CN117813504A - 对蛋白质样品中的残留宿主细胞蛋白质的鉴定和定量 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于确定对样品中的一种或多种蛋白质进行的鉴定和定量的高灵敏度方法。例如，本公开提供了用于对蛋白质样品中的残留宿主细胞蛋白质进行高灵敏度鉴定和定量的方法，并且能够适于以靶向或靶标不可知的方式对蛋白质进行鉴定和定量，并且能够经过修改以实现适用于不同用例的灵敏度范围。

Description

对蛋白质样品中的残留宿主细胞蛋白质的鉴定和定量
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月4日提交的美国临时申请号63/197,052的优先权，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入，并且要求其优先权。
技术领域
本公开涉及用于确定对样品中的一种或多种蛋白质进行的鉴定和定量的高灵敏度方法。例如，本公开提供了用于对蛋白质样品中的残留宿主细胞蛋白质进行高灵敏度鉴定和定量的方法，并且能够适于以靶向或靶标不可知的方式对蛋白质进行鉴定和定量，并且能够经过修改以实现适用于不同用例的灵敏度范围。
背景技术
多肽的大规模、经济的纯化日益成为生物技术行业的一个重要问题。一般而言，多肽通过细胞培养产生，其中使用通过插入含有用于该多肽的基因的重组质粒进行工程化以产生目的多肽的哺乳动物或细菌细胞系。由于所使用的细胞系为活生物体，因此需要从供给细胞的化合物混合物以及由细胞本身产生的内源性蛋白质(宿主细胞蛋白或“HCP”)中分离出目的多肽。
通常使用不同色谱技术的组合来实现目的多肽与HCP的分离。虽然生物技术行业中采用的此类复杂的分离策略能够高效去除HCP，从而提供经纯化的目的多肽的制剂，但对极低含量的HCP进行定量仍然是一个非常期望的目标。例如，存在于最终产品组合物(例如，超滤和渗滤(UF/DF)合并物、原料药(DS)和/或药品(DP))中的残留水解酶(hydrolyticenzyme/hydrolase)可能导致药品中的聚山梨酯(PS)降解，并且导致可见颗粒(VP)和不可见颗粒(SVP)问题。即使那些水解酶以极低含量存在，情况也是如此。因此，制定有效的策略来鉴定和定量低含量的HCP对于支持生物制品制造的工艺开发或研究特别有用。
虽然现有的解决方案，诸如脂肪酸质谱法(“FAMS”)分析或基于活性的测定，已经有效解决了PS降解的某些方面，但根本原因(即，引起最终产品中的PS20降解的水解酶)大多不为人所知。当涉及到定量时，这种对残留HCP的具体特性的了解的缺乏是一个特别棘手的问题，对于表现出有限的灵敏度的当前策略(通常为5ppm至10ppm)而言尤其如此。此外，现有的解决方案不适合于通常与生物制品开发相关联的时间表。例如，FAMS依赖于游离脂肪酸的产生，并且通常需要2周至4周才能出现可检测的PS降解，这可能成为工艺开发或研究的瓶颈。因此，本领域需要能够高度灵敏地定量蛋白质样品中的HCP的方法。特定而言，迫切需要可适于以靶向方式(例如，其中要鉴定和定量的HCP为预先确定的)或靶标不可知的方式(例如，其中要鉴定和定量的HCP不是预先确定的)鉴定和定量HCP的含量并且能够经过修改以实现适用于不同用例的灵敏度范围的方法。
发明内容
在第一方面，本公开涉及用于鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，这些方法包括：a)使样品与蛋白酶在足以消化存在于样品中的蛋白质的条件下接触；b)使包含经消化的蛋白质的样品与脱氧胆酸钠(SDC)在还原和加热条件下接触；c)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及e)使用LC-MS/MS来分析洗脱液以鉴定样品中的一种或多种蛋白质。在某些实施例中，LC-MS/MS是在数据依赖型采集(DDA)模式下进行的。
在某些实施例中，蛋白质为宿主细胞蛋白质。在某些实施例中，宿主细胞蛋白质为酶。在某些实施例中，酶为水解酶。
在某些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。在某些实施例中，样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。在某些实施例中，使经消化的蛋白质样品与约1％w/v的SDC接触。
在某些实施例中，色谱支持物为固相萃取支持物。在某些实施例中，色谱支持物为表面带电杂化支持物。
在某些实施例中，方法具有约0.1ppm至约5ppm的检测限(LOD)。
在某些实施例中，蛋白质产物为抗体。在某些实施例中，包含蛋白质产物的样品为部分或完全纯化的样品。在某些实施例中，部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为原料药样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为药品样品
在某些实施例中，样品中的蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。在某些实施例中，使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。在某些实施例中，用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。在某些实施例中，用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。在某些实施例中，使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
在另一方面，本公开涉及用于确定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种靶蛋白质的ppm水平的方法，这些方法包括：a)使样品与蛋白酶在足以消化一种或多种靶蛋白质的条件下接触；b)使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；c)使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及e)使用LC-MS/MS来分析洗脱液以对样品中的一种或多种靶蛋白质进行鉴定和定量，其中分析包括确定与一种或多种靶蛋白质的多个标准ppm水平相关联的信号以及将这些信号与针对样品中的一种或多种靶蛋白质所检测到的信号进行比较。在某些实施例中，LC-MS/MS是在平行反应监测(PRM)模式下进行的。
在某些实施例中，一种或多种靶蛋白质为宿主细胞蛋白质。在某些实施例中，宿主细胞蛋白质为酶。在某些实施例中，酶为水解酶。
在某些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。在某些实施例中，样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。在某些实施例中，使一种或多种经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
在某些实施例中，色谱支持物为固相萃取支持物。在某些实施例中，色谱支持物为表面带电杂化支持物。
在某些实施例中，方法具有约0.01ppm的定量限(LOQ)。
在某些实施例中，方法包括对来自LC-MS/MS分析的数据进行归一化。
在某些实施例中，蛋白质产物为抗体。在某些实施例中，包含蛋白质产物的样品为部分或完全纯化的样品。在某些实施例中，部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为原料药样品。
在某些实施例中，样品中的蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。在某些实施例中，使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。在某些实施例中，用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。在某些实施例中，用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。在某些实施例中，使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
在另一方面，在某些实施例中，本公开涉及用于以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，这些方法通过调整蛋白质产物的样品载量以实现期望的灵敏度：a)使包含蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化存在于样品中的蛋白质的条件下接触，b)使包含经消化的靶蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；c)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；e)使洗脱液重悬；以及f)使用LC-MS/MS来分析经重悬的洗脱液的级分，以鉴定样品中的一种或多种蛋白质。在某些实施例中，LC-MS/MS是在DDA模式下进行的。
在某些实施例中，经重悬的洗脱液的级分含有约6μg、约30μg、约60μg、约150μg或约300μg的蛋白质产物。
在某些实施例中，蛋白质为宿主细胞蛋白质。在某些实施例中，宿主细胞蛋白质为酶。在某些实施例中，酶为水解酶。在某些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。在某些实施例中，样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。在某些实施例中，使经消化的蛋白质样品或经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
在某些实施例中，色谱支持物为固相萃取支持物。在某些实施例中，色谱支持物为表面带电杂化支持物。
在某些实施例中，方法包括对来自液相色谱/质谱分析的数据进行归一化。
在某些实施例中，蛋白质产物为抗体。
在某些实施例中，包含蛋白质产物的样品为部分或完全纯化的样品。在某些实施例中，部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为抗体超滤/渗滤合并物样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为原料药样品。在某些实施例中，过程中合并物样品为药品样品。
