KR20180114719A - 방사무늬김의 펩신 처리물을 이용한 면역증진용 조성물 - Google Patents

방사무늬김의 펩신 처리물을 이용한 면역증진용 조성물 Download PDF

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김서영
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Abstract

세 발명은 마우스 말초면역세포에 대해 세포독성이 없으면서 그것의 증식 효과를 보이고 마우스 대식세포의 수를 유의적으로 증가시키며 T 세포의 증식과 분화 등에 관여하는 Th1 cytokine인 IFN-γ, Th2 cytokine인 IL-10의 분비를 유의적으로 증가시키는 활성을 지닌 방사무늬김 펩신 처리물을 이용한 면역증진용 조성물을 개시한다.

Description

방사무늬김의 펩신 처리물을 이용한 면역증진용 조성물{Composition for immune enhancement using pepsin-processed products of Porphyra yezoensis}
본 발명은 방사무늬김(Porphyra yezoensis)의 펩신(pepsin) 처리물을 이용한 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
모든 생명체는 박테리아, 바이러스 등의 침입자들의 공격을 방어할 수 있는 복잡하고 다양한 기작을 가지고 있으며, 이러한 인체의 방어체계를 면역체계라고 한다[1]. 최근에 환경오염물질 등과 같은 다양한 환경적 요인들로 인해 체내 면역력이 저하되고 감염에 대해 더 자주 노출되고 있으며, 더구나 새로운 균, 바이러스 또는 내성균, 내성바이러스들이 꾸준히 출현함으로써, 단순한 항생제 요법으로는 감염증에 대한 치료가 용이하지 않게 되었을 뿐만 아니라 감염의 재발이나 만성화를 초래하기도 한다[2]. 또한 농약, 살충제 등의 사용량 및 식품 내 잔류량 증가, 식품 보존제, 방부제, 착색제 등이 첨가된 가공식품 소비의 증가, 수질토양대기오염의 증가, 현대인의 스트레스의 증가, 활동량의 감소 그리고 풍요로운 식생활로 인한 비만 등의 문제들로 인해 암, 재발성, 난치성, 만성화된 호흡기 질병 등 다양한 질병의 환자가 늘어나고 있다. 따라서 면역에 대한 중요성을 인식하고 면역을 증강시킬 수 있는 물질을 찾기 위한 노력이 계속되고 있다.
김은 긴 타원모양의 가장자리에 주름이 있으며 바다의 암초에 이끼처럼 붙어 자르는 해조류로 약 30~40% 탄수화물과 단백질, 2% 정도의 지질이 포함되어 있으며, 무기질은 전체의 10% 정도로 풍부하게 함유되어 있어 고영양, 저칼로리 기호식품으로 알려져 있다[3]. 그 중 방사무늬김(Porphyra yezoensis)은 참김과 함께 국내에서 주로 양식하는 김 종류중 하나로써 예로부터 인후염, 열, 부종을 치료하는데 사용되어왔다[4]. 다양한 연구에 의하면 방사무늬김에서 항암효과[5, 6], 항고지혈증효과[7, 8], 항고혈압효과[9]가 있다고 보고되었다. 또한 Shi 등[10]에 따르면, 방사무늬김 추출물은 LPS로 자극한 마우스에서 Toll-like receptor 4의 발현 및 활성을 조절하고, NF-B, MAP kinases 활성을 억제시켜 항염효과를 나타내는 것으로 보고하였으며, Yasuko 등[11]은 방사무늬김 추출물을 처리하였을 때, 대식세포의 탐식능이 활성화됨을 확인하였다.
본 발명은 방사무늬김의 펩신 처리물의 면역증진 활성을 개시한다.
[참고문헌]
1. Abbas AK, Lichman AH, Pillai S. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: Elsevier Saunders. 2015.
2. Campbell DE, Boyle RJ, Thornton CA, Prescott SL. Mechanisms of allergic disease-environmental and genetic determinants for the development of allergy. Clin Exp Allergy. 2015; 45(5):844-58.
3. Park CK, Kang TJ, Kim KS. The nutritional and functional constituents of laver. Bull Fish Soc Inst. 2000, 9(1): 133-137.
4. Shi C, Pan T, Caoa M, Liua Q, Zhang L, Liu G. Suppression of Th2 immune responses by the sulfated polysaccharide from Porphyra haitanensis in tropomyosin-sensitized mice. Int Immunopharmacol. 2015, 24(2):211-8.
5. Noda H, Amano H, Arashima K, Nisizawa K. Antitumor activity of marine algae. Hydrobiologia. 1990, 204(205):577-584.
6. PARK SJ, RYU J, KIM IH, CHOI YH, NAM TJ. Activation of the mTOR signaling pathway in breast cancer MCF cells by a peptide derived from Porphyra yezoensis. Oncol Rep. 2015, 33(1):19-24.
