JP2023519961A - 低存在量の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法 - Google Patents

低存在量の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、高存在量タンパク質を含む試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定するための方法およびシステムを提供する。ＨＣＰ不純物は、固体支持体に結合された相互作用するペプチドリガンドを使用して濃縮することができる。ＨＣＰ不純物は、相間移動界面活性剤を含む溶液を使用して、固体支持体から溶出することができる。単離されたＨＣＰ不純物を消化して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成し、それをその後、質量分析計を使用して同定することができる。【選択図】図１

Description

分野
本発明は、概して、低存在量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を同定および定量して、バイオ医薬品中の不純物を監視および制御するための方法およびシステムに関する。
背景
組換えＤＮＡ技術は、宿主細胞でバイオ医薬品を産生するために広く使用されてきた。バイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たしている必要がある。したがって、薬物の開発、製造、保管、および取り扱いの異なる段階で、かかるバイオ医薬品中のいかなる不純物も監視することが重要であり得る。残留不純物は、臨床試験を実施する前に、許容可能な低レベルでなければならない。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、細胞ベースのシステムを使用して開発されるタンパク質ベースのバイオ医薬品中に存在し得る。医薬品中のＨＣＰの存在を監視する必要があり、一定の量を上回ると許容されない可能性がある。時には、微量のＨＣＰであっても、免疫原性応答を引き起こす可能性がある。
免疫アッセイは、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を使用してＨＣＰの除去を監視するために使用されている。免疫アッセイは、ハイスループットにおける総ＨＣＰレベルの半定量を提供することができるが、個々のＨＣＰを迅速に定量するのに効果的ではない場合がある。ＨＣＰの除去を監視するための液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）が最近登場した。しかしながら、高濃度の精製抗体の存在下でのＨＣＰの膨大な動的濃度範囲は、ＨＣＰの除去を監視するＬＣ－ＭＳ法を開発するための課題となる可能性がある。
原薬中の残留ＨＣＰを監視および制御して安全性のリスクを軽減するために、ＨＣＰを同定および定量する方法およびシステムが必要であることは理解されるであろう。
概要
バイオ医薬品におけるＨＣＰ不純物の同定は、非常に高い試料複雑性に起因するタンパク質濃度の広範な動的範囲に対処する課題に遭遇する。本出願は、治療用医薬品中の低存在量ＨＣＰを濃縮する必要性を満たすための濃縮法を含む高存在量タンパク質を含む試料中のＨＣＰ不純物を同定する方法およびシステムを提供する。
本開示は、試料中のＨＣＰ不純物を同定および／または定量する方法を提供する。例示的な一実施形態では、試料中のＨＣＰ不純物を同定および／または定量する方法は、試料を固体支持体に接触させることであって、相互作用するペプチドリガンドが固体支持体に結合され、ＨＣＰ不純物が相互作用するペプチドリガンドに結合することができる、接触させることと、界面活性剤を含む溶液を使用して固体支持体を洗浄して、ＨＣＰ不純物を単離し溶出液を提供することと、溶出液を酵素消化反応に供して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成することと、質量分析計を使用して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を同定することであって、試料が少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含む、同定することと、を含む。一態様では、本出願の方法における界面活性剤は、相間移動界面活性剤、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせである。別の態様では、本出願の方法における界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
一態様では、本出願の方法における少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質の濃度は、各ＨＣＰ不純物の濃度よりも約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、または約１，０００，０００倍高い。一態様では、本出願の方法における相互作用するペプチドリガンドは、コンビナトリアルヘキサペプチドリガンドのライブラリーである。別の態様では、本出願の方法におけるＨＣＰ不純物は、質量分析計を使用して定量され、各ＨＣＰ不純物の検出限界は、約０．０５～０．１ｐｐｍである。別の態様では、本出願の方法における少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬品、または薬物である。一態様では、本出願の方法における酵素消化反応の酵素は、トリプシンである。
さらに別の態様では、本出願の方法における質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、またはトリプル四重極質量分析計であり、質量分析計は液体クロマトグラフィーシステムに接続されている。一態様では、質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析法）分析またはＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析法）分析を行うことができる。
本開示は、少なくとも部分的に、試料中のＨＣＰ不純物を同定するためのシステムを提供する。例示的な一実施形態では、試料中のＨＣＰ不純物を同定するためのシステムは、固体支持体と、相互作用するペプチドリガンドであって、ＨＣＰ不純物が相互作用するペプチドリガンドに結合することができるように、相互作用するペプチドリガンドが固体支持体に結合される、相互作用するペプチドリガンドと、固体支持体を洗浄してＨＣＰ不純物を単離することができる界面活性剤を含む溶液と、単離されたＨＣＰ不純物から成分を生成することができる酵素消化溶液と、単離されたＨＣＰ不純物から成分を同定または定量することができる質量分析計であって、試料が少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含む、質量分析計と、を含む。
一態様では、本出願のシステムにおける界面活性剤は、相間移動界面活性剤、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせである。一態様では、本出願のシステムにおける界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。別の態様では、本出願のシステムにおける少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質の濃度は、各ＨＣＰ不純物の濃度よりも少なくとも約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、または約１，０００，０００倍高い。別の態様では、本出願のシステムにおける相互作用するペプチドリガンドは、コンビナトリアルヘキサペプチドリガンドのライブラリーである。一態様では、本出願のシステムにおける各ＨＣＰ不純物の検出限界は、約０．０５～０．１ｐｐｍである。さらに別の態様では、本出願のシステムにおける少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬品、または薬物である。さらに別の態様では、本出願のシステムにおける酵素消化溶液の酵素は、トリプシンである。
一態様では、本出願のシステムにおける質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、またはトリプル四重極質量分析計であり、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに接続されている。別の態様では、本出願のシステムにおける質量分析計は、ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析を行うことができる。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
特許または出願ファイルには、カラーで描かれた少なくとも１つの図面が含まれている。カラーの図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要望および必要な料金の支払いに応じて、庁によって提供されるだろう。
例示的な一実施形態による、装填、洗浄、溶出、トリプシン消化、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のステップを含む、ＨＣＰを濃縮するためにＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを使用する一般的なワークフローを示す。 例示的な一実施形態による、ポリ結合スプライシング因子ＰＵＦ６０に由来する、１つのＨＣＰペプチド、例えばＩＹＶＡＳＶＨＱＤＬＳＤＤＤＩＫのＰＲＭシグナルの変化を示す。 例示的な一実施形態による、プロテインＮｉｐＳｎａｐホモログ３Ｂに由来する、１つのＨＣＰペプチド、例えば、ＴＹＦＬＫＰＳＫのＰＲＭシグナルの変化を示す。 例示的な一実施形態による、３反復の実験を使用した本出願のＨＣＰ濃縮法の再現性の評価を示す。 例示的な一実施形態による、本出願のＨＣＰ濃縮法の再現性を評価するためのピアソン相関分析の結果を示す。 例示的な一実施形態による、ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって同定されたＨＣＰと比較して、ＮＩＳＴｍＡｂを使用してＨＣＰを同定する本出願のＨＣＰ濃縮法を使用した結果を示す。 図５Ａは、例示的な一実施形態による、濾過（フィルター）法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の比較によるｍＡｂ３および１３のスパイクインＨＣＰを含む試料中のＨＣＰの検出および同定の結果を示す。図５Ｂは、例示的な一実施形態による、濾過（フィルター）法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の比較によるｍＡｂ４およびＨＣＰ不純物を含む試料中のＨＣＰの検出および同定の結果を示す。 例示的な一実施形態によるｍＡｂ４およびＨＣＰ不純物を含む試料を使用した、ＨＣＰ濃縮のための本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の再現性の試験結果を示す。 例示的な一実施形態による、ｍＡｂ５およびＨＣＰ不純物を含む試料を使用したＨＣＰ濃縮のためのネイティブ消化法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の効率を示す。 例示的な一実施形態による、ＨＣＰ濃縮の効率のためのネイティブ消化法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の比較を示す。