在某些实施例中，使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。在某些实施例中，用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。在某些实施例中，用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。在某些实施例中，使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
附图说明
图1描绘了使用以下实例2中所述的方法在包含或不包含固相萃取(SPE)步骤的情况下在四种不同的mAb-2 UF/DF合并物组合物中鉴定出的HCP肽和HCP蛋白质的数量。四种不同的UFDF合并物组合物由A、B、C和D表示；使用SPE与在方法中不使用SPE形成对比(例如，在药品组合物A中分别为“A_SPE”和“A”)。
图2A至2C描绘了使用以下实例3中所述的方法在添加和不添加脱氧胆酸钠(SDC)的情况下以及相对于SDC添加的时间鉴定出的目的肽和缔合的蛋白质的数量。图2A描绘了使用BEH柱、过夜消化、1:400的胰蛋白酶:蛋白质比率，由添加有五种重组水解酶(LPL、PLBL2、SMPD1、PPT1和LipA)各百万分之一份(1ppm)的mAb-1 UF/DF合并物的消化物得到的结果。图2B描绘了使用CSH柱、2小时消化、1:2000的胰蛋白酶:蛋白质比率，由添加有八种重组水解酶各0.1ppm的mAb-1 UF/DF合并物的消化物的结果。为评定结果的重现性，测试一式两份地进行，由重复1(Repl.1)和重复2(Repl.2)表示。图2C描绘了以5ppm添加有9种已鉴定的蛋白质并且在还原和加热步骤(“SDC_reduction1”和“SDC_reduction2”)期间或在还原和加热之前向消化物中添加SDC(“SDC_digest1”和“SDC_digest2”)所得到的mAb-2消化物的结果。
图3描绘了使用以下实例4中所述的方法对mAb-1 UF/DF合并物组合物中的四种目的HCP的鉴定。如实例4中所概述，在25g/L mAb-1蛋白质浓度下采用1:400、1:2000、1:5000和1:10000的胰蛋白酶:蛋白质比率。
图4A至4B描绘了在不同胰蛋白酶消化条件下添加至mAb-1 UF/DF合并物组合物中的八种重组水解酶的鉴定。图4A描绘了在30μg样品载量下mAb-1中大约1ppm(0.58ppm至1.22ppm)的八种加标水解酶的结果(注：30μg样品载量是指从来自2mg mAb-1药品组合物起始材料的100μL重悬消化物中加载1.5μL)。图4B描绘了在400μg样品载量下mAb-1中大约0.1ppm(0.058ppm至0.27ppm)的八种加标水解酶的结果。为评定结果的重现性，测试一式两份地进行，由重复1(Repl.1)和重复2(Repl.2)表示。
图5描绘了在不同样品载量下鉴定出的加标蛋白质的数量。8种重组水解酶是以0.1ppm至5ppm范围内的不同含量添加的。各种样品载量是基于预期的灵敏度需求来选择的，例如，针对1ppm加标样品选择30μg起始材料载量，如实例5中所概述。结果表明，样品载量成功地调节了消化时UF/DF合并物组合物的10g/L蛋白质浓度下的灵敏度。为评定结果的重现性，测试一式两份地进行，由重复1(repl.1)和重复2(repl.2)表示，并且针对每个测试样品的LC-MS/MS进样也一式两份地进行(如A和B所示)。
图6A至6B描绘了实例6的结果，并且通过独特肽计数的数量证明了胰蛋白酶消化时间和消化时蛋白质浓度对添加的重组水解酶的鉴定的影响。胰蛋白酶消化时间经过进一步微调，以提高鉴定低含量(0.058ppm至0.27ppm)的八种重组水解酶的灵敏度和方法稳健性。图6A描绘了10g/L蛋白质浓度下胰蛋白酶消化2、3和4小时的影响。图6B描绘了消化时蛋白质浓度的影响(10g/L与25g/L相比)。为评定结果的重现性，测试一式两份地进行，由重复1(repl.1)和重复2(repl.2)表示。
图7示出25g/L蛋白质浓度和4小时消化时可靠的0.1ppm灵敏度。确定以低含量(0.058ppm至0.27ppm)添加至蛋白质样品中的八种重组水解酶的独特肽计数。通过使用先前用过的或新的SPE/nanoLC柱一致地鉴定出含量≥0.1ppm的所有水解酶，证明了该方法的重现性/稳健性。
图8描绘了基于标准添加的平行反应监测(PRM)工作流程用于定量蛋白质样品中的低含量靶向HCP的示意图。
具体实施方式
本公开涉及用于确定对样品中的一种或多种蛋白质进行的鉴定和定量的高灵敏度方法。例如，本公开的主题提供了用于高灵敏度地鉴定和定量生物制品制造期间所产生的蛋白质样品中的残留宿主细胞蛋白质的方法。在某些实施例中，此类方法可适应于鉴定和定量预先确定的蛋白质(即，作为定量靶标的特定蛋白质)的水平，例如“靶蛋白质”或“靶向蛋白质”。在某些实施例中，此类方法可适应于以靶标不可知的方式进行，以鉴定和定量未预先确定或先验选择作为定量靶标的蛋白质(例如，“非靶向蛋白质”)的含量。在某些实施例中，可修改此类方法以实现适用于不同用例的灵敏度范围。
为清楚起见，但不作为限制，本文所公开的主题的具体实施方式分为以下小节：
1.定义；
2.用于鉴定蛋白质的靶标不可知的方法；
3.用于定量蛋白质的靶向方法；以及
4.通过改变样品载量来调节灵敏度。
1.定义
在本说明书中使用的术语在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书的其他地方讨论，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制造和使用它们时向从业者提供额外的指导。
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，“一个/种”或“一者”一词的使用可以表示“一个/一种/一者”，但也与“一个一种/一者或多个/多种/多者”、“至少一个/一种/一者”和“一个/一种/一者或超过一个/一种/一者”的含义一致。
本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，并不排除额外行为或结构的可能性。本公开还考虑其他实施方案“包括”本文所提出的实施方案或元件、“由其构成”和“基本上由其构成”，无论是否明确提出。
术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，“约”可以意谓3个或多于3个标准偏差。另选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且更优选地至多1％的范围。另选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。
“培养”细胞是指在适合于细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。
如本文所用，术语“细胞”是指任何合适的原核细胞或真核细胞。例如，合适的真核细胞包括动物细胞，例如哺乳动物细胞。在某些实施例中，合适的细胞为培养细胞。在某些实施例中，合适的细胞为宿主细胞、重组细胞和重组宿主细胞。在某些实施例中，合适的细胞是从哺乳动物组织获得或源自哺乳动物组织的细胞系，当将其置于含有适当营养物质和/或生长因子的培养基中时能够生长和存活。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸可被随后引入以创建重组细胞的细胞及其子代。这些宿主细胞也可以已被修饰(即，工程化)以改变或删除某些内源性宿主细胞蛋白质的表达。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代不需要与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。将外源核酸引入(例如，通过转染)至这些宿主细胞将创建源自原始“宿主细胞”、“宿主细胞系”或“宿主细胞系”的重组细胞。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”也可以指此类重组细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中以使得能够表达目的重组产物的细胞及其子代。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”也可以指此类重组细胞及其子代。由此类细胞表达的重组产物可以是重组蛋白、重组病毒颗粒或重组病毒载体。
术语“哺乳动物宿主细胞”或“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物的细胞系，当它们置于单层培养物中或含有适当营养物和生长因子的培养基中的悬浮培养物中时，能够生长和存活。特定细胞系的必需生长因子很容易凭经验确定而无需过度实验，例如MammalianCell Culture(Mather,J.P.编，Plenum Press,N.Y.1984)和Barnes与Sato,(1980)Cell,22:649中所述。通常，细胞能够表达并分泌大量特定蛋白质(例如糖蛋白)到培养基中。在本公开的上下文中合适的哺乳动物宿主细胞的实例可包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:42161980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)；CHO-K1(ATCC,CCL-61)；通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59 1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251 1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。在某些实施例中，哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)。
如本文所用，“多肽”通常是指具有超过约十个氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以与宿主细胞同源或优选地可以是外源性的，这意味着对于所利用的宿主细胞而言，这些多肽是异源的，即，是外来的，诸如中国仓鼠卵巢细胞生产的人蛋白质、或由哺乳动物细胞生产的酵母多肽。在某些实施方案中，使用哺乳动物多肽(最初源自哺乳动物生物体的多肽)，更优选那些直接分泌到培养基中的多肽。
术语“蛋白质”意为其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。这是为了与“肽”或其他不具有此类结构的小分子量药物区分开。通常，本文的蛋白质将具有至少约15至20kD的分子量，优选至少约20kD。本文定义中涵盖的蛋白质的示例包括宿主细胞蛋白质以及所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性蛋白质和诊断性蛋白质，诸如治疗性抗体和诊断性抗体，并且一般是含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
