CN102083455B - Mmp-9的调节剂及其用途 - Google Patents

Mmp-9的调节剂及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102083455B
CN102083455B CN200880112385.3A CN200880112385A CN102083455B CN 102083455 B CN102083455 B CN 102083455B CN 200880112385 A CN200880112385 A CN 200880112385A CN 102083455 B CN102083455 B CN 102083455B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mmp
domain
antibody
protein
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200880112385.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102083455A (zh
Inventor
I·萨吉
G·罗森布卢姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeda Research and Development Co Ltd
Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Research and Development Co Ltd filed Critical Yeda Research and Development Co Ltd
Publication of CN102083455A publication Critical patent/CN102083455A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102083455B publication Critical patent/CN102083455B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24035—Gelatinase B (3.4.24.35), i.e. matrix metalloprotease 9 or MMP9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G01N2333/96491—Metalloendopeptidases (3.4.24) with definite EC number
    • G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

本发明公开了调节金属蛋白酶9(MMP-9)活性的方法。该方法包括使MMP-9与同MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的调节物接触。本发明还公开了能够与OG结构域进行特异性相互作用的分子、鉴定所述分子的方法、包含所述分子的药物组合物及其用途。

Description

MMP-9的调节剂及其用途
发明领域与背景
本发明涉及MMP-9的调节剂，更具体地讲，涉及靶向其OG结构域的调节剂。
基质金属蛋白酶(MMP)的生理作用和病理作用是多方面的。MMP家族的成员不仅通过使胞外基质(ECM)组分进行分解代谢而且还通过加工各种可溶性介质，来参与炎性细胞和癌细胞通过结缔组织迁移的多个方面，加重许多疾病状态。虽然所有MMP都有同样的催化部位，但是在其底物特异性方面观察到显著差异，这至少部分是由于非催化性蛋白结构域上存在的额外底物结合部位所引起的。因此，不同的MMP具有不同的生物功能。MMP-9，亦称明胶酶B，由于其组织损伤作用和对可溶性蛋白的促炎加工(包括蛋白酶抑制剂、趋化因子和细胞因子)，因此是炎症性疾病的原型靶标(prototypical target)。
相比之下，据推测MMP-2或明胶酶A通过使炎性趋化因子失活，并通过调节结缔组织更新，从而主要具有抗炎功能和稳态功能。这就意味着可以识别这些高度相似的酶的选择性抑制剂，对于无副作用的有效抗炎疗法十分重要。从这一点来看，可以靶向区分MMP-2和MMP-9的酶的其它非催化部分，来产生选择性抑制剂。
有趣的是，MMP-9和MMP-2之间的主要结构差异是在MMP-9中存在大量的O-糖基化(OG)结构域[Opdenakker，G.等(2001)，TrendsImmunol.22，571-579；Van den Steen，P.E.等(2006)J Biol Chem.281，18626-18637]。MMP-9中的其它结构域也存在于MMP-2中，包括负责保持潜伏状态的肽原结构域(pro-peptide domain)、其中插入3个纤连蛋白重复序列的催化结构域以及构成外结合位点(exosite)的C端结构域(亦称血红素结合蛋白样结构域)，所述外结合位点用于与内源MMP-9和MMP-2抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)结合。尽管MMP-9在许多疾病中以及在与MMP-2相比之下极为重要，但是可获得的有关MMP-9的结构信息只限于其两个末端结构域，而不是全长酶。含有催化结构域前体(pro-catalytic domain)的N端部分的X射线结构[Elkins等，2002，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58，1182-1192]显示它具有基质蛋白酶折叠。C端血红素结合蛋白样结构域由具有假四折叠对称(pseudo-four-fold symmetry)的4片β-螺旋浆叶片式结构组成[Cha等，2002，J Mol Biol 320，1065-1079]。图1A表示pro-MMP-9的催化结构域前体和血红素结合蛋白样结构域的晶体结构。结构域由代表64个氨基酸长的接头(含有22个脯氨酸残基、6个甘氨酸残基和大约12-14个O-联聚糖)的虚线连接而成[Van den Steen等，2001，Biochim Biophys Acta 1528，61-73]。重要的是，pro-MMP-9的接头结构域比MMP家族的胶原酶、溶基质蛋白酶和明胶酶A的接头区长2-3倍，对于MMP家族，典型的接头长度跨距的范围仅仅为21-27个氨基酸残基。
已经证实，要使pro-MMP-9的接头结构域单独或与其它蛋白质结构域一起结晶十分困难。在甘氨酸的情况下缺乏大的侧链，而且在脯氨酸的情况下存在内嵌转角(built-in bend)，妨碍了二级结构的形成，并且常常形成环或松散区(unstructured region)。此外，作为O-聚糖连接点的聚簇丝氨酸和苏氨酸的存在可能产生会阻碍晶体堆积的位阻效应。该结构域由于其与V型胶原具有序列相似性还一直被称为V型胶原样结构域，最近才被重新命名为O-糖基化(OG)结构域。OG结构域在血红素结合蛋白结构域的定向中具有活性，使得能够进行外结合位点相互作用。然而，完全不了解有关OG结构域对MMP-9整个3D结构及其生物物理学性质的影响。
美国专利第20040175817号教导了根据MMP-9催化亚基的晶体结构对MMP-9调节剂进行鉴定。然而，由于MMP一般在其催化部位都有共同的高序列同源性，因此设计靶向催化部位的调节剂可能没有对于MMP-9的选择性。
发明概述
存在对MMP-9特异性调节剂的需求。
一方面，提供调节金属蛋白酶9(MMP-9)活性的方法，该方法包括使MMP-9与同MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的调节物(agent)接触，从而调节MMP-9的活性。
另一方面，提供鉴定能够特异性调节MMP-9的调节物的方法，该方法包括确定该调节物是否能够与MMP-9的OG结构域进行相互作用，所述调节物是推定的MMP-9特异性调节剂。
再一方面，提供治疗MMP-9介导的医学病症的方法，该方法包括给予有需要的受治疗者治疗有效量的与MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的调节物，从而治疗MMP-9介导的疾病或病症。
另外再一方面，提供能够特异性调节MMP-9活性的分子，其中该分子与MMP-9的OG结构域相互作用，前提条件是该分子不是非人源化抗体。
另外一方面，提供包含与MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的抗原识别结构域的人源化抗体。
另外又一方面，提供包含能够特异性调节MMP-9活性的分子作为活性成分和药学上可接受的载体的药物组合物，其中该分子与MMP-9的OG结构域相互作用，前提条件是该分子不是非人源化抗体。
按照一个实施方案，所述MMP-9是天然MMP-9。
按照又一个实施方案，所述活性是溶胶原活性(collagenolyticactivity)。
按照又一个实施方案，所述活性是溶明胶活性(gelatinolyticactivity)。
按照又一个实施方案，所述调节是增量调节。
按照又一个实施方案，所述调节是减量调节。
按照又一个实施方案，所述调节物包括多肽调节物。
按照又一个实施方案，所述多肽调节物包括抗体。
按照又一个实施方案，所述调节物包括小分子。
按照又一个实施方案，所述确定是通过将调节物的结构与MMP-9OG结构域的结构进行比较来实现的。
按照又一个实施方案，所述确定是通过使所述调节物与分离的MMP-9的OG结构域接触来实现的。
按照又一个实施方案，所述调节物包括多肽。
按照又一个实施方案，所述多肽包括抗体。
按照又一个实施方案，所述调节物包括小分子。
按照又一个实施方案，所述调节物按照本文所述方法进行鉴定。
按照又一个实施方案，所述调节物包括小分子或多肽调节物。
按照又一个实施方案，所述多肽调节物包括抗体。
按照又一个实施方案，所述分子包括人源化抗体，所述人源化抗体包含与所述MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的抗原识别结构域。
附图简述
本文仅通过实施例并参考附图对本发明进行描述。要强调的是，就现在具体参考附图细节而言，仅通过实施例，而且仅为了说明性地论述本发明的优选实施方案而给出细节，并且是为了提供我们认为是对本发明的原理和构思方面最有用和最易理解的描述而提供这些细节。在这点上，我们没有试图以比基本理解本发明所必需的更为详细的方式来说明本发明的结构细节，附图中的说明，可使本领域技术人员了解本发明的几种形式如何具体体现在实践中。
附图中：
图1A-D是表征pro-MMP-9的计算机生成模型和各类图。图1A表示末端结构域的晶体结构。Pro-MMP-9的N端结构域(PDB代码：1L6J)包含肽原(绿色)、3个纤连蛋白II型重复序列(蓝色)和催化结构域(红色)与含锌活性部位(灰色球)。OG结构域(虚线)含有未知结构的64个残基片段，它使N端结构域与由4个螺旋浆叶片(青色)组成的C端血红素结合蛋白样结构域(PDB代码：1ITV)连接在一起。图1B是表示大小排阻层析法的曲线图，表示pro-MMP-9的寡聚体种类(峰1，15.8分钟；峰2，22.7分钟)和单体(峰3，25.1分钟)形式的洗脱分布曲线。插图：具有已知斯托克斯半径(Stokes radii)的蛋白质标准溶液的Porath曲线[57]用来标定superdex 200柱(从左到右：甲状腺球蛋白 铁蛋白过氧化氢酶醛缩酶白蛋白)。将Kd的立方根对每种蛋白质的斯托克斯半径作图，并给出线性最小二乘方拟合。图1C是明胶酶谱的照片。为了将单体与制备量的较高寡聚体结构分离开来，采用了甘油沉降。对明胶酶谱中每个流分的等分量进行了分析。流分1-3中存在高寡聚体结构。流分3含有全部寡聚体形式的混合物。流分4-7主要含有单体形式。图1D是用来计算沉降系数分布的分析型超速离心沉降速度分析。插图：由是时间和距转动轴距离的函数的实验数据(点)按模型绘制的沉降分布曲线(线图)。残差图见上方的小图。为了清楚起见，只显示分析中所用的每一个的第十条分布曲线。
图2A-E是计算机生成模型和表示pro-MMP-9结构分析的各类图。图2A曲线图表示溶液中pro-MMP-9的SAXS数据。应用CHADD将X射线强度实验数据(黑点)与最可能模型(灰线)相比较。插图：SAXS实验数据的对分布函数。图2B表示通过CHADD重构的Pro-MMP-9模型。由SAXS数据获得的模型用半径为的白球表示。每个模型以0°和90°沿垂直轴旋转。N端和C端结构域的对接晶体结构(dockedcrystal structure)[22、24]分别用蓝色带状结构和红色带状结构表示。图2C是通过PONDR[37]预测的pro-MMP-9的序列中的长无序区(long-disorder region)(粗黑线)和相应的结构域组构(上条形柱：PRO-肽原，CAT+FN-催化结构域和3个纤连蛋白II型重复序列，OG-O-糖基化结构域，PEX-血红素结合蛋白样结构域)。图2D表示具有重构OG结构域的全长pro-MMP-9的计算散射曲线与实验数据的拟合。最佳的3个模型的计算曲线用绿线、青线和黄线表示。实验数据用黑点表示。运用CHADD模型内的RAPPER[38、39]计算出OG结构域的3个最佳模型。图2E表示OG结构域的结构重构。最佳的3个模型用绿色、青色和黄色的带状结构表示。
图3A-F是野生型和突变型pro-MMP-9的曲线图和AFM图像。戊二醛用作表面上的胺与蛋白质之间的共价接头(covalent linker)。全部扫描都采用一个尖钉触头(spike tip)。图3A-C：野生型pro-MMP-9的半干模式扫描。图3D-F：pro-MMP-9ΔOG突变体的半干模式扫描。图3A和图3D是2D图像。图3B和图3E是3D图像。图3C和图3F是沿图3A和图3D中所显示的短划线的XZ横切面。有关样品制备和成像条件见正文。高度比例尺用靠右的比例尺表示，其中Z轴的范围为(由深到浅)。
图4A-F是通过AFM测定的野生型(左)和pro-MMP-9ΔOG(右)的粒径分布直方图。所有直方图的y轴都是通过计数除以总体得到的归一化频度。图4A和4B-高度分布。图4C和4D-宽度分布。宽度值如实验方法部分中所述方法校正。图4E表示野生型pro-MMP-9的波瓣与波瓣之间(lobe-to lobe)的分布。无法分辨pro-MMP-9ΔOG中波瓣之间的分离情况。图4F表示按模型制作pro-MMP-9的构象状态。将根据波瓣间AFM数据计算得到的标准差减去(左)或加上(右)通过SAXS结构重构获得的平均化结构(中)的结构域间分离。N端和C端结构域[22、24]分别用蓝色卡通图(blue cartoon)和红色卡通图表示。OG结构域通过RAPPER重构[38、39]，并用绿色C？示踪表示。
图5A-B表示通过SAXS获得的重构pro-MMP-9模型。图5A是GASBOR模型。图5B是CHADD模型。半径的白球表示所获得的模型。N端和C端结构域的对接晶体结构分别用蓝色卡通图和红色卡通图表示。每个模型沿垂直轴以0°和90°旋转。
图6A-C是pro-MMP-9的AFM图像。戊二醛用作表面上的胺与蛋白质之间的共价接头。全部扫描都采用一个尖钉触头，只是图6A的使用氧化物削磨的氮化硅触头。图6A：缓冲溶液中的野生型pro-MMP-9。图6B：野生型酶的干燥样品在环境条件下扫描。图6C：进行相同固定化步骤但未使用酶的空白样品。箭头表示在1×1μm2扫描下观察到的单个粒子。高度比例尺用靠右的比例尺表示，其中Z轴的范围为(由深到浅)。
图7A-B：图7A表示表达分泌性MMP-9的HT1080细胞的原位酶谱图(in situ zymography)。检出绿色荧光表示具有IV型胶原的蛋白水解活性。蓝色表示核染色(Hoechst)。图7B表示HT1080细胞与抗MMP孵育(9小时)，然后用缀合Oregon绿的IV型胶原覆盖。细胞周围缺乏明显绿色荧光表示细胞周围的蛋白水解被MMP-9抑制。
优选实施方案的描述
本发明涉及MMP-9的调节剂，更具体地讲，涉及靶向其OG结构域的调节剂。
参考附图和随附说明可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明至少一个本发明的实施方案之前，应该了解本发明在其申请中并不限于以下说明中所描述的细节或者实施例中所例举的细节。本发明能够有其它实施方案，或者能够以各种方式实施或实现。同样，还应了解本文所采用的措辞和术语是为了说明目的，不应视为限制。
金属蛋白酶(MMP)家族的成员参与炎性细胞和癌细胞通过结缔组织迁移的多个方面，加重许多疾病状态。虽然所有MMP都有同样的催化部位，但是其底物结合部位却不同。因此，不同的MMP具有不同的生物功能。例如，MMP-9加重组织损伤和炎症，而MMP-2则主要涉及抗炎功能和稳态功能。这就意味着可以识别这些高度相似的酶的选择性抑制剂，对于无副作用的有效抗炎疗法至关重要。
在构思本发明的同时，本发明的发明人认识到MMP-9和MMP-2之间的主要结构差异是在MMP-9中存在大量的O-糖基化(OG)结构域。然而，可获得的有关MMP-9的结构信息只限于其两个末端结构域，没有包括这一OG结构域。因此，没有有关OG结构域对MMP-9整个3D结构及其生物物理学性质的影响的信息。
在将本发明付诸实施时，本发明的发明人将小角度X射线散射(SAXS)与单分子原子力显微镜(AFM)成像结合起来进行了一项新的结构分析，首次表征了pro-MMP-9全长结构及其O-糖基化接头结构域的分子特征。SAXS之后通过图像分析和结构重构分析提供了全长pro-MMP-9的分子形状，代表其在溶液中的平均构象(图2A-E)。该结构得到了高分辨AFM成像(图3A-F和4A-E)和生物物理测量值的支持，显示出带有OG结构域的细长蛋白质在两个末端结构域之间用作长为的柔性接头(图5A-B)。由通过单分子成像检测的各种蛋白质构象对OG结构域柔性度进行了统计学评价(图4F)。pro-MMP-9的全长结构-动态模型为了解蛋白质结构域柔性在MMP-9活性所必需的在调节底物、配体和受体的识别、结合和加工中的作用提供了新的视野。
在将本发明进一步付诸实施时，本发明的发明人用原位酶谱表明能够与MMP-9的OG结构域特异性相互作用的抗体阻断其溶胶原活性，但却不阻断其溶明胶活性(图7A-B)。因此，本发明的发明人提出了调节OG结构域柔性的调节物用途可用来控制该酶的病理活性。
因此，本发明一方面，提供调节金属蛋白酶9(MMP-9)活性的方法，该方法包括使MMP-9与同MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的调节物接触，从而调节MMP-9的活性。
本文所使用的术语“MMP-9”(多结构域锌内肽酶基质金属蛋白酶-9，亦称明胶酶B)是指哺乳动物(例如人)MMP-9多肽的前体或活性形式(EC 3.4.24.35；Swiss Prot No.P14780)，包括同源物(homolog)、直向同源物(ortholog)及其同工型(isoform)。MMP-9通常包含3个结构域--催化结构域、底物结合结构域及两者中间的接头结构域。接头结构域，本文亦称V胶原样结构域或O-糖基化(OG)结构域，包含64个氨基酸和大约12-14个O-联聚糖，其中，64个氨基酸中有22个是脯氨酸残基，6个是甘氨酸残基。
按照本发明这一方面的一个实施方案，MMP-9是天然的，即不是变性的。按照本发明这一方面的另一个实施方案，MMP-9是有活性的，优选为有完全活性。
MMP-9的活性包括但不限于溶明胶活性；天然I型胶原、III型胶原和XI型胶原的降解(溶胶原活性)；弹性蛋白、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、层粘连蛋白A链和髓鞘碱性蛋白的降解。
本文所使用的术语“调节”是指减量调节或增量调节。应当了解的是，抑制OG结构域柔性的调节物可减量调节需要呈柔性的OG结构域的MMP-9的功能，例如其溶胶原活性。相比之下，通过与OG结构域相互作用的调节物可增量调节需要MMP-9的特定3D结构却不需要OG结构域柔性的活性。这类活性的一个实例是其溶明胶活性或与受体和/或生长因子相互作用的能力。
正如所提及的一样，通过使MMP-9与能够与其OG结构域进行特异性相互作用的调节物接触，来实施本发明的方法。
本文所使用的术语“接触”是指在允许调节物与MMP-9的OG结构域相互作用(例如与OG结构域结合)的条件(即时间、温度、缓冲液)下，使MMP-9能够与该调节物发生接触并影响其刚性。应当了解的是，接触可在体内、离体或体外进行。