詳細な説明
残留するＨＣＰは製品の安全性および安定性を損なう可能性があるため、バイオ医薬品を得るには、高純度のバイオ医薬品を得ることが重要である。細胞ベースの組換え治療用抗体を産生する場合、典型的には、プロセス開発中のポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を使用したＨＣＰの除去（クリアランス）を監視するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイが使用されてきた。ＥＬＩＳＡは、ハイスループットにおける総ＨＣＰレベルの半定量を提供することができる。しかしながら、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体は、総ＨＣＰを捕捉、検出、および定量するために、ＥＬＩＳＡに使用されているが、個々のＨＣＰを定量するのに有効ではない場合がある。特に、一部の非免疫原性または弱免疫原性ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡを使用して検出されない場合がある。
ＨＣＰを同定および定量するために、一次元／二次元（１Ｄ／２Ｄ）ＰＡＧＥまたは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）接続タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などのいくつかの補完的アプローチが、ＨＣＰを監視するのに使用されている。しかしながら、高濃度の精製抗体の存在下におけるＨＣＰの広い動的濃度範囲は、ＨＣＰ不純物の除去を監視するためのＬＣ－ＭＳ方法を開発する上で大きな課題であり得る。質量分析法（ＭＳ）だけでは、６桁を超え得る広い動的濃度範囲のため、高濃度の治療用抗体の存在下で、低ｐｐｍレベルのＨＣＰなどの低存在量の標的を検出する能力を欠いている。この問題を克服するために、１つの戦略は、データ依存型取得またはデータ非依存型取得と組み合わせて、２Ｄ－ＬＣおよび／またはイオン移動度などの別の次元の分離法を追加することによって、ＭＳ分析前に共溶出ペプチドを分離して、分離効率を高めることができる。
Ｈｕａｎｇらは、抗体試料中のＨＣＰ不純物のショットガンプロテオミクス特徴付けのためのトリプシン消化を使用した試料調製方法を記載している（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＰｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１７，Ｍａｙ １６；８９（１０）：５４３６－５４４４）。Ｈｕａｎｇの試料調製方法は、ＨＣＰが消化されている間、抗体をほぼインタクトで維持する。Ｈｕａｎｇのアプローチは、従来のトリプシン消化試料調製と比較して、質量分析法を使用したＨＣＰ検出の動的範囲を１～２桁減少させることができる。ＨＣＰスパイク実験によって実証されるように、Ｈｕａｎｇのアプローチは、ｒＰＬＢＬ２などの６０ｋＤａを超える分子量を有する０．５ｐｐｍのＨＣＰを検出することができる。例えば、Ｈｕａｎｇのアプローチを使用して、６０のマウスＨＣＰ不純物が、ＲＭ ８６７０（ＮＩＳＴｍＡｂ、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準、マウス細胞株で発現、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）で検出された。
Ｄｏｎｅａｎｕらは、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）方法を使用して、抗体試料中の１ｐｐｍまでの低存在量ＨＣＰ不純物の検出を報告している（Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｈｉｇｈ－Ｐｕｒｉｔｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｏｗｎ ｔｏ １ ｐｐｍ Ｕｓｉｎｇ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｏｃｔ ２０；８７（２０）：１０２８３－１０２９１）。Ｄｏｎｅａｎｕのアプローチは、カラム飽和の課題を軽減するために新しい電荷表面修飾Ｃ１８固定相を使用すること、共溶出ペプチド前駆体の進行波イオン移動度分離を組み込むこと、および前駆体の断片化に使用される衝突エネルギーを移動度ドリフト時間と相関させることによって、低存在量のＨＣＰペプチドの断片化効率を改善すること、が含まれる。ＨＣＰ不純物の同定は、イオン移動度質量分析法分析と組み合わせて、２Ｄ－ＨＰＬＣ（２Ｄ高性能液体クロマトグラフィー）を使用して、１０～５０ｐｐｍで検出することができる。しかしながら、２Ｄ－ＬＣまたは２Ｄ－ＨＰＬＣのサイクル時間が非常に長くなる場合がある。加えて、これらの方法は、例えば、１０ｐｐｍ未満の低レベルＨＣＰ分析に対して十分な感度がない場合がある。ＨＣＰ不純物を同定する他のアプローチとしては、親和性精製または抗体を除去するための限定的な消化を使用するなど、試料中の抗体を除去することによってＨＣＰを濃縮するための試料調製が挙げられる。加えて、別の一般的なアプローチは、ポリクローナル抗体を使用してＨＣＰを捕捉することである。
ＨＣＰの不純物を同定するために必要な分析技術は、非常に高い試料の複雑性のために、分析物（例えばＨＣＰまたはＨＣＰペプチド）よりも約１００万倍多くのマトリックス分子を扱うという課題に遭遇する。ＨＣＰ不純物は、タンパク質バイオ医薬品において、１～１００ｐｐｍなどの低レベルで存在することがほとんどであるため、検出レベルに到達するためのＨＣＰ濃縮法の探索は、容易ではない。ＨＣＰの同一性および特性を知らずに、ＨＣＰ（またはＨＣＰペプチド）を濃縮するための一般的な試料調製手順を開発すること、またはマトリックスのバックグラウンドを除去することは、非常に困難であり得る（Ｄｏｎｅａｎｕら）。
本出願は、相互作用するペプチドリガンド（例えば、コンビナトリアルリガンドライブラリー）を使用して、ＨＣＰを濃縮する方法を提供する。一部の例示的な実施形態では、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、例えば、ビーズ上に固定化されたコンビナトリアルヘキサペプチドライブラリーを使用して、ＨＣＰを濃縮する。ペプチド－リガンド結合ビーズが様々なタンパク質種を含む試料に適用される場合、各タンパク質種は、その相互作用するペプチドリガンドに結合することができる。ＨＣＰは、いくつかの弱い相互作用力（例えば、イオン相互作用および水素結合）と組み合わせて、主に疎水力によって、相互作用するペプチドリガンドに結合する。
コンビナトリアルリガンドライブラリー内の各タンパク質種に対応する相互作用するペプチドリガンドの数が限られているため、高存在量タンパク質種は、過剰量存在することで、その相互作用するペプチドリガンドを飽和させる場合がある。限られた数の対応する相互作用するペプチドリガンドは、過剰量の高存在量タンパク質の存在下で容易に飽和され得る。相互作用するペプチドリガンドに結合することができない過剰量の高存在量タンパク質は、ビーズから洗い流され得る。高存在量タンパク質と比較して、試料中の低存在量タンパク質の量は比較的低いため、低存在量タンパク質は、対応する相互作用するペプチドリガンドを飽和させない場合がある。したがって、低存在量タンパク質は、高存在量タンパク質と比較して、相対的に濃縮され得る。濃縮プロセスを実施した後、広範な動的範囲のタンパク質濃度を顕著に減少させることで、低存在量タンパク質の検出を可能にすることができる。本出願のＨＣＰ濃縮法は、高存在量タンパク質の量を減少させることによって、中存在量タンパク質および低存在量タンパク質を濃縮し、検出することができる。本出願のＨＣＰ濃縮法はまた、治療用医薬品における低存在量ＨＣＰ不純物を濃縮する必要性を満たす。
一部の例示的な実施形態では、抗体試料をＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズで処理して、高存在量で存在する抗体の量を低減し、低存在量のＨＣＰ不純物を濃縮する。その後、ＨＣＰ濃縮試料を、ショットガンプロテオミクス分析に供する。この手順は、低存在量のＨＣＰ不純物を濃縮し、同時に、抗体のレベルを低減することができる。それは、ＨＣＰおよび低存在量のＨＣＰ不純物の検出を可能にする抗体薬物間の動的濃度範囲をうまく低減することができる。本出願のＨＣＰ濃縮法を使用したＨＣＰ不純物の検出限界は、約０．０５～０．１ｐｐｍである。
一部の例示的な実施形態では、本出願は、試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定する方法であって、以下を含む方法を提供する：試料を固体支持体に接触させることであって、相互作用するペプチドリガンドが固体支持体に結合され、ＨＣＰ不純物が相互作用するペプチドリガンドに結合することができる、接触させることと、界面活性剤を含む溶液を使用して固体支持体を洗浄して、ＨＣＰ不純物を単離し溶出液を提供することと、溶出液を酵素消化反応に供して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成することと、質量分析計を使用して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を同定することであって、試料が少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含む、同定すること。
一部の例示的な実施形態では、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）などの相間移動界面活性剤（ＰＴＳ）を使用して、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズからＨＣＰを溶出する。ＳＤＣは、タンパク質相互作用の破壊および解離に特に有用なイオン性洗剤である。イオン性洗剤は、帯電した親水性頭部基を有し、負（アニオン性）または正（カチオン性）のいずれかに帯電し得る。ＳＬＳは、アニオン性界面活性剤である。ＳＬＳまたはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアニオン性洗剤は、スルホン化長鎖、アルコールまたは炭化水素のナトリウム塩である。
