolved in an appropriate solvent at an appropriate concentration, centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant 501 was collected. Subsequently, 1 ml of the above OPA reagent was added, stirred well, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the absorption at 340 nm was measured with an absorptiometer (trade name Ubest-35, manufactured by JASCO Corporation).
  • a calibration curve was prepared by preparing a 1% caseinate hydrolyzate and measuring it in the same manner using an appropriately diluted solution. The relationship between absorbance and molar concentration was determined. The average chain length was calculated according to the following formula. As a result, the average chain length was 1.4.
  • Average chain length (Molar concentration of 1% caseinate hydrolyzate) Z (Molar concentration of 1% casein enzyme hydrolyzate for each sample)
  • the powder prepared above is dissolved in an appropriate amount of distilled water and analyzed using an automatic peptide analyzer (trade name: PPSQ-10, manufactured by Shimadzu Corporation). What It was investigated whether the amino acid was located. The results are shown in Table 1. Note that the automatic peptide analyzer does not detect free amino acids.
  • the total of amino acids at the fifth residue was 120 pmol, and the total of amino acids at the sixth residue was 100 pmol. From these results, it was found that most of the peptides contained in the powder were dipeptides and tripeptides. In addition, the percentage of peptides with Pro as the second amino acid was significantly increased to 49.5%. In addition, the ratio of peptides with Pro as the third amino acid was 29.8%.
  • the powder contains a large amount of Xaa Pro or Xaa Pro Pro, and it can be estimated that these peptides are highly resistant to enzymatic degradation by proteases in vivo and are peptides.
  • the amount of peptide and free amino acid in a solution obtained by diluting the powder with distilled water was 8.15 mgZml, the amount of peptide was 4.57 mgZml, and the amount of Xaa Pro in the peptide was 514.5 g. Therefore, the ratio of Xaa Pro to the total amount of peptide and free amino acid in the powder was 6.3 wt%, and the amount of Xaa Pro Pro in the peptide was 116.5 ⁇ g. It was confirmed that the ratio of Xaa Pro Pro to the total amount of peptide and free amino acid in the powder was 1.4% by weight.
  • CM4 stock Lactobacillus helveticas CM4 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1-1-1 Central No. 6: FERM BP -6060, Deposit ⁇ 1997. 8 15) (hereinafter referred to as CM4 stock).
  • CM4 stock Lactobacillus helveticas CM4 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1-1-1 Central No. 6: FERM BP -6060, Deposit ⁇ 1997. 8 15) (hereinafter referred to as CM4 stock).
  • This CM4 strain has been registered with the above deposit number in the Budapest Treaty on the International Approval of Deposits for Microorganisms in Patent Procedures, and this strain has already been patented.
  • CM4 stock starter Fermentation liquid (5 ⁇ 10 8 cells Zml) was inoculated with 3% (vZw) and fermented at 37 ° C. for 24 hours to obtain CM4 fermented milk.
  • the obtained CM4 fermented milk was sterilized at 80 ° C, and freeze-dried to obtain CM4 fermented powder.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 As test substances, casein enzyme degradation product prepared in Production Example 1 (Example 1), CM4 fermented powder prepared in Production Example 2 (Comparative Example 1), milk casein sodium (Comparative Example 2), and milk casein acid degradation product An amino acid (Comparative Example 3) was prepared.
  • M. tuberculosis H37a (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which was killed by heating, was weighed in an appropriate amount and made into a fine powder in an agate mortar.
  • liquid paraffin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added little by little to suspend it, and a suspension of 5 mgZml was prepared as a sensitizing adjuvant. This sensitized adjuvant was prepared on the day of sensitization of the adjuvant described later.
  • Body weight On dayO, 5, 9, 14, 19 and 22, body weight was measured with a scale.
  • Arthritis score Visual observation of the degree of redness, swelling and tonicity in the right forelimb, left forelimb and left hindlimb excluding the right hindlimb of the sensitized site with the naked eye, 0 for none, 1 for mild, 1 for moderate The grade was rated 2 points, moderately severe 3 points, and severely 4 points. The observation days were dayO, 5, 9, 14, 19 and 22.
  • Foot volume The volume of the right hind limb and left hind limb is measured by a foot volume measuring device (trade name TK-105, Muromachi Machine ). The measurement date was the same as the arthritis score observation date.
  • the obtained arthritis score is shown as a mean value standard error for each group.
  • Analysis of variance (ANOVA) was performed using analysis software (Stat View, Abacus Inc., USA) to confirm the statistical significance of each group relative to the control group (1 group). After that, the multiple comparison test which is Fisher's PLSD method was performed and the comparison between groups was performed. Statistical significance was significant when P ⁇ 0.05.
  • Table 3 shows the results of the arthritis score. Body weight did not change significantly in each group compared to the control. General symptoms were strong throughout the study period, with no signs of abnormal symptoms other than arthritic symptoms in all groups.