本文所使用的术语“特异性相互作用”是指与MMP-9的其它结构域(例如催化结构域或底物结合结构域)相对比，对MMP-9的OG结构域的亲和力增高，并且对MMP-9的OG结构域的亲和力相对于对其它金属蛋白酶(例如MMP-2)的OG结构域的亲和力增高。最小亲和力的一个实例可能为10-5M。优选调节物与MP-9的OG结构域相互作用的亲和力比上述亲和力至少高3倍，更优选亲和力至少高5倍，更优选亲和力至少高10倍以上。应当了解的是，因为MMP-9的OG结构域的氨基酸序列是MMP-9特异性的(与在MMP-9和MMP-2之间是高度同源的催化结构域的氨基酸序列相对比)，因此，能够与MMP-9的OG结构域发生特异性相互作用的调节物能够特异性调节MMP-9。
本发明所提出的能够与MMP-9的OG结构域相互作用的调节物(即分子)包括但不限于多肽调节物(例如包含与MMP-9的OG结构域特异性相互作用的抗原识别结构域的抗体)、肽和小分子。应当了解的是，该调节物可根据特定的氨基酸序列识别和/或构象识别与OG结构域相互作用。
识别MMP-9的OG结构域的抗体调节物是市售的，例如可获自Sigma、Chemicon和Abcam公司。
本发明使用的术语“抗体”包括完整分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv，它们能够与特定线粒体蛋白结合。较小的抗体片段可能具有优于完整抗体的优势，因为它们能够更容易地渗入组织，并且更快地从机体中清除掉。这对于体内使用MMP-9特异性抗体尤为重要。同样，抗体片段的其它优势是它们可以在细菌或酵母中产生。
通过使用包含OG结构域的肽，可实现针对MMP-9OG结构域的抗体的产生。抗体可使用其它MMP-9结构域作为阴性对照进行筛选。
用于实施本发明的合适抗体片段包括免疫球蛋白轻链(本文亦称“轻链”)的互补决定区(CDR)、免疫球蛋白重链(本文亦称“重链”)的互补决定区、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链、Fd片段以及包含轻链和重链两者的基本完整可变区的抗体片段，例如Fv、单链Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2。
同时包含轻链和重链的完整或基本完整可变区的功能性抗体片段定义如下：
(i)Fv，定义为含有表达成2条链的轻链可变区和重链可变区的遗传工程片段；
(ii)单链Fv(“scFv”)，包括轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽接头连接而成的遗传工程单链分子。
(iii)Fab，一种含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可通过用酶即木瓜蛋白酶处理完整抗体得到一条完整的轻链和一条重链的Fd片段而获得，该Fd片段由可变区及其CH1结构域组成；
(iv)Fab’，一种含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可通过用酶即胃蛋白酶处理完整抗体后经还原而获得(每个抗体分子可获得两个Fab’片段)；和
(v)F(ab’)2，一种含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可通过用酶即胃蛋白酶处理完整抗体而获得(即两个Fab’片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体)。
抗体(即单克隆抗体和多克隆抗体)的制备方法是本领域众所周知的。抗体可以通过本领域已知的若干方法中的任一种来制备，这些方法可采用诱导体内产生抗体分子，筛选免疫球蛋白文库(Orlandi D.R.等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837；Winter G.等，1991.Nature 349：293-299)，或者由培养物中的连续细胞系产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler G.等，1975.Nature 256：495-497；Kozbor D.等，1985.J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote RJ.等，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030；Cole SP.等，1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。
如果靶抗原太小，在当在体内产生抗体时不能引起适当的免疫原性反应(immunogenic response)，则可将这类抗原(半抗原)与抗原中性载体(antigenically neutral carrier)例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)]载体偶联(参见美国专利号5,189,178和5,239,078)。半抗原与载体的偶联可以采用本领域众所周知的方法实现。例如，可实现与氨基直接偶联，并任选接着使所形成的亚氨基键还原。或者，可以采用缩合剂(例如二环己基碳二亚胺)或其它碳二亚胺脱水剂使载体偶联。接头化合物也可用于实现偶联；同双官能和异双官能接头均可获自Pierce Chemical Company，Rockford，Ill。然后，可将所得免疫原性复合物注射到小鼠、兔等合适的哺乳动物受治疗者体内。合适的方案包括按照加强血清中抗体产生的时间表，在佐剂存在下重复注射免疫原。应用本领域众所周知的免疫测定法，可容易地测定出免疫血清的效价。
所获得的抗血清可以直接使用，或者按照上文中所述获得单克隆抗体。
可以应用本领域众所周知的方法，获得抗体片段[(参见例如Harlow和Lane，“Antibodies：A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，New York，(1988)]。例如，可以通过抗体的蛋白水解，或者通过抗体片段的编码DNA在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中的表达，来制备本发明的抗体片段。
或者，可以通过常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体获得抗体片段。如上所述，可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶促切割得到5S片段，从而产生(Fab’)2抗体片段。还可以使用巯基还原剂，任选使用由二硫键裂解所产生的巯基的封端基团，使该片段进行进一步裂解产生3.5S Fab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶促切割来直接产生2个单价Fab′片段和Fc片段。本领域技术文献提供了实施这类方法的大量指导(例如参见：Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647；Porter，RR.，1959.BioChem.J.73：119-126)。切割抗体的其它方法，例如重链分离形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或者还可以使用其它酶技术、化学技术或遗传技术，只要该片段与被完整抗体识别的抗原结合。
如上所述，Fv由重链可变区和轻链可变区配对组成。这种缔合可以是非共价的(参见例如Inbar等，1972.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.69：2659-62)。或者，如上所述，可变区可通过分子间二硫键连接形成单链Fv，又或者这些链可用化学试剂(例如戊二醛)交联。
Fv优选为单链Fv。
单链Fv通过构建结构基因来制备，该结构基因包含由编码肽接头的寡核苷酸连接的重链可变区和轻链可变区的编码DNA序列。将该结构基因插入表达载体中，随即将表达载体导入宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接2个可变区的接头肽的单一多肽链。本领域技术文献中提供了用于产生单链Fv的大量指导(例如参见：Whitlow和Filpula，1991.Methods，2：97-105；Bird等，1988.Science242：423-426；Pack等，1993.Bio/Technology 11：1271-77；以及Ladner等，美国专利第4,946,778号)。
分离的互补决定区肽可以通过构建目标抗体互补决定区的编码基因获得。这类基因可通过例如抗体生成细胞mRNA的RT-PCR制备。本领域技术文献提供了实施这类方法的大量指导(例如参见Larrick和Fry，1991.Methods 2：106-10)。
应当了解的是，对于用于人的疗法，优选使用人源化抗体。人源化形式的非人类(例如鼠)抗体是遗传工程嵌合抗体或抗体片段，其具有衍生自非人类抗体的部分(优选最小部分)。人源化抗体包括这样的抗体，其中人抗体的互补决定区(受体抗体)被小鼠、大鼠或兔等非人类物种互补决定区(供体抗体)的具有所需官能团的残基置换。在某些情况下，人抗体的Fv构架残基被相应的非人类残基置换。人源化抗体还可包括既不存在于受体抗体，又不存在于输入的互补决定区或构架序列中的残基。一般而言，人源化抗体基本上所有都可包含至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本上所有的互补决定区都相当于非人类抗体互补决定区，所有或基本上所有的构架区都相当于有关人共有序列的构架区。人源化抗体最好还包括至少一部分通常衍生自人抗体的抗体恒定区，例如Fc区(参见例如Jones等，1986.Nature321：522-525；Riechmann等，1988.Nature 332：323-329；以及Presta，1992.Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596)。
使非人类抗体人源化的方法是本领域众所周知的。人源化抗体一般具有一个或多个从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为输入性残基(imported residue)，通常取自输入性可变区。基本上可按照文献方法(参见例如：Jones等，1986.Nature321：522-525；Riechmann等，1988.Nature 332：323-327；Verhoeyen等，1988.Science 239：1534-1536；美国专利第4,816,567号)，通过用相应的啮齿动物互补决定区取代人互补决定区来进行人源化。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上不超过一个完整的人可变区被得自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常可以是其中一些互补决定区残基及可能的一些构架残基被得自啮齿动物抗体相似位点的残基取代的人抗体。
还可以采用本领域已知的各种技术制备人抗体，包括噬菌体展示文库[参见例如Hoogenboom和Winter，1991.J.Mol.Biol.227：381；Marks等，1991.J.Mol.Biol.222：581；Cole等，“Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy”，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等，1991.J.Immunol.147：86-95)]。还可以将人免疫球蛋白基因座编码序列导入转基因动物中，来制备人源化抗体，转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全钝化的小鼠。在抗原攻击时，在这类动物中观察到人抗体的产生，这些抗体在包括基因重排、链装配和抗体谱在内的所有方面都与在人体内观察到的十分相似。本领域技术文献中提供了实施这类方法的大量指导(例如参见：美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks等，1992.Bio/Technology 10：779-783；Lonberg等，1994.Nature 368：856-859；Morrison，1994.Nature 368：812-13；Fishwild等，1996.NatureBiotechnology 14：845-51；Neuberger，1996.Nature Biotechnology 14：826；Lonberg和Huszar，1995.Intern.Rev.Immunol.13：65-93)。
为了鉴定能够特异性调节MMP-9的推定调节物，可对调节物就其与MMP-9的OG结构域相互作用的能力进行评价。
因此，本发明一方面，提供确定调节物是否是MMP-9的特异性调节剂的方法，该方法包括确定该调节物是否能够与MMP-9的OG结构域进行相互作用，所述调节物是推定的MMP-9特异性调节剂。
通过精确的实验，本发明的发明人揭示了全长pro-MMP-9的3D结构。本文所描述的完整MMP-93D结构可用于合理设计调节(优选抑制)MMP9作用的药物。这些MMP9调节剂可用来防止或处理MMP9活性的不良物理和药理性质。因此，按照本发明这一方面的一个实施方案，可通过将调节物的结构与MMP-9OG结构域的结构进行比较，来对该调节物特异性调节MMP-9的能力进行评价。这可通过应用全长MMP-9的计算机模型进行，例如通过本发明的发明人借助例如GASBOR和CHADD等程序生成的计算机模型。该方法可能特别适于鉴定肽调节物和小分子。
一旦获得了调节物的结构，就可以设计与OG结构域3D结构契合并可望稳定(stanilize)或破环它的肽。可以筛选出这类特异性结合OG结构域的肽/小分子。
如上所述，可采用各种方法，包括例如展示技术，来进行肽模拟物的制备。
构建这类展示文库的方法是本领域众所周知的。这类方法可参见例如Young AC等，“The three-dimensional structures of a polysaccharidebinding antibody to Cryptococcus neoformans and its complex with apeptide from a phage display library：implications for the identification ofpeptide mimotopes(抗新生隐球菌的多糖结合抗体及其与得自噬菌体展示文库的肽的复合物的三维结构：用于鉴定肽模拟表位的意义)”JMol Biol 1997年12月12日；274(4)：622-34；Giebel LB等，“Screening ofcyclic peptide phage libraries identifies ligands that bind streptavidin withhigh affinities(环肽噬菌体文库的筛选鉴定出以高亲和力结合链霉抗生物素蛋白的配体)”Biochemistry 1995年11月28日；34(47)：15430-5；Davies EL等，“Selection of specific phage-display antibodies usinglibraries derived from chicken immunoglobulin genes(采用衍生自鸡免疫球蛋白基因的文库对特异性噬菌体展示抗体进行筛选)”J ImmunolMethods 1995年10月12日；186(1)：125-35；Jones C RT等，“Currenttrends in molecular recognition and bioseparation(分子识别和生物分离的最新趋势)”J Chromatogr A 1995年7月14日；707(1)：3-22；Deng SJ等，“Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chainantibodies from synthetic gene libraries(用于选择得自合成基因文库的改进的糖结合单链抗体的基础)”Proc Natl Acad Sci USA 1995年5月23日；92(11)：4992-6；以及Deng SJ等，“Selection of antibodysingle-chain variable fragments with improved carbohydrate-binding byphage display(通过噬菌体展示选择具有改进的糖结合的抗体单链可变区片段)”J Biol Chem 1994年4月1日；269(13)：9533-8，所述文献通过引用结合到本文中。
应用计算生物学还揭示了肽模拟物。例如，可以运用下文实施例部分中所描述的各种三维计算工具，对各种化合物结合OG结构域的能力进行计算分析。用于显示三维结构模型的软件程序，例如RIBBONS(Carson，M.，1997.Methods in Enzymology 277，25)、O(Jones，TA.等，1991.Acta Crystallogr.A47，110)、DINO(DINO：VisualizingStructural Biology(2001)www.dino3d.org)；以及QUANTA，INSIGHT、SYBYL、MACROMODE、ICM、MOLMOL、RASMOL和GRASP(有关综述见Kraulis，J.，1991.Appl Crystallogr.24，946)，可用来模拟OG结构域和预期的肽模拟物之间的相互作用，从而鉴定出与OG区的结合具有最高可能性的肽。蛋白质-肽相互作用的计算建模已成功用于合理的药物设计，有关详情参见Lam等，1994.Science 263，380；Wlodawer等，1993.Ann Rev Biochem.62，543；Appelt，1993.Perspectives in Drug Discovery and Design 1，23；Erickson，1993.Perspectives in Drug Discovery and Design 1，109以及Mauro MJ.等，2002.J Clin Oncol.20，325-34。
按照本发明这一方面的另一个实施方案，可以通过将调节物与分离MMP-9一起孵育，来对调节物特异性调节MMP-9的能力进行评价。因为MMP-9的氨基酸序列是已知的，因此包含OG结构域的分离MMP-9或其片段可应用标准重组DNA技术或通过化学合成产生。可以应用标准蛋白质标记技术测定调节物与靶标的结合。标记可以是直接(例如用S35标记MMP-9)或间接的，例如使用第二抗体。标准免疫学法(ELISA、免疫测定法)和生物化学法(例如凝胶过滤)可以用于评价调节物结合。
一旦鉴定出推定调节物，便可以对其调节MMP-9功能的能力及其针对MMP-9的选择性的能力进行测定。这类测定法的一个实例是下文实施例7中描述的溶胶原活性的原位酶谱分析法。
正如所提及的一样，已知由于MMP-9的组织损伤作用和对可溶性蛋白的促炎加工(包括蛋白酶抑制剂、趋化因子和细胞因子)，因而MMP-9是炎症性疾病中的原型靶标。因此，能够减量调节MMP-9活性的调节物都可用来治疗MMP-9相关疾病。
因此，本发明一方面，提供治疗MMP-9介导的医学病症的方法，该方法包括给予有需要的受治疗者治疗有效量的与MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用的调节物，从而治疗MMP-9介导的医学病症。
本文所使用的术语“有需要的受治疗者”是指哺乳动物，优选人类受治疗者。
本文所使用的术语“治疗”是指预防、治愈、逆转、减轻、减缓、抑制或停止MMP-9介导的疾病或病症的有害作用或者使该病的有害作用降到最低。
术语“MMP-9介导的医学病症”是指其中MMP-9可能是造成其发生或发展的疾病或病症。MMP-9介导的医学病症的一个实例为癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等转移性癌症。
除了在癌症中起作用以外，MMP-9还涉及其它病理，例如涉及关节炎或神经变性性疾病，例如多发性硬化(Firestein，Curr.Opin.Rheumatol.4：348-354(1992)；Gijbels等，J.Neuroimmunol.41：29-34(1992))。例如与健康患者或骨关节炎患者相比，在炎症性关节炎(例如类风湿性关节炎)患者的血清和滑液中检出高水平的MMP-9(Ahrens等，Arthritis & Rheumatism 39：1576-87(1996)；Gruber等，Clin.Immunol.& Immunopathol.，78：161-171(1996))。此外，有研究报告了关节的关节炎活动性评分(arthritic activity score)与吸出的滑液中MMP-9的量的关联性(Koolwijk等，J.Reumatology，22：385-393(1995))。