术语“宿主细胞蛋白质”在本文中以最广泛的意义使用，并且涵盖由用于表达外源性核酸(例如，用于产生目的多肽)的细胞所产生的内源性蛋白质。一般而言，目的多肽通过培养重组细胞(例如，通过插入含有该多肽的基因的重组质粒进行工程化以产生目的多肽的哺乳动物或细菌细胞系)产生。由于所使用的培养细胞为活生物体，因此除外源性引入目的多肽以外，它们还产生内源性蛋白质。因此，在细胞培养物生产过程结束时，细胞培养收获物为细胞本身所产生的蛋白质(宿主细胞蛋白质或“HCP”)和目的多肽(例如，抗体)的复杂混合物。
术语“残留宿主细胞蛋白质”用于指在细胞培养收获物通过下游加工纯化后持续存在并且在生物制品制造期间保留在纯化过程中合并物中和/或之外(例如，在原料药和/或药品中)的宿主细胞蛋白质。
术语“产物”、“蛋白质产物”和“重组蛋白质产物”可互换使用，并且是指由表达通过重组技术引入的外源性核酸的宿主细胞或重组细胞产生的重组产物。由此类细胞表达的重组产物可以是重组蛋白质(例如，抗体)、重组病毒颗粒或重组病毒载体。
2.用于鉴定蛋白质的靶标不可知的方法
在一个方面，本文所公开的主题提供了使用靶标不可知的方法鉴定样品中的一种或多种蛋白质的方法(例如，其中所鉴定的蛋白质并非预先确定的)。在某些实施例中，本公开提供了用于鉴定样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法，这些方法包括对来自液相色谱/质谱分析的数据进行归一化。
在某些实施例中，本公开提供了用于鉴定包含抗体的样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法。在某些实施例中，包含抗体的样品为部分纯化的样品。在某些实施例中，包含抗体的样品为纯化过程中合并物样品，诸如抗体超滤/渗滤合并物样品。在某些实施例中，包含抗体的样品为原料药或药品样品。
例如但不限于，本文所公开的用于鉴定样品(例如，包含重组蛋白质产物的样品)中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法，这些方法可包括：
a)在足以消化样品中的蛋白质的条件下使含有蛋白质的样品与蛋白酶接触；
b)使包含经消化的蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)从样品中分离SDC、未消化的蛋白质和变性的蛋白质；
d)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；
e)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
f)使用LC-MS/MS(例如，在数据依赖型采集(DDA)模式下)分析洗脱液，以鉴定样品中以方法检测限(LOD)水平或高于LOD水平的一种或多种蛋白质。
在LC-MS/MS分析之前，从天然消化过程中有效去除未消化的蛋白质可改善分析稳健性，因为未消化的蛋白质如果不去除，则可能导致色谱柱堵塞并且缩短LC柱寿命。本文所公开的主题至少部分地基于以下发现：使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触的步骤允许更有效地从肽中去除蛋白质，从而允许提高LC-MS分析稳健性。因此，某些实施例中，本公开的方法包括使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质的步骤。在某些实施例中，色谱支持物为表面带电杂化支持物。在某些实施例中，色谱支持物为SPE支持物。
然而，天然消化策略可能遗漏与重组多肽产物(诸如mAb产物)缔合的蛋白质(例如，HCP)，并因此存在于原始蛋白质组合物(例如，mAb药品组合物)中，但它们在沉淀期间被去除。本文所公开的主题至少部分地基于以下发现：SDC添加增强了本文所述的方法的检测灵敏度，例如对于低丰度HCP(包括与重组多肽缔合的那些(例如，mAb产物))。不遵循任何理论，包含SDC添加的改善的肽(例如，HCP肽)鉴定可通过以下来解释：SDC能够破坏蛋白质(例如，HCP)与重组多肽产物(诸如mAb产物)之间的强相互作用，这些强相互作用可能导致最终药品中存在残留蛋白质(例如，HCP)。在某些实施例中，本公开的方法包括使包含经消化的蛋白质产物的样品与SDC在还原和加热条件下接触的步骤。如图2C所示，与还原前添加SDC相比，包括使包含经消化的蛋白质产物的样品与SDC在还原和加热条件下接触的方法增加了对低含量HCP的鉴定。不受理论的约束，此改善可能是因为天然消化条件当在还原和加热条件下添加SDC时得以维持，而在还原之前添加SDC则导致“天然”消化变成“变性”消化。与原始天然消化条件相比，变性消化可增加mAb的消化并且减少HCP鉴定。在某些实施例中，SDC为约0.9％w/v。
在某些实施例中，本公开的方法涉及用于酶消化的特别合适的酶-蛋白质比率，例如，蛋白酶:蛋白质产物比率，其中蛋白质是指所分析的样品中的重组蛋白质产物(例如，mAb产物)的浓度。例如，在某些实施例中，特定的酶:蛋白质比率可用于减少用于消化的总样品体积。在某些实施例中，消化物中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:200。在某些实施例中，消化物中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:400。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:800。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:4000。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:2000。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:200至约1:4000。在某些实施例中，酶为蛋白酶。在某些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些实施例中，将消化的蛋白质稀释至样品中重组蛋白质产物的浓度范围为2.5g/L至25g/L。在某些实施例中，将蛋白质产物稀释至2.5g/L的浓度。在某些实施例中，将蛋白质产物稀释至5g/L的浓度。在某些实施例中，将蛋白质产物稀释至10g/L的浓度。在某些实施例中，将蛋白质产物稀释至25g/L的浓度。
在某些实施例中，本公开的方法提供了用于酶消化的酶:蛋白质比率(例如，蛋白酶:蛋白质产物比率)与消化时的重组蛋白质产物浓度相关。在某些实施例中，在包含对应的胰蛋白酶:蛋白质比率的消化时的不同蛋白质产物浓度提供了增加的灵敏度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:200并且将经消化的蛋白质产物稀释至2.5g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:400并且将蛋白质产物稀释至5g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:800并且将蛋白质产物稀释至10g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:2000并且将蛋白质产物稀释至25g/L的浓度。
在某些实施例中，本文所公开的主题提供了用于鉴定样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法，这些方法包括使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约2小时至约4小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约2小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约3小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约4小时。
在某些实施例中，本文所公开的主题提供了用于鉴定一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法，其中方法具有约百万分之0.1份(ppm)的检测限(LOD)。在某些实施例中，方法具有约0.2ppm的LOD。在某些实施例中，方法具有约0.5ppm的LOD。在某些实施例中，方法具有约1ppm的LOD。在某些实施例中，方法具有约5ppm的LOD。
3.用于定量蛋白质的靶向方法
在另一方面，本文所公开的主题提供了用于鉴定和定量样品中的一种或多种靶向蛋白质的方法。在某些实施例中，一种或多种靶向蛋白质的定量包括确定一种或多种靶向蛋白质的ppm水平。
在某些实施例中，样品中的一种或多种靶向蛋白质为宿主细胞蛋白质，诸如宿主细胞酶。在某些实施例中，样品中的一种或多种靶向蛋白质为水解酶。
在某些实施例中，靶向蛋白质选自由以下项组成的组：N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(酸性神经酰胺酶)(ASAH1)；棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)；鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)；溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)；脂蛋白脂肪酶(LPL)；脂肪酶A(LIPA)；假定磷脂酶B样2(PLBL2)；和磷脂酶D家族成员3(PLD3)。
在某些实施例中，靶向蛋白质选自由以下项组成的组：凝溶胶蛋白；乳运铁蛋白；血清运铁蛋白(脱铁运铁蛋白)；血清白蛋白；过氧化氢酶；组氨酰-tRNA合成酶；抗凝血酶-III；微管相关蛋白tau；肌酸激酶M型；小泛素相关修饰蛋白1(SUMO-1)；膜联蛋白A 5；NAD(P)H脱氢酶(醌)1；碳酸酐酶2；碳酸酐酶1；核糖基二氢烟酰胺脱氢酶；谷胱甘肽S-转移酶A1(GST A1)；谷胱甘肽S-转移酶P(GST-P)；C-反应蛋白；泛素结合酶E2 E1(UbcH6)；BH3相互作用域死亡激动剂(BID)；过氧化还原蛋白1；GTP酶HRas(Ras蛋白)；视黄醇结合蛋白；泛素结合酶E2 C(UbcH10)；肽基脯氨酰顺反异构酶A；泛素结合酶E2 I(UbcH9)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；肌红蛋白C；干扰素γ(IFN-γ)；瘦素；细胞色素b5；血红蛋白β链；超氧化物歧化酶(Cu-Zn)；γ-突触核蛋白；血红蛋白α链；脂肪酸结合蛋白；溶菌酶C；α-乳清蛋白；硫氧还蛋白；血小板源性生长因子B链；β-2-微球蛋白；细胞色素c(辅细胞色素c)；泛素；拟素(Nedd8)；补体C5(补体C5a)；白介素-8；胰岛素样生长因子II；和表皮生长因子。