一部の例示的な実施形態では、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズからＨＣＰを溶出するための溶出緩衝液は、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、相間移動界面活性剤、またはそれらの組み合わせを含む。一態様では、溶出緩衝液は、ＳＤＣ、ＳＬＳ、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む。一態様では、溶出緩衝液は、ＰＴＳ緩衝液を含み、１２ｍＭのＳＤＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、１２ｍＭのＳＬＳ（ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）、１０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、還元剤）、および３０ｍＭのＣＡＡ（クロロアセトアミド）を含む。
微量の特定のＨＣＰは、薬物注射後に免疫応答または毒性生物活性を引き起こす可能性がある。バイオ医薬品における残留ＨＣＰの存在は、薬物の安全性に関して懸念されており、バイオ医薬品中のＨＣＰ不純物を同定および特徴付ける方法およびシステムの開発の要望の増加をもたらしてきた。治療用タンパク質製品におけるＨＣＰの存在のリスク評価のための、個々のＨＣＰを同定および監視するための満たされていないニーズが存在する。
本開示は、原薬中の残留ＨＣＰを監視および制御して安全性のリスクを軽減するための、ＨＣＰを同定および定量する方法およびシステムを提供することによって、前述の要望を満たすための方法およびシステムを提供する。本明細書に開示される例示的な実施形態は、前述の要望および長年望まれていたニーズを満たす。
「１つ（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」および「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが意図され、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味することが理解される。
一部の例示的な実施形態では、本出願は、試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定する方法であって、以下を含む方法を提供する：試料を固体支持体に接触させることであって、相互作用するペプチドリガンドが固体支持体に結合され、ＨＣＰ不純物が相互作用するペプチドリガンドに結合することができる、接触させることと、界面活性剤を含む溶液を使用して固体支持体を洗浄して、ＨＣＰ不純物を単離し溶出液を提供することと、溶出液を酵素消化反応に供して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成することと、質量分析計を使用して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を同定することであって、試料が少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含む、同定すること。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、共有結合的に連結されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含み、一般に、当該技術分野で「ペプチド」または「ポリペプチド」として知られている。タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含んでもよい。一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。
一態様では、本出願の方法における少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬品、または薬物である。一態様では、高存在量タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐである（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示されている）。好ましい態様では、高存在量タンパク質は、アフリベルセプトである。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得、これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域により散在する。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され得る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、生成、または単離されたものを含むが、これらに限定されない。ＩｇＧは、抗体のサブセットを含む。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」、および同様の用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴うタンパク質消化または組換え遺伝子操作技術などの、任意の好適な標準的な技術を使用して、完全な抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置するために、またはコドンを導入し、システイン残基を生成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失するなどのために、配列決定され、化学的に操作されるか、もしくは分子生物学の技術を使用することによって操作され得る。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部（例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域）を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。一部の例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、一部の例示的な実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、かつ／または抗原への結合に対して親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に産生されてもよく、かつ／または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生されてもよい。代替的または追加的に、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含んでもよい。代替的または追加的に、抗体断片は、一緒に（例えば、ジスルフィド結合によって）連結された複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含んでもよい。機能的な抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上または同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、概して、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも、少なくとも１～２、または３、または４桁低く、逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的上（例えば、同じまたは異なるタンパク質上）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現され得る。
典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、ならびに免疫グロブリン軽鎖を有し、免疫グロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合し得るか、または各重鎖と会合し得、かつ重鎖抗原結合領域が結合するエピトープのうちの１つ以上と会合し得るか、または各重鎖と会合し得、かつ重鎖のうちの一方または両方をエピトープの一方または両方と結合させ得る。ＢｓＡｂは、２つの主要なクラス（Ｆｃ領域を有するもの（ＩｇＧ様）とＦｃ領域を欠くもの）に分類することができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧおよびＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、これらに限定されないが、トリオマブ、ノブ・イントゥ・ホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツー・イン・ワンもしくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、またはκλボディなどの異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、またはドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体が挙げられる（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ＆Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２６５－３１０（２０１４））。
ＢｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的コンジュゲーション、および組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝子アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、以下の特許出願に開示されているものが挙げられる（これらは、参照により本明細書に援用される）：２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、および２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体の製造中のいくつかのステップで存在し得る。このようなホモ二量体不純物の検出は、通常の液体クロマトグラフィー法を使用して実施する場合、ホモ二量体不純物の存在量が少なく、これらの不純物が主な種と共溶出するため、インタクトな質量分析を使用して実施する場合は困難である可能性がある。