在神经系统疾病中也检测到MMP-9的表达。例如，与正常脑组织相比，脱髓鞘病变的反应性星形细胞和巨噬细胞中存在大量的MMP-9表达(Cuzner等，J.Neuropathol.Exp.Neurol，55：1194-1204(1996))。MMP-9在以下情况下升高：在脑脊髓炎中(Gijbels等，J.Neuro.Res.36：432-440(1993)；Proost等，Biochem.Biophys.Res.Comm.192：1175-1181(1993))、在多发性硬化患者的脑脊液中(Leppert等，Brain  121：2327-2334(1998)；Rosenberg等，Brain Res.，703：151-155(1995))；以及在AIDS相关痴呆患者中(Conant等，AnnalsofNeurology 46：391-398(1999))。此外，在肌萎缩性侧索硬化患者中，MMP-9表达存在于运动皮质的锥形神经元和脊髓的运动神经元中(Lim等，J.Neurochem.，67：251-259(1996))。
MMP-9还与各种其它炎症性疾病有关。例如，高水平的MMP-9活性存在于主动脉瘤血管壁中(Freestone等，Arteriosclerosis，Thrombosis & Vascular Biology，15：1145-1151(1995)；Newman等，Connective Tissue Research，30：265-276，(1994)；Sakalihasan等，J.Vascular Surgery，24：127-33(1996))。此外，巨细胞性动脉炎患者的MMP-9水平升高，MMP-9mRNA存在于发炎血管中层基质内碎裂的弹性组织区域的平滑肌细胞和成纤维细胞中(Sorbi等，Arthitis &Rheumatism，35：1747-1753(1996))。MMP-9水平增高也存在于囊性纤维化患者的痰和支气管扩张患者的支气管肺泡灌洗液中(Delacourt等，Amer.J.Respiratory & Critical Care Med.，152：765-764(1995)；Sepper等，Chest，106：1129-1133(1994))。高水平的MMP-9还存在于大疱性类天疱疮患者皮损的水疱液中(Stahle-Backdahl等，J.Clinical Invest.，93：2022-2030(1994))。
MMP-9表达还涉及若干种其它疾病的发病机制。例如，MMP-9涉及多囊性肾病(Murray等，Conn.Tissue Res.，33：249-256(1996))、膜性肾病(McMillin等，J.Clin.Invest.，97：1094-1101(1996))和阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)(Lim等，J.Neurochem.，68：1606-1611(1997))。
因此，本发明包括使用能够与MMP-9的OG结构域进行选择性相互作用的调节物治疗所有上文提及的疾病或病症。
将本发明的调节物本身或作为药物组合物的组成部分给予受治疗者，所述药物组合物还包括生理上可接受的载体。药物组合物的目的是有利于将活性成分给予生物体。
本文所使用的“药物组合物”是指一种或多种本文所述活性成分及生理上适宜的载体和赋形剂等其它化学组分的制剂。药物组合物的目的是有利于将化合物给予生物体。
本文所使用的术语“活性成分”是指负责预期生物效应(即减量调节MMP-9活性)的调节物。
下文中，术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可以互换使用，是指不会对生物产生明显刺激性并且不会削弱所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些术语内。包括在药学上可接受的载体中的成分之一可为例如聚乙二醇(PEG)、多种同时可溶于有机介质和水性介质的生物相容性聚合物[Mutter等(1979)]。
本文术语“赋形剂”是指加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例包括而不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的制备和给药技术可参见“Remington’s PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，该文献通过引用结合到本文中。
合适的给药途径可包括例如口服、直肠、经黏膜(尤其是经鼻、经肠)或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以按局部方式而不是按全身方式给予制剂，例如通过将制剂直接注射到患者身体的特定部位。
本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭(dragee-making)、研碎、乳化、包胶囊、包封或冻干步骤。
用于本发明的药物组合物可以按常规方式，使用一种或多种生理上可接受的载体来配制，所述载体包括赋形剂和助剂，有助于将活性成分加工成可以药用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
对于注射，可以在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液(例如Hank溶液(Hank′s solution)、林格液(Ringer′s solution)或生理盐缓冲液)中配制本发明的活性成分。对于经黏膜给药，在剂型中使用适于待穿过屏障的渗透剂。这类渗透剂一般为本领域所知。
对于口服给药，药物组合物可容易地通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体相混合来制备。这类载体能够使药物组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，以用于患者口服摄取。可以使用固体赋形剂，任选将所得混合物研磨，并对颗粒混合物进行加工，如有需要在加入合适的助剂之后，得到片剂或锭剂芯，从而制备口服使用的药物制剂。合适的赋形剂特别为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠。
锭剂芯与合适的包衣材料一起提供。为此，可以使用浓糖溶液，它可任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇、二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。还可将染料或颜料加到片剂或锭剂包衣材料中以区分或鉴别活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的两节式胶囊剂(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊剂。两节式胶囊剂可含有活性成分与以下成分相混合：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉类；润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁；以及任选稳定剂。在软胶囊剂中，可将活性成分溶于或悬浮于合适液体例如脂肪油、液状石蜡或液态聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型都应为适于所选择的给药途径的剂量。
对于口腔给药，组合物可以呈按常规方式配制的片剂或糖锭剂形式。
对于通过经鼻吸入给药，本发明所用的活性成分适宜以气雾剂喷雾提供的形式由使用合适抛射剂的加压包装或喷雾器递送，合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在压缩气雾剂的情况下，可以通过提供阀门递送计量的用量来确定剂量单位。用于分配器的诸如明胶的胶囊和针筒，可以制成装有化合物和合适粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以配制本文所述制剂用于胃肠外给药，例如通过推注注射或连续输注。用于注射的剂型可呈单位剂型，例如安瓿或多剂量容器，任选加入防腐剂。组合物可以是油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有调配剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
胃肠外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成合适的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的物质供制备高度浓缩的溶液剂。
或者，活性成分可以是粉针剂的形式，用前与合适的溶媒(例如无菌无热原水基溶液)重配。
本发明的药物组合物还可以使用例如常用的栓剂基料(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直肠用组合物，例如栓剂或滞留型灌肠剂。
适用于本发明这个方面的药物组合物包括这样的组合物，其中所包含的活性成分的有效量可达到预期目的。更准确地讲，“治疗有效量”是指活性成分(例如核酸构建体)的量可有效地预防、减轻或改善疾病症状(例如局部缺血)或延长待治疗的受治疗者的存活时间。
治疗有效量的确定尽在本领域技术人员掌握之中，尤其是根据本文所提供的详细的公开内容。
对于用于本发明方法的任何制剂，剂量或治疗有效量可从体外实验和细胞培养实验中作出初步估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以获得所需要的浓度或效价。可以用这类信息更准确地确定在人体中的有益剂量。
可通过体外标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中确定本文所述活性成分的毒性和治疗功效。在制定人用剂量范围时，可以利用从这些体外实验和细胞培养实验及动物研究中获得的数据。剂量可根据所使用的剂型和所采用的给药途径而变化。确切的剂型、给药途径和剂量可由各名医师考虑患者状况后做出选择(参见例如Fingl E.等(1975)，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章，第1页)。
可以个别调节用量和给药间隔以提供诱导或抑制生物效应的活性成分的足够血浆水平或脑水平(即最低有效浓度，MEC)。各种制剂的MEC可以不同，但是可以通过体外数据估计。要达到MEC所需要的剂量将取决于个体特征和给药途径。可采用检测实验来测定血浆浓度。
根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次给药或多次给药，其中疗程持续数天至数周，或者直到实现治愈，或者达到减轻疾病。
待给予的组合物的量必然将取决于待治疗的受治疗者、疾病的严重程度、给药方式、处方医师的判断等等。
如有需要，本发明的组合物可以用包装或分配装置提供，例如经FDA核准的药盒，药盒可装有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可包括金属箔或塑料薄片(plastic foil)，例如泡罩包装。包装或分配装置可随附用药说明书。包装或分配装置还可随附由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定格式的批文，该批文反映出组合物的形式已获政府机构批准用于人用或兽用给药。例如，这类批文可以包括经美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的处方药物的标识或核准药品插页的标识。还可制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明制剂的组合物，将其装入合适容器中，贴上治疗适应症的标签，有关更多详情见上文。
根据以下实施例，本发明的其它目的、优势和新的特征对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，这些实施例并不是限制性的。另外，上文所述的本发明各个不同的实施方案和各个方面，以及所附权利要求书部分所要求保护的范围都可以在下述实施例中找到实验支持。
实施例
下面参考以下实施例并结合上述说明书，以非限制性方式对本发明进行说明。
一般而言，本文所用术语和本发明所采用的实验室方法包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。文献中全面阐述了这类技术。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”，第I-III卷，Ausubel，R.M.编著(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A PracticalGuide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编著)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中公开的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis，J.E.编著(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷，Coligan J.E.编著(1994)；Stites等(编著)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；专利和科技文献中大量披露了可应用的免疫测定法，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.编著(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1985)；“Transcriptionand Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1984)；“Animal CenCulture”Freshney，R.I.编著(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications”，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有文献都通过引用结合到本文中，正如本文中全部引用的一样。还提供贯穿本文的其它一般性参考文献。我们认为文献方法是本领域众所周知的，仅为了方便读者而在此提供。所有包括在其中的资料都通过引用结合到本文中。
通用材料与方法
MMP-9的表达：通过用携带人proMMP-9cDNA的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，使重组pro-MMP-9进行表达[19]。将数公升量的细胞培养液离心、过滤后用明胶琼脂糖凝胶层析法纯化为均质[52]。将材料在100mM Tris(pH 7.4)、100mM NaCl、10mM CaCl2(缓冲液C)中充分透析后进行进一步处理，在本研究中使用大约20mg材料。按同样方法制备缺乏OG结构域的突变体(MMP-9？OG)[19]。
小角度X射线散射：根据标准规程，在Synchrotron RadiationSource(Daresbury Laboratory，UK)工作站2.1[53]内，在溶液中进行了SAXS实验。蛋白质溶液以13,000×g离心5分钟后，在4℃下进行了测定。散射曲线用二维多线比例计数器采集，样品至检测器距离为1m(7mg/ml、100μl)和4.25m(0.8mg/ml、1.6mg/ml、2.5mg/ml、100μl)，波长(λ)为覆盖的动量传递范围为(q＝4πsinθ/λ，其中2θ为散射角)。在30个连续的1分钟帧(frame)内收集数据，然后归一化至入射光束强度，在60°扇面内径向求积分，对帧数求平均值，并归一化至检测器响应。然后减去缓冲液的散射，低角曲线与高角曲线在q为的范围内汇合。作为时间函数的强度再现性表明单体pro-MMP-9样品没有辐射损伤。利用Guinier近似法：I(q)＝I(0)exp(-q2Rg 2/3)(对于qRg＜1.3)[54]，以及用间接傅里叶变换程序GNOM的完整散射曲线[55]，来估算回转半径(Rg)。GNOM还提供定义为其中p(r)变为零的点的颗粒的距离分布函数p(r)及其最大尺寸Dmax。为了求出p(r)，首先，设p(0)＝0，p(Dmax)任意赋值，以判断所选择的r间距是否正确。Dmax是产生最小正p(Dmax)的最小值。在设定Dmax后，将p(0)和p(Dmax)设置为零。然后在低角区与高角区截取(cut)数据直到p(r)函数收敛。
为了计算两个MMP-9结构域(N端催化结构域和C端血红素结合蛋白样结构域)相应的理论散射曲线，运用程序CRYSOL[36]对两个MMP-9结构域的晶体结构进行了分析。将此再进行傅里叶变换，求出理论上的对分布函数，同时计算得出Dmax和Rg值。SAXS曲线的从头建模(Ab initio modeling)的详述见下文。结构图用PyMOL(DeLano，W.L.The PyMOL Molecular Graphics System(PyMOL分子制图系统)(2002)DeLano Scientific，San Carlos，CA，USA.www.pymol.org)绘制。
为了进一步证实模型的准确性，运用HYDROPRO[34]计算出其溶液流体动力学特性，然后与实验值进行了比较。壳形微珠(shellminibead)的半径从到按6个增量变化。运用SEDNTERP[27]计算出溶剂密度和粘度，以及蛋白质微分比容。流体动力壳模型(hydrodynamic shell model)的球体半径在之间变化。SAXS模型中假残基(dummy residue，DR)的半径为然而，由于蛋白质水合作用所致，壳模型的实际尺寸略微较大，但是增大的程度难以确定[34]。以前的研究指出，DR半径增加时将水合作用考虑在内较可靠[56]。
原子力显微镜成像：成像采用配备了E-扫描仪的多模式原子力显微镜(MMAFM Veeco/Digital Instruments，Santa Barbara，CA，USA)进行，最大扫描范围为14×14μm2。使用轻敲模式，使空气或缓冲液中的样品成像。为了从假吸附物中获得不含人为产物(主要是盐沉积物)的样品，需要极充分的漂洗步骤。通过使用经胺修饰的硅烷表面和交联步骤，有可能制成除去几乎所有本底的表面(如用空白操作测定的一样)，而同时保持可观的蛋白质表面浓度。
为使所施加的力量最小，调节幅度设定点至给出稳定示踪的最大值。使用得自Mikromasch(Estonia)的“尖钉”触头-DP14“HI′RESTM”探头，获得空气中生物样品的高分辨图像。这些探头的共振频率约为160kHz，力常数约为5N/m，额定曲率半径为1nm以下，但是只适于测量rms糙度小于20nm的表面，因为存在可能在粗糙表面上引起多次接触的额外“尖钉”。标称半径为20nm的DNP-S探头(Veeco)用于液体测量，这在标准MMAFM液体池中进行。从横切面分析确定蛋白质分子的大小。通过减去典型高分辨SEM图像中所观察到的触头包络(tip envelope)，来校正通过触头加宽的宽度值。
大小排阻层析法：将pro-MMP-9的寡聚体混合物加到预平衡并在4℃下操作的Superdex-200柱(300×10mm，Amersham Biosciences)上。样品体积为100μl 1.1mg/ml pro-MMP-9，流速为0.5ml/分钟。通过280nm下的吸光度监测洗脱情况。同时利用Porath曲线及Laurent和Killander曲线[Siegel，L.M.和Monty，K.J.(1966).Biochim BiophysActa 112，346-362]，通过分析相对于校准曲线的洗脱时间，来确定斯托克斯半径。用于校准曲线的已知斯托克斯半径的5种标准蛋白质(Amersham Biosciences)是甲状腺球蛋白铁蛋白过氧化氢酶醛缩酶和白蛋白用蓝色葡聚糖测量的空体积的保留时间t0为16.23分钟；用维生素B-12测定的总体积的保留时间fT为39.44分钟。由这些数值，如下计算给定蛋白质的分配系数Kd：Kd＝(te-t0)/(tT-t0)，te为给定蛋白质的保留时间。从Porath曲线及Laurent和Killander曲线得到非常相似的结果。三组重复实验的保留时间的不确定性平均起来为0.5％。对于Porath曲线及Laurent和Killander曲线两者的线性最小二乘方拟合的相关系数为r2＝0.97。