在某些实施例中，本公开提供了用于鉴定和定量包含抗体的样品中的一种或多种靶蛋白质的方法。在某些实施例中，包含抗体的样品为部分纯化的样品。在某些实施例中，包含抗体的样品为纯化过程中合并物样品，诸如抗体超滤/渗滤合并物样品。在某些实施例中，包含抗体的样品为原料药或药品样品。
在某些实施例中，本公开提供了用于鉴定和定量样品(例如，包含蛋白质产物的样品)中的一种或多种靶蛋白质的方法，这些方法包括：
a)使样品与蛋白酶在足以消化存在于样品中的一种或多种靶蛋白质的条件下接触；
b)使包含经消化的靶蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)从样品中分离SDC、未消化的蛋白质和变性的蛋白质；
d)使包含经消化的靶蛋白质的样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；
e)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
f)使用LC-MS/MS来分析(例如，在平行反应监测(PRM)模式)洗脱液，并且将此类分析的结果与一种或多种靶蛋白质的多个标准ppm水平相关联的信号进行比较，以鉴定并且定量样品中的一种或多种靶蛋白质的ppm水平。
在某些实施例中，本公开的方法包括使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白的步骤。在某些实施例中，色谱支持物为表面带电杂化支持物。在某些实施例中，色谱支持物为SPE支持物。
在某些实施例中，实现本公开的方法，该方法包括使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触的步骤。在某些实施例中，SDC为约0.9％w/v。
在某些实施例中，本公开的方法涉及预先确定的酶:蛋白质比率，例如蛋白酶:蛋白质产物比率，用于改善酶消化和整体灵敏度。例如，在某些实施例中，特定的酶:蛋白质比率可用于减少用于消化的总样品体积。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:200。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:400。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:800。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:4000。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:2000。在某些实施例中，酶为蛋白酶。在某些实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶。
在某些实施例中，本公开的方法提供了用于酶消化的酶:蛋白质比率(例如，蛋白酶:蛋白质产物比率)与消化时的重组蛋白质产物浓度相关。在某些实施例中，在包含对应的胰蛋白酶:蛋白质比率的消化时的不同蛋白质产物浓度提供了增加的灵敏度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:200并且将蛋白质产物稀释至2.5g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:400并且将蛋白质产物稀释至5g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:800并且将蛋白质产物稀释至10g/L的浓度。在某些实施例中，样品中的酶与蛋白质的w/w比率为约1:2000并且将蛋白质产物稀释至25g/L的浓度。
在某些实施例中，本文所公开的主题提供了用于鉴定和定量样品中的一种或多种靶蛋白质的ppm水平的方法，该方法包括使含有重组蛋白的样品与蛋白酶在足以消化该蛋白质的条件下接触约2小时至约4小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约2小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约3小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约4小时。
在某些实施例中，本文所公开的主题提供了用于鉴定和定量一种或多种靶蛋白质的ppm水平的方法，其中该方法具有约0.01ppm的定量限(LOQ)。在某些实施例中，对重悬洗脱液的级分的分析可包括使用LC-MS/MS在PRM模式下确定样品中靶蛋白质的ppm水平，可包括确定已知靶蛋白质的与多个标准ppm水平相关联的信号，并且对将这些信号与针对样品中的已知靶蛋白质所检测到的信号进行比较，从而实现0.01ppm的定量灵敏度。
4.通过改变样品载量来调节灵敏度
在另一方面，本文所公开的主题提供了用于调节本文所述的鉴定和定量策略的灵敏度的方法。在某些实施例中，此类灵敏度的调节可通过选择待结合本公开的方法消化的样品中蛋白质的特定的量(例如，重组蛋白质产物的量)来实现。例如但不限于，存在于进样用于LC-MS/MS分析的样品中的重组蛋白产物的量可基于起始材料的量，例如，30μg样品载量意指从来自2mg起始材料消化物的100μL重悬消化物中加载1.5μL。
在某些实施例中，本公开提供了用于以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法。在某些实施例中，本公开的以预先确定的灵敏度来鉴定样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法可包括：
a)使预先确定的蛋白质产物浓度的含有蛋白质的样品与蛋白质在足以消化蛋白质的条件下接触；
b)使包含经消化的蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)从样品中分离SDC、未消化的蛋白质和变性的蛋白质；
d)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；
e)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
f)使用LC-MS/MS(例如，在DDA模式下)分析洗脱液，以鉴定样品中的一种或多种蛋白质。
在某些实施例中，本公开提供了用于经由液相色谱/质谱法确定样品中的蛋白质的浓度来分析具有预先确定的量的重组蛋白产物的重悬浮洗脱液的级分，以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定样品中的蛋白质的靶标不可知的方法。如上所述，存在于进样用于LC-MS/MS分析的样品中的重组蛋白产物的量可基于起始材料的量(例如，30μg样品载量意指从来自2mg起始材料消化物的100μL重悬消化物中加载1.5μL)的量来确定。在某些实施例中，经重悬的洗脱液的级分含有约6μg、约30μg、约60μg、约150μg或约300μg的蛋白质产物。在某些实施例中，重悬洗脱液的级分含有约6μg蛋白质产物。在某些实施例中，重悬洗脱液的级分含有约30μg蛋白质产物。在某些实施例中，重悬洗脱液的级分含有约60μg蛋白质产物。在某些实施例中，重悬洗脱液的级分含有约150μg蛋白质产物。在某些实施例中，重悬洗脱液的级分含有约300μg蛋白质产物。
在某些实施例中，本文所公开的主题提供了用于以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定样品中的一种或多种蛋白质的靶标不可知的方法，这些方法包括使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约2小时至约4小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约2小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约3小时。在某些实施例中，使含有蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化蛋白质的条件下接触约4小时。
5.示例性非限制性实施例
A.在某些实施例中，本公开涉及用于鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，这些方法包括：
a)使样品与蛋白酶在足以消化存在于样品中的蛋白质的条件下接触；
b)使包含经消化的蛋白质的样品与脱氧胆酸钠(SDC)在还原和加热条件下接触；
c)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；
d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
e)使用LC-MS/MS来分析洗脱液以鉴定样品中的一种或多种蛋白质。
A1.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中LC-MS/MS是在数据依赖型采集(DDA)模式下进行的。
A2.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中蛋白质为宿主细胞蛋白质。
A3.在某些实施例中，本公开涉及A2所述的方法，其中宿主细胞蛋白质为酶。
A4.在某些实施例中，本公开涉及A3所述的方法，其中酶为水解酶。
A5.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中蛋白酶为胰蛋白酶。
A6.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
A7.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中使经消化的蛋白质样品与约1％w/v的SDC接触。
A8.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中色谱支持物为固相萃取支持物。
A9.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中色谱支持物为表面带电杂化支持物。
A10.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中方法具有约0.1ppm至约5ppm的检测限(LOD)。
A11.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中蛋白质产物为抗体。
A12.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