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」または「Ｍａｂ」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（例えば、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、追加の特異性を有する抗体（例えば、三重特異性抗体およびＫＩＨ三重特異性）は、本明細書に開示されるシステムおよび方法によって対処することができる。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能なまたは既知の任意の手段による単一のクローン（任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む）に由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製され得、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用が含まれる。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、哺乳動物細胞から精製され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源または非ヒト起源の細胞であってもよく、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、および網膜上皮細胞）、樹立細胞株またはそれらの株（例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、およびＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ－１、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞、もしくはそれらの派生物）、任意の組織もしくは臓器由来の線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ系組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓、ならびに線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１系統（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ系統（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、またはそれらの派生物）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞タンパク質」という用語は、宿主細胞に由来するタンパク質を含み、所望の目的のタンパク質とは無関係であってもよい。宿主細胞タンパク質は、製造プロセスに由来するプロセス関連不純物であり得、細胞基質由来、細胞培養由来、および下流由来の３つの主要なカテゴリーを含み得る。細胞基質由来不純物としては、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または総ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養由来不純物としては、誘導物質、抗生物質、血清、および他の培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。下流由来不純物としては、酵素、化学的および生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤、および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、ならびに他の溶出物が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。一例示的な特定の実施形態では、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０であり得る。
一部の例示的な実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質の種類は、少なくとも２種類であり得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質医薬品」または「バイオ医薬品」には、本質的に完全にまたは部分的に生物学的であり得る活性成分を含む。一態様では、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含むことができる。別の態様では、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせの組換え、操作、修飾、変異、または切断バージョンを含み得る。
別の例示的な実施形態では、試料は、培養細胞培養液（ＣＣＦ）、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ）、プロセス性能適格性（ＰＰＱ）、下流処理における任意のステップ、薬物溶液（ＤＳ）、または最終的に製剤化された製品を含む医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。一部の他の特定の例示的な実施形態では、試料は、清澄化、クロマトグラフィー精製、ウイルス不活性化、または濾過の下流プロセスの任意のステップから選択され得る。一部の特定の例示的な実施形態では、医薬品は、臨床、輸送、保管、または取り扱いにおける製造された医薬品から選択され得る。
本明細書で使用される場合、「質量分析計」は、特定の分子種（または本明細書で言及される成分）を同定し、それらの正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、検出および／または特徴付けのためにポリペプチドまたはペプチドが溶出され得る任意の分子検出器を含むことが意図される。質量分析計は、３つの主要な部分：イオン源、質量分析計、および検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを形成することである。分析物の原子、分子、またはクラスターを、気相に移し、（エレクトロスプレーイオン化の場合など）同時にイオン化することができる。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。
一態様では、本出願の方法における質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、またはトリプル四重極質量分析計であり、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに接続されている。
本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液中のカチオンまたはアニオンのいずれかが、溶液を含むエレクトロスプレーニードルの先端と対電極との間に電位差を印加することから生じる高度に帯電した液滴の流れの形成および大気圧での脱溶媒和を介して気相に移される、スプレーイオン化のプロセスを指す。一般に、溶液中の電解質イオンから気相イオンを産生するには、３つの主要なステップがある。これらは、（ａ）ＥＳ注入チップにおける帯電液滴の生成、（ｂ）溶媒蒸発による帯電液滴の縮小、および気相イオンを生成することができる高度に帯電した小さな液滴をもたらす液滴崩壊の繰り返し、ならびに（ｃ）非常に小さな高度に帯電した液滴から気相イオンが生成するメカニズムである。段階（ａ）～（ｃ）は、一般に装置の大気圧領域で起こる。一部の例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であってもよい。
本明細書で使用される場合、「トリプル四重極質量分析計」という用語は、（非質量分解）高周波（ＲＦ）を有する直列した２つの四重極質量分析器からなるタンデム質量分析計を指し、その間の四重極のみが衝突誘起解離のためのセルとして機能する。トリプル四重極質量分析計では、ペプチド試料は、ＭＳ機器と接続したＬＣに注入される。第１の四重極は、標的ｍ／ｚを有するペプチドを単離するための質量フィルターとして使用され得る。第２の四重極は、ペプチドを断片に分解するための衝突セルとしての役割を果たす。第３の四重極は、初期親ペプチドからの特定のｍ／ｚ断片の第２の質量フィルターとして機能する。本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析法」という用語は、質量選択および質量分離の複数の段階を使用することによって、試料分子に関する構造情報を得ることができる技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に移し、インタクトでイオン化できること、および第１の質量選択ステップの後、ある程度の予測可能かつ制御可能な様式でバラバラになるように誘導できることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、まず、前駆体イオン（ＭＳ２）を選択および単離し、それを断片化し、一次断片イオン（ＭＳ３）を単離し、それを断片化し、二次断片イオン（ＭＳ４）を単離することによって、有意義な情報を取得し得るか、または断片化イオンシグナルが検出可能であり得る限り、実施することができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせを用いて成功裏に実施されている。特定の用途のために組み合わせる分析器は、感度、選択性、および速度だけでなく、サイズ、コスト、および可用性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデム・イン・スペースとタンデム・イン・タイムであるが、ハイブリッドも存在し、タンデム・イン・タイム分析器が空間内で接続されるか、またはタンデム・イン・スペース分析器と接続される。タンデム・イン・スペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、および少なくとも２つの非捕捉質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器のあるセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、生成イオンがｍ／ｚ分離およびデータ収集のために別の分析器に伝達されるように設計され得る。タンデム・イン・タイム質量分析計では、イオン源で産生されたイオンは、同じ物理デバイス内で、捕捉、分離、断片化、およびｍ／ｚ分離され得る。
質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトのタンパク質およびそれらの翻訳後修飾の代理標本（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）として使用することができる。これらは、実験的ＭＳ／ＭＳデータと理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質の特徴付けに使用することができる。後者は、タンパク質配列データベース中の可能なペプチドから生成される。特徴付けとしては、タンパク質断片のアミノ酸を配列決定すること、タンパク質の配列決定を行うこと、タンパク質のデノボ配列決定を行うこと、翻訳後修飾の場所を特定すること、もしくは翻訳後修飾を同定すること、もしくは比較可能性分析、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベース（複数可）におけるすべての可能な配列（または、本明細書で言及される成分）に対して、未解釈のＭＳ－ＭＳスペクトルを検索できるようにするバイオインフォマティクスのツールを指す。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに接続され得る。
本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学混合物が、定常的な液相または固相の周囲または上を流れる際に、化学物質の差次的分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。
例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、試料中の低存在量ＨＣＰ不純物を同定するための方法およびシステムを提供する。
一部の例示的な実施形態では、本出願は、試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定する方法であって、以下を含む方法を提供する：試料を固体支持体に接触させることであって、相互作用するペプチドリガンドが固体支持体に結合され、ＨＣＰ不純物が相互作用するペプチドリガンドに結合することができる、接触させることと、界面活性剤を含む溶液を使用して固体支持体を洗浄して、溶出液を提供することと、溶出液を酵素消化反応に供して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成することと、質量分析計を使用して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を同定することであって、試料が少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含む、同定すること。
一態様では、本出願の方法またはシステムにおける固体支持体は、ビーズ、磁気ビーズ、クロマトグラフィー樹脂、ポリマー、またはクロマトグラフィーマトリックスであり得る。
一態様では、本出願の方法における界面活性剤は、相間移動界面活性剤、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせである。一部の態様では、本出願の方法における界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
一態様では、本出願の方法における少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質の濃度は、各ＨＣＰ不純物の濃度よりも少なくとも約５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、または約１，０００，０００倍高い。一態様では、本出願の方法におけるＨＣＰ不純物は、質量分析計を使用して定量され、各ＨＣＰ不純物の検出限界は、約０．０５～０．１ｐｐｍ、約０．０１～０．５ｐｐｍ、約０．０２～０．５ｐｐｍ、約０．０３～０．５ｐｐｍ、約０．０４～０．５ｐｐｍ、約０．０２～０．４ｐｐｍ、約０．０３～０．４ｐｐｍ、約０．０４～０．４ｐｐｍ、約０．０２～０．３ｐｐｍ、約０．０３～０．３ｐｐｍ、約０．０４～０．３ｐｐｍ、約０．０２～０．２ｐｐｍ、約０．０３～０．２ｐｐｍ、または約０．０４～０．２ｐｐｍである。
本システムは、前述のＨＣＰ、相互作用するペプチドリガンド、固体支持体、バイオ医薬品、ペプチド、タンパク質、抗体、界面活性剤、タンパク質医薬品、または質量分析計のいずれかに限定されないことを理解されたい。
本明細書で提供される方法ステップの数字および／または文字での連続した標識は、方法またはその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。
特許、特許出願、公開特許出願、受託番号、技術論文、および学術論文を含む、様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された参照文献の各々は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。別段記載されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、本開示をより十分に理解することができるであろう。これらは、例示することを意図し、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
材料および方法
１．材料
ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）タンパク質濃縮キットは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）テクノロジーは、生体試料中のタンパク質濃度の動的範囲を圧縮するための試料調製ツールである。様々なタンパク質を捕捉するために、コンビナトリアルヘキサペプチドリガンドの大規模なライブラリーをビーズ上に固定した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）スピンカラムは、２０μｌの沈降ビーズ体積を有する５００μｌのビーズスラリー（４％のビーズ、２０％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨ水溶液）を含んだ。キットの洗浄緩衝液は、５０ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液生理食塩水、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＮのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）を含む。キットの溶出緩衝液は、凍結乾燥した尿素ＣＨＡＰＳ（８Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ；ＣＨＡＰＳ洗剤は、３－（（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート）を含む。キットの補水緩衝液には、５％の酢酸が含まれている。
ＬＣ－ＭＳグレードであったクロマトグラフィー溶媒は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。モノクローナル抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）によって産生された。ＨＣＰとしてスパイクインされたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）タンパク質は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）によって産生された。デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＳＬＳ）およびクロロアセトアミド（ＣＡＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ｔｒｉｓ－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＲＭ８６７０（ＮＩＳＴｍＡｂ、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準、マウス細胞株で発現）は、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から取得した。
２．ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）タンパク質濃縮キットを使用したタンパク質濃縮
ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）タンパク質濃縮キットを使用して、試料中のタンパク質を濃縮した。小規模のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）カートリッジを５回の実験に使用した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを、キットに提供される２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。ビーズを、２００μＬの水で再懸濁し、４０μＬのビーズスラリーをチューブに移して１回の実験を行った。８ｍｇのＮＩＳＴｍＡｂ、１５ｍｇのｍＡｂ１、または１５ｍｇのｍＡｂ２を、水で５０ｍｇ／ｍＬに希釈し、続いて、２５ｍＭ ｐＨ４．０の酢酸ナトリウムを使用して、溶液のｐＨをｐＨ６に調整した。試料をＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズスラリーに加え、２時間回転させながら室温でインキュベートした。次いで、試料混合物をフリットで先端に装填した。１０００×ｇで１分間遠心分離することによって、上清を除去した。続いて、ビーズを、先端に１００μＬの洗浄緩衝液を添加することによって洗浄し、続いて、２００×ｇで１分間、３回遠心分離した。最後に、濃縮されたタンパク質を、１０μＬのＰＴＳ緩衝液（１２ｍＭのＳＤＣ、１２ｍＭのＳＬＳ、１０ｍＭのＴＣＥＰ、および３０ｍＭのＣＡＡ）を使用して溶出し、続いて、２００×ｇで１分間、３回遠心分離した。濃縮されたタンパク質を含む回収した溶出液を変性させ、還元し、９５℃で５分間アルキル化した。アルキル化タンパク質を１５０μＬに希釈し、１μｇのトリプシンで３７℃で一晩消化して、ペプチド混合物を含む溶液を得た。ペプチド混合物を含む溶液を、１０μＬの１０％のＴＦＡを使用して酸性化し、ＳＤＣおよびＳＬＳを沈殿させた。その後、ペプチド混合物を含む溶液を、１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、ペプチド混合物を含む上清を、ＧＬ－Ｔｉｐ ＧＣ脱塩チップを使用して脱塩し、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥させた。
３．ＮＩＳＴｍＡｂの直接消化
参照材料として、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準（例えば、ＮＩＳＴｍＡｂ）を、以下の手順で、トリプシンで消化した：２０μｇのＮＩＳＴｍＡｂ（ＲＭ８６７０）を、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥させ、続いて、２０μｌのＰＴＳ緩衝液で再構成した。抗体（タンパク質）を変性させ、還元し、９５℃で５分間アルキル化した。アルキル化されたタンパク質を、１００μｌに希釈し、１μｇのトリプシンで、３７℃で一晩消化して、ペプチド混合物を含む溶液を得た。ペプチド混合物を含む溶液を、１０μｌの１０％のＴＦＡを使用して酸性化して、ＳＤＣおよびＳＬＳを沈殿させ、続いて、１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、ペプチド混合物を含む上清を、ＧＬ－Ｔｉｐ ＧＣ脱塩チップを使用して脱塩し、続いて、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥させた。乾燥したペプチド混合物を、４０μｌの０．１％のＦＡに再懸濁した。２μｌの再懸濁溶液を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析およびＰＲＭ分析のための直接注入に使用した。