甘油梯度沉降：使纯化的pro-MMP-9样品(0.2mg)在4个装有10-45％甘油梯度(在GradientMaster BioCompTM中制备)的缓冲液的异质同晶聚合物管(polyallomer tube)中分层。然后将各管在SW41转子中于37,000rpm、4℃下离心63小时。然后将梯度液分级分离成0.5ml样品，通过明胶酶谱法(gelatin zymography)测定样品中存在的单体结构和其它寡聚体结构[Masure，S.，Proost，P.，Van Damme，J.和Opdenakker，G.(1991).Eur J Biochem.198，391-398]。合并含有均质单体结构的流分，经缓冲液透析除去过量甘油。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。
分析型超速离心：用配备An-50Ti转子的Beckman Optima XL-A分析型超速离心法进行沉降速度实验。实验在缓冲液C中于20℃进行。将蛋白质浓度为0.4mg/ml的样品加载到12mm光程吸收池中，以50,000rpm离心。每160秒钟记录280nm下的吸光度，采用在径向范围6-7.3cm内径向间距为0.001cm。
运用可供评价沉降系数的软件SEDFIT[Schuck，P.(2000).Biophys J.78，1606-1619]对沉降分布图进行了分析。分析了130条实验曲线，获得在该区分辨率为200步进，网格大小(grid size)为500点时介于0.3～50S之间沉降系数c(s)的分布。参数化法的置信水平设定为0.9。运用软件SEDNTERP[Laue，T.M.，Shah，B.D.，Ridgeway，T.M.和Pelletier，S.L.(1992).Analytical Ultracentrifugation in Biochemistryand Polymer Science(生物化学和聚合物学科中的分析型超速离心法)(Cambridge，U.K.：Royal Society of Chemistry)]估算溶剂密度(ρ)为1.0062g/cm3，粘度(η)为1.045cP。根据氨基酸和聚糖组成计算蛋白质微分比容为0.7328cm3/g，其中利用Kharakoz的氨基酸参数[Kharakoz，D.P.(1997).Biochemistry.36，10276-10285]。
用于AFM成像的胺官能化基底制备：针对与戊二醛相互作用的具有高浓度伯胺基对这些表面进行选择，其中戊二醛使蛋白质交联并与之结合。戊二醛与胺表面基团形成酰胺键。戊二醛的游离胺通过共价相互作用自发地使蛋白质与普遍存在于蛋白质外表面的胺基交联。因此，为了将蛋白质附加在该表面上，不需要工程改造或修饰。此外，该方法仅最低限度地干扰蛋白质构象的随机分布和在表面上的取向。
文献中简要描述了用于与蛋白质特异性结合的胺官能化基底的制备和表征(Veeco Metrology，Inc Santa Barbara，CA部分编号FSUB-11)。从抛光的<111>晶片(International Wafer Servive INC.-Denmark)上切下1cm2的硅片。通过等离子体增强化学气相沉积(4thState，LLC，Belmont，CA)，用胺封端的硅烷对硅片进行修饰，以制成胺官能化基底。在胺官能化之前和之后，采用具有单色Al k？X射线源的Kratos Axis Ultra(Kratos，Manchester，UK)在1486.6eV下，通过X射线光电子能谱法(X-ray Photoelectron Spectroscopy，XPS)对该基底的表面组成进行了分析。只在胺官能化之后，在XPS光谱中由氮峰表示的胺基存在于该表面上。通过应用轻敲模式的原子力显微镜(AFM)，在空气中用OTESP探头(VEECO)，测出经处理基底的均方根(RMS)表面糙度为采用辣根过氧化物酶(HRP)测定法测定胺官能化基底的结合潜力。通过戊二醛交联剂将HRP标记的抗体固定在胺官能化基底上。该基底经超声处理去除了所有未结合抗体，然后用SureBlueReserve TMB 1Component过氧化物酶底物(Kirkegaard和Perry Labs，Maryland)进行了分析。通过450nm下读取吸光度来测定结合活性。
蛋白质固定化方法：将胺化模具(aminized die)保持在4℃的干燥器中。临使用前，按照以下方法步骤通过戊二醛交联剂将pro-MMP-9固定在胺官能化基底上：将1.25％戊二醛的0.1M碳酸钠溶液(pH 9)在胺官能化基底上孵育过夜。然后，该基底用碳酸钠溶液充分漂洗以除去未结合的戊二醛。然后，将体积为100μl含有0.1mg/ml经分级分离含有单体形式的pro-MMP9ΔOG突变体或野生型pro-MMP-9的单分散溶液的样品，在该模具上孵育3小时。样品依次用2×200μl缓冲液和5×200μl Milli-Q水轻轻漂洗，最后在氮气流下干燥。戊二醛用作蛋白质与胺化表面的共价交联剂。这确保了在漂洗和后续成像期间蛋白质分子与表面的稳固连接。对于在缓冲液中进行的AFM实验，使样品保持连续水合。
SAXS曲线的从头建模：程序GASBOR[Svergun，D.I.，Petoukhov，M.V.和Koch，M.H.(2001).Biophys J 80，2946-2953]和CHADD[Petoukhov，M.V.，Eady，N.A.，Brown，K.A.和Svergun，D.I.(2002).Biophys J 83，3113-3125]用来生成低分辨模型。考虑pro-MMP-9上的糖基化，假设根据其电子密度和长度，单个聚糖相当于～1.6个氨基酸残基[Receveur，V.，Czjzek，M.，Schulein，M.，Panine，P.和Henrissat，B.(2002).J Biol Chem.277，40887-40892]。研究还发现，该值表示聚糖和残基的平均分子量之间的关系。然后根据以前表征过的氨基酸序列和聚糖组成，计算得出DR的总数[Van den Steen，P.E.，Van Aelst，I.，Hvidberg，V.，Piccard，H.，Fiten，P.，Jacobsen，C.，Moestrup，S.K.，Fry，S.，Royle，L.，Wormald，M.R.，Wallis，R.，Rudd，P.M.，Dwek，R.A.和Opdenakker，G.(2006).J Biol Chem.281，18626-18637]。
为了通过随机Monte-Carlo拟合程序检查模型与唯一方案的收敛性，生成用于各种方法的相同输入参数的若干模型。为了选出最可能的方案，利用DAMAVER[Volkov，V.V.和Svergun，D.I.(2003).Journalof Applied Crystallography 36，860-864]对模型进行了检查，并计算出平均归一化间隙差异(normalized spatial discrepancy，NSD)值(参见补充数据结果)。然后运用软件SUPCOMB[Kozin，M.B.和Svergun，D.I.(2001).Joumal of Applied Crystallography 34，33-41]，将末端结构域的晶体结构[Elkins，P.A.，Ho，Y.S.，Smith，W.W.，Janson，C.A.，D′Alessio，K.J.，McQueney，M.S.，Cummings，M.D.和Romanic，A.M.(2002).ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 58，1182-1192；Cha，H.，Kopetzki，E.，Huber，R.，Lanzendorfer，M.和Brandstetter，H.(2002).J Mol Biol 320，1065-1079]在代表性模型中进行对接。
溶胶原活性的原位酶谱分析法：通过将人纤维肉瘤HT1080(CCL-121；ATCC，Rockville，MD)细胞与60nM抗MMP9hr或用于对照的相应缓冲液以及450nM标记的胶原(作为分子内猝灭的Oregon绿标记的IV型胶原-Molecular probes公司)一起在37℃下孵育16小时，来进行原位酶谱分析[Deshane，2003]。胶原的降解产生绿色荧光，这表示净溶胶原活性。在成像之前，样品用Hoechst 33258(Molecularprobes公司)以3.8μg/ml的最终浓度染色用于核标记。检查样品，并用配备了Plan Fluor物镜的荧光显微镜(E600；Nikon，Tokyo，Japan)与CCD照相机(DMX1200F；Nikon)连接来拍照。实验重复进行6次。图像应用Adobe Photoshop(Adobe systems，San Jose，CA)进行编辑。
实施例1
单体形式的pro-MMP-9的分离和表征
pro-MMP-9单体的分子大小和形状测定、结构重构及单分子图像的分析都需要单分散的均质蛋白质样品。下面的实施例描述了结合各种方法来表达、分离和表征单体形式的pro-MMP-9。利用分子半径的表征来证实光谱形状测定。
结果
按以前报告的方法[19]，由杆状病毒感染的Sf9细胞表达重组pro-MMP-9并进行纯化(参见材料与方法)。该酶形成单体和其它较高寡聚体种类的混合物[20]。
图1B表示通过分析型大小排阻层析法(SEC)测定的pro-MMP-9单体与其寡聚体种类的相对分子比。层析图中主峰(3号)包含斯托克斯半径为的pro-MMP-9单体(见插图)。采用常规方法，根据相应的保留时间来测定斯托克斯半径。
通过甘油梯度沉降法[26]，实现从制备量的较高寡聚体种类中分离出pro-MMP-9单体。图1C表示各个流分的酶谱分析。将分离的单体流分进行分析型超速离心法(AUC)用于再次估算其斯托克斯半径(图1D)。在此沉降速度实验中，使均匀的pro-MMP-9溶液受重力场作用。这在弯液面附近造成溶质排空，并在排空区和均匀浓缩的沉积溶质之间形成鲜明的界线(图1D，插图)。可以测定这一界线的移动速率，由此测定沉降系数，进而测定有效大小和形状，沉降系数与颗粒质量成正比，与摩擦比成反比。
研究发现Pro-MMP-9单体作为单一种类沉降，其中主峰表示样品中91％总蛋白质的归一化沉降系数so 20，w为4.4S(图1D)。此值与最新的测量值一致[19]。利用计算出的微分比容为0.7328cm3/g，通过程序SEDNTERP[27]，用计算机计算得到斯托克斯半径为基于AUC的形状分析(利用实验性摩擦比)表示为椭圆形状，其a/b轴比为1∶6。通过AUC获得的分子半径结果与通过SEC获得的值一致。此外，使用pro-MMP-9分子质量及氨基酸和聚糖组成，通过SEDNTERP进行的半径理论估值，得到分子的当量球形半径为 此值与实验性斯托克斯半径的偏差再次说明为非球形形状，或为细长形或包含了空腔。
实施例2
通过小角度X射线散射(SAXS)进行的pro-MMP-9分子形状分析揭示了细长的三结构域结构
结果
通过SAXS对pro-MMP-9单体在溶液中的球形构象进行了研究。在SAXS中，由随机取向分子的总体(entire ensemble)得到散射图，产生有关其平均构象的信息(大约1纳米)。因此，SAXS不同于需要难以得到的大分子高品质晶体的晶体学结构分析法，是为数不多的研究溶液中蛋白质结构的技术之一。该方法利用因靶分子电子引起的入射X射线光子的弹性散射。分子中由原子排列支配的电子密度分布形成干涉图。然后，从散射图重构分子的三维形状[28]。
在对应于d-间距范围的动量传递范围 内，观察到散射强度(图2A)。较低值锁定了在测量中可获得的倒数第一位的分辨率。散射强度在小-q区中为线性(散射图见图2A)，通过Guinier定律进行精确拟合。观察到斜率与蛋白质浓度呈弱相关。这就意味着既不是聚集也不是颗粒间干涉对信号产生显著作用。通过测量得到的回转半径(Rg)为函数p(r)表示分子内原子间距离的分布(对分布函数-图2A，插图)。由得自p(r)的Rg开方(extraction of Rg from p(r))得出与之相当的数值这就表明准确的初步数据分析(在拟合方法之前)。最大原子间距离(Dmax)为p(r)的形状表示细长的椭圆体结构(参见例如[29-31])。
pro-MMP-9的三维重构模型运用程序GASBOR[32]和CHADD[33]获得。理论散射曲线模拟表示蛋白质残基的球形中心(或假残基)的三维排列，这些残基联合起来形成总体蛋白质形状。通过将模拟的理论曲线与实验数据重复拟合，来确定最终的蛋白质形状。CHADD的优势是利用获自可获得的分离结构域晶体结构的现有知识以将约束因素导入数据分析方法。相比之下，通过GASBOR生成的模型是在无任何现有知识的情况下计算出来的。CHADD与GASBOR之间的详细比较见下文实施例3。
图2B表示pro-MMP-9的三维重构结构。运用程序HYDROPRO[34]计算得到pro-MMP-9重建结构的斯托克斯半径。这一计算出的半径范围介于和之间，这与分别通过SEC和AUC得到的测量值和一致。此外，SAXS模型和AUC获得的轴比参数皆表明为细长形状。因此，由实验性SAXS图中复原的重构形状与由SEC和AUC两者获得的流体动力学测量数据一致。
这一结构的模拟曲线拟合分析见图2A(灰色曲线)。催化结构域前体α碳主链的定位在结构重构分析中用作约束条件，而OG和血红素结合蛋白样结构域采用CHADD重构。最后，运用软件SUPCOMB[35]，使催化结构域前体[22]和血红素结合蛋白样结构域[24]的晶体结构相继对接到等密度线上(图2B)。其余密度属于将两个末端结构域分隔开达的OG结构域。运用软件CRYSOL[36]，根据分离N端和C端结构域的晶体结构计算理论p(r)曲线，进一步验证了此值。计算出的这些结构域的Dmax值分别为和从全长pro-MMP-9的实验值减去这些值，进一步证实了其中末端结构域被分开的重构结构。
检查OG和血红素结合蛋白样结构域所占体积，表明了它们有同样的体积。然而，OG结构域(包括O-聚糖)的计算分子量却大约是血红素结合蛋白样结构域的一半。运用PONDR[37]对OG结构域进行的计算序列分析表明，该区比起其它结构域明显杂乱无序(图2C)。因此，尽管观察到其致密构象，但是该富含脯氨酸的OG结构域具有相对低密度的无序结构。因此，SAXS检测到OG结构域相对较大的电子密度，表示在溶液中由此接头肽保持的多种构象。这就表明OG接头结构域是柔性的。应用结构建模程序RAPPER[38、39]来生成可与所观察到的散射图和密度图相符的可能的接头构象。准确地讲，500种计算构象异构体中有8种符合接头的SAXS模型。计算得出(运用SAXS程序CRYSOL[36])总体pro-MMP-9模型结构的理论散射曲线。图2D和图2E表示同时符合pro-MMP-9的实验性散射曲线和SAXS密度图的最佳接头模型。OG接头似乎具有多个推定的松散构象。
实施例3
用于SAXS数据分析的建模软件的比较
结果
运用程序GASBOR[Svergun，D.I.，Petoukhov，M.V.和Koch，M.H.(2001).Biophys J 80，2946-2953]和CHADD[Petoukhov，M.V.，Eady，N.A.，Brown，K.A.和Svergun，D.I.(2002).Biophys J 83，3113-3125]生成pro-MMP-9的低分辨模型。两个程序通过使测量的散射曲线再现的球形散射中心的3D排列，给出蛋白质图像。CHADD的优势是利用了由分离结构域的晶体结构确定的一部分Cα定位的现有知识，同时分子的其余部分则是建模的，而GASBOR无需引用现有知识来对整个结构建模。在各个程序中，对若干独立计算结果进行比较以分析溶液结构的收敛性。
8次独立的GASBOR运行收敛到细长总体构象的唯一方案，其中一端尺寸较大，可容纳N端结构域的晶体结构，而另一端呈圆盘样形状，可以容纳C端结构域的晶体结构(图5A)。运用程序SUPCOMB[Kozin，M.B.和Svergun，D.I.(2001).Journal of Applied Crystallography34，33-41]，将末端结构域对接在GASBOR模型上。其余密度属于将末端结构域分隔达的OG结构域，视为OG结构域长度。8次计算内的归一化间隙差异(NSD)的范围为1.42～1.57。NSD值衡量了溶液结构之间的相似性：较低值对应于较好的重叠。运用DAMAVER[Petoukhov，M.V.和Svergun，D.I.(2003).Journal of AppliedCrystallography 36，540-544]，计算出NSD值，这还能够选出最可能的方案(χ2＝1.38)，并确定异常值。
在利用已知结构信息的替代性建模方案中，运用CHADD重构全长pro-MMP-9结构。对11次独立运行用计算机进行了计算，结果显示NSD值为1.59-1.75，而且没有异常值，这表明了各种方案收敛到单一模型。最可能的方案(χ2＝1.66)见图5B。该模型表明细长的三结构域结构，该结构显示带有圆盘样结构域的大双峰形状，通过相对低密度的OG结构域连接。运用软件SUPCOMB[Kozin，M.B.和Svergun，D.I.(2001).Journal of Applied Crystallography 34，33-41]，将催化结构域前体和血红素结合蛋白结构域的晶体结构相继对接在等密度线上。其余密度属于将两个末端结构域分隔开达的OG结构域，此值与通过CRYSOL计算的OG结构域理论尺寸十分相符。
通过两种独立的建模算法所获得的两种结构是若干计算结果收敛到唯一方案的结果。检验GASBOR和CHADD模型之间相似性得到的NSD值为1.68，这表明了模型之间十分一致。虽然GASBOR模型相当细长(OG结构域为而不是)，但是两个模型共同有着非常相似的特征，即通过接头连接的两个基本为球形的结构域(椭圆形N端通过OG接头与C端血红素结合蛋白连接)导致形成总体上细长的结构，该结构由两个基本球形的结构域通过接头连接组成。OG结构域的尺寸与CRYSOL计算值一致，且总体形状与AFM的相似性结果使本发明的发明人选择CHADD作为更可靠的模型。
实施例4
通过单分子成像对pro-MMP-9的形状和结构域柔性进行表征
结果
为了进一步证实SAXS分析，本发明的发明人设计了直接观察pro-MMP-9形状和评价其OG结构域的分子性质的实验，如图2B和图2E中的预测。准确地讲，本发明的发明人应用原子力显微镜(AFM)，对野生型pro-MMP-9和pro-MMP-9的OG缺失突变体(pro-MMP-9？OG)进行了单分子成像分析。在AFM成像之前，通过使蛋白质样品与Si(111)表面上胺修饰的硅烷化层交联，获得单一pro-MMP-9分子的可再现图像(图3)。
使样品在缓冲溶液中以及在空气中成像(图6A-C)。使用“尖钉”触头，以半干模式获得最佳图像。图3A-C表示固定在经修饰的Si(111)表面上的野生型pro-MMP-9的单分子图像。与所报告的SAXS分析结果一致，蛋白质图像具有细长的多结构域结构。表示高度与宽度的图像横切面(图3C)揭示两个间隔开的蛋白质结构域假定通过OG接头连接。相比之下，缺乏64个残基的OG结构域的pro-MMP-9？OG突变体有几分球形的形状，无可分辨的结构域间隔(图3D-F)。
实施例5
pro-MMP-9的原子力显微镜(AFM)成像的条件和对照的选择
结果
使样品在缓冲溶液中以及在空气中成像。虽然前一模式接近生理条件，但是图像质量差(图6A)。图像质量差可能由以下几个因素造成：(1)设计用于潮湿条件的触头比起用于环境条件的“尖钉”触头具有显著较大的半径。(2)完全水化的样品可能较软，较易在触头压力下变形。(3)蛋白质与表面的结合在完全水化条件下仍可能允许某种程度的移动。因此，为了改进图像质量，采用了环境条件，其中样品经漂洗后，通过2-3分钟轻缓的氮气流除去过量的水分。此步骤可在样品上留下薄薄的水化层，因此称为“半干模式”。为了检查在任何水化层不存在时蛋白质的形状，我们采用了彻底干燥法(图6B)，这使得精细特征丧失，蛋白质收缩，并导致横切面的图像噪声。
在这些半干测量中，主要困难是从假吸附物中获得不含人为产物(主要是盐沉积物)的样品。需要极充分的漂洗步骤以除去这些吸附物，但是同样会导致除去大量蛋白质。通过采用经胺修饰的硅烷表面和交联步骤，就可能制备除去几乎全部本底的表面(如空白操作所测定的一样)，同时又保持了可观的蛋白质表面浓度，与在完全水化条件下所观察到的类似。在与样品相同条件但是没有pro-MMP-9时孵育制备的空白对照(图6C)，通常在1μm2图像上含有的特征不超过一个。与具有pro-MMP-9的样品进行的比较表明，平均起来5％以下所观察到的特征可能是由碎片或无水盐分所引起的人为产物。