  • test substance As the test substance, the casein enzymatic degradation product prepared in Production Example 1 (Example 2) and Ibuprofen (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a positive control substance were prepared.
  • Rats Eight-week-old female Lewis rats (SPF) were preliminarily raised for 7 days and subjected to experiments. Rats were housed in the SPF barrier breeding room at a room temperature of 24 ⁇ 3 ° C and a relative humidity of 55 ⁇ 15% during the pre-breeding period and the experimental period, with a lighting time of 7:00 to 19:00 and a ventilation rate of 18 times. At this time, rats should be 2 to 3 rats / cage, and all groups should have chow (trade name MF, Oriental Yeast Co., Ltd.) and sterilized deionized water were freely ingested. Individual identification of rats was performed by applying picric acid to the hair.
  • chow trade name MF, Oriental Yeast Co., Ltd.
  • Body weight was measured with a scale on dayO, 5, 9, 14, 19 and 21.
  • Arthritis score Visual observation of the degree of redness, swelling and tonicity in the right forelimb, left forelimb and left hindlimb excluding the right hindlimb of the sensitized site with the naked eye, 0 for none, 1 for mild, 1 for moderate The grade was rated 2 points, moderately severe 3 points, and severely 4 points. The observation days were dayO, 5, 9, 14, 19 and 21.
  • Foot volume The volume of the right hind limb and the left hind limb was measured using a foot volume measuring device (trade name TK-105, manufactured by Muromachi Kikai Co., Ltd.). The measurement date was the same as the arthritis score observation date.
  • Plasma analysis On the next day (day 22) and the next day (day 23) after the end of the test, blood was collected from the heart using a syringe (added with sodium Na) under ether inhalation anesthesia, and the upper layer (plasma) after centrifugation was collected. NO / NO Assav Kit- Nitric oxide (NO) using CII Colorimetric (Dojin Kagaku)
  • the obtained arthritis score, foot volume, NO and PGE are the mean value standard error for each group.
  • Table 4 shows the arthritis score results
  • Table 5 shows the sensitized limb volume results in the foot volume
  • Table 6 shows the non-sensitized limb volume results
  • Table 1 shows the plasma PGE results
  • Fig. 2 shows the plasma NO results. Shown in each
  • the body weight was not significantly changed in each group compared to the control.
  • General symptoms were strong throughout the study period, with no signs of abnormal symptoms other than arthritic symptoms in all groups. ⁇
  • the plasma NO (NO 1 + NO 2) concentration increase was significantly suppressed in the groups administered with the test substances 500, 1000, and 2000 mgZkg of Example 2 (p ⁇ 0.05).
  • the adjuvant arthritis model experiment described above is described as a model of chronic rheumatoid arthritis, for example, as described in Inflammation Vol.15 No.5 (1995) p395-399 (Japan Inflammation Society Journal). It is widely recognized as the disease model.