A13.在某些实施例中，本公开涉及A12所述的方法，其中部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
A14.在某些实施例中，本公开涉及A13所述的方法，其中过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。
A15.在某些实施例中，本公开涉及A13所述的方法，其中过程中合并物样品为原料药样品。
A16.在某些实施例中，本公开涉及A13所述的方法，其中过程中合并物样品为药品样品。
A17.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中样品中的蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。
A18.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
A19.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
A20.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。
A21.在某些实施例中，本公开涉及A所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
B.在某些实施例中，本公开涉及用于确定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种靶蛋白质的ppm水平的方法，这些方法包括：
a)使样品与蛋白酶在足以消化一种或多种靶蛋白质的条件下接触；
b)使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；
d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
e)使用LC-MS/MS分析洗脱液以对样品中的所述一种或多种靶蛋白质进行鉴定和定量，其中分析包括确定与一种或多种靶蛋白质的多个标准ppm水平相关联的信号以及将这些信号与针对样品中的一种或多种靶蛋白质所检测到的信号进行比较。
B1.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中LC-MS/MS是在平行反应监测(PRM)模式下进行的。
B2.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中一种或多种靶蛋白质为宿主细胞蛋白质。
B3.在某些实施例中，本公开涉及B2所述的方法，其中宿主细胞蛋白质为酶。
B4.在某些实施例中，本公开涉及B3所述的方法，其中酶为水解酶。
B5.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中蛋白酶为胰蛋白酶。
B6.根据B所述的方法，其中样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
B7.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中使一种或多种经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
B8.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中色谱支持物为固相萃取支持物。
B9.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中色谱支持物为表面带电杂化支持物。
B10.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中方法具有约0.01ppm的LOQ。
B11.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其进一步包括对来自LC-MS/MS分析的数据进行归一化。
B12.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中蛋白质产物为抗体。
B13.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
B14.在某些实施例中，本公开涉及B13所述的方法，其中部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
B15.在某些实施例中，本公开涉及B14所述的方法，其中过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。
B16.在某些实施例中，本公开涉及B14所述的方法，其中过程中合并物样品为原料药样品。
B17.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中样品中的蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。
B18.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
B19.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
B20.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。
B21.在某些实施例中，本公开涉及B所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
C.在某些实施例中，本公开涉及用于以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，这些方法通过调整蛋白质产物的样品载量以实现期望的灵敏度：
a)使包含蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化存在于样品中的蛋白质的条件下接触，
b)使包含经消化的蛋白质的样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)使包含经消化的蛋白质的样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；
d)使色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；
e)使洗脱液重悬；以及
f)使用LC-MS/MS来分析经重悬的洗脱液的级分，以鉴定样品中的一种或多种蛋白质。
C1.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中LC-MS/MS是在DDA模式下进行的。
C2.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中经重悬的洗脱液的级分含有约6μg、约30μg、约60μg、约150μg或约300μg的蛋白质产物。
C3.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中蛋白质为宿主细胞蛋白质。
C4.在某些实施例中，本公开涉及C3所述的方法，其中宿主细胞蛋白质为酶。
C5.在某些实施例中，本公开涉及C4所述的方法，其中酶为水解酶。
C6.根据C所述的方法，其中蛋白酶为胰蛋白酶。
C7.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
C8.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中使经消化的蛋白质样品或经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
C9.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中色谱支持物为固相萃取支持物。
C10.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中色谱支持物为表面带电杂化支持物。
C11.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其包括对来自液相色谱/质谱分析的数据进行归一化。
C12.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中蛋白质产物为抗体。
C13.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
C14.在某些实施例中，本公开涉及C13所述的方法，其中部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
C15.在某些实施例中，本公开涉及C14所述的方法，其中过程中合并物样品为抗体超滤/渗滤合并物样品。
C16.在某些实施例中，本公开涉及C14所述的方法，其中过程中合并物样品为原料药样品。
C17.在某些实施例中，本公开涉及C14所述的方法，其中过程中合并物样品为药品样品。
C18.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中使样品与蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
C19.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中用于使样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
C20.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的温度为约90℃。
C21.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的样品与SDC接触的时间为约10分钟。
实例
材料和方法
材料
全长mAb-1(IgG1，全长)、mAb-2(IgG1 Fab)和mAb-3(IgG1，全长)药品组合物是内部生产的。重组人脂蛋白脂肪酶(LPL)购自R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。所有其他七种重组水解酶均通过将C端6xHis或双6xHis-Flag表位融合至各水解酶作为纯化标签来产生。表达构建体通过DNA测序验证并瞬时转染到CHO细胞中。在转染后10天收获重组酶，并且通过Ni-NTA、体积排阻和抗His亲和色谱纯化。将七种重组水解酶与重组LPL合并以生成水解酶标准品(STD)。这些酶的名称、分子量(MW)、重组标准品的纯度以及在内部生产的mAb-1药品组合物中以百万分之一份(ppm)为单位所测量的含量(在本文所述的任何加标之前)(“mAb-1中的内源性含量”)列于表1中。通用蛋白质组标准品1(UPS-1)购自(Sigma-Aldrich)，并且含有已知等摩尔浓度并且MW范围为6.3kDa至82.9kDa的48种重组蛋白的混合物。人源化IgG1κ单克隆抗体标准品RM 8671购自美国国家标准与技术研究院(NIST)。重组牛胰蛋白酶来自Roche。所有试剂储备液均用LCMS级水制备。