AFM图像的统计学分析：对野生型pro-MMP-9和pro-MMP-9？OG的高度、宽度和波瓣间距离(lobe-to-lobe distance)进行了统计学分析。这些数据在图4A-E中用直方图表示，并概括于下面的表1中。因为两个亚群的存在可能对平均值造成偏差，因此只报告了最可能的值。括号内为标准差。数值相当于野生型pro-MMP-9(n＝90)和pro-MMP-9ΔOG突变体(n＝120)。测量了XZ横切面上各峰之间的波瓣间距离。只有当蛋白质在表面上的取向可供鉴定两个截然不同的结构域时，才能推导出(extract)该值(n＝83)。pro-MMP-9ΔOG中波瓣之间的间距可能无法区别开。
表1
  野生型   Pro-MMP-9Δ0G
  高度   34(7.5)   22(2.9)
  宽度   190(33)   130(13)
  波瓣-波瓣   78(9.5)   N/A
对于野生型和突变型，最可能的高度值分别为和对从晶体结构推导出的可能的高度值进行的比较[Elkins，P.A.，Ho，Y.S.，Smith，W.W.，Janson，C.A.，D′Alessio，K.J.，McQueney，M.S.，Cummings，M.D.和Romanic，A.M.(2002).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58，1182-1192；Cha，H.，Kopetzki，E.，Huber，R.，Lanzendorfer，M.和Brandstetter，H.(2002).J Mol Biol 320，1065-1079]，表明蛋白质图像变平，这可能是由与表面相互作用或者在AFM触头下结构的某些压缩造成的。图4A直方图的图形显示，野生型蛋白质分布成两个亚群，与OG缺失突变体(图4B)不同，OG缺失突变体在分布上具有单一峰值。对于野生型(图4C)和pro-MMP-9？OG(图4D)，最可能的宽度值分别为和这种差别表明，OG结构域对野生型蛋白质宽度的影响十分明显。由于蛋白质与表面的不同结合构型，因此预期在高度和宽度值上有某种扩展。因为蛋白质不是球形的，使其中长轴按相对于曲面法线不同角度定向的结合状态将导致不同的最大高度和最大宽度，正如通过AFM所测量的一样。因此，高度可能以该角度的余弦变化，宽度则以正弦变化。
对于野生型pro-MMP-9最可能的波瓣间距离值为(图4E)。这个距离不亚于通过SAXS获得的波瓣间数值。得自SAXS模型的可能值的范围为这取决于各个结构域的允许取向。
实施例6
单分子成像统计学分析与SAXS联用揭示蛋白质结构域柔性由0G结构域介导
结果
对两种酶进行对比的一个突出特征是，野生型的宽度值和高度值的扩展明显大于突变体(图4A-E)。这种差异可能起因于OG结构域给野生型结构提供额外的自由度，与其中两个波瓣较受限制的突变体不同。大小不均匀由以下两个主要变量引起：蛋白质在表面上的不同取向和不同的蛋白质构象。因为突变体不含OG结构域，所以构象不均匀性降低，这意味着数值扩展主要由在表面上的不同取向造成。
在图4E中清楚观察到OG结构域对蛋白质柔性的影响，图中报告了波瓣间距离的测量值。距离扩展范围为并可分成两个亚群。显然，这些结果支持由OG结构域的柔性分子性质介导的多种酶构象的存在。图4F表示基于推导出的波瓣间距离的各种蛋白质构象的某些可能模型。允许波瓣间距离在1个标准差内变化。运用结构建模程序RAPPER[38、39]，计算得出图4F中所表示的不同OG结构域构象。
通过这种新的分子分析法检测的pro-MMP-9的蛋白质柔性，可供了解新分子的总体结构和该酶的动力学，突出了pro-MMP-9优于MMP家族其它成员(包括明胶酶A/MMP-2)的结构-功能独特性[21]。例如，在胶原酶-1/MMP-1中，短得多的接头区的柔性因血红素结合蛋白结构域与结构域前体之间的相互作用而受更多限制[40]。同样，在MMP-2中血红素结合蛋白结构域的第二片(blade)通过氢键与纤连蛋白结构域相连接(Morgunova等，Science 1999)。
实施例7
蛋白质结构域柔性在pro-MMP-9酶促功能中的作用
结果
MMP-9是一种分泌酶，尚不清楚它是如何靶向正确位置以及如何控制其在细胞周围空间中的活性[41]。准确地讲，尚不清楚催化期间各个结构域在介导有效的蛋白质-底物和蛋白质-蛋白质相互作用中起什么样的作用。本文报告的pro-MMP-9全长结构提出了对了解该酶结构及其明显的结构域柔性方面的新见解。具体地讲，所报告的结果提出了在MMP-9中观察到的蛋白质柔性是介导其功能所必需的可能性。
早期研究曾假定OG结构域的贡献是作为允许末端结构域独立移动的间隔部分(spacer moiety)[19、42、43]。有趣的是，所有可利用的数据库的生物信息学“BLAST”检索[44、45]全都表明，pro-MMP-9中的OG结构域与多种细胞表面缔合蛋白和ECM结合蛋白中类似的无序结构域同源(参见下表2)。表2所报告的结果在于超过默认E-值阈值。同一性和相似性数值的单位为百分比。
表2
  蛋白质名称   生物   同一性   相似性
  表面蛋白锚定区   革兰氏阳性球菌   42   62
  外膜受体蛋白，大多数为Fe转运蛋白   流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)   43   51
  血红蛋白结合蛋白   流感嗜血菌   42   50
  纤维素结合蛋白B   溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)   45   52
  胶原黏着蛋白 苏云金芽孢杆菌以色列血清型(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)   36   44
引人注目的是，pro-MMP-9与真菌纤维素酶的OG接头和总体结构域组构之间存在密切的结构同源性[29、31]，为此提出接头在纤维素酶中的作用是介导蛋白质-纤维素结合以及酶在完整基质中迁移。这就表明了pro-MMP-9通过细胞表面缔合和/或与固相底物(例如ECM)相互作用来介导其生物功能和酶活性。最近，Owen等人描述了TIMP-1-抗MMP-9在嗜中性粒细胞的细胞表面上的活性[46]。实现使MMP-9血红素结合蛋白结构域与细胞连接的一种方法可能是通过细胞表面上MT6-MMP/TIMP-1复合物进行相互作用。现有数据表明，OG结构域柔性允许MMP-9的N端接近细胞周围环境中的复合物底物网(complex substrate network)(例如胶原样分子)。可通过存在于MMP-9OG结构域上富含脯氨酸的序列[47]介导的非特异性蛋白质-蛋白质相互作用，实现这类蛋白质-底物相互作用的稳定化。相比之下，pro-MMP-9中血红素结合蛋白样结构域和纤连蛋白结构域则显示出与底物按化学计量结合并具有高亲和力[48、49]。这就表明了pto-MMP-9通过与其底物的特异性和非特异性相互作用介导其催化活性。在这个分子设想中，两个末端结构域可提供底物特异性，而OG柔性结构域则用来通过弱的非特异性相互作用破坏例如胶原型底物三级结构的稳定。
重要的是，与TIMP-1、LRP-1和巨蛋白正确的相互作用需要OG结构域参与才能实现血红素结合蛋白样结构域和催化结构域的适当取向[19]。OG缺失突变体显示对这些分子的亲和力降低，这就表明了OG结构域对于调节活性MMP-9的生物利用度必不可少。虽然单分子成像结果表明末端结构域间距并非恒定不变，但是正如通过SAXS模型重构所获得的OG结构域的准球形形状，确保了两个结构域间的最小间距，这就允许调节剂与C端结构域结合而无来自N端催化结构域的位阻。MMP-2中没有观察到这类结构域柔性。这可以解释为什么MMP-9可与LRP-1直接结合，而MMP-2需要与TIMP-2[50]或与血小板反应蛋白[51]形成前体复合物才实现与LRP-1的有效结合。
为了检验OG结构域在MMP-9的溶胶原活性中的作用，进行了原位抑制实验。使用抗MMP-9-绞链区(得自Sigma、Chemicon和Abcam公司等三个不同销售商的抗MMP-9hr)。这种市售抗体是针对OG结构域内的肽产生的。所使用的底物是在降解时显示荧光增强的荧光标记的IV型胶原。图7A-B表示通过阻碍OG结构域柔性或通过破坏如原位酶谱所表示的酶-底物接触的空间位阻，来减量调节溶胶原活性的抗体。
将荧光标记的IV型胶原覆盖在MMP-2/9生成细胞HT-1080上。由该细胞系产生的MMP-2和MMP-9均能够降解IV型胶原，然而研究显示，纯化的MMP中超过70％是MMP-9，针对IV型胶原的比活是MMP-2的4倍。用抗MMP-9hr(图7A)或不用抗MMP-9hr(图7B)检测了细胞周围的溶胶原活性。在加入抗MMP-9hr时，比起参比的扩散活性，溶胶原活性受到较多限制。
总之，可以假定影响OG结构域降低了溶胶原功效，而溶明胶活性不受影响。
结论
本研究是通过结构分析法的新组合揭示全长人pro-MMP-9的首次实验性结构测定法。利用单分子成像和SAXS联用，推导出完整的分子模型，可供深入了解这个重要酶的结构和动力学特征。引人注目的是，本发明的结果证实了桥接催化酶核心与血红素结合蛋白结构域的柔性松散OG结构域的存在。该结构赋予pro-MMP-9相对于其它家族成员的独特结构域结构。可利用这种结构专一性设计MMP-9的同工型选择性抑制剂。MMP-9调节剂的设计可以靶定限制其结构域柔性，这可在特定疾病中阻断MMP-9的病理活性。
应当理解的是，为了清楚起见，在不同实施方案内容中描述的本发明的某些特征，同样也可合并起来在一个实施方案中提供。相反，为简明起见，在一个实施方案内容中描述的本发明的各种特征，同样也可单独或以任何合适的再合并方式予以提供。
尽管本发明结合其具体的实施方案加以描述，但是显然许多替换、修改和变动对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明包括所有落入所附权利要求书精神和大范围中的这些替换、修改和变动。本说明书所提及的所有出版物、专利、专利申请和GenBank检索号都通过引用全部结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利或专利申请或GenBank检索号具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请中，任何参考文献的引用或标识都不得解释为承认这样的参考文献都可作为本发明的现有技术获得。
参考文献
1.Stetler-Stevenson，W.G.，Aznavoorian，S.和Liotta，L.A.(1993).Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion andmetastasis(肿瘤细胞在侵袭和转移期间与胞外基质的相互作用).AnnuRev Cell Biol.9，541-573。
2.Werb，Z.和Chin，J.R.(1998).Extracellular matrix remodelingduring morphogenesis(形态发生期间的胞外基质重塑).Ann N Y AcadSci.857，110-118。
3.Wolf，K.，Mazo，I.，Leung，H.，Engelke，K.，von Andrian，U.H.，Deryugina，E.I.，Strongin，A.Y.，Brocker，E.B.和Friedl，P.(2003).Compensation mechanism in tumor cell migration：mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis(肿瘤细胞迁移中的代偿机制：阻断细胞周围的蛋白水解之后的间充质-似变形虫转换).J Cell Biol.160，267-277。
4.Maskos，K.(2005).Crystal structures of MMPs in complex withphysiological and pharmacological inhibitors(MMP在与生理和药理抑制剂的复合物中的晶体结构).Biochimie 87，249-263。
5.Agrawal，S.，Anderson，P.，Durbeej，M.，van Rooijen，N.，Ivars，F.，Opdenakker，G.和Sorokin，L.M.(2006).Dystroglycan is selectivelycleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyteextravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis(在实验性自身免疫性脑脊髓炎中，营养不良蛋白聚糖在白细胞外渗部位的实质基底膜上被选择性切割).J Exp Med.203，1007-1019。
6.Liu，Z.，Shipley，J.M.，Vu，T.H.，Zhou，X.，Diaz，L.A.，Werb，Z.和Senior，R.M.(1998).Gelatinase B-deficient mice are resistant toexperimental bullous pemphigoid(明胶酶B缺陷型小鼠对实验性大疱性类天疱疮具有抗性).J Exp Med.188，475-482。
7.Opdenakker，G.，Nelissen，I.和Van Damme，J.(2003).Functionalroles and therapeutic targeting of gelatinase B and chemokines in multiplesclerosis(多发性硬化中明胶酶B和趋化因子的功能作用和治疗靶向).Lancet Neurol.2，747-756。
8.Van den Steen，P.E.，Proost，P.，Brand，D.D.，Kang，A.H.，VanDamme，J.和Opdenakker，G.(2004).Generation of glycosylated remnantepitopes from human collagen type II by gelatinase B(通过明胶酶B由人II型胶原产生糖基化残余表位).Biochemistry 43，10809-10816。
9.Liu，Z.，Zhou，X.，Shapiro，S.D.，Shipley，J.M.，Twining，S.S.，Diaz，L.A.，Senior，R.M.和Werb，Z.(2000).The serpin alphal-proteinaseinhibitor is a critical substrate for gelatinase B/MMP-9in vivo(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白α1-蛋白酶抑制剂是体内明胶酶B/MMP-9的关键底物).Cell.102，647-655。
10.Van den Steen，P.E.，Proost，P.，Wuyts，A.，Van Damme，J.和Opdenakker，G.(2000).Neutrophil gelatinase B potentiates interleukin-8tenfold by aminoterminal processing，whereas it degrades CTAP-III，PF-4，and GRO-alpha and leaves RANTES and MCP-2intact(嗜中性粒细胞明胶酶B通过氨基端加工使白介素-8效能增加10倍，却降解CTAP-III、PF-4和GRO-α并保留RANTES和MCP-2完整).Blood.96，2673-2681。
11.Heissig，B.，Hattori，K.，Dias，S.，Friedrich，M.，Ferris，B.，Hackett，N.R.，Crystal，R.G.，Besmer，P.，Lyden，D.，Moore，M.A.，Werb，Z.和Rafii，S.(2002).Recruitment of stem and progenitor cells from thebone marrow niche requires MMP-9mediated release of kit-ligand(得自骨髓龛的干细胞和祖细胞的募集需要MMP-9介导的kit-配体的释放).Cell.109，625-637。
12.Nelissen，I.，Martens，E.，Van den Steen，P.E.，Proost，P.，Ronsse，I.和Opdenakker，G.(2003).Gelatinase B/matrix metalloproteinase-9cleaves interferon-beta and is a target for immunotherapy(明胶酶B/基质金属蛋白酶-9切割干扰素-β并且是免疫疗法的靶标).Brain.126，1371-1381。
13.Yu，Q.和Stamenkovic，I.(2000).Cell surface-localized matrixmetalloproteinase-9proteolytically activates TGF-beta and promotestumor invasion and angiogenesis(定位于细胞表面的基质金属蛋白酶-9蛋白水解性地激活TGF-β并促进肿瘤侵袭和血管生成).Genes Dev.14，163-176。
14.McQuibban，G.A.，Gong，J.H.，Tam，E.M.，McCulloch，C.A.，Clark-Lewis，I.和Overall，C.M.(2000).Inflammation dampened bygelatinase A cleavage of monocyte chemoattractant protein-3(通过明胶酶A切割单核细胞化学引诱物蛋白-3来抑制炎症).Science 289，1202-1206。
15.Monaco，S.，Sparano，V.，Gioia，M.，Sbardella，D.，Di Pierro，D.，Marini，S.和Coletta，M.(2006).Enzymatic processing of collagen IV byMMP-2(gelatinase A)affects neutrophil migration and it is modulated byextracatalytic domains(通过MMP-2(明胶酶A)对IV型胶原进行酶加工影响嗜中性粒细胞迁移且酶加工受催化外结构域调节).Protein Sci15，2805-2815。
16.Itoh，T.，Matsuda，H.，Tanioka，M.，Kuwabara，K.，Itohara，S.和Suzuki，R.(2002).The role of matrix metalloproteinase-2and matrixmetalloproteinase-9in antibody-induced arthritis(基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9在抗体诱导的关节炎中的作用).J Immunol 169，2643-2647。
17.Garg，P.，Rojas，M.，Ravi，A.，Bockbrader，K.，Epstein，S.，Vijay-Kumar，M。，Gewirtz，A.T.，Merlin，D.和Sitaraman，S.V.(2006).Selective ablation of matrix metalloproteinase-2exacerbates experimentalcolitis：contrasting role of gelatinases in the pathogenesis of colitis(选择性切除基质金属蛋白酶-2加重实验性结肠炎：明胶酶在结肠炎发病机制中的对比作用).J Immunol 177，4103-4112。
18.Opdenakker，G.，Van den Steen，P.E.和Van Damme，J.(2001).Gelatinase B：a tuner and amplifier of immune functions(明胶酶B：免疫功能的调节器和放大器).Trends Immunol.22，571-579。