４．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）濃縮から得られた脱塩ペプチド混合物を乾燥させ、４０μＬの０．１％のギ酸（ＦＡ）溶液に再懸濁した。ペプチド混合物を含む５μＬの溶液を、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続された低流量液体クロマトグラフィーシステム（例えば、ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に注入した。ペプチドを、２５ｃｍのＣ１８カラム（内径０．０７５ｍｍ、２．０μｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離した。移動相緩衝液は、超純水中に０．１％のＦＡを含み（緩衝液Ａ）、溶出緩衝液は、８０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）中に０．１％のＦＡを含んだ（緩衝液Ｂ）。ペプチドを、２％～２５％緩衝液Ｂの１００分間の線形勾配を使用して、３００ｎＬ／分の流速で溶出した。質量分析計は、データ依存モードで動作した。最も強い１０個のイオンを、各々、分解能１２０，０００（自動ゲイン制御（ＡＧＣ）標的３ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ ３７５～１５００）での全ＭＳスキャン、および分解能３０，０００（ＡＧＣ標的１ｅ５、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ ２００～２０００）でのＭＳ／ＭＳ事象について、２７％の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）による高エネルギー衝突性解離（ＨＣＤ）断片化に供した。ＭＳプロテオミクスのデータは、ＪＰＯＳＴリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに、プロジェクト受託番号ＰＸＤ０１６１９４で寄託した。
５．ＰＲＭ解析
１μｇの直接消化ＮＩＳＴｍＡｂ試料を、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ質量分析計に接続されたＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステムに注入した。消化ペプチドを、０．０７５ｍｍ（２．０μｍ、１００Å）の内径を有する２５ｃｍのＣ１８カラムを使用して分離した。移動相緩衝液は、水中に０．１％のＦＡを含み（緩衝液Ａ）、溶出緩衝液は、８０％のＡＣＮ中に０．１％のＦＡを含んだ（緩衝液Ｂ）。ペプチドを、２％～２５％緩衝液Ｂの１００分間の線形勾配を使用して、３００ｎＬ／分の流速で溶出した。カラムからの溶出液は、エミッタースプレーチップを介して質量分析器に導入された。各試料を、２ｍ／ｚの単離ウィンドウで、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）下で分析した。すべての実験において、ｍ／ｚ ２００に対する分解能１２０，０００（ＡＧＣ標的１ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ ３５０－２０００）での全質量スペクトルに続いて、分解能３０，０００（ＡＧＣ標的１ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ）での時間スケジュールＰＲＭスキャンを行った。２７％のＮＣＥでＨＣＤを使用した。
実施例１．様々な溶出緩衝液を使用したＨＣＰの濃縮
ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを使用して、抗体およびＨＣＰを含む試料中のＨＣＰを濃縮した。図１に示されるように、ＨＣＰを濃縮するためにＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを使用する一般的なワークフローには、装填、洗浄、溶出、トリプシン消化、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のステップが含まれた。いくつかの緩衝液を試験して、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズからタンパク質を溶出した。緩衝液には、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）溶出緩衝液およびいくつかのＭＳ互換性溶出緩衝液、例えば、ＰＴＳ緩衝液、５％の酢酸（ＡＡ）中の８Ｍの尿素、５０％のＣＡＮ中の６Ｍのグアニジンおよび０．１％のＴＦＡ（０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ）、が含まれた。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）タンパク質濃縮キットに提供される溶出緩衝液には、１Ｄ／２Ｄゲル分析の互換性のために設計された２％のＣＨＡＰＳが含まれた。ＣＨＡＰＳは、質量分析法（ＭＳ）分析との互換性がないため、アセトン沈殿またはＦＡＳＰ（フィルター支援試料調製）を試験して、ＣＨＡＰＳを溶出液から除去した。ＦＡＳＰは、洗剤除去およびタンパク質消化用の使い捨て遠心分離式限外濾過ユニットを利用する方法である。ペプチド画分の生成を可能にするために、２つまたは３つのプロテアーゼを使用して、連続したタンパク質消化を行った。
ｍＡｂ１（１０ｍｇ）およびＨＣＰを含む試料を、２０μＬのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズで処理して、ＨＣＰを濃縮した。試料をＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズで処理し、続いて、洗浄ステップ（例えば、アセトン沈殿またはＦＡＳＰ）と組み合わせてＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）溶出緩衝液で溶出したところ、表１に示されるように、１１個または８個の内因性ＨＣＰが同定された。対照的に、洗浄ステップを使用せずに５％の酢酸中の８Ｍの尿素を溶出緩衝液として使用すると、試料からのＨＣＰの濃縮がより効果的であり、表１に示されるように、高い信頼性で同定された内因性ＨＣＰの数が２６個に増加した。いくつかのＨＣＰがクリーニングステップによって除去されたことから、これらの結果は、クリーニングステップ（例えば、アセトン沈殿またはＦＡＳＰを使用したＣＨＡＰＳ除去ステップ）の追加が、ＨＣＰ濃縮に対して悪影響を及ぼす場合があることを示唆した。
（表１）ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを使用したＨＣＰの濃縮
Figure 2023519961000002
異なるＭＳ互換性溶出緩衝液の有効性を評価するために、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞からの１３の精製ＨＣＰを、０．１ｐｐｍ（０．１ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ｍＡｂ）～２００ｐｐｍの範囲の様々な濃度で、８ｍｇの精製モノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ２）にスパイクした。精製ｍＡｂ２には、非常に低レベルの内因性ＨＣＰが含まれていた。表２に示されるように、ＰＴＳまたは６Ｍのグアニジンの溶出緩衝液は、５％の酢酸中の８Ｍ尿素または０．１％のＴＦＡ／５０％のＡＣＮ（それぞれ、１１．３５または１４．２５μｇ）の溶出緩衝液と比較して、より強力な溶出効率を示し、より多量のペプチド（それぞれ、２６．１μｇまたは２２．８μｇ）が得られた。ＰＴＳ緩衝液では、高い信頼性で６０個のタンパク質が得られ、すべての１３個のスパイクインＨＣＰが含まれた。８Ｍの尿素では、高い信頼性で３２個のタンパク質が得られ、１２個のスパイクインＨＣＰが含まれた。６Ｍのグアニジンでは、高い信頼性で３０個のタンパク質が得られ、１２個のスパイクインＨＣＰが含まれた。０．１％のＴＦＡ／５０％のＣＡＮでは、高い信頼性で３４個のタンパク質が得られ、１２個のスパイクインＨＣＰが含まれた。ＰＴＳ緩衝液は、最高のＨＣＰ溶出効率を有した。したがって、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよびＰＴＳ溶出緩衝液の組み合わせは、原薬中のＨＣＰを顕著に濃縮することができる。
（表２）スパイクインＨＣＰ（０．１～２００ｐｐｍ）を含む８ｍｇの精製ｍＡｂ２を使用したＨＣＰの濃縮
Figure 2023519961000003
実施例２．異なるｐＨ環境下でのＨＣＰの濃縮
これまでの研究は、ｐＨ環境が、異なる植物試料中のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）結合効率に影響を及ぼすことを示した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズは以前にＨＣＰ分析に使用されたことがないため、異なるｐＨ環境でのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズへの治療用医薬品の結合効率を試験した。表３に示されるように、試験結果は、原薬が、塩基性条件で、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズに対する好ましい結合を示すことを示した。塩基性条件での原薬のＰＳＭ（ペプチドスペクトルの一致）数は、酸性条件よりも２０％多かった。ＰＳＭ値は、タンパク質について一致したペプチドスペクトルを示す。塩基性条件（ｐＨ９、Ｔｒｉｓ）で、約３５個の内因性ＨＣＰが同定された。酸性状態（ｐＨ４、酢酸ナトリウム）で、約６６個の内因性ＨＣＰが同定された。
（表３）異なるｐＨ環境でのＨＣＰの濃縮
Figure 2023519961000004
実施例３．ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズに対する試料の比率の最適化
試料とＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズの比率を、ＨＣＰの濃縮を行うために最適化した。各ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）キットは、２０μＬのビーズを含んでいた。２０μＬ（１キット）または４μＬ（１／５キット）のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを、ＨＣＰの濃縮について試験した。製造元の推奨に従って、試料とビーズの比率が、１０ｍｇのｍＡｂ１と２０μＬのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよび２ｍｇのｍＡｂ１と４μＬのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズで試験した。表４に示されるように、これらの結果は、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズの量が濃縮効率に影響を及ぼさないことを示した。したがって、４μＬのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズが、ＨＣＰ濃縮物の試験に適していた。最良の感度を達成するために、最適な試料装填量も試験した。表５に示されるように、２ｍｇの試料装填量は、ｍＡｂ２スパイクイン試料を使用して、０．５ｐｐｍの感度を示した。
（表４）ＨＣＰの濃縮を実施するための、試料とＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズの比率の最適化
Figure 2023519961000005
（表５）試料装填量の最適化
Figure 2023519961000006
最適な試料装填量および検出限界を評価するために、０．０５ｐｐｍ～０．５ｐｐｍの範囲の異なる濃度を有するＣＨＯ細胞からの１１個の精製ＨＣＰを、試験のために異なる量の精製ｍＡｂ２にスパイクした。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズの濃縮優先度のバイアスを試験するために、スパイクインタンパク質は、濃度が変化するだけでなく、サイズも変化した。０．５ｐｐｍのスパイクインＨＣＰはすべて、わずか４ｍｇの試料装填で見出すことができる。０．１ｐｐｍのスパイクインＨＣＰのほとんどは、８ｍｇの試料装填で見出すことができる。０．１ｐｐｍを上回る濃度のスパイクインタンパク質のほとんどは、４ｍｇの試料装填で同定され得るが、８ｍｇの試料装填は、低濃度であったタンパク質のほとんどにおいて、より良好なカバレッジを示した。表６および７に示されるように、さらに試料を１５ｍｇに増やした場合、検出限界が０．０５ｐｐｍに低下した。表８に、３反復の結果を示す。表９に示されるように、装填量を２ｍｇから８ｍｇに４倍増やした場合、検出限界が０．１ｐｐｍに増加した。これらの結果は、１５ｍｇの試料装填を使用して、潜在的な検出限界が０．０５ｐｐｍであることを示した。これらの結果はまた、試料の装填量を増やすことで、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズ上の低存在量タンパク質を効果的に蓄積させ、したがって、検出限界を向上させることができることを示した。試験結果はまた、最適な条件下で、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズの検出限界が０．０５ｐｐｍに低下し得ることを示した。
（表６）最適な試料装填量の評価
Figure 2023519961000007
（表７）最適な検出限界の評価
Figure 2023519961000008
（表８）１５ｍｇの試料装填の反復
Figure 2023519961000009
（表９）試料装填量を４倍増やす
Figure 2023519961000010
動的範囲の減少を評価するために、ＰＲＭ分析（例えば、標的化ＭＳアプローチ）を行い、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法から得られるＨＣＰ濃縮係数を計算した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズに接触する前後で、個々のＨＣＰペプチドと抗体ペプチドの相対的な存在量を比較することによって、ＨＣＰ濃縮係数を計算することができる。図２Ａに、既知のＨＣＰのうちの１つ（例えば、ポリ結合スプライシング因子ＰＵＦ６０）に由来する、１つのＨＣＰペプチド（例えば、ＩＹＶＡＳＶＨＱＤＬＳＤＤＤＩＫ）のＰＲＭシグナルの変化を示した。図２Ｂに、別のＨＣＰペプチド（例えば、この研究で新たに発見されたＨＣＰであるプロテインＮｉｐＳｎａｐホモログ３Ｂ）に由来するＴＹＦＬＫＰＳＫのＰＲＭシグナルの変化を示す。両方の例示的なペプチドは、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズ処理後、ＰＲＭシグナルが２００倍以上増加したことを示した。低存在量のＨＣＰを濃縮することによって、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）処理試料中のタンパク質の動的範囲が顕著に減少し、その後のＭＳ分析におけるシグナル対ノイズ比が増加した。
実施例４．再現性の評価方法
ＮＩＳＴｍＡＢ標準を使用して、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよびＰＴＳ緩衝液を使用して、本出願のＨＣＰ濃縮法の再現性を評価した。本出願のＨＣＰ濃縮法のワークフローには、２００μＬのＰＢＳでスピンカラム中のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズを洗浄し、続いて、１０００ｒｃｆで３０秒間遠心分離して緩衝液を除去し、同じステップを２回繰り返すステップが含まれた。ビーズを２００μＬのＰＢＳで再懸濁するステップに続いて、４０μＬのビーズ懸濁液をチューブに移した。５０ｍｇ／ｍＬの１５ｍｇの試料をチューブに添加し、室温で２時間、回転させながらビーズ懸濁液と混合した。ビーズおよび試料の混合物をフリットでチップに装填し、続いて、１０００ｒｃｆで３０秒間遠心分離した。続いて、チューブから上清を除去した。その後、ビーズを１００μＬのＰＢＳで洗浄し、続いて、２００ｒｃｆで１分間遠心分離して、上清を除去した。ビーズを再度洗浄した。その後、１０μＬのＰＴＳ緩衝液を使用して、ビーズからタンパク質を溶出した。ビーズを、ＰＴＳ緩衝液に完全に再懸濁し、続いて、２００ｒｃｆで１分間遠心分離して、上清の溶出液を回収した。同じステップを２回繰り返した。溶出液を、９５℃で５分間加熱した。その後、緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を使用して、溶出液を５倍希釈した。１μｇのトリプシンを希釈した溶出液に添加して一晩消化し、ペプチド混合物を含む溶液を得た。続いて、１０％ＴＦＡを、０．１％ＴＦＡの最終濃度でペプチド混合液に添加した。その後、ペプチド混合液を１４０００ｒｃｆで５分間遠心分離して、沈殿物および上清を得た。上清に対して脱塩プロセスを実施した。
本出願のＨＣＰ濃縮法の再現性を評価するために、ＮＩＳＴｍＡｂ標準を使用して３反復の実験を行った。図３Ａに示されるように、３回の実行にわたって、合計で全タンパク質の８９．４％に相当する７１５個の共通のタンパク質、および全ペプチドの８５．８％に相当する３３１０個の共通のペプチドが同定された。再現性の高い結果は、ＨＣＰの濃縮に不可欠なタンパク質の同定において高い信頼性を示した。さらに、無標識定量を行って、すべての実行における各ペプチドの相対量を定量した。図３Ｂに示されるように、ピアソン相関分析は、０．９７超であった。これは、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよびＰＴＳ緩衝液を使用する本出願のＨＣＰ濃縮法が、再現性が高く、変動がほとんどないことを示した。
本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法を使用して、合計５２７個のＨＣＰが、高い信頼性で同定された。直接消化を使用して同定されたＨＣＰは、２９個のみであった。図４に示されるように、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法と限定消化法を比較すると、両方の方法によって５８のＨＣＰが同定された。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法と濾過法を比較すると、両方の方法によって１４０個のＨＣＰが同定された。これらの１４０個のＨＣＰは、濾過法によって同定された１６６個のＨＣＰの約８４％であった。
実施例５．ＮＩＳＴｍＡｂ標準を使用したＨＣＰの同定
（ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよびＰＴＳ緩衝液を使用する）本出願のＨＣＰ濃縮法を使用して、ＮＩＳＴｍＡｂ標準（例えば、ＲＭ ８６７０）を使用してＨＣＰを同定した。図４に示されるように、合計５２７個のＨＣＰ、例えば、マウスタンパク質は、０．０１以下の偽陽性率で、高い信頼性で同定された（２つを超えるペプチドが同定された）が、直接消化を使用すると、わずか２９個のマウスタンパク質が同定された。これらの５２７個のマウスタンパク質を、２つの以前の研究（例えば、ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらの研究）と比較した。ＮＩＳＴｍＡｂ標準（ＲＭ ８６７０）を使用して、ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって、それぞれ１４個のＨＣＰおよび５９個のＨＣＰが高い信頼性で同定された。図４に示されるように、Ｄｏｎｅａｎｕらによって検出された１４個のＨＣＰのすべて、およびＨｕａｎｇらによって検出された６０個のＨＣＰのうちの５８個は、本出願のＨＣＰ濃縮法を使用して同定された。
ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって検出されなかったアタキシン２は、本出願の方法によって実際に検出されたが、１つのペプチドのみが同定された。ホスホグリセリン酸キナーゼ２は、Ｈｕａｎｇらでは、２つのペプチドで同定された。ホスホグリセリン酸キナーゼ１は、ホスホグリセリン酸キナーゼ２と８４％の配列類似性を有し、本出願の方法によって、１７個の固有のペプチドで同定された。要約すると、ＮＩＳＴｍＡｂ標準における５２７個の同定されたマウスＨＣＰのうちの４６７個は、ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって以前に報告されていなかった。これらの４６７個のマウスＨＣＰの中で、これらの４６７個のマウスＨＣＰのうちの１９２個は、５つを超える固有のペプチドを含み、これらの４６７個のマウスＨＣＰのうちの３３０個は、３つ以上の固有のペプチドを含む。
実施例６．並列反応モニタリングによる同定されたＨＣＰの検証
本出願のＨＣＰ濃縮法を使用して（ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）ビーズおよびＰＴＳ緩衝液を使用して）同定されたＨＣＰの同一性を検証するために、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析を使用した。５２７個の同定されたＮＩＳＴｍＡｂ ＨＣＰのうちの２５個を、ＰＲＭ分析のためにランダムに選択した。直接消化およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ処理試料の両方における選択された２５個のＨＣＰの存在を、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）処理の前後のこれらのＨＣＰのペプチドシグナルを比較することによって確認した。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ法の効率の向上は、ＰＲＭ検証によっても検証された。表１０および１１に示されるように、選択されたＨＣＰは、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法を使用して、約１３～１１０９倍濃縮されることが判明した。表１０は、ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって同定されたＨＣＰを列挙し、選択されたＨＣＰの８２％は、直接消化試料中に１ｐｐｍより高いレベルで存在していることが測定され、これは、Ｈｕａｎｇらの結果と一致した。表１１に、本出願のＨＣＰ濃縮法によって検出および同定された新規ＨＣＰ標的が列挙されている。
（表１０）ＤｏｎｅａｎｕらおよびＨｕａｎｇらによって同定されたＨＣＰ
Figure 2023519961000011
（表１１）本出願のＨＣＰ濃縮法によって同定された選択された新規標的
Figure 2023519961000012
これらの結果は、本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法を使用して、感度が実質的に向上したことを示した。測定されたタンパク質のほとんどは、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）処理前、非常に低いレベルで存在したが、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）処理後、同じタンパク質の相対濃度が実質的に増加した。表１０および１１に示されるように、ほとんどのＨＣＰが１００倍超濃縮されたため、これらの低存在量タンパク質の検出における感度は、顕著に改善された。特に、ある選択されたＨＣＰは、表１０に示されるように、１０００倍超濃縮された。本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法は、各ＨＣＰのシグナルを顕著に増加させて、試料におけるタンパク質濃度の動的範囲を減少させることができた。
実施例７．濾過法とＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の比較
ＨＣＰの濃縮の効率を、抗体を含む試料中のＨＣＰの検出および同定について、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法と濾過（フィルター）法の間で比較した。１．５ｍｇのｍＡｂ３およびＨＣＰを、ＳＤＣおよびＳＬＳカクテル緩衝液中で解離し、解離後、５０Ｋ ＭＷＣＯフィルターを適用することによって、ＨＣＰを抗体から分離することができる。（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔｏｆｆ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０２０ ９２（５），３７５１－３７５７）。フィルター法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法について、２つのペプチドで同定されたＨＣＰの数を、図５Ａおよび図５Ｂに示す（ＩＰの結果は、すべての異なるロットのｍＡｂ３およびｍＡｂ４の組み合わせた結果である）。表１２に、スパイクインＨＣＰの試験結果を示した。試験のために、ＣＨＯ細胞由来の１３個の精製ＨＣＰを、０．１ｐｐｍ～２００ｐｐｍの範囲の様々な濃度で、精製ｍＡｂ３を含む試料にスパイクした。表１２に示されるように、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法は、全体的に、より多くの同定されたＰＳＭおよびより多くの固有のペプチドを示した。
（表１２）スパイクインＨＣＰに対するフィルター法とＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の比較
Figure 2023519961000013
実施例８．再現性試験
ＨＣＰの濃縮に対する本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の再現性を、ｍＡｂ４を使用して試験した。ｍＡｂ４およびＨＣＰ不純物を含む１５ｍｇの試料を、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）キットの１／５を使用して試験した。３回実施した。表１３および図６に示されるように、これらの結果は、ＩＰの結果との一致に基づいて、良好な再現性を示す。
（表１３）ＨＣＰの濃縮のためのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の再現性試験
Figure 2023519961000014
実施例９．ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法と限定消化法の比較
ＨＣＰの濃縮のためのネイティブ消化法およびＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法の効率を試験し、ＨＣＰ不純物を含むｍＡｂ５を使用して比較した。図７に示されるように、本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法を使用して、合計６３個のＨＣＰを高い信頼性で同定した。ネイティブ消化法を使用して、合計２５個のＨＣＰを高い信頼性で同定した。図８に示されるように、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）およびネイティブ消化法を比較すると、両方の方法によって２１個のＨＣＰが同定された。ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法およびネイティブ消化法を比較すると、両方の方法によって２６個のＨＣＰが同定された。表１４は、本出願のＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（商標）法を使用して、ｍＡｂ５試料中に見出された６３個のＨＣＰを示す。
（表１４）ｍＡｂ５試料中に見出されたＨＣＰ
Figure 2023519961000015
Figure 2023519961000016
Figure 2023519961000017

Claims (20)

  1. 試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定する方法であって、以下を含む、方法：
    前記試料を固体支持体に接触させることであって、
    前記試料が、少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質を含み、
    相互作用するペプチドリガンドが、前記固体支持体に結合されており、
    前記ＨＣＰ不純物が、前記相互作用するペプチドリガンドと結合することができる、
    前記接触させることと、
    界面活性剤を含む溶液を使用して、前記固体支持体を洗浄し、溶出液を提供することと、
    前記溶出液を酵素消化条件に供して、単離されたＨＣＰ不純物の成分を生成することと、
    質量分析計を使用して、前記単離されたＨＣＰ不純物の成分を同定すること。
  2. 前記界面活性剤が、相間移動界面活性剤、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記界面活性剤が、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質の濃度が、各ＨＣＰ不純物の濃度よりも、少なくとも約１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、または１，０００，０００倍高い、請求項１に記載の方法。
  5. 前記相互作用するペプチドリガンドが、コンビナトリアルヘキサペプチドリガンドのライブラリーである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＨＣＰ不純物が、前記質量分析計を使用して定量され、各ＨＣＰ不純物の検出限界が、約０．０５～０．１ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質が、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬品、または薬物である、請求項１に記載の方法。
  8. 酵素消化反応の酵素が、トリプシンである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、またはトリプル四重極質量分析計であり、前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに接続されている、請求項１に記載の方法。
  10. 前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析法）分析またはＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析法）分析を行うことができる、請求項１に記載の方法。
  11. 試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を同定するためのシステムであって、以下を含む、システム：
    固体支持体と、
    相互作用するペプチドリガンドであって、
    前記相互作用するペプチドリガンドが、前記固体支持体に結合され、
    前記ＨＣＰ不純物が、前記相互作用するペプチドリガンドと結合することができる、
    前記相互作用するペプチドリガンドと、
    界面活性剤を含む溶液と、
    前記ＨＣＰ不純物から成分を生成することができる酵素消化溶液と、
    前記成分を同定または定量することができる質量分析計。
  12. 前記界面活性剤が、相間移動界面活性剤、イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のシステム。
  13. 前記界面活性剤が、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである、請求項１１に記載のシステム。
  14. 少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質の濃度が、各ＨＣＰ不純物の濃度よりも、少なくとも約１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、または１，０００，０００倍高い、請求項１１に記載のシステム。
  15. 前記相互作用するペプチドリガンドが、コンビナトリアルヘキサペプチドリガンドのライブラリーである、請求項１１に記載のシステム。
  16. 各ＨＣＰ不純物の検出限界が、約０．０５～０．１ｐｐｍである、請求項１１に記載のシステム。
  17. 少なくとも１つの高存在量ペプチドまたはタンパク質が、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬品、または薬物である、請求項１１に記載のシステム。
  18. 前記酵素消化溶液の酵素がトリプシンである、請求項１１に記載のシステム。
  19. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、またはトリプル四重極質量分析計であり、前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに接続されている、請求項１１に記載のシステム。
  20. 前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析法）分析またはＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析法）分析を行うことができる、請求項１１に記載のシステム。
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