表1.mAb-1药品组合物中的这八种水解酶的分子量、重组标准品的纯度和内源性含量。
*重组人LPL购自R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)，并且按照制造商提供的分析证书，其纯度为约95％。其他7种重组水解酶为CHO衍生的蛋白质，且其纯度通过体积排阻色谱法进行评定。
**在mAb-1药品中未检测到(ND)PPT1、SMPD1、LPLA1、LipA和PLD3。
设备
在样品制备期间使用能够保持37℃的水浴(VWR Scientific，1235型或同等产品)、能够保持90℃的干浴(USA Scientific，BSH200型或同等产品)以及能够高速和温度控制的离心机(Eppendorf，5424R型或同等产品)。
HCP模型样品的制备
通过将Hydrolase STD或UPS-1蛋白质标准溶液以指定的ppm水平添加至特定mAb中，制备药品中低含量HCP的模型，其中ppm代表各蛋白质相对于抗体重量的重量。
天然消化
将2mg抗体样品等分试样用水和1M Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)稀释至期望的蛋白质浓度(范围为2.5、5、10和25g/L)，并且用牛胰蛋白酶分别以1:200、1:400、1:800和1:2000的酶:蛋白质比率(w/w)在37℃消化2小时，然后在存在0.9％w/v脱氧胆酸钠(SDC)的情况下用11mM TCEP(Thermo Scientific，BondbreakerTM TCEP溶液，77720)还原并且在90℃干浴中加热10min。将样品冷却至室温，且然后用7％甲酸(FA)酸化至pH<2，以淬灭消化并且使SDC沉淀。使SDC沉淀物以及未消化和变性的蛋白质通过在20,000g和4℃下的30min离心步骤沉淀。将来自离心步骤的上清液转移至新的1.5mL低结合微量离心管(EppendorfTMLoBind 022431081或同等产品)中，并且在20,000g和4℃下再离心10min。将最终上清液通过Oasis HLBμElution板净化，用20μL 50％乙腈(ACN)洗脱，干燥并且重悬于100μL 0.1％甲酸的水溶液中。将每个处理后的样品转移至300μL锥形瓶中(Waters QuanRecovery withMaxPeak，186009186或同等产品)。请注意，进样用于LC-MS/MS分析的样品是基于起始材料的量，例如，30μg样品载量意指从来自2mg起始材料的100μL重悬消化物中加载1.5μL。
纳流RPLC-MS/MS分析
LC-MS/MS分析在与Orbitrap ExplorisTM 480质谱仪联用的UltiMate3000RSLCnano系统(Thermo Fisher Scientific)上进行。使用来自CoAnn Technologies(美国华盛顿州里奇兰)的定制的CSH C18(1.7μm,75μm×50cm)柱分离肽。流动相为0.1％ FA的水溶液(流动相A，pH约2.7)和0.1％ FA的ACN溶液(流动相B)。所有分离梯度均用250nL/min流速和60℃柱温运行，并且样品在自动进样器中保持在6℃。将消化物用0％ B以5μl/min加载到在线Waters NanoEase M/Z Symmetry C18柱(5μm，180μm×2cm捕集柱)上，并且用0％流动相B清洗10分钟，然后通过172min的LC梯度(250nL/min)进行分离：在1min内从1％B增加至5％B，在6min内从5％B增加至8％B，在42min内从8％B增加至15％B，在81min内从15％ B增加至24％ B，在31min内从24％ B增加至32％ B，在5min内32％ B增加至40％ B，在5min内从40％增加至50％，在1min内从50％ B增加至1％ B。每个LC梯度后还进行1％ B纳流柱平衡33min。质谱仪针对12种最强的离子在数据依赖型模式下操作。肽经受高能碰撞解离(HCD)碎裂，每次全MS扫描的归一化碰撞能量(NCE)为30％，分辨率为60,000，归一化自动增益控制(AGC)目标为300％，最大进样时间为100ms，m/z为300至1500，并且MS/MS事件的分辨率为15,000，归一化AGC目标的100％，最大进样时间为100ms。
用于HCP鉴定的数据分析
对于HCP鉴定，使用带有SEQUEST搜索的Thermo Proteome Discoverer软件(版本1.4)，将LC-MS/MS数据文件在含有相关生物治疗产品的序列加上所有加标蛋白质标准品的序列的数据库中搜索，该数据库连接到来自Uniprot.org的CHO Canonical和Isoform数据库(35,256个条目)和其他人污染物数据库。将连接到来自Uniprot.org的小鼠(musmusculus)Swiss-Prot数据库(2021年2月版；17,068个条目)的含有NIST mAb序列的数据库用于NIST mAb中的HCP分析。蛋白质需要具有两个独特的肽(在针对肽的5％的错误发现率下，通过诱饵数据库搜索进行评估)才能得到阳性鉴定。
实例1：高度灵敏且稳健的基于天然消化的1D LC-MS/MS工作流程的开发
典型的基于天然消化的工作流程包括四个关键步骤：1)非变性条件下的胰蛋白酶消化，2)还原和加热，3)通过离心去除未消化的抗体(主要是Fab和Fc结构域片段)，以及4)去除上清液用于LC-MS/MS分析。
为允许在本研究下进行多项研究，除非另有说明，否则使用添加至药品mAb-1中的八种纯化的重组水解酶蛋白来评定用于胰蛋白酶消化条件的参数以及影响灵敏且稳健的HCP鉴定和定量的其他样品制备步骤。由于这些蛋白质具有不同的纯度水平，并且其中一些在添加至药品之前以非常低的内源性含量存在(表1“内源性含量”)，因此即使在相同的目标含量下：八种水解酶中仅有五种达到或高于目标加标水平。例如，在0.1ppm加标样品中，八种水解酶的实际含量在0.058ppm至0.267ppm的范围内，并且8种蛋白质中只有5种达到或高于目标0.1ppm加标水平。
实例2：用于确保方法稳健性的离线SPE净化
在LC-MS/MS分析之前，从天然消化物中有效去除未消化的mAb对于确保分析的稳健性非常重要。根据LC-MS/MS分析，即使在20,000g下重复离心两次后，未消化的mAb仍未完全去除，导致柱堵塞或柱寿命缩短，如柱压升高或柱性能大幅降低所示。为提高分析稳健性并且进一步去除样品中残留的未消化的mAb，用改善的洗脱条件实现SPE步骤。在80％和50％ ACN洗脱条件下(n＝2)洗脱的样品均为澄清溶液。然而，在将样品干燥至适当体积以去除ACN后，针对用80％ ACN洗脱的样品，观察到少量沉淀；50％ ACN洗脱的样品保持澄清。离心后，一些变性的mAb可能残留在溶液中，并且用80％ ACN从SPE中洗脱，然后在通过SpeedVac去除大部分ACN后发生沉淀。因此，选择ACN含量较低(50％)的洗脱条件进行SPE净化。该50％ ACN含量足以回收期望的经消化的HCP肽，因为大多数肽通常在<25％ ACN下从RP柱洗脱，并且相对较大且疏水的未消化mAb仍可保留在SPE上。
如图1所示，总体而言，与不使用SPE的方法相比，带有额外的SPE净化的方法从mAb-2的四种不同UFDF合并物样品中一致地鉴定出数量相当的蛋白质和略多的肽。最重要的是，额外的SPE净化提供了长柱寿命，并且在多次上样后提供更一致的柱压，这是稳健测定中的关键特征。
实例3：用于增强对低含量HCP的检测灵敏度的SDC添加
对于以1ppm添加七种HCP的全长mAb-1样品，如图2A所示，在还原/加热步骤中添加SDC(0.9％)增加了对于mAb-1中以1ppm加标的五种HCP(LPLA2、SMPD1、PPT1、PLD3和LipA)以及三种内源性HCP(LPL、PLBL2和ASAH1)所鉴定出的肽的总数(16种相对于11种)和蛋白质的总数(5种相对于3种)。因此，在天然消化方案中实现SDC添加。SDC可在用于蛋白质沉淀的同一步骤中去除。进一步评估了SDC添加方法在检测0.1ppm的低水平残留HCP方面的优势。对于含量从0.058ppm至0.267ppm的八种加标水解酶，SDC添加增加了肽鉴定(图2B)，并且鉴定出(n＝2)额外的蛋白质LPLA2，据报道，在<0.1ppm时该蛋白质导致PS降解并因此需要高灵敏度方法来检测和定量。表2显示了另外的实验，证明SDC添加方法增加了对于mAb-3中以0.1ppm至1.3ppm水平加标的UPS-1蛋白质的总体肽鉴定，其提高了低含量蛋白质鉴定的方法稳健性。
表2.对于以0.1ppm至1.3ppm添加至mAb-3中的UPS-1蛋白质所鉴定出的肽和蛋白质数量。
样品 蛋白质 肽
不使用SDC_rep1 39 292
不使用SDC_rep2 41 296
使用SDC_rep1 41 355
使用SDC_rep2 40 309
使用SDC添加对HCP/肽鉴定的改善可能是由于SDC能够破坏HCP与mAb之间的强相互作用，这些强相互作用已导致最终药品中存在残留HCP。先前的研究重点介绍了天然消化如何遗漏与mAb缔合并因此在沉淀期间被去除的HCP，目前使用和不使用SDC的结果进一步证实了这一点(图2B)。此外，SDC添加的时间可能影响低含量HCP的鉴定。例如，实验使用以5ppm添加9种蛋白质的mAb-2进行，并且在还原和加热步骤期间(“SDC_reduction1”和“SDC_reduction2”)或者在还原和加热之前向消化物中添加SDC(“SDC_digest1”和“SDC_digest2”)。如图2C所示，与在还原之前添加SDC相比，在还原和加热条件下添加SDC增加了对低含量HCP的鉴定。我们的发现表明，SDC在改善天然消化条件下低含量HCP的回收率方面发挥着出人意料的有效作用。
实例4：蛋白质浓度和胰蛋白酶比率
可评估胰蛋白酶:蛋白质比率和消化时间以增强胰蛋白酶的消化。先前的研究表明，与在5g/L蛋白质浓度下的原始天然消化方案中使用的1:400胰蛋白酶:蛋白质比率过夜消化相比，2h消化时间具有优势。当首次使用分析流LC-MS分析时，需要大量起始材料(约20mg)来检测低含量(0.1ppm及以上)HCP。因此，为减少用于消化的样品体积和样品载量，在25g/L的较高蛋白质浓度(代替5g/L)下测试胰蛋白酶:蛋白质比率，其中消化时间为2h。图3示出使用不同的胰蛋白酶:蛋白质比率在mAb-1中鉴定出的靶蛋白质(水解酶)的肽数量。来自四种靶蛋白质的大多数肽是在胰蛋白酶消化时针对25g/L的蛋白质浓度使用1:2000的胰蛋白酶:蛋白质比率获得的。使用0.1ppm至1.3ppm UPS-1加标的mAb-1的实验也证实，在25g/L的蛋白质浓度下，与1:400的比率相比，1:2000的胰蛋白酶:蛋白质比率鉴定出的UPS-1蛋白质增加一种(35种相对于34种)，并且鉴定出的UPS-1肽增加60种(266种相对于206种)。