19.Van den Steen，P.E.，Van Aelst，I.，Hvidberg，V.，Piccard，H.，Fiten，P.，Jacobsen，C.，Moestrup，S.K.，Fry，S.，Royle，L.，Wormald，M.R.，Wallis，R.，Rudd，P.M.，Dwek，R.A.和Opdenakker，G.(2006).Thehemopexin and O-glycosylated domains tune gelatinase B/MMP-9bioavailability via inhibition and binding to cargo receptors(血红素结合蛋白和O-糖基化结构域通过抑制和结合运货受体调节明胶酶B/MMP-9生物利用度).J Biol Chem.281，18626-18637。
20.Wilhelm，S.M.，Collier，I.E.，Marmer，B.L.，Eisen，A.Z.，Grant，G.A.和Goldberg，G.I.(1989).SV40-transformed human lung fibroblastssecrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted bynormal human macrophages(SV40转化的人肺成纤维细胞分泌的92-kDa IV型胶原酶与正常人巨噬细胞分泌的相同).J Biol Chem 264，17213-17221。
21.Morgunova，E.，Tuuttila，A.，Bergmann，U.，Isupov，M.，Lindqvist，Y.，Schneider，G.和Tryggvason，K.(1999).Structure of humanpro-matrix metalloproteinase-2：activation mechanism revealed(人基质金属蛋白酶-2前体的结构：所揭示的活化机制).Science.284，1667-1670。
22.Elkins，P.A.，Ho，Y.S.，Smith，W.W.，Janson，C.A.，D′Alessio，K.J.，McQueney，M.S.，Cummings，M.D.和Romanic，A.M.(2002).Structure of the C-terminally truncated human ProMMP9，agelatin-binding matrix metalloproteinase(C端截短的人ProMMP9，明胶结合基质金属蛋白酶的结构).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58，1182-1192。
23.Stocker，W.和Bode，W.(1995).Structural features of asuperfamily of zinc-endopeptidases：the metzincins(锌-内肽酶超家族的结构特征：metzincin).Curr Opin Struct Biol.5，383-390。
24.Cha，H.，Kopetzki，E.，Huber，R.，Lanzendorfer，M.和Brandstetter，H.(2002).Structural basis of the adaptive molecularrecognition by MMP9.(通过MMP9的适应性分子识别的结构基础)JMol Biol 320，1065-1079。
25.Van den Steen，P.E.，Opdenakker，G.，Wormald，M.R.，Dwek，R.A.和Rudd，P.M.(2001).Matrix remodelling enzymes，the proteasecascade and glycosylation(基质重塑酶、蛋白酶级联和糖基化作用).Biochim Biophys Acta 1528，61-73。
26.Olson，M.W.，Bernardo，M.M.，Pietila，M.，Gervasi，D.C.，Toth，M.，Kotra，L.P.，Massova，I.，Mobashery，S.和Fridman，R.(2000).Characterization of the monomeric and dimeric forms of latent and activematrix metalloproteinase-9.Differentialrates for activation by stromelysin1(潜隐型和活性基质金属蛋白酶-9的单体和二聚体形式的表征。由溶基质蛋白酶1激活的差别速率).J.Biol.Chem.275，2661-2668。
27.Laue，T.M.，Shah，B.D.，Ridgeway，T.M.和Pelletier，S.L.(1992).Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science(生物化学和聚合物学科中的分析型超速离心法)(Cambridge，U.K.：RoyalSociety of Chemistry)。
28.Svergun，D.I.和Koch，M.H.(2002).Advances in structureanalysis using small-angle scattering in solution(在溶液中采用小角度散射的结构分析的进展).Curr Opin Struct Biol 12，654-660。
29.Receveur，V.，Czjzek，M.，Schulein，M.，Panine，P.和Henrissat，B.(2002).Dimension，shape，and conformational flexibility of a twodomain fungal cellulase in solution probed by small angle X-rayscatterings(通过小角度X射线散射探测两结构域真菌纤维素酶在溶液中的大小、形状和构象柔性).J Biol Chem.277，40887-40892。
30.Violot，S.，Aghajari，N.，Czjzek，M.，Feller，G.，Sonan，G.K.，Gouet，P.，Gerday，C.，Haser，R.和Receveur-Brechot，V.(2005).Structureof a full length psychrophilic cellulase from Pseudoalteromonashaloplanktis revealed by X-ray diffraction and small angle X-rayscattering(通过X射线衍射和小角度X射线散射揭示游海假交替单胞菌的全长嗜冷菌纤维素酶的结构).J Mol Biol.348，1211-1224。
31.von Ossowski，I.，Eaton，J.T.，Czjzek，M.，Perkins，S.J.，Frandsen，T.P.，Schulein，M.，Panine，P.，Henrissat，B.和Receveur-Brechot，V.(2005).Protein disorder：conformational distribution of the flexible linkerin a chimeric double cellulase(蛋白质无序结构：嵌合双重纤维素酶中柔性接头的构象分布).Biophys J.88，2823-2832。
32.Svergun，D.I.，Petoukhov，M.V.和Koch，M.H.(2001).Determination of domain structure of proteins from X-ray solutionscattering(由X射线溶液散射测定蛋白质的结构域结构).Biophys J 80，2946-2953。
33.Petoukhov，M.V.，Eady，N.A.，Brown，K.A.和Svergun，D.I.(2002).Addition of missing loops and domains to protein models by x-raysolution scattering(通过X射线溶液散射将缺失的环和结构域加到蛋白质模型中).Biophys J 83，3113-3125。
34.Garcia De La Torre，J.，Huertas，M.L.和Carrasco，B.(2000).Calculation of hydrodynamic properties of globular proteins from theiratomic-level structure(由球形蛋白质的原子水平结构计算其流体动力学特性).Biophys J.78，719-730。
35.Kozin，M.B.和Svergun，D.I.(2001).Automated matching ofhigh-and low-resolution structural models(高分辨和低分辨结构模型的自动化匹配).Journal of Applied Crystallography 34，33-41。
36.Svergun，D.，Barberato，C.和Koch，M.H.J.(1995).CRYSOL-Aprogram to evaluate x-ray solution scattering of biologicalmacromolecules from atomic coordinates(CRYSOL--一种从原子坐标评价生物大分子的X射线溶液散射的程序).Journal of AppliedCrystallography 28，768-773。
37.Li，X.，Romero，P.，Rani，M.，Dunker，A.K.和Obradovic，Z.(1999).Predicting protein disorder for N-，C-，and internal regions(N区、C区和内部区蛋白质无序结构的预测).Genome Informatics 10，30-40。
38.DePristo，M.A.，de Bakker，P.I.，Lovell，S.C.和Blundell，T.L.(2003).Ab initio construction of polypeptide fragments：efficientgeneration of accurate，representative ensembles(多肽片段的从头构建：有效生成精确的代表性整体).Proteins.51，41-55。
39.DePristo，M.A.，De Bakker，P.I.，Shetty，R.P.和Blundell，T.L.(2003).Discrete restraint-based protein modeling and the Calpha-traceproblem(基于离散约束的蛋白质建模和Cα示踪问题).Protein Sci.12，2032-2046。
40.Lauer-Fields，J.L.，Juska，D.和Fields，G.B.(2002).Matrixmetalloproteinases and collagen catabolism(基质金属蛋白酶与胶原分解代谢).Biopolymers.66，19-32。
41.Fridman，R.，Toth，M.，Chvyrkova，I.，Meroueh，S.O.和Mobashery，S.(2003).Cell surface association of matrixmetalloproteinase-9(gelatinase B)(基质金属蛋白酶-9(明胶酶B)的细胞表面缔合).Cancer Metastasis Rev.22，153-166。
42.Overall，C.M.(2002).Molecular determinants ofmetalloproteinase substrate specificity：matrix metalloproteinase substratebinding domains，modules，and exosites(金属蛋白酶底物特异性的分子决定因子：基质金属蛋白酶底物结合结构域、模件和外结合位点).MolBiotechnol 22，51-86。
43.Rudd，P.M.，Mattu，T.S.，Masure，S.，Bratt，T.，Van den Steen，P.E.，Wormald，M.R.，Kuster，B.，Harvey，D.J.，Borregaard，N.，VanDamme，J.，Dwek，R.A.和Opdenakker，G.(1999).Glycosylation ofnatural human neutrophil gelatinase B and neutrophil gelatinaseB-associated lipocalin(天然人嗜中性粒细胞明胶酶B和嗜中性粒细胞明胶酶B相关脂笼蛋白的糖基化).Biochemistry 38，13937-13950。
44.Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997).Gapped BLAST and PSI-BLAST：anew generation of protein database search programs(Gapped BLAST和PSI-BLAST：一种新出现的蛋白质数据库检索程序).Nucleic Acids Res.25，3389-3402。
45.Schaffer，A.A.，Aravind，L.，Madden，T.L.，Shavirin，S.，Spouge，J.L.，Wolf，Y.I.，Koonin，E.V.和Altschul，S.F.(2001).Improving theaccuracy of PSI-BLAST protein database searches withcomposition-based statistics and other refinements(利用基于组成的统计学和其它精修提高PSI-BLAST蛋白质数据库检索的准确性).NucleicAcids Res.29，2994-3005。
46.Owen，C.A.，Hu，Z.，Barrick，B.和Shapiro，S.D.(2003).Inducible expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-resistantmatrix metalloproteinase-9on the cell surface of neutrophils(金属蛋白酶抗性基质金属蛋白酶-9的组织抑制物在嗜中性粒细胞的细胞表面上的诱导型表达).Am J Respir Cell Mol Biol.29，283-294。
47.Williamson，M.P.(1994).The structure and function ofproline-rich regions in proteins(蛋白质中富含脯氨酸的区域的结构和功能).Biochem J.297，249-260。
48.Collier，I.E.，Krasnov，P.A.，Strongin，A.Y.，Birkedal-Hansen，H.和Goldberg，G.I.(1992).Alanine scanning mutagenesis and functionalanalysis of the fibronectin-like collagen-binding domain from human92-kDa type IV collagenase(得自人92-kDa IV型胶原酶的纤连蛋白样胶原结合结构域的丙氨酸分区诱变和功能分析).J Biol Chem.267，6776-6781。
49.Roeb，E.，Schleinkofer，K.，Kernebeck，T.，Potsch，S.，Jansen，B.，Behrmann，I.，Matern，S.和Grotzinger，J.(2002).The matrixmetalloproteinase 9(mmp-9)hemopexin domain is a novel gelatinbinding domain and acts as an antagonist(基质金属蛋白酶9(mmp-9)血红素结合蛋白结构域是一种新的明胶结合结构域并用作拮抗剂).JBiol Chem.277，50326-50332。
50.Emonard，H.，Bellon，G.，Troeberg，L.，Berton，A.，Robinet，A.，Henriet，P.，Marbaix，E.，Kirkegaard，K.，Patthy，L.，Eeckhout，Y.，Nagase，H.，Hornebeck，W.和Courtoy，P.J.(2004).Low density lipoproteinreceptor-related protein mediates endocytic clearance ofpro-MMP-2.TIMP-2complex through a thrombospondin-independentmechanism(低密度脂蛋白受体相关蛋白通过不依赖血小板反应蛋白的机制介导pro-MMP-2.TIMP-2复合物的胞吞清除).J Biol Chem 279，54944-54951。
51.Yang，Z.，Strickland，D.K.和Bornstein，P.(2001).Extracellularmatrix metalloproteinase 2levels are regulated by the low densitylipoprotein-related scavenger receptor and thrombospondin 2(胞外基质金属蛋白酶2水平受低密度脂蛋白相关清除受体和血小板反应蛋白2的调节).J Biol Chem 276，8403-8408。
52.Masure，S.，Proost，P.，Van Damme，J.和Opdenakker，G.(1991).Purification and identification of 91-kDa neutrophil gelatinase.Release bythe activating peptide interleukin-8(91-kDa嗜中性粒细胞明胶酶的纯化和鉴定。通过激活白介素-8这种肽而释放).Eur J Biochem.198，391-398。
53.Towns-Andrews，E.，Berry，A.，Bordas，J.，Mant，G.R.，Murray，P.K.，Roberts，K.，Sumner，I.，Worgan，J.S.，Lewis，R.和A.，G.(1989).Time-resolved X-ray-diffraction station-X-ray optics，detectors和dataacquisition(时间分辨X射线衍射工作站--X射线光学装置、检测器与数据采集).Rev Sci Instrum 60，2346-2349。
54.Guinier，A.和Fournet，G.(1955).Small-angle scattering ofX-rays(X射线的小角度散射)(New York：John Wiley & Sons，Inc.)。
55.Svergun，D.I.(1992).Determination  of the  RegularizationParameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria(利用感知标准在间接转化方法中测定调整参数).Journal of AppliedCrystallography 25，495-503。
56.Ackerman，C.J.，Harnett，M.M.，Harnett，W.，Kelly，S.M.，Svergun，D.I.和Byron，O.(2003).19A solution structure ofthe filarialnematode immunomodulatory protein，ES-62(19丝虫免疫调节蛋白的溶液结构，ES-62).Biophys J.84，489-500。
57.Siegel，L.M.和Monty，K.J.(1966).Determination of molecularweights and frictional ratios of proteins in impure systems by use of gelfiltration and density gradient centrifugation.Application to crudepreparations of sulfite and hydroxylamine reductases(采用凝胶过滤和密度梯度离心测定杂质系统中蛋白质的分子量和摩擦比。应用于亚硫酸盐还原酶和羟胺还原酶的粗制备物).Biochim Biophys Acta 112，346-362。