Abstract

関節リウマチ抑制作用を示す、安全性に優れた経口摂取用関節リウマチ抑制剤を提供すること。本発明の経口摂取用関節リウマチ抑制剤は、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として２．１以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む。

Description

明 細 書
経口摂取用関節リウマチ抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、経口摂取により、慢性関節リウマチ等の関節リウマチ抑制作用を示す特 定の獣乳カゼイン加水分解物を有効成分とする経口摂取用関節リウマチ抑制剤及 び該抑制作用が期待できる機能性食品に関する。
背景技術
[0002] 慢性関節リウマチ (RAと略すことがある)は、自己免疫疾患の一つで、慢性的に関節 に炎症が生じ、関節の腫れや変形をきたすものである力 その原因は今のところ分つ ていない。
該 RAの炎症には、プロスタグランジン (PGE)、プロスタサイクリン (PGI)、ヒスタミンや ブラジキュンを代表とするキュンが関与していると考えられるため、その治療には、ま ず NSAID (非ステロイド性抗炎症薬)に代表される抗炎症薬が処方される例が多 、。そ して、抗炎症薬で効果がない場合、 Tリンパ球、 Bリンパ球を介した免疫調節作用に 関わる、 TNF o;、インターロイキン 1(IL-1)、 IL-6等の炎症性サイト力インを抑制し、免 疫全般の働きを抑える免疫抑制薬や、 RAに関連する免疫の異常な働きのみを抑え る免疫調整薬等の抗リウマチ薬が処方され、最近では初期の段階でも該抗リウマチ 薬が処方される場合も出てきて!/、る。
しかし、従来の免疫抑制薬や免疫調整薬等の抗リウマチ薬では、何等かの副作用 の影響があり、その処方にある程度の制限が必要である。そこで、最近では、このよう な副作用を少しでも抑制するために、 RAの病態を悪ィ匕させる分子のみを標的とした 分子生物学的アプローチがなされている。例えば、抗 TNF αモノクローナル抗体、可 溶性 TNF aレセプター (sTNFR)融合蛋白、 IL-1レセプター拮抗薬、 IL-6レセプター抗 体等を利用した生物学的製剤の開発も進められている。
[0003] ところで、従来、乳成分やその分解物等における生理機能が多く見出されている。
例えば、特許文献 1には、特定の乳蛋白質の酵素分解物における特定物力 TNF a や IL- 6抑制作用を有し、全身性炎症反応症候群 (systemic inflammatory response sy ndrome)や炎症反応を緩和しうることが、また、特許文献 2には、獣乳カゼインを平均 鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びべプチ ドを含むカゼイン加水分解物が、アンジォテンシン I変換酵素阻害活性又は血圧降 下作用を有することが提案されている。
し力しながら、食品素材として知られ、その安全性が十分確保されている乳成分や その分解物等に RA抑制作用があることにつ ヽては従来知られて ヽな 、。
特許文献 1 :特開 2004— 155751号公報
特許文献 2 : WO2005— 102542号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、関節リウマチに係る関節炎等の抑制作用を示し、副作用等の懸 念が少なぐ安全性に優れた経口摂取用関節リウマチ抑制剤を提供することにある。 本発明の別の課題は、日常的に連用可能で、安全性に優れ、関節リウマチに係る 関節炎等の抑制作用が期待できる、健康食品、特定保健用食品等の機能性食品を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に加水 分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水 分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含有する経口 摂取用関節リウマチ抑制剤が提供される。
また本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に 加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該 加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含有する 関節リウマチ抑制作用を有する機能性食品が提供される。
更に本発明によれば、経口摂取用関節リウマチ抑制剤を製造するための、獣乳力 ゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に加水分解して得た、遊離アミノ 酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミ ノ酸及びペプチド混合物の使用が提供される。 更にまた本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以 下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又 は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物の有効量を、経口投与 する関節リウマチの抑制方法が提供される。
発明の効果
[0006] 本発明の経口摂取用関節リウマチ抑制剤及び機能性食品は、食品素材として知ら れる、特定のカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及び ペプチド混合物を有効成分として含むので、安全性に優れ、関節リウマチに係る関 節炎等の抑制作用が期待できる。特に、これら有効成分を粉末又は錠剤とした剤を、 機能性食品等に添加する場合は、日常的に連用可能である。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]実施例 2で行ったアジュバント関節炎に対する評価における血漿 PGE測定の
2 結果を示すグラフである。
[図 2]実施例 2で行ったアジュバント関節炎に対する評価における血漿 NO測定の結 果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の関節リウマチ抑制剤及び機能性食品は、獣乳カゼインをアミノ酸残基数と して平均鎖長が特定範囲になるように加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチド 混合物を、好ましくはカゼイン加水分解物全量に対して 80重量％以上、特に好ましく は 80〜90重量％含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミ ノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む。特に、該ペプチドが、 Xaa Pro配列 を有するジペプチド及び Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチド力 なる生体内難分 解性ペプチドを特定割合で含むことが好ましい。但し、ペプチドはペプチド塩としても 良い。
[0009] ここで、平均鎖長とは、カゼインにおける酸加水分解物の総アミノ酸のモル数に対 する、同重量の獣乳カゼインを加水分解した際に生産されるペプチド及び遊離アミノ 酸の合計モル数の比で示すことができる。カゼインにおける酸加水分解物とは、カゼ インタンパク質をアミノ酸にまで分解したものである。
該平均鎖長は、例えば、ァミノ基に反応して発色する OPA(o-フタルアルデヒド)試薬 を用いた OPA法により、加水分解物中のモル濃度を評価し、平均鎖長 = (カゼイン酸 加水分解物中のモル数) Z (カゼイン酵素加水分解物中のモル数)として求めることが できる。
また、前記生体内難分解性ペプチドとは、生体の腸管から吸収された際に、生体内 ぺプチダーゼ群に対して分解抵抗性が高 、、カルボキシ末端に proを有するジぺプ チド Xaa Pro及びトリペプチド Xaa Pro Proを意味する。
[0010] 本発明において、獣乳カゼインを加水分解して得られる分解物の平均鎖長は、アミ ノ酸残基数として 2. 1以下、好ましくは 1. 1〜2. 1、特に好ましくは 1. 3〜2. 1である 。該平均鎖長が 2. 1を超える場合には、所望のジペプチド及びトリペプチド、更には 遊離アミノ酸の割合が低下し、生体吸収性、更には生体内難分解性ペプチドの含有 割合が低下し、所望の効果が得られ難い恐れがある。
前記カゼイン加水分解物中に含まれる Xaa Pro配列を有するジペプチドの含有割 合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 5重量％以上、好 ましくは 5〜25重量％である。該含有割合が 5重量％未満の場合には、所望の作用 が低下する恐れがある。
前記カゼイン加水分解物中に含まれる Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含 有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 1重量％以上 、好ましくは 1〜5重量％である。該含有割合が 1重量％未満の場合には、所望の作 用が低下する恐れがある。
[0011] 前記カゼイン加水分解物中のペプチドにお!/、て、 Xaa Pro配列を有するジペプチド 及び Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの Xaaは、任意のアミノ酸であって良い。 例えば、 Xaa Pro配列を有するジペプチドとしては、 lie Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gin Pr o、 Met Pro, Tyr Proが挙げられ、 Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドとしては、 Ser Pro Pro, lie Pro Pro, Val Pro Proが挙げられる。カゼインカ卩水分解物としては、前記 例示したジペプチド及びトリペプチドの少なくとも 1種もしくは全部を含むカゼインカロ 水分解物が好ましく挙げられる。 [0012] 前記カゼイン加水分解物は、ペプチド以外に遊離アミノ酸を含むが、遊離アミノ酸 の含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 35〜50 重量％、好ましくは 40〜45重量％である。
前記カゼイン加水分解物には、前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例えば巿 販の獣乳カゼイン等に通常含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維、水分等が 1 0〜20重量％程度含まれていても良ぐまた、必要に応じてこれらのうちの適当な成 分の一部若しくは全部を除去しても良い。
[0013] 前記カゼイン加水分解物を製造するには、例えば、カゼイン加水分解物の平均鎖 長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に分解しうる酵素群を用いて、獣乳カゼインを、該 平均鎖長 2. 1以下に加水分解する方法により得ることができる。
獣乳カゼインは、 Proを多く含む食品等に用いられる安全性が確認されたタンパク 質であり、例えば、牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等のカゼインが挙げられ、特に牛乳力 ゼインが好ましく使用できる。
獣乳カゼインを加水分解する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが前記加水 分解物を効率良く生産するために、 3〜19重量％が好ましい。
[0014] 前記酵素群としては、カゼイン分解物の平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下 に分解しうる酵素を適宜選択して組合せた酵素群であれば良ぐ例えば、 Xaa Pro Xa a又は Xaa Pro Pro Xaaのカルボキシ末端の Pro Xaa配列が切断可能なぺプチダーゼ を含む酵素群 (X)が好ましく挙げられる。
酵素群 (X)は、活性中心にセリンを持つ、セリンタイプのプロティナーゼもしくは、活 性中心に金属を持つ金属プロティナーゼを含むことが好ましい。金属プロティナーゼ としては、中性プロテアーゼ I、中性プロテアーゼ II及びロイシンアミノぺプチダーゼ等 が挙げられ、これらの少なくとも 1種を更に含むことが、所望の加水分解物を効率良く 、且つ短時間で、更には 1段階反応で得ることができる点で好ましい。また前記 Pro X aa配列が切断可能なぺプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示す酵素であること が好ましい。