使用2h消化，胰蛋白酶:蛋白质比率(25g/L蛋白质浓度下为1:2000，5g/L蛋白质浓度下为1:400)似乎与消化时的蛋白质浓度相关。为检验该假设，并且为具有宽浓度范围的代表性原料药或药品样品建立可预测的消化条件，对消化时不同蛋白质浓度(2.5、5、10和25g/L)与其对应的胰蛋白酶:蛋白质比率(1:200、1:400、1:800和1:2000)的组合以及它们对HCP鉴定的影响进行了评估。
在每种消化条件下(n＝2)，针对以约1ppm八种重组水解酶(实际含量在0.584ppm至1.122ppm的范围内)加标的样品所生成的数据。如图4A所示，所有消化条件均能够在30μg样品载量鉴定出所有这八种加标蛋白质。结果证实，当蛋白质:胰蛋白酶比率与消化时蛋白质浓度呈反比线性增加时，可实现类似的分析灵敏度。因此，为达到1ppm水平的灵敏度，基于样品的原始蛋白质浓度，可采用不同的消化策略，使用所测试的消化时蛋白质浓度与其对应的胰蛋白酶:蛋白质比率的组合。
针对以约0.1ppm加标的八种重组水解酶(实际含量在0.058ppm至0.267ppm的范围内，其中五种蛋白质的浓度为或接近0.1ppm及以上)，使用400μg的样品载量重复相同的实验。如图4B所示，在所有条件下均鉴定出八种水解酶中的四种至六种。与2.5g/L和5g/L条件相比，消化时较高的蛋白质浓度(10和25g/L)在两次方法重复中均鉴定出更多的肽。考虑到来自两次实验结果的结果，选择10g/L的蛋白质浓度，在消化时使用1:800的胰蛋白酶:蛋白质比率，以测试用样品载量调节灵敏度。
实例5：经样品载量调节的方法灵敏度
由于30μg起始材料分析表现出1ppm灵敏度(图4A)，因此对LC-MS/MS分析可接受范围内的样品载量能够按比例调节灵敏度的假设进行测试，即，从相同的消化物中，6μg载量预计表现出5ppm灵敏度，并且300μg载量预计表现出0.1ppm灵敏度。将具有从0.1ppm至5ppm范围内的不同加标水平的样品消化，并且根据预期的灵敏度需求选择不同的样品载量，例如，针对1ppm加标样品选择30μg起始材料载量。基于先前关于分析流CSH柱的报告，使用50cm长的纳流CSH柱，以允许更高的样品载量，从而提高灵敏度，同时保持良好的峰分离度。如图5所示，在灵敏度为0.5ppm至5ppm的样品载量条件(6μg至60μg起始材料)下，所有八种蛋白质均在两次方法重复中的至少一者中被鉴定出至少一次；在两次方法重复中均鉴定出处于或高于目标灵敏度水平的所有五种蛋白质。预测的0.1ppm和0.2ppm灵敏度也在所测试的样品载量下得到证明，其中一致地鉴定出五种水解酶中的四种处于或高于目标灵敏度水平，并且总共八种水解酶中的两种或三种低于目标水平。
随着LC-MS分析灵敏度的提高，将鉴定出更多的残留HCP。在评定相关联的安全风险之前，还需要确定每种HCP的含量。经调节的灵敏度提供了一种工具，以在进行更多靶向定量工作之前快速估计鉴定出HCP的含量。例如，如果在6μg、30μg和300μg载量分析中鉴定出X、Y和Z数量的蛋白质，则表明对应的蛋白质最有可能分别以≥5ppm、1ppm和0.1ppm的含量存在。对于具有X和Y种鉴定出的蛋白质的样品，不同(即，非重叠)蛋白质可能以在1ppm至5ppm之间的含量存在；类似地，对于具有Y和Z种鉴定出的蛋白质的样品，不同蛋白质可能以在0.1ppm至1ppm之间的含量存在。这些信息将有助于估计鉴定出的每种蛋白质的含量，并且支持决定是否需要进一步靶向定量以获得准确的HCP测量结果。
实例6：针对0.1ppm水平的改善的灵敏度和稳健性
为针对低含量(0.1ppm)进一步微调灵敏度并且提高方法稳健性，然后对10g/L下的胰蛋白酶消化时间进行评估。4h消化时间在两次方法重复中鉴定出最低含量的加标蛋白质LipA(0.058ppm)，并且至少一次鉴定出所有八种蛋白质，因此被视为最佳条件(图6A)。由于消化时25g/L的蛋白质浓度始终显示出更好的LPLA2检测效果，因此进一步比较了针对25g/L和10g/L蛋白质浓度的4h胰蛋白酶消化。图6B显示，在所有测试的条件下，25g/L和4h条件可鉴定出所有五种以>＝0.1ppm加标的蛋白质以及以<0.1ppm加标的三种蛋白质的两种，而10g/L则无法鉴定出0.1ppm的LPLA2并且总体上鉴定出更少的肽和蛋白质。图7证明了针对LipA的一致的0.058ppm灵敏度以及鉴定0.1ppm或以上的其他水解酶的稳健性(n＝3)。使用该方法的这些结果表明，与当前先进的方法相比，灵敏度得到显著改善：与大多数先前报道的方法灵敏度(10ppm)相比，增强了100倍以上；并且与最近报道的天然消化方法相比，灵敏度增强了约10倍。
实例7：mAb-3中添加的UPS-1蛋白质的鉴定
为进一步证实调节样品载量对于实现期望的蛋白质鉴定灵敏度的有效性，对添加有已知含量的48种UPS-1蛋白质以模拟痕量水平HCP的mAb-3样品进行了分析。使用包含以在0.10ppm至1.34ppm之间的水平加标的UPS-1蛋白质的mAb-3样品来证实0.1ppm灵敏度。表3显示，在300μg样品载量下，一致地鉴定出处于0.1ppm或更高(各自约4.8飞摩尔)的41种(85.4％)或更多种UPS-1蛋白质，证明对宽MW范围(6.3kDa至82.9kDa MW)内的蛋白质具有预期的灵敏度(n＝2)。类似地，使用含有0.16ppm至2.21ppm范围内的UPS-1蛋白质的mAb-3样品，用来自30μg起始材料的消化物来证实1ppm灵敏度。鉴定出含量在0.59ppm至2.21ppm之间的所有16种UPS-1蛋白质(n＝2)(表4)，证实了期望的1ppm灵敏度。
表3.在300μg样品载量下，以0.1ppm及更高含量添加mAb-3的48种UPS-1蛋白质的检测。
表4.在30μg载量下，以1ppm及更高含量添加mAb-3的48种UPS-1蛋白质的检测。
实例8：在RM8671 NIST mAb中鉴定出的HCP
为进一步证明用于鉴定蛋白质(例如，残留HCP)的靶标不可知的方法的灵敏度和稳健性并且与最近的报道进行比较，对RM8671 NIST抗体进行了分析。该方法被视为靶标不可知的方法，因为它不依赖关于这些样品中存在这些特定HCP的先验知识。基于本文所述的方法，平均鉴定出599.5种蛋白质和3589.5种独特的肽(30μg载量分析)以及722种蛋白质和4363.5种独特的肽(300μg载量分析)(表5)。这些分析鉴定出比报道的针对RM8671 NIST抗体中的HCP的最佳结果(602种蛋白质的2725种肽)更多的独特的肽和蛋白质，进一步证实本发明的方法用于HCP分析的高灵敏度和稳健性。此外，在方法重复分析中平均有90％(30μg载量)和88％(300μg载量)的蛋白质是共同的，显示了分析的高重现性。正如预期的那样，在使用300μg载量的分析中也由30μg载量分析发现了超过93％的蛋白质，证实300μg载量分析具有更高的灵敏度。与30μg载量分析相比，从300μg载量分析中鉴定出的另外的蛋白质可能以在0.1pmm至1ppm之间的含量存在。
表5.不同样品载量下在RM8671 NIST抗体中鉴定出的HCP的总结。
在30μg和300μg样品载量下，本研究鉴定出在原始天然消化方法中针对RM8670NIST mAb报道的60种蛋白质中的58至59种。在本公开中，分别从30μg和300μg载量分析中鉴定出在所报道的602种蛋白质中的平均421种(约70％)和466.5种(约77％)蛋白质。此外，通过我们的300μg载量分析还发现了602种蛋白质中前199种蛋白质中的95％(各自肽计数≥5)。蛋白质鉴定的差异可能是由于方法的差异；先前的报道将另外的Protein A去除和FAIMS气相分离应用于天然消化条件。
通过对天然消化LC-MS/MS工作流程的不同方面进行评估，本方法显示出DDA方法对HCP检测的最高灵敏度(0.1ppm)，以及对RM8671NIST mAb的最高的HCP覆盖率(总共845种蛋白质)。与在消化时5g/L的蛋白质浓度下确定酶比率的先前研究相比，本研究显示出较高的蛋白质浓度在鉴定和定量低含量HCP方面的优势。本研究也是首个表明能够为具有宽浓度范围(2.5g/L至25g/L)的代表性药品样品建立可预测的消化条件的工作。将该方法与平行反应监测(PRM)相结合时，本研究能够使用原始纯化方法来鉴定和定量mAb-1中含量低至0.01ppm的水解酶(表7)，诸如LipA和SMPD1，由于其含量极低，因此未从DDA中鉴定出来。对原始纯化方法进行改进后，降低了靶标水解酶的含量。纯化改进旨在通过添加另外的纯化步骤来改善HCP去除，因此结果表明，本方法可用于监测已知靶标水解酶的清除率以支持生物工艺开发。
表7.使用基于标准添加的平行反应监测(PRM)对mAb-1中的水解酶(在对纯化方法进行改进之前和之后)进行定量
*利用基于标准添加的方法监测对用于mAb-1的纯化方法进行改进之前和之后的水解酶清除率。首先，通过分别添加0、0.1、0.5和1ppm水解酶标准品，针对每个测试样品创建一系列标准添加样品。然后每个标准添加样品经受本文所述的天然消化方案处理，并且经受使用针对每种水解酶的2个最高响应的肽进行PRM分析。使用Skyline软件进行数据分析，然后生成每种蛋白质的靶标肽的标准添加图，其中以加标HCP含量(ppm)为X轴，并且以靶标肽的所有碎片离子的峰面积总和为Y轴。对于每个函数Y＝mX+b，测试样品中靶标HCP的ppm水平等于b/m，如果纯度<100％，则乘以原始加标蛋白质储备标准品的百分比纯度。当蛋白质的2种肽显示为不同数字时，取最高含量(粗体)进行HCP定量。当未检测到肽时，将其表示为ND。
本公开展示了改进的基于天然消化的工作流程，用于在用于重组mAb疗法的纯化过程中合并物、原料药或药品样品中≥0.1ppm的残留HCP(涵盖宽范围蛋白质大小)灵敏且稳健的鉴定。目前的工作发现，固相萃取(SPE)步骤对于确保从肽中更多地去除未消化的mAb以获得LC-MS分析的稳健性是有价值的。本公开还证明了SDC添加、改善的牛胰蛋白酶:蛋白质比率和消化时的高蛋白质浓度(25g/L)对于低含量残留HCP的回收、鉴定和定量的有效性。使用该改进的工作流程，高达约300μg起始材料的天然消化可应用于灵敏且稳健的HCP分析。还表明，可通过按比例调整样品载量来调节本文所述的方法以实现在0.1ppm至5ppm范围内的期望的灵敏度。这种经调节的策略允许使用单一简单且灵活的测定以满足从安全风险评定到生物工艺开发的广泛HCP测定需求。此外，该工作流程可与DDA一起使用进行未知蛋白质鉴定，或者与靶向分析一起使用以更高的灵敏度(0.01ppm)分析目的蛋白质。
本文引用的所有出版物、专利和其他参考文献通过引用整体并入本公开。

Claims (66)

1.一种用于鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与蛋白酶在足以消化存在于所述样品中的蛋白质的条件下接触；
b)使包含经消化的蛋白质的所述样品与脱氧胆酸钠(SDC)在还原和加热条件下接触；
c)使包含经消化的蛋白质的所述样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；
d)使所述色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
e)使用LC-MS/MS来分析所述洗脱液以鉴定所述样品中的一种或多种蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LC-MS/MS是在数据依赖型采集(DDA)模式下进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为宿主细胞蛋白质。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白质为酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶为水解酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使经消化的蛋白质样品与约1％w/v的SDC接触。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱支持物为固相萃取支持物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱支持物为表面带电杂化支持物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有约0.1ppm至约5ppm的检测限(LOD)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质产物为抗体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述过程中合并物样品为原料药样品。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述过程中合并物样品为药品样品
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的所述蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。
19.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样品与所述蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
20.根据权利要求1所述的方法，其中用于使所述样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
21.根据权利要求1所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的温度为约90℃。
22.根据权利要求1所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的时间为约10分钟。
23.一种用于确定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种靶蛋白质的ppm水平的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与蛋白酶在足以消化所述一种或多种靶蛋白质的条件下接触；
b)使包含一种或多种经消化的靶蛋白质的所述样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)使包含所述一种或多种经消化的靶蛋白质的所述样品与色谱支持物接触以去除未消化的蛋白质；
d)使所述色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；以及
e)使用LC-MS/MS分析所述洗脱液以对所述样品中的所述一种或多种靶蛋白质进行鉴定和定量，其中所述分析包括确定与所述一种或多种靶蛋白质的多个标准ppm水平相关联的信号以及将这些信号与针对所述样品中的所述一种或多种靶蛋白质所检测到的信号进行比较。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述LC-MS/MS是在平行反应监测(PRM)模式下进行的。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种靶蛋白质为宿主细胞蛋白质。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白质为酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述酶为水解酶。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
30.根据权利要求23所述的方法，其中使所述一种或多种经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述色谱支持物为固相萃取支持物。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述色谱支持物为表面带电杂化支持物。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法具有约0.01ppm的LOQ。
34.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括对来自LC-MS/MS分析的数据进行归一化。
35.根据权利要求23所述的方法，其中所述蛋白质产物为抗体。
36.根据权利要求23所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述过程中合并物样品为超滤/渗滤合并物样品。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述过程中合并物样品为原料药样品。
40.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品中的所述蛋白质产物的载量为约6μg至约300μg。
41.根据权利要求23所述的方法，其中使所述样品与所述蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
42.根据权利要求23所述的方法，其中用于使所述样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
43.根据权利要求23所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的温度为约90℃。
44.根据权利要求23所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的时间为约10分钟。
45.一种用于以在约0.1ppm至约5ppm之间的预先确定的灵敏度来鉴定包含蛋白质产物的样品中的一种或多种蛋白质的方法，其通过调整蛋白质产物的样品载量以实现期望的灵敏度：
a)使包含蛋白质的样品与蛋白酶在足以消化存在于所述样品中的蛋白质的条件下接触，
b)使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC在还原和加热条件下接触；
c)使包含经消化的蛋白质的所述样品与色谱支持物接触以进一步去除未消化的蛋白质；
d)使所述色谱支持物与流动相接触并且收集洗脱液；
e)使所述洗脱液重悬；以及
f)使用LC-MS/MS来分析经重悬的洗脱液的级分，以鉴定所述样品中的一种或多种蛋白质。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述LC-MS/MS是在DDA模式下进行的。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述经重悬的洗脱液的所述级分含有约6μg、约30μg、约60μg、约150μg或约300μg的蛋白质产物。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白质为宿主细胞蛋白质。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞蛋白质为酶。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述酶为水解酶。
51.根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
52.根据权利要求45所述的方法，其中所述样品中的蛋白酶与蛋白质产物的w/w比率为约1:2000、约1:800、约1:400或约1:200。
53.根据权利要求45所述的方法，其中使经消化的蛋白质样品或经消化的靶蛋白质样品与约0.9％w/v的SDC接触。
54.根据权利要求45所述的方法，其中所述色谱支持物为固相萃取支持物。
55.根据权利要求45所述的方法，其中所述色谱支持物为表面带电杂化支持物。
56.根据权利要求45所述的方法，其包括对来自液相色谱/质谱分析的数据进行归一化。
57.根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白质产物为抗体。
58.根据权利要求45所述的方法，其中包含蛋白质产物的所述样品为部分或完全纯化的样品。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述部分或完全纯化的样品为纯化过程中合并物样品。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述过程中合并物样品为抗体超滤/渗滤合并物样品。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述过程中合并物样品为原料药样品。
62.根据权利要求59所述的方法，其中所述过程中合并物样品为药品样品。
63.根据权利要求45所述的方法，其中使所述样品与所述蛋白酶接触的时间为约2小时至约4小时。
64.根据权利要求45所述的方法，其中用于使所述样品与蛋白酶接触的温度为约37℃。
65.根据权利要求45所述的方法，其中用于使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的温度为约90℃。
66.根据权利要求45所述的方法，其中使包含经消化的蛋白质的所述样品与SDC接触的时间为约10分钟。
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