Claims (8)

1.一种鉴定能够调节MMP-9的溶胶原活性的调节物的方法，该方法包括确定该调节物是否能够与MMP-9的OG结构域进行相互作用，所述调节物是推定的MMP-9溶胶原活性的调节剂。
2.权利要求1的方法，其中所述确定是通过将所述调节物的结构与MMP-9的OG结构域的结构进行比较来实现的。
3.权利要求1的方法，其中所述确定是通过使所述调节物与分离的MMP-9的OG结构域接触来实现的。
4.权利要求1的方法，其中所述调节物包括多肽。
5.权利要求4的方法，其中所述多肽包括抗体。
6.权利要求1的方法，其中所述调节物包括小分子。
7.与MMP-9的OG结构域进行特异性相互作用并且减量调节所述MMP-9溶胶原活性的抗体在制备用于治疗癌症或炎症性疾病的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述抗体是人源化抗体。
CN200880112385.3A 2007-08-15 2008-08-07 Mmp-9的调节剂及其用途 Expired - Fee Related CN102083455B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93548607P 2007-08-15 2007-08-15
US60/935486 2007-08-15
PCT/IL2008/001082 WO2009022328A2 (en) 2007-08-15 2008-08-07 Regulators of mmp-9 and uses therof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102083455A CN102083455A (zh) 2011-06-01
CN102083455B true CN102083455B (zh) 2015-01-07