[0015] 前記酵素群又は酵素群 (X)としては、例えば、ァスペルギルス 'ォリゼ一 (Aspergillus oryzae)等の麹菌由来の酵素群が挙げられる。このような酵素群は、適当な培地で菌 体を培養し、生産される酵素を水抽出した酵素群等が挙げられ、特に、ァスペルギル ス 'オリゼー由来の酵素群のうちの等電点が酸性域を示す酵素群が好ましく挙げられ る。
ァスペルギルス 'ォリゼ一由来の酵素群としては、市販品を利用することができ、例 えば、スミチーム FP、 LP又は MP (以上、登録商標、新日本化学 (株)製)、ゥマミザィム（ 登録商標、天野ェンザィム (株)製）、 Sternzyme B11024、 PROHIDROXY AMPL (以上 、商品名、株式会社樋口商会製)、オリエンターゼ ONS (登録商標、阪急バイオインダ ストリー (株)製)、デナチーム AP (登録商標、ナガセ生化学社製)が挙げられ、特に、ス ミチーム FP (登録商標、新日本化学 (株)製)の使用が好ま U、。
これら市販の酵素群を用いる場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記 カゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時間等を、 用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。
[0016] 前記獣乳カゼインを加水分解する際の酵素群の添加量は、例えば、獣乳カゼイン を溶解した水溶液に、酵素群 Z獣乳カゼインが重量比で lZiooo以上、好ましくは iZiooo〜iZio、特に好ましくは iZioo〜iZio、更に好ましくは 1Z40〜： LZ
10の割合となるような量である。
反応条件は、酵素群に応じて目的のカゼイン加水分解物が得られるように適宜選 択できる。例えば、反応温度は、通常 25〜60°C、好ましくは 45〜55°Cであり、 pHは 、 3〜10、好ましくは 5〜9、特に好ましくは 5〜8である。また、酵素反応時間は、通 常 2〜48時間、好ましくは 7〜15時間である。
[0017] 酵素反応の終了は、酵素を失活させることにより行なうことができ、通常、 60〜： L 10 °Cで酵素を失活させ、反応を停止させることができる。
酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、遠心分離除去や各種フィルター処理に より除去することが好まし 、。
また、必要に応じて、得られる加水分解物力も苦味や臭味を有するペプチドを除去 することもできる。このような苦味成分や臭味成分の除去は、活性炭又は疎水性榭脂 を用いて行なうことができる。例えば、得られた加水分解物中に、使用したカゼイン量 に対して活性炭を 1〜20重量％添加し、 1〜10時間反応させることにより実施できる 。使用した活性炭の除去は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法により行なうこ とがでさる。
[0018] 得られるカゼイン加水分解物を含む反応液は、そのまま飲料等の液体製品に添加 して機能性食品に利用することができる。また、前記カゼイン加水分解物の汎用性を 高めるために、前記反応液を濃縮後、乾燥し粉末の形態とすることで、関節リウマチ 抑制作用を付与する機能付与剤とすることができる。
このような粉末には、栄養的バランスや風味等を改善するために、各種補助添加剤 を含有させることもできる。例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、甘 味料、香料、色素、テクスチユア改善剤が挙げられる。
[0019] 本発明の関節リウマチ抑制剤の有効投与量は、ヒトの場合、 1日あたり、カゼインカロ 水分解物の乾燥量又はカゼイン加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の乾燥 量として、通常 0. 04〜： LOOg、特に 0. 2〜20g程度が好ましぐ 1日に何回かに分け て摂取しても良い。
関節リウマチ抑制剤の投与期間は、その症状等により調整することができ、通常 1 〜365日間で、常用的な摂取が好ましい。
[0020] 本発明の関節リウマチ抑制剤の投与方法は、経口投与であり、その形態は、経口 投与用の製剤の形態、例えば、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロ カプセル、散剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。
前記製剤化は、例えば、適宜必要に応じて、薬剤として許容される担体、アジュバ ント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、 PH調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲ ル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位 用量形態で製造することができる。
[0021] 本発明の機能性食品は、関節リウマチ抑制のための効能を表示又は宣伝しうる健 康食品や特定保健用食品等とすることができる。
特に関節リウマチ抑制作用を得るための摂取量は、機能性食品が、連用可能であ り、常用的に長期間摂取することを鑑みると、ヒトの場合、 1日あたり、前記カゼインカロ 水分解物の乾燥量又はカゼイン加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸混合物 の乾燥量として、通常 0. 04〜： LOOg、特に 0. 2〜20g程度力 子まし!/ヽカ 1曰あたり の摂取回数に応じて、機能性食品における 1回あたりの摂取量を前記量より更に低く することも可會である。
本発明の機能性食品の摂取期間は、特に限定されず、長期間摂取することが好ま しいが、上記効能を得るために、通常 1日間以上、特に 20日間〜 12か月程度、常用 的に摂取することが好ま 、。
[0022] 本発明の機能性食品は、有効成分であるカゼイン加水分解物又は該カゼイン加水 分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の他に、必要に応じて、飲食品に用いる他の 成分、例えば、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、フレーバー、またはこれら の混合物等の添加物を添加することもできる。
本発明の機能性飲食品の形態は、前記カゼイン加水分解物又は該カゼイン加水 分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸を、そのまま、若しくは粉末や顆粒とし、各種 飲食品に添加することで、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態とすることができ 、例えば、飲料、ヨーグルト、流動食、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、錠菓、クッキ 一、カステラ、パン、ビスケット、チョコレート等とすることができる。
実施例
[0023] 以下、本発明を製造例、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明 の範囲はこれらに限定されない。
製造例 1
牛乳由来カゼイン (日本 NZMP社製) lgを約 80°Cに調整した蒸留水 99gにカ卩えて充 分に撹拌した後、 1N水酸ィ匕ナトリウム (和光純薬社製)溶液を添加して pH7. 0とし、ま た温度を 20°Cに調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液にァスペルギルス ·オリゼー由来であり、少なくとも金属プロテア ーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ I、中性プロテアーゼ II及びロイシンアミ ノぺプチダーゼを含む市販の酵素 (登録商標「スミチーム FP」、新日本ィ匕学工業社製) を、酵素 Zカゼインの重量比が 1Z25となるように添加して、 50°Cで 14時間反応さ せた。続いて、 110°Cで 10分間のオートクレープにより酵素を失活させ、カゼイン酵 素分解物溶液を得た。次に、得られた酵素分解物溶液をスプレードライヤーにより乾 燥し、粉末を調製した。 得られた粉末中の含有成分の分析を行なった。タンパク質はケルダール法で測定 し、アミノ酸についてはアミノ酸分析装置にて測定した。また、該タンパク質量力もアミ ノ酸を引いた量をペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法で、灰分は直接灰化法 で、水分は常圧加熱乾燥法でそれぞれ測定した。尚、 100%から各成分を引いた残 りを炭水化物量とした。その結果、アミノ酸は 35. 8重量％、ペプチドは 45. 7重量％ 、水分は 6. 6重量％、脂質は 0. 2重量％、灰分は 4. 1重量％及び炭水化物は 7. 6 重量％であった。
[0024] <平均鎖長の測定 >
得られた粉末に含まれるアミノ酸及びペプチドの平均鎖長は、それに含まれる遊離 アミノ酸及びペプチドのァミノ基に反応する OPA試薬でモル数を測定し、同様に測定 したカゼイン酸加水分解物のモル数との比で評価した。
メタノール lmlに 0-フタルアルデヒド (蛍光分析用特級試薬、ナカライテスタ社製) 40 mgを溶解させ、 j8 -メルカプトエタノール 100 1をカ卩えた。予め調製しておいた 100 mMの四ホウ酸ナトリウム溶液 25mlに、 20%ドデシル硫酸ナトリウム 2. 5mlを加えた ものを用いて、上記溶解した 0-フタルアルデヒドを 25mlに希釈し、更に蒸留水で 50 mlとすることで OPA試薬を調製した。
前記酵素を反応させた 1%カゼイン酵素加水分解物粉末試料を、適当な溶媒に適 当な濃度で溶解し、 15000rpmで 10分間遠心分離を行い、上清 50 1を分取した。 続いて、上記 OPA試薬を lml加え、よく撹拌し、室温で 5分間放置した後、吸光光度 計 (商品名 Ubest-35、日本分光 (株)製)で 340nmの吸収を測定した。
検量線は 1%のカゼイン酸加水分解物を調製し、適切に希釈したものを用いて同 様に測定した結果から、吸光度とモル濃度の関係を求めた。そして、平均鎖長は以 下の式に従って計算した。その結果、平均鎖長は 1. 4であった。
平均鎖長 = (1%カゼイン酸加水分解物のモル濃度) Z (各試料 1%カゼイン酵素加水 分解物のモル濃度）
[0025] <ペプチド構成アミノ酸の測定 >
上記で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解し、自動ペプチド分析機 (商品名 PPSQ -10(株)島津製作所製)を用いて解析し、粉末中にお ヽて N末端側カゝら順に如何なる アミノ酸が位置するかを調べた。結果を表 1に示す。尚、自動ペプチド分析機は遊離 アミノ酸を検出しない。
また、 5残基目のアミノ酸の合計は 120pmol、 6残基目のアミノ酸の合計は 100pm olであった。これらの結果より、前記粉末中に含まれるペプチドのほとんどがジぺプ チド及びトリペプチドであることが判った。また、 2残基目のアミノ酸が Proであるぺプ チドの割合が 49. 5%と顕著に上昇していた。更に 3残基目のアミノ酸が Proであるべ プチドの割合も 29. 8%と多かった。
従って、前記粉末には、 Xaa Pro又は Xaa Pro Proが多く含まれ、これらペプチドは 生体内プロテアーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が高 、ペプチドであると推 定できる。
[表 1]
Figure imgf000011_0001
<酵素分解物中に含まれるペプチドの測定 >
上記酵素分解物の粉末について、各種の化学合成標準ペプチドを用いて、常法 に従い、該粉末に含まれる表 2に示すジペプチド及びトリペプチド量を求めた。結果 を表 2に示す。 [0028] [表 2]
Figure imgf000012_0001
[0029] 前記粉末を蒸留水で希釈溶解した溶液中のペプチド及び遊離アミノ酸量が 8. 15 mgZmlであり、ペプチド量が 4. 57mgZmlであり、該ペプチド中の Xaa Pro量が 51 4. 5 gであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対する Xaa Pr oの割合は 6. 3重量％であり、更に、該ペプチド中の Xaa Pro Pro量が 116. 5 μ gで あつたので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対する Xaa Pro Proの割 合は 1. 4重量％であることを確認した。
[0030] 製造例 2
ラクトバチルス ·ヘルべティカス CM4株 (独立行政法人産業技術総合研究所特許生 物寄託センター 日本国茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6寄託番号： FERM BP -6060,寄託曰 1997. 8. 15) (以下、 CM4株と称す)を用意した。この CM4株は、 特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で 登録されており、この株は既に特許されている。
次に、市販の脱脂粉乳を固形率 9%(wZw)となるように蒸留水で溶解し、オートタレ ーブで 105°C、 10分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、 CM4株スターター 発酵液 (菌数 5 X 108個 Zml)を 3%(vZw)接種して、 37°Cで 24時間、静置状態で発 酵させ CM4発酵乳を得た。得られた CM4発酵乳を 80°C達温殺菌後、凍結乾燥によ り CM4発酵粉末を得た。
[0031] 実施例 1及び比較例 1〜3 被験物質として、製造例 1で調製したカゼイン酵素分解物 (実施例 1)、製造例 2で調 製した CM4発酵粉末 (比較例 1)、牛乳カゼインナトリウム (比較例 2)及び牛乳カゼイン 酸分解物アミノ酸 (比較例 3)を準備した。
一方、加熱して死菌とした M. tuberculosis H37a (和光純薬社製)を適当量秤り、メノ ゥ乳鉢で微粉末にした。次いで、流動パラフィン (和光純薬社製)を少しずつ加えて懸 濁し、 5mgZmlの懸濁液を調製し、感作アジュバントとした。この感作アジュバントの 調製は、後述するアジュバントの感作日に行った。
[0032] 8週齢の雌性 Lewis系ラット (SPF)を 7日間予備飼育して実験に供した。ラットは、予 備飼育期間及び実験期間を通して、室温 24± 3°C、相対湿度 55± 15%の SPFバリ ァ飼育室において、照明時間 8時〜 18時、換気回数 18回 Z時間で飼育した。この 際、ラットは、 2〜3匹/ケージとし、全ての群に、固形飼料 (商品名 MF、オリエンタル 酵母社製)と、滅菌脱イオン水をそれぞれ自由摂取させた。ラットの個体識別は、ピク リン酸を被毛に塗布して行った。
前記予備飼育終了後、 8匹 Z群の 5群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し 、上記で調製した感作アジュバントの 0. 1mlを右後肢の足躕皮内に注射して関節炎 を誘発した。尚、誘発日を dayOとした。
次いで、 dayOから day21まで、 4群のラットに上記被験物質のそれぞれを 0. 5%CM C (カルボキシメチルセルロース)溶液にて 10%に希釈したものを別個に、ラット用経 口ゾンデを用いて 1日 1回、 lmlZlOOgの割合で強制経口投与した。対照として、被 験物質を含まない 0. 5%CMC溶液を投与した群を 1群設けた。以下の検査項目に ついて観察を行った。
[0033] 一般状態：毎日 1回症状を観察し、記録用紙に記入した。
体重： dayO、 5、 9、 14、 19及び 22に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア:感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の 3箇所につ いて、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを 0点、軽度を 1点、中程度 を 2点、やや重度を 3点、重度を 4点とし、最高 12点の合計点で評価した。観察日は 、 dayO、 5、 9、 14、 19及び 22とした。
足容積:右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置 (商品名 TK-105、室町機械 社製)により測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
得られた関節炎スコアは、群毎の平均値士標準誤差として示す。対照群 (1群)に対 する各群の統計的有意を検定するために、解析ソフト (Stat View, Abacus Inc., USA) を用いて分散分析 (ANOVA)を行い等分散であることを確認した後、 Fisher's PLSD法 である多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差は P< 0. 05の場合 を有意であるとした。
関節炎スコアの結果を表 3に示す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化 は見られなかった。一般症状は、試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外 の異常症状は示さな力つた。
[0034] [表 3]
Figure imgf000014_0001
( )内は有意差を示し、 NSは有意差無を示す。 表 3の関節炎スコアの結果、 dayl4、 19及び 22のスコア測定で、実施例 1の被験物 質を投与した群でスコア増加を有意に抑制した (P< 0. 05)。
[0035] 実施例 2
被験物質として、製造例 1で調製したカゼイン酵素分解物 (実施例 2)、陽性対照物 質として Ibuprofen (和光純薬社製)を準備した。
一方、実施例 1と同様に、後述するアジュバントの感作日に感作アジュバントの調製 を行った。
[0036] 8週齢の雌性 Lewis系ラット (SPF)を 7日間予備飼育して実験に供した。ラットは、予 備飼育期間及び実験期間を通して、室温 24± 3°C、相対湿度 55 ± 15%の SPFバリ ァ飼育室において、照明時間 7時〜 19時、換気回数 18回 時間で飼育した。この 際、ラットは、 2〜3匹/ケージとし、全ての群に、固形飼料 (商品名 MF、オリエンタル 酵母社製)と、滅菌脱イオン水をそれぞれ自由摂取させた。ラットの個体識別は、ピク リン酸を被毛に塗布して行った。
前記予備飼育終了後、 8匹 Z群の 6群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し 、上記で調製した感作アジュバントの 0. 1mlを右後肢の足躕皮内に注射して関節炎 を誘発した。尚、誘発日を dayOとした。
次いで、 dayO力も day21まで、 5群のラットに上記被験物質を 0. 5%CMC溶液にて カゼイン酵素分解物を、 5%(EL5%)、 10%(EL10%)又は 20%(EL20%)に希釈した もの、 Ibuprofenを 0. 3%に希釈したものを別個に、ラット用経口ゾンデを用いて 1日 1 回、 lmlZlOOgの割合で強制経口投与した。対照として、被験物質を含まない 0. 5 %CMC溶液を投与した群を 1群設け、また無処置群を 1群設けた。以下の検査項目 につ!/ヽて観察及び測定を行った。
[0037] 一般状態：毎日 1回症状を観察し、記録用紙に記入した。
体重： dayO、 5、 9、 14、 19及び 21に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア:感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の 3箇所につ いて、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを 0点、軽度を 1点、中程度 を 2点、やや重度を 3点、重度を 4点とし、最高 12点の合計点で評価した。観察日は 、 dayO、 5、 9、 14、 19及び 21とした。
足容積:右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置 (商品名 TK-105、室町機械 社製)を使用して測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
血漿分析:試験終了翌日 (day22)及び翌々日 (day23)にエーテル吸入麻酔下で、 注射器 (へノ^ン Na添加)を用いて心臓より採血し、遠心後の上層 (血漿)部分に対し て、 NO /NO Assav Kit- CII Colorimetric (同仁科学社製)を用いて一酸化窒素 (NO)
2 3
を Griess法で測定し、 Prostaglandin E EIA Kit- Monoclonal(Cavman Chemical社製）
2
を用いてプロスタグランジン E (PGE )を EIA法で測定した。
2 2
[0038] 得られた関節炎スコア、足容積、 NO及び PGEは、群毎の平均値士標準誤差として
2
示した。対照群 (1群)に対する各群の統計的有意を検定するために、解析ソフト (Stat View, Abacus Inc., USA)を用いて分散分析 (ANOVA)を行い等分散であることを確認 した後、 Fisher's PLSD法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有 意差は pく 0. 05の場合を有意であるとした。
関節炎スコアの結果を表 4に、足容積における感作肢容積結果を表 5に、非感作肢 容積結果を表 6に、血漿 PGEの結果を図 1に、血漿 NOの結果を図 2にそれぞれに示
2
す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化は見られな力 た。一般症状は、 試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外の異常症状は示さな力つた。 關
Figure imgf000016_0001
( )内は有意差を示し、 NSは有意差無を示す。
[0040] [表 5]
Figure imgf000016_0002
( )内は有意差を示し、 NSは有意差無を示す。
[0041] [表 6] dayO day5 da 9 dayl4 dayl9 day21
耀離 1.35±0.005 1.36±0.009 1.35±0.007 1.36±0.007 1.36± 0.006 1·37±0.006
0.5%C C ( S) (NS) (p<0.001) (p<0.001) (p<0.001) θ.001)
L36±0.01 .73+0.09
o 1.37±0.01 1 3.16±0.07 3.14±0.08 3.17±0.04
EL5 % 1.36±0,01 1.36 ±0.01 1.79±0.09 2.83±0.10 2.99±0.05 3.03±0.06
(NS) (NS) (NS) (NS) (NS) (NS)
EL I 0 % 1.36±0.01 1.35 ±0.01 1.56±0.06 2.85±0.10 2.92±0.12 2.78士 0.06
(NS) (NS) (p<0.05) (p<0.0S) (p<0.05) (p<0.05)
EL2 0 % 1.36±0.01 1.36±0.01 1.39±0.01 2.54±0.17 2.58±0.11 2.58±0.10
(NS) (NS) (JX0.01) (p<0.001) (p<0.001) (ρθ.001)
Ibuprofen 1.36±0.01 1.37±0.01 1.38±0.01 2.26±0.06 2.43±0.06 2.23±0.03 0. 3 % (NS) (NS) (p<0.001) (p<0.001) (p<0.001) (ρθ.001)
( )内は有意差を示し、 NSは有意差無を示す。
[0042] 表 4の関節炎スコアの結果、 day9、 14、 19及び 21のスコア測定で、実施例 2の被 験物質 2000mgZkgを投与した群でスコア増加を有意に抑制した (pく 0. 01)。 表 5の感作後足容積の結果、実施例 2の被験物質 500mgZkgを投与した群で day 9、 19及び 21の感作後足容積増加を有意に抑制した (pく 0. 05)。実施例 2の被験 物質 2000mgZkgを投与した群で day5、 9、 19及び 21の感作後足容積増加を有意 に抑制した (p< 0. 001)。
表 6の非感作後足容積の結果、実施例 2の被験物質 lOOOmgZkg及び 2000mg Zkgを投与した群で、非感作後左肢容積の増加を、 day9、 14、 19及び 21で有意に 抑制した (p< 0. 001)。
図 1の血漿 PGEの結果、実施例 2の被験物質 2000mgZkgを投与した群で血漿 P
2
GE濃度増加を有意に抑制した (p< 0. 05)。
2
図 2の NOの結果、実施例 2の被験物質 500、 1000、 2000mgZkgを投与した群 で血漿 NO (NO "+NO )濃度増加を有意に抑制した (p< 0. 05)。
2 3
[0043] 尚、上述のアジュバント関節炎モデル実験は、慢性リウマチ性関節炎のモデルとし て、例えば、炎症 Vol.15 No.5 (1995) p395-399(日本炎症学会雑誌)に記載されてい るように当該疾患モデルとして広く認められている。

Claims

請求の範囲
[1] 獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2. 1以下に加水分解して得た、遊 離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる 遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含有する経口摂取用関節リウマ チ抑制剤。
[2] 前記カゼイン加水分解物が、獣乳カゼインを、麹菌由来の酵素により酵素分解して 得た分解物である請求項 1記載の関節リウマチ抑制剤。
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