7. Qian L, Zhou Y, Ma JX. Hypolipidemic effect of the polysaccharides from Porphyra yezoensis. Int J Biol Macromol. 2014, 68(1):4849.
8. Kim H, Lee Y, Han T, Choi EM. The micosporine-like amino acids-rich aqueous methanol extract of laver (Porphyra yezoensis) inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes. Nutr Res Pract. 2015, 9(6):592-598.
9. Qu W, Ma H, Pan Z, Luo L, Wanga Z, He R. Preparation and antihypertensive activity of peptides from Porphyra yezoensis. Food Chemistry. 2010, 123(1):1420.
10. Shi C, Pan T, Cao M, Liu Q, Zhang L, Liu G. Suppression of Th2 immune responses by the sulfated polysaccharide from Porphyra haitanensis in tropomyosin-sensitized mice. Int Immunopharmacol. 2015, 24(2):211-8.
11. Yoshizawa Y, Enomoto A, Todoh H, Ametani A, Kaminogawa S. Activation of murine macrophages by polysaccharide fractions from marine algae (Porphyra yezoensis). Biosci Biotechnol Biochem. 1993, 57(11):1862-6.
본 발명의 목적은 방사무늬김 펩신 처리물의 면역증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 방사무늬김의 펩신 처리물이 마우스 말초면역세포에 대해 세포독성이 없으면서 그것의 증식 효과를 보이고, 마우스 대식세포의 수를 유의적으로 증가시키며 T 세포의 증식과 분화 등에 관여하는 Th1 cytokine인 IFN-γ, Th2 cytokine인 IL-10의 분비를 유의적으로 증가시킴을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 면역증진용 조성물은 방사무늬김의 펩신 처리물 또는 그것의 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
펩신은 사람을 포함한 포유동물, 조류, 파충류, 어류 등의 위장 추출물에서 얻어질 수 있는 단백분해효소로, 현재 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격")에 천연첨가물의 일종으로 등재된 식품첨가물이다. 최적 pH는 2.0 전후, 최적 온도는 35℃ 전후로 알려져 있다. 본 발명에서 "펩신"은 식품첨가물공전의 기준 및 규격에 따라 얻어진 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 펩신 처리물은 그 처리 대상인 방사무늬김에 펩신이 작용하여 얻어지는 방사무늬김의 펩신 가수분해물을 의미한다. 이러한 펩신 처리물은 바람직하게는 펩신의 최적 pH, 최적 온도에서 충분한 반응시간(즉 12시간 이상, 바람직하게는 24시간 이상)을 거쳐 얻어진 것을 의미한다.
또 본 명세서에서, 펩신 처리물의 추출물은 추출 대상인 펩신 처리물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 면역증진용 조성물에서 그 유효성분은 면역증진 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 의도한 면역증진 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 면역증진 효과의 상승·보강을 위하여 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성이 확인된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임), 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 "건강기능식품에관한법률"임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물 등이 포함된다. 예컨대 그러한 화합물 또는 추출물로서 한국 건강기능식품공전 또는 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 개별 인정 원료로서, L-글루타민, 게르마늄 효모, 금사상황버섯, 당귀혼합추출물, 동충하초 주정추출물, 스피루리나, 클로렐라, 청국장균 배양 정제물(폴리감마글루탐산칼륨), 표고버섯균사체, 효모베타글루칸 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격")에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.
약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 방사무늬김 펩신 처리물을 이용한 면역증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 방사무늬김 펩신 처리물의 마우스의 비장세포에 대한 세포독성 평가 결과이다.
도 2는 방사무늬김 펩신 처리물의 마우스의 비장세포 증식능에 대한 평가 결과이다.
도 3 내지 5는 방사무늬김 펩신 처리물의 마우스 말초면역세포의 수적 변화에 미치는 영향에 대한 평가 결과이다.
도 6은 방사무늬김 펩신 처리물의 마우스 말초면역세포에서의 사이토카인(IL-2, IL-10, IFN-γ) 분비에 미치는 영향에 대한 평가 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 방사무늬김 펩신 처리물의 제조
방사무늬김(전초)은 2014년 11월 내지 2015년 2월 채집하여, 염 및 각종 이물질을 제거하기 위하여 3회 이상 수세하였고, 원적외선을 이용해 건조된 후 실험에 사용되기 전까지 영하 20℃ 이하에서 냉동 보관하였다. 건조된 방사무늬김은 분쇄기를 이용하여 분말로 분쇄된 후, 시료 5g을 물 250mL에 균질화시킨 뒤 pepsin 50㎕와 각각 혼합하였다. 그 후 pepsin의 최적 pH 및 온도로 반응액을 맞춰주었으며, pepsin 효소 반응은 24시간 동안 수행되었다. Pepsin 효소의 가수분해반응 후, pepsin 효소를 불활성화하기 위해 반응물을 100℃에서 15분 동안 끓였다. 그 후, 시료들을 4℃에서 1200rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 0.45㎛ filter paper로 잔류물을 소거하였다. 이로써 얻어진 추출물을 pH 7.0으로 맞추고 이를 pepsin 효소 추출물(Pepsin extracts of Porphyra yezoensis; 이하 "PPEE")이라고 명명하였다. Pepsin 효소 추출물은 다음 실험 전까지 영하 20℃에서 보관하였다.
<실험예> 면역증진 활성 실험
<실험예 1> 마우스 말초면역세포에서의 세포독성 평가
(1) 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일세포 부유액을 염화암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분 간 실온에서 배양하였다. 그 후, 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 PPEE를 농도별로 처리하였다.
(2) 실험방법
말초면역세포에 대해서 PPEE가 독성을 나타내는지 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 말초면역세포의 생존율을 측정하였다. 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 5분간 실온에서 배양하였다. 그 후, 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 항생제(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 PPEE를 농도별로 처리하였다. 96-well plate에 말초면역세포를 1×105cells/well로 넣고 농도별 PPEE와 함께 24시간 배양한 후, MTT 용액(5 mg/ml)을 각각의 well에 15㎕씩 넣고 4시간 배양한 후 버퍼(solubilization buffer, pH 4.7) 100㎕씩 첨가하여 formazan 결정을 녹인 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
(3) 실험결과
결과를 도 1에 나타내었다. PPEE는 저농도인 3.9㎍/ml부터 1000㎍/ml의 고농도까지 말초면역세포에 대한 독성을 나타내지 않았다(a; p<0.05).
<실험예 2> 마우스 말초면역세포에서의 세포증식능 평가
(1) 마우스 비장세포 부유액 준비
마우스 비장세포 부유액 준비은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 준비하였다.
(2) 실험방법
PPEE가 말초면역세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위해 3H-thymidine incorporation assay를 수행하였다. 단일 세포로 분리한 비장세포 부유액을 96-well palte에 4×105cell/well로 넣은 후 PPEE를 농도별(0, 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 1000㎍/ml)로 처리하여 54시간 배양 후 각 well에 3H-thymidine(42 Ci/mmol; Aersham, USA)을 1μCi씩 넣어 18시간 배양시켰다. 그 후 유리섬유 여지에 포획하고 유리섬유 여지를 건조시킨 다음 방사능 측정기 (MicroBeta TriLux; Perkin Elmer, Germany)를 이용하여 방사성 동위원소의 양을 측정하였다.
(다) 실험결과
결과를 도 2에 나타내었다. PPEE는 3.9㎍/ml부터 125㎍/ml까지 농도의존적으로 세포의 증식률이 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였고(b; p<0.005, c; p<0.0005), 250㎍/ml에서 1000㎍/ml까지의 고농도에서는 농도의존적으로 세포 증식률이 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 마우스 말초면역세포의 수적 변화에 미치는 영향 평가
(1) 마우스의 비장세포 부유액 준비
마우스 비장세포 부유액 준비은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 준비하였다.
(2) 실험방법
PPEE가 말초면역세포의 수적 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 유세포분석법을 수행하였다. 단일세포로 분리한 비장세포 부유액을 24well plate에 3×106/well로 분주한 후, PPEE를 31.3㎍/ml, 62.5g/ml의 농도로 처리하여 48시간 배양하였다. 이후 세포를 수확하여 DPBS로 씻어내고, 면역세포 중 표면에 Fc receptor를 발현하는 세포들에 대한 비특이적 반응을 줄이기 위해 purified anti-mouse CD16/32 단클론항체(5㎍/ml)를 이용하여 4℃에서 15분간 반응시킨 후, FITC-, PE-, V500, BV650, PC7, PerCP-CY5.5, AF700, V450-labelled anti-mouse CD3e, anti-mouse CD4, anti-mouse CD8, anti-mouse CD11b, anti-mouse CD11c, anti-mouse CD25, anti-mouse CD44, anti-mouse CD45, anti-mouse CD62L, anti-mouse CD45R/B220, anti-mouse CD19 단클론항체(각 5㎍/ml)를 4℃에서 15분간 반응시켰다. 위의 모든 항체는 BD Biosciences (CA, USA)에서 구입하였다. 각 반응이 끝난 후 washing buffer를 이용하여 2회에 걸쳐 세포를 세척하고, 염색이 완료된 세포는 1% paraformaldehyde가 포함된 staining buffer에 고정시켜 CytoFLEX와 CytExpert Software(Beckman-Coulter, Pasadena, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
(3) 실험결과
PPEE의 처리가 말초면역세포의 수적변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 유세포분석법을 수행한 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다. PPEE를 처리하였을 때, CD3e+CD4+ T 세포(도 3의 A, B)와 CD3e+CD8+ T 세포의 수적변화에 큰 영향을 미치지 않았고(도 3의 A, C), CD4+CD25+ 조절 T 세포(도 3의 D, E)와 CD8+CD25+ 조절 T 세포의 수적변화에도 큰 영향을 미치지 않았으며(도 3의 D, F), 또 다른 면역세포인 CD45R/B220+CD19+ B 세포의 수적변화에도 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3의 G, H).
또 PPEE를 처리하였을 때, CD44+CD62L- 작동 T 세포의 수적변화에는 영향을 미치지 않았으나(도 4의 A, B), CD44+CD62L+ 기억 T 세포는 31.3㎍/ml, 62.5㎍/ml에서 유의적이지는 않았지만 농도의존적으로 증가하는 경향을 보였다(도 4의 A, C, p=0.07)
또한, CD45+CD11b+ 대식세포의 수는 PPEE를 31.3g/ml, 62.5g/ml 농도로 처리하였을 때 모두 유의성있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 A, B, p<0.05).
<실험예 4> 마우스 비장세포에서의 IL-2, IL-10, IFN-γ의 분비에 미치는 영향 평가
(1) 마우스의 비장세포 부유액 준비
마우스 비장세포 부유액 준비은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 준비하였다.
(2) 실험방법
말초면역세포에서 IL-2, IL-10, IFN-γ 생성량에 PPEE가 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA를 통하여 평가하였다. 단일 세포로 분리한 비장세포 부유액을 6 well plate에 4×106/well로 분주한 후, PPEE를 31.3㎍/ml, 62.5㎍/ml의 농도로 처리하여 48시간 배양하였다. 48시간 후 상층액을 수확하고 IL-2, IL-10, IFN-γ ELISA kit(Biolegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 지시된 방법에 따라 분비량 변화를 분석하였다. 흡광도는 Microplate Reader(Asys, Dornstadt, Germany)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.
(다) 실험결과
PPEE의 처리가 T 세포의 증식과 작동 T 세포 및 기억 T 세포로의 분화를 촉진하는 IL-2의 분비와 Th1 cytokine인 IFN-γ, Th2 cytokine인 IL-10의 분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여 ELISA를 수행하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. PPEE를 처리하였을 때, IL-2 분비의 변화는 없었지만(도 6의 A), IFN-γ의 분비는 31.3㎍/ml, 62.5㎍/ml의 농도에서 모두 증가하였다(도 6의 B, c; p<0.0005). 또한 Th2 cytokine인 IL-10의 분비도 31.3㎍/ml, 62.5㎍/ml의 농도에서 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 6의 C, b; p<0.005).

Claims (4)

  1. 방사무늬김의 펩신 처리물 또는 그것의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.


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