Family

ID=40351257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880112385.3A Expired - Fee Related CN102083455B (zh) 2007-08-15 2008-08-07 Mmp-9的调节剂及其用途

Country Status (14)

Country Link
US (3) US20110052572A1 (zh)
EP (2) EP2581445B1 (zh)
JP (1) JP2010536744A (zh)
KR (1) KR20100071972A (zh)
CN (1) CN102083455B (zh)
AU (1) AU2008288082B2 (zh)
BR (1) BRPI0814479A2 (zh)
CA (1) CA2695969A1 (zh)
DK (1) DK2185175T3 (zh)
ES (1) ES2406105T3 (zh)
IL (1) IL222302A (zh)
MX (1) MX2010001657A (zh)
RU (1) RU2474433C2 (zh)
WO (1) WO2009022328A2 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110052572A1 (en) 2007-08-15 2011-03-03 Yeda Research And Development Co. Ltd Regulators of mmp-9 and uses therof
WO2009111450A2 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins
SG188224A1 (en) 2010-08-27 2013-04-30 Gilead Biologics Inc Antibodies to matrix metalloproteinase 9
JP5814800B2 (ja) * 2011-12-28 2015-11-17 株式会社Ｌｓｉメディエンス 神経変性疾患の検出方法
SG10201610788VA (en) 2012-02-29 2017-03-30 Gilead Biologics Inc Antibodies to matrix metalloproteinase 9
WO2014006123A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-biotin antibodies and methods of use
EP2869848B1 (en) 2012-07-04 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked antigen-antibody conjugates
BR112014030843A2 (pt) 2012-07-04 2019-10-15 Hoffmann La Roche anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
CA2930046A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
EP3089758B1 (en) 2014-01-03 2021-01-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
CN105899540B (zh) 2014-01-03 2020-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用
CN107106683B (zh) * 2015-01-16 2021-07-20 中央研究院 含靶向与效应组件的分子构建体
WO2020005891A1 (en) * 2018-06-25 2020-01-02 University Of Southern California Compositions and methods for ameliorating tissue injury, enhancing liver regeneration and stem cell therapies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000020860A1 (en) * 1998-10-08 2000-04-13 Calbiochem Novabiochem Corporation Diagnostic assay for matrix metalloproteinase 9 and use thereof
WO2003006006A1 (en) * 2001-07-09 2003-01-23 The Regents Of The University Of California Use of matrix metalloproteinase inhibitors to mitigate nerve damage
WO2003075765A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Biospecific contrast agents

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5189178A (en) 1990-11-21 1993-02-23 Galardy Richard E Matrix metalloprotease inhibitors
US5239078A (en) 1990-11-21 1993-08-24 Glycomed Incorporated Matrix metalloprotease inhibitors
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US6544761B2 (en) * 1994-12-13 2003-04-08 Human Genome Sciences, Inc. Human tissue inhibitor of metalloproteinase-4
WO1997000449A1 (en) * 1995-06-14 1997-01-03 Aberdeen University Prognostic and therapeutic system for cancer
US20020015997A1 (en) * 1997-06-16 2002-02-07 Lafferty William Michael Capillary array-based sample screening
AU2002235692A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-04 Biophage Inc. Methods and compositions for preventing and treating neutrophil-mediated diseases
SE0102298D0 (sv) 2001-06-27 2001-06-27 Astrazeneca Ab Crystal structure of enzyme and uses thereof
US7731648B2 (en) * 2001-07-25 2010-06-08 Aduro Biotech Magnetic nanoscale particle compositions, and therapeutic methods related thereto
US7524938B2 (en) * 2003-04-04 2009-04-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Antibodies and pharmaceutical compositions containing same useful for inhibiting activity of metalloproteins
FI20040572A0 (fi) * 2004-04-23 2004-04-23 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Matriisi-metalloproteinaasin aktiviteetin inhibiittorit
WO2006037513A1 (en) * 2004-10-09 2006-04-13 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with matrix metalloproteinase 9 (mmp9)
US20110052572A1 (en) 2007-08-15 2011-03-03 Yeda Research And Development Co. Ltd Regulators of mmp-9 and uses therof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000020860A1 (en) * 1998-10-08 2000-04-13 Calbiochem Novabiochem Corporation Diagnostic assay for matrix metalloproteinase 9 and use thereof
WO2003006006A1 (en) * 2001-07-09 2003-01-23 The Regents Of The University Of California Use of matrix metalloproteinase inhibitors to mitigate nerve damage
WO2003075765A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Biospecific contrast agents

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Real-time dual zymographic analysis of matrix;Kazuo Watanabe et al;《Analytical Biochemistry》;20021231;390–392 *
The hemopexin and O-glycosylated domains tune gelatinase B-MMP-9 bioavailability via inhibition and binding to cargo receptors;Philippe E. Van den Steen et al;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20060707;第281卷(第27期);18626–18637 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010108429A (ru) 2011-09-20
AU2008288082A1 (en) 2009-02-19
IL222302A (en) 2016-07-31
EP2581445B1 (en) 2015-04-08
US20130280247A1 (en) 2013-10-24
EP2185175A4 (en) 2010-08-11
BRPI0814479A2 (pt) 2016-07-12
WO2009022328A3 (en) 2010-03-04
DK2185175T3 (da) 2013-05-13
CN102083455A (zh) 2011-06-01
KR20100071972A (ko) 2010-06-29
RU2474433C2 (ru) 2013-02-10
US20150158953A1 (en) 2015-06-11
US8999332B2 (en) 2015-04-07
MX2010001657A (es) 2010-03-15
ES2406105T3 (es) 2013-06-05
EP2185175B1 (en) 2013-02-13
EP2581445A1 (en) 2013-04-17
EP2185175A2 (en) 2010-05-19
WO2009022328A2 (en) 2009-02-19
AU2008288082B2 (en) 2013-01-10
US20110052572A1 (en) 2011-03-03
CA2695969A1 (en) 2009-02-19
JP2010536744A (ja) 2010-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102083455B (zh) Mmp-9的调节剂及其用途
Li et al. The past, present and future perspectives of matrix metalloproteinase inhibitors
Gall et al. Crystal structure of the stromelysin-3 (MMP-11) catalytic domain complexed with a phosphinic inhibitor mimicking the transition-state
Rosenblum et al. Insights into the structure and domain flexibility of full-length pro-matrix metalloproteinase-9/gelatinase B
Podobnik et al. Crystal structure of the wild-type human procathepsin B at 2.5 Å resolution reveals the native active site of a papain-like cysteine protease zymogen
Hettiaratchi et al. Local delivery of stabilized chondroitinase ABC degrades chondroitin sulfate proteoglycans in stroke-injured rat brains
US7919082B1 (en) High-activity mutants of butyrylcholinesterase for cocaine hydrolysis and method of generating the same
Perona et al. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases
Fu et al. Shedding of discoidin domain receptor 1 by membrane-type matrix metalloproteinases
Liu et al. A unified mechanism for aminopeptidase N-based tumor cell motility and tumor-homing therapy
CN107257806A (zh) 用于治疗pvns的抗csf1r抗体
Markland et al. Fibrolase: trials and tribulations
Holyoak et al. Structural basis for differences in substrate selectivity in Kex2 and furin protein convertases
CN102822202A (zh) 抑制金属蛋白的抗体
JP2020512363A (ja) 成人及び青年における低ホスファターゼ症（ｈｐｐ）を治療する方法
Marie-Claire et al. Evidence by site-directed mutagenesis that arginine 203 of thermolysin and arginine 717 of neprilysin (neutral endopeptidase) play equivalent critical roles in substrate hydrolysis and inhibitor binding
Toul et al. Extended mechanism of the plasminogen activator staphylokinase revealed by global kinetic analysis: 1000-fold higher catalytic activity than That of clinically used alteplase
Guo et al. A marine fibrinolytic compound FGFC1 stimulating enzymatic kinetic parameters of a reciprocal activation system based on a single chain urokinase-type plasminogen activator and plasminogen
Pérez de la Lastra et al. Antibodies targeting enzyme inhibition as potential tools for research and drug development
DE60131423T2 (de) Ratten-spezifische cathepsin, dipeptidyl peptidase i (dppi): kristallstruktur, hemmstoffe und deren anwendungen
Mahdiuni et al. Appraisal of sildenafil binding on the structure and promiscuous esterase activity of native and histidine-modified forms of carbonic anhydrase II
Garay-Canales et al. Novel immunotherapy strategies involving matrix metalloproteinase (MMP) family
Manzetti Studies of enzymes from two protease families: Tissue Kallikreins, ADAMs and MMPs.
Bojarski et al. In Silico Approaches for Better Understanding Cysteine Cathepsin-Glycosaminoglycan Interactions
Rosenblum Insights into structure and dynamics of matrix metalloproteinase-9

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150107

Termination date: 20170807

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee