JP7224583B2 - ガレクチン－９産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、特定のペプチドを含有することを特徴とするガレクチン－９産生促進剤に関し、又、ガレクチン－９が関与する疾患に対する予防、改善又は治療用薬剤組成物に関する。

ガレクチンは、β－ガラクトシドに親和性をもつレクチンファミリーの一種で、細胞表面上の糖鎖を認識して結合する。ガレクチンは、細胞の発生、分化、成熟、細胞死、炎症修飾、ガン浸潤や転移等の多彩な場面に関与している。

現在、哺乳類のガレクチンとして、ガレクチン－１から－１５まで知られている。このうち、ガレクチン－９は、好酸球の遊走促進、ガン細胞のアポトーシス誘導、過剰な免疫反応の抑制等の様々な機能に関与する（非特許文献１及び２）。ガレクチン－９は、ガン細胞に対してアポトーシス誘導活性や細胞傷害活性を示すが、正常細胞にはそのような活性を示さない。このことから、ガレクチン－９のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト拮抗物質が、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、自己免疫疾患用剤等として開発されている（特許文献１）。又、安定化ガレクチン－９は、代表的な関節炎リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎を改善することが知られている（非特許文献３）。更に、最近の知見から、ガレクチン－９は成熟した不溶性エラスチンと結合することが明らかとなってきた（非特許文献４）。

自己免疫疾患は、何らかの原因により、本来生体に備わっている細菌やウイルス等に対して抵抗する機能に異常が生じ、自分自身の正常な細胞に対して敵対反応を示すことで、細胞や組織に炎症等の問題が生じてしまう疾患である。この患者数は、日本国内だけでも数百万人と見積もられている。自己免疫疾患の症状は、全身或いは一部の組織に炎症が起こり、少し体を動かすだけで激痛が走るため、日常生活を送るのにも困難な病気である。例えば、関節炎リウマチは、関節に炎症が続くことでその中にある滑膜に血管や細胞が増え、滑膜が厚く腫れてしまう。腫れあがった滑膜は、やがて骨の軟骨部分や靱帯を破壊し、進行すれば骨まで破壊してしまう。原因がはっきりと分かっていないが、細菌やウイルス等の感染、過労、ストレス、喫煙、出産又は怪我等をきっかけに発症することがある。

ガンは、遺伝子変異によって細胞が制御されずに増殖し、その細胞集団が周囲の組織に浸潤したり転移を起こしたりして、次から次へと新しい組織を作ってしまう疾患である。大きく分けて、増殖が緩やかで宿主に悪影響を及ぼさない良性腫瘍と、近傍の組織に侵入、遠隔転移し、宿主の体を破壊しながら宿主が死ぬまで増え続けていく悪性腫瘍がある。ガンは死因の上位に挙げられ、高齢化によって患者数は年々増加している。又、二人に一人が一生のうちに何らかのガンにかかると言われており、今やガンは誰でもなり得る身近な病気である。ガンの発生は、喫煙、食生活、飲酒、運動等の生活習慣と深い関わりがあることが分かっているが、完全に予防できる病気ではない。

自己免疫疾患、炎症又はガンのリスクは、加齢に伴って増加する。高齢化が進む日本では、これらの疾患は深刻な問題である。例えば、抗リウマチ薬として、消炎鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、生物学的製剤等が知られている。又、抗炎症剤として、糖質コルチコイド等のステロイド、アスピリン等の非ステロイド等が知られている。更に、抗ガン剤として、シクロホスファミド、メトトレキサート等が知られている。しかしながら、これらの薬剤の副作用として、胃腸障害、腎機能障害、肝機能障害等が報告されている。このように、自己免疫疾患、炎症又はガンに効果のある薬剤では少なからず副作用が認められることから、有効で、且つ、副作用の少ない予防、改善又は治療剤が求められている。

生体組織は、コラーゲンやエラスチン等のタンパク質、プロテオグリカン等の糖タンパク質で構成される細胞外マトリックスと細胞により、複雑、且つ、高度に組織化された構造を有し、機能を発現している。細胞外マトリックスは細胞接着能を有するため、細胞の移動、分化、増殖等の多くの機能を積極的に担っている。ガレクチン－９は、細胞表面上の糖鎖を認識して結合し、且つ、成熟した不溶性エラスチンとも結合するため、細胞による細胞外マトリックスの構築に関与していると考えられる。

血管は心臓より排出される血圧を常に受けており、弾力性や伸縮性が重要である。このため、他の結合組織と比較して、エラスチンより構成される弾性線維が多く存在する。加齢に伴って正常なエラスチンが減少したり、エラスチンの構造が変性したりすると、弾力性が低下し、高血圧や動脈瘤等の血管性疾患の原因となる。このため、エラスチン等の細胞外マトリックスの構造を強化する剤が求められている。

グリシルプロリンは、グリシンとプロリンがアミド結合を介して結合したジペプチドであり、分子式はＣ_７Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_３である。近年、グリシルプロリンの研究が進められ、コラーゲン合成促進剤（特許文献２）、塩味増強剤（特許文献３）が開示されているが、グリシルプロリンのガレクチン－９産生促進効果は報告されていない。

特開２００４－２４４４１１ 特開２０１１－１０５６３４ 特開２０１７－００６０９５

Ｐｅｒｉｌｌｏ ＮＬ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．，７６（６），４０２－４１２（１９９８） Ｋａｓｈｉｏ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０（７），３６３１－３６３６（２００３） 平島光臣，アレルギー，５７（９－１０），１２９３（２００８） Ｉｔｏｈ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１（１１），２０９８－２１０４（２０１７）

本発明は、有効で、且つ、副作用の少ないガレクチン－９産生促進剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、この問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、グリシルプロリンに優れたガレクチン－９産生促進効果を発見し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）グリシルプロリンを含有することを特徴とするガレクチン－９産生促進剤。
（２）請求項１記載のガレクチン－９産生促進剤を含有することを特徴とする自己免疫疾患の予防、改善又は治療剤。
（３）請求項１記載のガレクチン－９産生促進剤を含有することを特徴とする抗炎症剤。
（４）請求項１記載のガレクチン－９産生促進剤を含有することを特徴とする抗ガン剤。
（５）請求項１記載のガレクチン－９産生促進剤を含有することを特徴とするガン転移抑制剤。
（６）請求項１記載のガレクチン－９産生促進剤を含有することを特徴とする細胞外マトリックス構造強化剤。

本発明のグリシルプロリンはガレクチン－９産生促進効果に優れ、安全で、且つ、ガレクチン－９が関与する自己免疫疾患、炎症又はガンに対して予防、改善又は治療効果が期待される。又、ガレクチン－９が関与する細胞外マトリックスの構築を促して、その構造を強化し、血管性疾患の予防、改善又は治療効果が期待される。

本発明のガレクチン－９（ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＬＧＡＬＳ９、ＥＣＡＬＥＣＴＩＮ）とは、レクチンファミリーの一種であり、好酸球の遊走促進、ガン細胞のアポトーシス誘導、過剰な免疫反応の抑制、不溶性エラスチンとの結合等の様々な機能に関与する。ガレクチン－９は、ガン細胞に対してアポトーシス誘導活性や細胞傷害活性を示すが、正常細胞にはそのような活性を示さないことから、抗ガン剤、抗炎症剤、自己免疫疾患用剤等として用いられている。

本発明の自己免疫疾患とは、何らかの原因により、本来生体に備わっている細菌やウイルス等に対して抵抗する機能が自分自身の正常な細胞に対して敵対反応を示してしまい、自分の細胞や組織に炎症等の問題が生じてしまう疾患である。例えば、関節炎リウマチ、全身性強皮症、皮膚筋炎等が挙げられる。

本発明の炎症とは、外傷、火傷、細菌の侵入、免疫反応の異常、薬物、放射線の作用等に対して生体に起こる防御的反応のことである。生体の一部に充血、腫れ、発熱、痛み等の症状を引き起こす。

本発明のガンとは、遺伝子変異によって細胞が制御されずに増殖し、その細胞集団が周囲の組織に浸潤したり転移を起こしたりして、次から次へと新しい組織を作ってしまう疾患である。

本発明のガン転移とは、ガン細胞が最初に発生した場所から、血管やリンパ管に入り込み、血液やリンパの流れにのって別の臓器や器官に移動し、そこで増殖することである。リンパの流れが集まる場所であるリンパ節に転移したり、肺、肝臓、脳、骨等の血液の流れが豊富な場所に転移したりすることが多い。

本発明の細胞外マトリックス構造強化とは、細胞が足場として接着することができるコラーゲンやエラスチン等のタンパク質、プロテオグリカン等の糖タンパク質で構成される細胞外マトリックスの構築を促して、その構造を頑丈なものにすることである。細胞外マトリックスを構成するコラーゲンやエラスチン等を産生するだけではなく、ガレクチン－９を介して適切に構築することが、細胞外マトリックスの構造強化には重要である。このように細胞外マトリックスの構造を強化することで、細胞が移動、分化、増殖等の多くの機能を盛んに行うことができる。

本発明のグリシルプロリンとは、グリシンとプロリンがアミド結合を介して結合したジペプチドであり、分子式はＣ_７Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_３である。化学式を（１）に示す

グリシルプロリンは、そのまま用いても良いし、塩の状態で用いることもできる。塩としては、製剤上許容できる酸付加塩や塩基付加塩等が挙げられる。具体的には、酸付加塩としては、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸の塩や、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等の有機酸の塩が挙げられる。又、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム、エタノールアミン等のアミン類の塩が挙げられる。

上記の物質の作製方法は、化学的に合成したり、コラーゲン等のタンパク質を加水分解したり、分離精製したりする方法等が挙げられる。化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常の合成方法によって行うことができる。固相法の場合、ポリマー性の固相支持体へペプチドのＣ末端側（カルボキシル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合していくのが良い。そして、そのようにして得られたペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を用いた周知の方法で精製することができる。又、本物質は、シグマアルドリッチジャパン株式会社や株式会社ペプチド研究所等から市販されているものを用いることができる。

本発明のペプチドは、周知の精製法、例えば、ゲル濾過法や逆相クロマトグラフィー法等を、単独又は組み合わせて用いることにより、必要に応じて精製することができる。

本発明のペプチドは、医薬品、医薬部外品、食品又は化粧品のいずれにも用いることができる。その剤形として、内用剤として用いる場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤等が挙げられる。又、注射液、座薬等として用いることができる。外用剤として用いる場合は、クリーム、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤等が挙げられる。又、点眼薬、洗眼液等の眼に適用する外用剤等として用いることができる。これらの剤形以外の周知な剤形を用いることができ、用途によって適宜選択すれば良い。

本発明のペプチドを内用剤に用いる場合、ペプチドの摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等に応じて、適宜選択することが可能であり、一般的には、０．１～５，０００ｍｇ／日であることが好ましく、１～５００ｍｇ／日が最も好ましい。又、１日１回から数回投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、又、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。又、製剤化における薬効成分の添加方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明のペプチドは、これらの具体的な形態に応じて、そのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、溶剤等の希釈剤を用いることができる。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコール等が挙げられる。

本発明のペプチドを外用剤に用いる場合、ペプチドの含有量は剤形や用途等に応じて適宜選択することが可能であり、一般的には、剤全体に対して０．００００１～１０重量％であることが好ましく、０．０００１～１重量％が最も好ましい。この含有量が、剤全体に対して０．００００１重量％未満であると、効果を十分に発揮することが困難であり、好ましくない。又、１０重量％を超えて含有しても、含有量の増加に見合った効果の増強を見込みにくく、好ましくない。又、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明のペプチドは、これらの具体的な形態に応じて固体、粉末のまま使用しても良く、溶液として用いても良い。又、効果を損なわない範囲内で、医薬組成物や外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を含有することができる。

次に、本発明を詳細に説明するため、実施例１として本発明の処方例、及び、実施例２として実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。

処方例１ 錠剤
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン ５．０
２．トウモロコシデンプン １０．０
３．精製白糖 ２０．０
４．カルボキシメチルセルロースカルシウム １０．０
５．微結晶セルロース ４０．０
６．ポリビニルピロリドン ５．０
７．タルク １０．０
［製造方法］成分１～５を混合し、次いで成分６の水溶液を結合剤として加え、常法により顆粒化する。これに滑沢剤として成分７を加えて含有した後、１錠１００ｍｇの錠剤に打錠する。当該錠剤を１日１２錠摂取することで、グリシルプロリンを６０ｍｇ／日摂取できる。

処方例２ カプセル剤
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン ５．０
２．微結晶セルロース ６０．０
３．トウモロコシデンプン １５．０
４．乳糖 １８．０
５．ポリビニルピロリドン ２．０
［製造方法］成分１～５を混合して顆粒化した後、２号硬カプセルに２５０ｍｇ充填してカプセル剤を得る。当該カプセル剤を１日６個摂取することで、グリシルプロリンを７５ｍｇ／日摂取できる。

処方例３ 飲料
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン ０．１
２．クエン酸 ０．７
３．果糖ブドウ糖液糖 ６０．０
４．香料 ０．１
５．精製水 ３９．１
［製造方法］成分５に成分１～４を加え、攪拌溶解してろ過し、加熱殺菌後、５０ｍＬガラス瓶に充填する。当該飲料を１日１本摂取することで、グリシルプロリンを５０ｍｇ／日摂取できる。

処方例４ クリーム
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン ０．１
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２５
１２．１，３－ブチレングリコール ８．５
１３．精製水 ６８．０５
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却後、製品とする。

処方例５ ゲル剤
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン ０．００１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 ０．１
６．１，３－ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水 ８４．１９９
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例６ 軟膏
処方 含有量（ｇ）
１．グリシルプロリン １．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水 ６５．９
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却後、製品とする。

以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。尚、本発明はこれにより限定されるものではない。

実験例１ ヒト皮膚線維芽細胞におけるガレクチン－９産生に及ぼすグリシルプロリンの影響
コンフルエントになったヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）にグリシルプロリン（最終濃度１、１０、１００及び１０００μｇ／ｍＬ）を加え、ＤＭＥＭ（－）にて２４時間培養し、総ＲＮＡの抽出を行った。比較として、グリシルプロリルヒドロキシプロリン（バッケム社製、最終濃度１０及び１００μｇ／ｍＬ）を用いた。総ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により、ガレクチン－９（ＬＧＡＬＳ９）ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。同時に、内部標準として、β－アクチンｍＲＮＡ発現量の測定を行った。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは、次の通りである。

ＬＧＡＬＳ９用のプライマーセット
ＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＧＴＧ（配列番号１）
ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧ（配列番号２）
β－アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）

その結果を表１に示した。ヒト皮膚線維芽細胞にグリシルプロリンを添加すると、ＬＧＡＬＳ９ｍＲＮＡ発現量が増加した。

グリシルプロリンは、好酸球の遊走因子、ガン細胞のアポトーシス誘導、過剰な免疫反応の抑制、不溶性エラスチンとの結合等の様々な機能に関与するガレクチン－９の産生促進効果を有する。グリシルプロリンを含有する組成物は、ガレクチン－９の産生を促進することで、自己免疫疾患、炎症又はガンを予防、改善又は治療することができる。又、ガレクチン－９が関与する細胞外マトリックスの構築を促して、その構造を強化し、血管性疾患を予防、改善又は治療することができる。

Claims (1)

1. ペプチドとしてグリシルプロリンのみを含有することを特徴とするガレクチン－９産生促進剤（コラーゲン合成促進剤としての使用を除く）。