KR20100057614A - 프리온 단백질（ＰＲＰｓｃ）이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법 - Google Patents

프리온 단백질（ＰＲＰｓｃ）이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100057614A
KR20100057614A KR1020107003554A KR20107003554A KR20100057614A KR 20100057614 A KR20100057614 A KR 20100057614A KR 1020107003554 A KR1020107003554 A KR 1020107003554A KR 20107003554 A KR20107003554 A KR 20107003554A KR 20100057614 A KR20100057614 A KR 20100057614A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
buffer
chromatography
prion
target protein
Prior art date
Application number
KR1020107003554A
Other languages
English (en)
Inventor
구스타브 길리얌
마츠 예른베르그
스테판 빙에
안드레아 나이서-스배
Original Assignee
옥타파르마 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옥타파르마 아게 filed Critical 옥타파르마 아게
Publication of KR20100057614A publication Critical patent/KR20100057614A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B01D15/426—Specific type of solvent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/12—Purification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3847—Multimodal interactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
    • B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

표적 단백질을 포함하는, 잠재적으로 PrPsc에 의해 오염된 시료를 다중 모드 (multimodal) 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계; 상기 표적 단백질이 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합되고 PrPsc는 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합하지 않도록 완충액 조건을 설정하는 단계; 및 상기 표적 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 프리온(PrPsc)을 제거 또는 고갈시키는 크로마토그래피에 의해 표적 단백질을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 프리온 단백질(PrPsc)이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법이 제공된다.

Description

프리온 단백질（ＰＲＰｓｃ）이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법{A process for isolation and purification of a target protein free of prion protein(PRPsc)}
본 발명은 질병 연관 단백질 형태 PrPsc 가 제거된(free of) 표적 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
최근에, 혈장 유래 약물의 정제 방법에서 PrPsc 불활성화 및 제거에 대한 집중은 증가된 관심에서 기인된다. 그 이유는 분명히 광우병 등의 발생이다. 생물의약품(biopharmaceutical drug)의 제조를 위한 재조합 세포주의 이용도 프리온 단백질의 발생에 대해 완전히 안전한 것으로 간주되지 않는다(Vorberg et al., The Journal of infectious diseases 2004; 189:431-9. Susceptibility of common fibroblast cell lines to transmissible spongiform encephalopathy agents). 생물의약품으로 의도된 단백질의 정제 방법을 정립하기 위한 연구 동안, 상이한 정제 단계들이 가능한 프리온 단백질 제거 단계로 평가될 수 있다(Foster PR, et al; Distribution of a bovine spongiform encephalopathy-derived agent over ion- exchange chromatography used in the preparation of concentrates of fibrinogen and factor VIII; Vox Sang. 2004 Feb;86(2):92-9; Trejo SR, et al, Evaluation of virus and prion reduction in a new intravenous immunoglobulin manufacturing process. Vox Sang. 2003 Apr;84(3): 176-87; Zeiler B, et al, Concentration and removal of prion proteins from biological solutions; Biotechnol Appl Biochem. 2003 Apr, 37(Pt 2): 173-82; Foster et al. Studies on the removal of abnormal prion protein by processes used in the manufacture of human blood plasma products, Vox Sang. 2000, 78:86-95; Burnouf et al., Transfus Clin Biol. 2006 Nov; 13 (5): 320-8. Epub 2007 Jan 23, Current strategies to prevent transmission of prions by human plasma derivatives).
크로마토그래피 수지가 정제 과정에서 PrPsc의 제거에 기여할 수 있다는 것이 입증되었다(참조문헌 2-4, 6-7). 그러나, 상이한 화학 구조 및 치환기를 갖는 크로마토그래피 수지 및 상이한 완충액 시스템을 이용하는 방법에서 균일한 PrPsc 제거 인자(clearance factor)가 발견된다는 사실은 감염성 작용제(infectious agent)의 크로마토그래피 지지체 표면으로의 비-특이적 결합의 발생을 뒷받침한다. PrPsc 제거는 재현가능한 것으로 보이나, 제거 메카니즘의 불완전한 이해는 (a) TSE 작용제를 결합하는 크로마토그래피 지지체의 최대 능력(capacity)을 결정하고, (b) 재순환된 겔의 효율적인 살균 처리를 확보하고 및 (c) 제조 사이클 동안 균일한 PrPsc 제거를 보장하는 방법에 관한 것과 같은 의문을 제기한다(Thyer J, Prion- removal capacity of chromatographic and ethanol precipitation steps used in the production of albumin and immunoglobulins; Vox Sang. 2006 Nov; 91(4) : 292-300).
WO-A-98/0041은 이온교환 크로마토그래피에 의해 다른 단백질, 예를 들면, 헤모글로빈으로부터 프리온의 제거를 개시한다. 이온교환 크로마토그래피 매질의 제조는 4차 암모늄 기의 (일정한) 표면을 수득하기 위해 (g-글리시독시프로필)트리메톡시실란 및 디메탄올아민에 의해 유도체화된 실리카겔을 가져온다.
WO-A-03/105911은 용리를 위해 염 구배를 이용하는 통상적인 이온교환 크로마토그래피 수단에 의해 인간 혈장을 정제(cleaning)하는 방법을 개시한다.
WO-A-94/08686은 단일 분리 매질을 이용한 액체 크로마토그래피 컬럼에서의 크로마토그래피 분리의 상이한 정도(note)를 순차적 방식으로 수행하는 방법을 개시한다.
D. B. Brimacombe et al. in Biochem. J. (1999) 342,605-613은 2회의 연속적인 크로마토그래피 단계에 의한 recPrP의 정제를 개시한다. 제1단계는 S-세파로오스 상에서 수행된 양이온-교환 크로마토그래피(150-650 NaCl-구배)이다. 합쳐진 목적 용리액(pooled eluate of interest)에 제2 크로마토그래피 단계(아연 충전된 킬레이팅 세파로오스(zink charged chelating sepharose); 0-10OmM 이미다졸 구배)가 수행되었다.
P. R. Foster et al. Vox Sanguinis 2000; 78:86-95는 다수의 단계에 의한 혈장 제품의 제조에서 프리온 단백질의 제거를 개시한다. 이 방법은 상이한 크로마토그래피 겔 상에서 상이한 컬럼 내에서 수행되는 4회의 이온-교환 크로마토그래피(단계 2, 11, 13 및 15) 및 1회의 친화도 크로마토그래피(세파로오스-FF 상의 고정화된 헤파린; 단계 12)를 포함한다.
T. Burnouf 등은 Tranfusion Clinique et Biologique 13 (2006) 320- 328에 혈장 유래 응고 인자의 다양한 크로마토그래피 단계 동안 TSE 작용제의 제거 정도를 개시했다. 상기 문헌은 FVIII (DEAE-Toyopearl 650M), vWF (DEAE-Toyopearl 650M), 피브리노겐(DEAE- Toyopearl 650M), 프로트롬빈 복합체//FIX (DEAE-셀룰로오스), PCC (DEAE-세파로오스), FIX (DEAE-세파로오스 또는 헤파린-세파로오스) 및 트롬빈(S-세파로오스)의 생산에서 이용되는 다양한 (주로) 이온-교환 크로마토그래피 단계들에 중점을 둔다.
Vox Sanguinis (2006)91, 292-300에서 J. Thyer 등은 DEAE-세파로오스, CM-세파로오스 및 Macro-Prep High Q 크로마토그래피 컬럼을 통한 PrP의 감소에 대해 보고한다("Materials and Methods"; Fig. 1, page 294; Table l). 또 다른 실험에서, 하나의 DEAE-세파로오스-컬럼 및 하나의 CM-세파로오스- 또는 Macro-Prep-컬럼의 순차적 이용이 개시된다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생물학적으로 유래된 출처(biologically derived source)와 같은, 잠재적으로 PrPsc에 의해 오염된 출처의 분획화(fractionation) 과정 동안 PrPsc를 제거하는 크로마토그래피 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 선행 기술의 단점을 회피해야 한다.
또 다른 목적은 정제 방법을 신뢰성있게 하고 크로마토그래피 지지체(chromatographic support)의 재생을 가능하게 하는 방법을 설계하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질의 프리온 고갈된 분획(prion depleted fraction)을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 프리온(PrPsc)을 제거하거나 고갈시키는 크로마토그래피에 의해 표적 단백질을 분리하고 정제하는 방법으로서,
- 잠재적으로 PrPsc에 의해 오염된, 표적 단백질을 포함하는 시료를 다중 모드(multimodal) 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,
- 상기 표적 단백질이 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합되고 PrPsc는 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합하지 않도록 완충액 조건을 설정하는 단계;
- 상기 표적 단백질을 용리시키는 단계; 및
- 상기 표적 단백질을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 크로마토그래피 수지가 PrPsc를 덜 강하게 결합하여, 상기 표적 단백질이 용리되기 전에 상기 크로마토그래피 수지로부터 상기 PrPsc의 제거를 가능하게 하기 때문에, 유의성 있는 개선을 제공한다.
본 발명에 따르면, "분리 및 정제(isolation and purification)"는 특히 원하는 단백질-유사 물질을 적어도 농축(enrich)하기 위해 이용되는 방법 또는 원치않는 물질을 고갈시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 따르면, 원하는 생성물을 최대 순도로 생성하는 것이 유리할 것이다.
용어 "표적 단백질(target protein)"은 PrPsc를 포함하지 않고 분리되고 및/또는 정제되어야 하는 목적 단백질을 의미한다. 표적 단백질은 또한 원하는 경우, 단백질의 혼합물, 예를 들면, 동시에(in an ensemble) 작용할 때 생물학적 효과를 갖는 상이한 인자들의 혼합물일 수 있다.
"프리온(prion)"은 감염성 단백질 물질이다.
발명의 상세한 설명
놀랍게도, 단일 크로마토그래피 수지가 크로마토그래피 조건 하에 PrPsc의 겔로의 결합을 최소화시킬 수 있고, 따라서 상기 수지에 결합하는 생성물에 대한 탁월한 감소값(reduction value)을 달성한다는 것이 확인되었다. 이 수지는 상업적으로 이용가능하고 예를 들면, WO-A-2004/024318에 기재된다. 상기 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. PrPsc에 대해 이 효과를 갖는 것으로 확인된 수지는 다중 모드(multi modal)(또는 혼합 모드 또는 소수성 충전 유도(hydrophobic charged induction)) 수지로 불린다. 예를 들면, 단 하나의 원리를 통해 작용하는 이온 교환기 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지와 같은 표준 크로마토그래피 매질과 대조적으로 다중 모드 수지는 이온성 상호작용과 소수성 상호작용의 조합을 통해 작용한다. 그와 같은 수지의 예는 상업적으로 이용가능한 GE Healthcare사의 Capto® MMC 및 Capto® Adhere, 또는 PALL사의 MEP, HEA 또는 PPA Hypercel® 수지이다. 이와 같은 다중 모드 수지의 리간드는 달리 설계될 수 있다; 상이한 리간드의 예는 하기와 같다:
Figure pct00001
다중 모드 크로마토그래피 물질의 종류가 하기에 요약된다.
본 발명은 다양한 생물학적 물질을 구분하고 분리하는데 유용한 효과적인 흡착제인 고체 기판을 제공한다. 본 발명의 고체 기판은 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피와 같은 제조(preparative) 기법, 및 바이오칩과 같은 분석 장치에서 이용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 고체 기판의 하나의 장점은 선행 기술의 기판에 대해 요구된 고비용이고 종종 유해한 세정(cleaning) 과정의 회피와 함께, 면역글로불린과 같은 생물학적 물질에 대한 높은 선택성 및 특이성이다. 두번째 장점은 본 발명의 고체 기판은 생리적 pH 및 이온 강도에서 생물학적 시료와 사용하기에 거의 이상적으로 적합하고, 그에 의해 선행 기술에 기재된 바와 같은 pH 조정 및 유방성(lyotropic) 염의 첨가를 피할 수 있다는 것이다. 세번째 장점은 제조를 위해 이용되는 시약의 낮은 비용을 고려할 때, 특화된 선행 기술의 흡착제의 이용 대비 상당한 경제적 잇점을 제공하는, 본 발명의 기판의 높은 용량(capacity)일 수 있다.
혼합 모드 리간드 ( Mixed Mode Liqand )
본 발명의 고체 기판은 고체 지지체 및 상기 지지체에 부착된 리간드를 포함한다. 상기 리간드는 단일고리기(monocyclic group) 또는 다중고리기일 수 있는 고리기, 및 선택적으로 황 원자를 포함하는 연결기(linking group)를 포함한다. 혼합 모드 작용을 통해 분석물(analyte)을 유인하는 리간드가 고체 지지체에 부착된다.
리간드는 상기 고체 지지체에 고정(tether)되고 술페이트, 술포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트기에 의해 치환된 단일고리기 또는 다중고리기일 수 있는 고리기를 포함한다. 이 단일고리기 또는 다중고리기는 본 명세서에 정의된 바와 같이, 방향족계(aromatic system)을 생성하기 위해 불포화 탄소-탄소 결합만을 포함하는 고리 탄화수소이다. 원칙적으로, 임의의 방향족기가 본 발명에서 이용될 수 있으나, 적합한 방향족기는 일반적으로 1개, 2개, 또는 3개의 방향족 고리를 포함한다. 따라서, 예시적인 방향족기는 페닐, 및 톨릴과 자일릴과 같은 그의 치환된 유도체이다. 이중고리(bicyclic) 방향족기는 융합된 개별적 고리를 포함하고, 나프릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다중고리 방향족기는 안트라세닐(anthracenyl) 및 페난트레닐(phenanthrenyl), 및 상이한 크기의 융합된 고리를 포함하는 아세나나프틸레닐(acenanaphthylenyl)과 같은 기를 포함한다. 방향족기가 선택되는 경우, 필수적인 것은 아니나, 방향족기가 하기에 기재되는 바와 같이, 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기(heteroaromatic group)에 융합되는 것이 바람직하다.
"헤테로고리(heterocycle)"는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 포화 고리 내지 부분적으로 포화된 고리이다. 유사하게, "헤테로방향족기(heteroaromatic group)"는 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자에 의해 치환된 것인 방향족기이다. 본 발명에서, 헤테로원자는 바람직하게는 N, S, 또는 O이다. 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기는 5-원(five-membered) 고리 또는 6-원 고리인 것이 바람직하고, 이는 이 기들을 포함하는 시약이 상업적 출처로부터 용이하고 저렴하게 수득되기 때문이다.
하기에 정의되는 바와 같은 연결기가 양가성(ambivalent) 황 원자를 포함하지 않는 경우, 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기가 고체 기판의 "티오친화성(thiophilic)"을 확립하거나 또는 그에 기여하는 작용기이고, 따라서, 하나 이상의 S 원자를 포함하는 작용기인 것이 바람직하다.
이가의 황 원자를 포함하는 다른 연결기의 이용시, 바람직한 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기는 하나 이상의 N 원자, 또는 S 원자와 N 원자의 조합을 포함한다.
따라서, 대표적인 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기는 티아졸린, 티아졸리돈, 이미다졸, 이미다졸린, 티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 이미다졸, 피리딘, 및 모르폴린을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 적합한 헤테로고리기 또는 헤테로방향족기는 전술된 바와 같이, 방향족기에 융합된다. 이 경우, 벤즈이미다졸 및 벤조티아졸이 탁월한 고체기판을 생성하는, 용이하게 입수가능한 후보이다.
전술된 바와 같이, 상기 단일고리기 또는 다중고리기는 술페이트, 술포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트기로 치환된다. 이 작용기들은 넓은 pH 범위, 예를 들면, 약 2 내지 약 12의 범위 내에서 하전된 모이어티로 존재할 수 있도록 충분히 산성이다. 이 경우, 상기 고체 지지체는 생리적 이온 강도(ionic strength) 및 pH에서 면역글로불린과 같은 생물학적 물질을 흡착하기에 이상적으로 적합하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치환된(substituted)"은 술페이트, 술포네이트, 포스페이트, 또는 포스포네이트의 단일고리기 또는 다중고리기로의 직접적 또는 간접적 결합(attachment)을 의미한다. 간접적 결합은 C1 -6 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기인 스페이서(spacer) 기를 통해 일어날 수 있다. 상기 알킬렌기는 -C(O)NH-, NHC(O)-, -0-, -S-, -S(0)-, -S(O)2-, -NH-, - C(O)O-, 및 -OC(O)-를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 이가 모이어티에 의해 선택적으로 개입(interrupt)된다. 따라서, 예시적인 스페이서 기는 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2-O-CH2-, 및 -CH2C(O)NHCH2CH2-를 포함한다.
상기 단일고리기 또는 다중고리기는 머캅토, 에테르 또는 아미노 함유 모이어티를 포함하는, 연결기에 의해 상기 고체 지지체에 고정된다. 하기에서 설명되는 구조적 고려 사항에 따라, 상기 연결기는 소수성이어서, 생물학적 물질의 결합이 정전기적 상호작용 및 소수성 상호작용을 통해 일어나는 pH에서 상기 고체 지지체에 소수성을 부여하는 것이 바람직하다. 소수성 모이어티는 직쇄형 및 분지형 C1 -6 알킬렌기, C2 -6 알케닐렌기, 및 C2 -6 알키닐렌기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특히 유용한 모이어티는 에틸렌 및 프로필렌이다. 다른 소수성 모이어티는 전술된 바와 같이, 예를 들면, 펜에틸렌(phenethylene)을 형성하기 위해 방향족기를 포함한다. 전술된 모이어티는 따라서, 하나 이상의 머캅토, 또는 아미노 모이어티에 의해 개입되거나 또는 캡핑된다. 상기 단일고리기 또는 다중고리기가 황 원자를 포함하지 않는 것인 구체예에서, 상기 연결기는 바람직하게는 머캅토 모이어티를 포함한다. 이 측면에서, 상기 연결기는 상기 고체 기판에 소수성 및 티오 친화성을 부여한다. 하나의 바람직한 머캅토-함유 연결기는 식에 의해 표현된다.
상기 연결기의 소수성은 히드록시, 할로겐화물, 또는 니트로와 같은 극성 치환기를 도입하거나, 공지된 방법에 의해 머캅토 모이어티를 산화시키거나, 에테르 또는 아미노 모이어티를 상기 연결기에 내포(incorporate)시키거나, 또는 이들의 조합에 의해 용이하게 맞춤화될 수 있다. 따라서, 용이하게 접근가능한 하나의 그와 같은 머캅토-함유 연결기가 식에 의해 표현된다.
예시적인 아미노-함유 연결기가 식에 의해 표현된다:
바람직하게는, 아미노-함유 연결기, 또는 산화된 머캅토 모이어티를 포함하는 고체 기판은 또한 하나 이상의 S 원자를 포함하는 단일고리기 또는 다중고리기를 포함한다. 따라서, 상기 고체 기판은 일부 티오친화성을 보유할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 연결기 자체가 히드록시-에틸-셀룰로오스, 전분, 아밀로오스 또는 아가로오스와 같은 다당류를 포함한다. 이 경우, 바람직한 다당류는 덱스트란이다. 따라서, 고체 지지체는 전술된 바와 같이, 연결기에 의해 유도체화될 수 있는 다당류에 의해 변형된다.
특정한 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 고체 기판이 고체 기판과 생물학적 물질 간의 "혼합-모드(mixed-mode)"를 통해 작동하는 것으로 생각한다. 전술된 단일고리기 및 다중고리기는 4 미만의 pK-값을 가지며, 따라서, 전술된 바와 같은 사용 pH 범위 내에서 음전하를 띤다. 면역글로불린과 같은 생물학적 물질이 약 pH 4 내지 pH 6에서 고체 기판과 접촉되며, 이 pH 범위에서 상기 생물학적 물질은 순 양전하 또는 중성 전하를 갖는다. 이 pH 범위에서, 상기 생물학적 물질은 단일고리기 또는 다중고리기와의 하나 이상의 종류의 상호작용을 통해 상기 고체 기판에 결합한다. 상기 상호작용은 정전기력(coulombic attraction) 및 약한 소수성 결합(mild hydrophobic association)을 포함한다. 상기 pH가 약 8보다 높아지면, 생물학적 물질은 순 음전하를 갖고, 그에 의해 음전하를 띤 고체 기판과 음전하를 띤 생물학적 물질 간에 정전 반발력(electrostatic repulsion)을 생성시킨다. 결과적으로, 생물학적 물질은 고체 기판으로부터 정전 반발력에 의해 방출되고, 분리될 수 있다. 이와 같은 반발적 이온력이 전술된 바와 같은 보다 약학 인력(attractive force)보다 더 큰 것으로 생각된다.
고체 기판( Solid Substrate )
본 발명은 혼합 모드 리간드가 부착된 고체 기판을 고려한다. 두 개의 상이한 포맷(format)이 특히 고려된다. 하나의 포맷에서, 고체 지지체(solid support)는 크로마토그래피 매질을 위해 일반적으로 이용되는 형태, 즉, 비드 또는 입자이다. 이 비드 또는 입자는 혼합 모드 리간드에 의해 유도체화된다. 상기 비드 또는 입자가 컬럼을 충진하기 위해 이용할 수 있는 크로마토그래피 매질을 형성하다. 또 다른 포맷에서, 고체 지지체는 칩의 형태, 즉, 혼합 모드 리간드가 공유 결합 등에 의해 부착될 수 있는 전반적으로 편평한 표면을 갖는 고체 지지체의 형태이다. 검출 장치의 프로브 인터페이스에 결합되도록 개조된 칩은 "프로브(probe)"로도 불린다.
비드 및 입자
본 발명의 교시에 따르면, 고체 기판은 먼저 유기 물질을 포함할 수 있는 고체 지지체(solid support)를 포함한다. 대표적인 유기 물질은 셀룰로오스, 전분, 아가, 아가로오스, 및 덱스트란과 같은 다당류이다. 치환 또는 미치환 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 친수성 중합체, 폴리스티렌, 폴리술폰, 및 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체를 포함한 친수성 합성 중합체가 고려된다. 대안적으로, 무기 물질이 고체 지지체 물질로 이용될 수 있다. 그와 같은 무기 물질은 실리카와 같은 다공성 미네랄 물질; 실리카, 지르코니아(zirconia), 티타니아(titania), 알루미나를 함유한 히드로겔; 및 기타 세라믹 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이 물질들의 혼합물, 또는 US-A-5,268,097, US-A-5,234,991, 및 US-A-5,075,371에 개시된 것들과 같은, 두 개의 물질의 공중합 또는 상호침투된(interpenetrated) 네트워크에 의해 형성된 합성 물질(composite material)을 이용할 수 있다.
고체 지지체는 직경이 약 0.1 mm 내지 약 1,000 mm인 비드 또는 부정형(irregular) 입자의 형태일 수 있다. 대안적으로, 상기 고체 지지체는 마이크론 내지 수-밀리미터 크기의 구멍이 분포된 스폰지-유사 물질, 막 또는 섬유를 형성할 수 있다.
전술된 단일고리기 또는 다중고리기가 상기 고체 지지체와 연결기, 및 상기 연결기와 단일고리기 또는 다중고리기 간에 공유 결합을 형성하는 것에 의해 고체 지지체 상에 화학적으로 고정화된다. 통상적인 시나리오에서, 고체 지지체에 먼저 연결기 전체 또는 그 일부를 형성하는 반응기를 도입하기 위해 작용하는 이관능성 시약(bifunctional reagent)으로 고체 지지체가 처리된다. 셀룰로오스, 히드로겔 함유 합성물(composite), 또는 히드록시기를 제시하는 기타 물질과 같은, 일부 고체 지지체의 경우, 이관능성 시약과의 반응 전에, 수산화물 공급원(hydroxide source)에 의해 히드록시 기로부터 양성자를 제거하는 것이 종종 유리하다. 이관능성 시약은 고체 지지체, 및 단일고리기 또는 다중고리기를 포함하는 시약과 반응할 수 있다. 동일하거나 또는 상이한 관능기를 포함하는, 예시적인 이관능성 시약은 에피클로르히드린(epichlorhydrin), 에피브롬히드린(epibromhydrin), 디브로모- 및 디클로로프로판올, 디브로모부탄, 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르, 부탄디올 디글리시딜에테르, 디비닐 술폰, 알릴글리시딜에테르, 및 알릴 브로미드(allyl bromide)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일단 관능화되면, 미반응 이관능성 시약, 반응 부산물, 또는 상기 둘 모두를 제거하기 위해, 고체 지지체가 하나 이상의 용매로 충분히 세척된다. 이 경우 이용되는 통상적인 용매는 물이다.
그 후, 머캅토, 히드록시, 또는 아미노기로 치환된 단일고리기 또는 다중고리기를 포함하는 시약에 의해 단일고리기 또는 다중고리기가 도입된다. 그와 같은 시약은 전술된 바와 같이 관능화된 고체 지지체에 의해 제시된 관능기와 반응한다.
이관능성 시약과 단일고리 시약 또는 다중고리 시약 간의 특정한 쌍 형성(pairing)은 잘 알려진 화학적 특성에 의해 유도된다. 예를 들면, 에폭시드로 관능화된 고체 지지체가 기판에 에틸렌-함유 연결기를 제공하기 위해 머캅토, 히드록시, 또는 아미노-함유 시약과의 반응을 수행할 수 있다. 예를 들면, 알릴 브로미드에 의해 변형된 다른 고체 지지체는 머캅토-함유 시약과 직접적으로 반응할 수 있는 알켄기를 제시한다. 대안적으로, 상기 알켄기는 적합한 반응성의 브롬 유도체를 제공하기 위해 더 브롬화될 수 있다.
고정화된 단일고리기 또는 다중고리기의 농도는 고체 지지체를 제조하기 위해 사용된 이관능성 시약의 농도에 따라, 고체 지지체의 밀리리터당 1 마이크로몰 미만(a fraction of a micromole) 내지 수백 마이크로몰 사이에서 변할 수 있다.
고정화된 작용기의 낮은 농도는 고체 지지체의 낮은 분리능을 초래하나, 높은 농도는 일반적으로 증가된 능력을 가져온다.
전술된 바와 같이, PrPsc에 결합하지 않는 PrPsc 제거 수지를 이용하는 것의 여러 장점들이 있고, 하나는 생성물의 용리 전에 상이한 완충액 조성물로 수지를 충분히(extensively) 세척하는 것이 가능하고, 이는 적어도 상이한 생화학적 조성물의 중의 PrPsc의 수를 매우 낮은 수준으로 감소시키거나 또는 상기 조성물로부터 PrPsc를 제거할 수 있게 한다는 것이다. 예를 들면, 수지를 생성물을 용리시키기 전에, 프리온의 보다 작은 양이 수지 또는 생성물에 대해 결합할 수 있는 이온성, 소수성 상호작용을 중단시키기 위해 고염 완충액 및 저염 완충액을 포함한 다양한 종류의 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 디터전트(detergent), 알코올 및 아미노산은 또한 생성물을 용리시키기 전에 최적의 순도를 달성하기 위해 세척 완충액에 첨가될 수 있는 것들의 예이다. PrPsc가 수지에 결합하는 것인 상이한 종류의 이온 교환 수지와 같은 "표준" 크로마토그래피 매질의 다른 종류에 유사한 세척 단계를 수행하는 것은 훨씬 더 어렵다. 결합 친화도가 생성물보다 훨씬 더 높은 경우에도, PrPsc가 어느 정도 생성물과 함께 수지로부터 공-용리될 위험이 항상 존재할 것이다. 따라서, 생성물이 "다중 모드로(multimodal)" 수지에 결합하고, PrPsc는 상기 수지에 대해 상대적으로 낮은 친화도를 갖는 것인 수지를 이용하는 것이 큰 장점이며, 이는 생성물의 용리 전에 적절한 세척 단계를 적용할 수 있게 한다.
본 발명에 따르면, 예를 들면, 하기에 의한 PrPsc 용리 후에 표적 단백질이 용리된다:
- 이온 강도를 증가 또는 감소시키는 것에 의한 용리 완충액의 이온 강도 조정(amending),
- 용리 완충액, 특히 수용액에 모노히드록시알칸올 또는 디히드록시알칸올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올과 같은 저급 지방족 알코올과 같은 알코올의 첨가, 및/또는
- pH의 증가 또는 감소에 의한 용리 완충액의 pH 조정.
또한, 전술된 용리 기법의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 증가된 이온 강도 및 증가된 에틸렌 글리콜 양을 이용한다.
또한, 다른 용리 조건, 예를 들면, 아미노산의 증가된 농도, "호프마이스터 시리즈(hofmeister serie)"에 따른 특정 염에 의한 증가된 농도가 이용될 수 있다.
표적 단백질의 용리는 표적 단백질의 생화학적 특성에 의존적이다. 예를 들면, 표적 단백질의 조효소 또는 표적 단백질의 삼차 구조에 대해 높은 인식도를 갖는 다른 물질을 이용할 수 있고, 예를 들면, 헤파린의 증가된 농도로 표적 단백질인 안티트롬빈을 용리시킬 수 있다.
표적 단백질을 포함하는 단백질 분획에서 프리온 단백질 감소 값(reduction value)은 최초에 수지에 적용된 양 대비, 1 내지 4 lg(1O) 미만이다. 목적 단백질 분획 중 프리온 분석값은 프리온 웨스턴 블롯 분석의 검출 한계 미만이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 크로마토그래피 조건은 하기 단계들 중 두 개 이상을 포함한다:
i) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하는 적재(loading) 및 평형화 완충액의 이용;
ii) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하지 않는 세척 완충액의 이용;
iii) 알코올 및/또는 아미노산을 포함한 세척 완충액의 이용;
iv) 고염(high salt) 농도를 포함하는 세척 완충액의 이용;
v) 저염 농도를 포함하는 세척 완충액의 이용;
vi) 알코올과 고염 농도의 조합을 포함하는 완충액의 이용.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 크로마토그래피 조건은 하기 단계들 중 두 개 이상을 포함한다:
i) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하는 적재 및 평형화 완충액의 이용;
ii) 용매 및 비이온성 디터전트를 포함하지 않는 제1 세척 완충액의 이용;
iii) 알코올 및 아미노산을 포함한 제2 세척 완충액의 이용;
iv) 고염 농도를 포함하는 제3 세척 완충액의 이용;
v) 저염 농도를 포함하는 제4 세척 완충액의 이용;
vi) 알코올과 고염 농도의 조합을 포함하는 완충액의 이용.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이용되는 완충액은 하기와 같다:
i) 적재 및 평형화 완충액은 약 0.1 내지 약 10%(w/w) 범위의 농도로 트리-n-부틸포스페이트 및/또는 트리톤 X-100을 포함하고;
ii) 제2 세척 완충액은 약 5 내지 약 30 % (w/w) 범위의 에틸렌 글리콜 및 약 0.2 내지 약 1.5M 라이신/아르기닌 범위로 에틸렌 글리콜 및/또는 라이신/아르기닌을 포함하고;
iii) 제3 세척 완충액은 약 0.5 내지 약 4M, 특히, 약 0.5 내지 약 1.5M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하고
iv) 제4 완충액은 약 0.01 내지 약 0.2, 특히, 0.01 내지 약 0.1M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하고;
v) 용리 완충액은 약 25 내지 약 75% (w/w), 특히 약 25 내지 약 50 %의 에틸렌 글리콜 및 약 0.5 내지 약 4M NaCl의 농도로 에틸렌 글리콜 및/또는 염화나트륨을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체에에서, 상기 크로마토그래피 조건은 하기 단계들 중 두 개 이상을 포함한다:
i) 0.3 내지 5% (w/w) 범위의 농도로 트리-n-부틸포스페이트 및/또는 트리톤 X-100을 포함하는 적재 및 평형화 완충액의 적용
ii) 10 내지 25%(w/w)의 EG 및 0.3 내지 1.0 M 라이신/아르기닌 범위의 에틸렌 글리콜 및/또는 라이신/아르기닌을 포함하는 제2 세척 완충액의 컬럼 용량의 10배 이상의 양에 의한 세척;
iii) 0.8 내지 1.5 M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하는 제3 완충액의 컬럼 용량의 10배 이상의 양에 의한 세척;
iv) 0.03 내지 0.15 M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하는 제4 완충액의 컬럼 용량의 10배 이상의 양에 의한 세척;
v) 35 내지 65 % (w/w)의 EG 및 0.8 내지 3.0의 범위의 NaCl 농도로 에틸렌 글리콜 및/또는 염화나트륨을 포함하는 용리 완충액의 적용.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이용된 완충액은 하기와 같다:
i) 0.8 내지 1.2 % (w/w) 범위의 농도로 트리-n-부틸포스페이트 및/또는 트리톤 X-100을 포함하는 적재 및 평형화 완충액의 적용
ii) 18 내지 22 %(w/w)의 EG 및 0.4 내지 0.6 M 라이신/아르기닌 범위의 에틸렌 글리콜 및/또는 라이신/아르기닌을 포함하는 제2 세척 완충액의 컬럼 용량의 20배 이상의 양에 의한 세척;
iii) 0.8 내지 1.2 M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하는 제3 완충액의 컬럼 용량의 20배 이상의 양에 의한 세척;
iv) 0.08 내지 0.12 M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하는 제4 완충액의 컬럼 용량의 20배 이상의 양에 의한 세척;
v) 45 내지 55 % (w/w)의 EG 및 1.3 내지 1.7의 NaCl 범위의 농도로 에틸렌 글리콜 및/또는 염화나트륨을 포함하는 용리 완충액의 적용.
상이한 종류의 세척 완충액 적용의 장점은 수지 또는 표적 단백질과의 상이한 상호작용 때문에 결합하는 상이한 종류의 프리온이 제거될 수 있는 가능성을 증가시킨다는 것이다. 또한, 각각의 세척 완충액의 양을 증가시키는 것에 의해(1배의 컬럼 용량(one column volume)은 수지의 용량과 일치함), 적용된 완충액에 대해 "느리게 작용하는(slowacting)" 잔류 프리온에 대한 안전(security)이 증가될 수 있다.
다중 모드 크로마토그래피 물질은
i) 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 리간드;
ii) 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 리간드;
iii) 페닐프로필 리간드;
iv) N-헥실 리간드;
v) 4-머캅토-에틸-피리딘 리간드;
vi) 3-[{3-메틸-5-((테트라히드로푸란-2-일메틸)아미노)-페닐}아미노]벤조산 리간드를 포함할 수 있다.
본 발명의 대상은 또한 잠재적 감염성 단백질을 함유한 출처로부터 분리된 단백질의 프리온 단백질 고갈 분획(prion protein depleted fraction)이다. 상기 분획은 본 발명의 방법에 따라 수득가능한, 약제학적으로 허용가능한 단백질을 포함한다.
특히, 혈장 단백질, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 및 다중클론 면역글로불린 단백질, 피브리노겐, 프로트롬빈, 트롬빈, 프로트롬빈 복합체, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII 및 FXIIIa를 포함하는 인간 및 동물 혈액 응고 인자, 폰 빌리브란트 인자(von Willebrandt factor), 알부민, 트랜스페린, 세룰로플라스민, 합토글로빈(haptoglobin), 헤모글리빈 및 헤모펙신을 포함하는 수송 단백질(transport protein), β-안티트롬빈, α-안티트롬빈을 포함한 프로테아제 억제제, α2-마크로글로불린, Cl-억제제, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor, TFPI), 헤파린 보조인자(heparin cofactor) II, 단백질 C 억제제(PAI-3), 단백질 C 및 단백질 S, α-1 에스테라아제 억제제 단백질, α-1 안티-트립신, 잠재-안티트롬빈(latent-antithrombin)을 포함한 항혈관형성 단백질(antiangionetic protein), α-l-산 당단백질을 포함한 고도의 당화 단백질(highly glycosylated protein), 안티키모트립신, 인터-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-HS 당단백질 및 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 및 히스티딘-풍부 당단백질(histidine-rich glycoprotein), 만난 결합 렉틴(mannmman binding lectin), C4-결합 단백질, 피브로넥틴, GC-글로불린, 플라스미노겐을 포함한 기타 단백질, 에리트로포이에틴(erythrmopoietin), 인터페론, 종양 인자, tPA, γCSF와 같은 혈액 인자로부터 선택된 혈장 단백질을 포함하는 단백질 분획이 청구된다.
본 발명은 하기의 비-한정적 실시예에 의해 더 설명된다.
실시예 1
컬럼 및 수지
Tricorn 컬럼(GE Healthcare, Sweden, 단면적: 0.2 cm2, 직경 0.5 cm)을 Capto MMC 수지(GE Healthcare Cat. No. 17-5317-10, lot No. 308581)로 충진시켰다; 9 cm 베드 높이(bed height), 컬럼 용량: 1.8 ml.
출발 물질
HEK 293 세포로부터 유래되고 포획 컬럼(capture column) 단계에서 농축된 재조합 단백질의 혼합물을 출발 물질로 이용하였다(배치 번호(batch number): BPP 047 SP 용리액(eluate), 117 ㎍ 단백질/ml).
완충액 조성 *
완충액 1 (S/D 첨가된 평형화 완충액 )
0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2 (2xH2O), 0.01 M L-히스티딘, 1% w/w Triton X-1OO, 0.3% w/w TNBP, pH : 7.0 ± 0.1, 전도도(conductivity): +25℃에서 29 ± 3 mS/cm2
완충액 2 (S/D 불포함 평형화 완충액 )
0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2 (2xH2O), 0.01 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) Tween 80, pH : 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 31 ± 3 mS/cm2
완충액 3 (세척 1 : 라이신 & 에틸렌글리콜(= EG ))
0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2 (2xH2O), 0.01 M L-히스티딘 0.02% (w/w) Tween 80, 0.5 M L-라이신 모노클로라이드(monochlorid), 20% (w/w) 에틸렌 글리콜(= EG)
pH : 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 37 ± 3 mS/cm2.
완충액 4 (세척 2: 고염 세척)
1.0 M NaCl, 0.05 M CaCl2 (2xH2O), 0.05 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) Tween 80, pH : 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 89 ± 5 mS/cm2.
완충액 5 (세척 3: 저염 세척)
0.1 M NaCl, 0.01 M CaCl2 (2xH2O), 0.01 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) Tween 80, pH : 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 13 ± 3 mS/cm2.
완충액 6 ( 용리 완충액 )
1.5 M NaCl, 0.02 M CaCl2 (2xH2O), 0.02 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) Tween 80 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 (EG), pH : 6.5 ± 0.1 (EG 첨가 전에 pH를 조정함) 전도도: EG 첨가 후 +25℃에서 측정, 39 ± 3 mS/cm2.
완충액 7 (재생 완충액 )
1M 수산화 나트륨
pH 조정:
1 M HCI
* 상기 완충액은 최종 부피로 1L 대신 1 kg의 물을 기준으로 제조하였다. 첨가물들이 최종 부피를 약간 증가시키므로, 최종 몰 농도에 작은 영향을 가질 것이다.
크로마토그래피 조건:
적용된 완충액의 근사량(approximate amount), ml/분 및 cm/시로 표현된 유속의 요약. 각 완충액 단계에 소요된 시간 및 단백질 용액에 대한 겔과의 접촉 시간도 표시된다.
Figure pct00002
MMC 수지를 약 9 cm의 베드 높이로 Tricorn 컬럼에 충진시켰다. 크로마토그래피 단계는 전도도 및 280nm에서 모니터링하였다. 단백질 적재량(load)은 1 ml의 수지에 대해 약 3 mg이었다.
먼저, 상기 컬럼을 안정적인 기준선(base line)이 수득될 때까지 S/D 화학물질을 포함하는 평형화 완충액으로 적절하게 평형화시켰다. 상기 평형화 완충액과 동일한 농도를 수득하기 위해 kg 당 14 g S/D 스톡의 비율로 출발 물질에 S/D 화학물질을 첨가하고, 단백질 용액을 상기 컬럼에 적용하기 전에 10분 이상 동안 교반시켰다. 하기 완충액의 분획을 수집하고 총 단백질(및 PrPsc 스파이킹 실험의 경우, 프리온)에 대해 분석하였다. 280 nm에서 흡광도로 측정된 크로마토그래피 프로파일을 부록 2에서 볼 수 있다:
- 통과액(Flow through) (완충액 1 + 단백질)
- 완충액 1(고 비-이온성 디터전트(High non-ionic detergent) 완충액; 0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2, 0.01 M L-히스티딘, 1% w/w 트리톤 X-100, 0.3% w/w TNBP, pH : 7.0)
- 완충액 2 (저 비-이온성 디터전트 완충액; 0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2, 0.01 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) 트윈 80 pH 6.5)
- 완충액 3 (아미노산/알코올 완충액; 0.3 M NaCl, 0.01 M CaCl2, 0.01 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) 트윈 80, 0.5 M L-라이신 모노클로라이드, 20% (w/w) 에틸렌 글리콜, pH 6.5)
- 완충액 4 (고염 완충액; 1.0 M NaCl, 0.05 M CaCl2, 0.05 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) 트윈 80, pH : 6.5 )
- 완충액 5 (저염 완충액; 0.1 M NaCl, 0.01 M CaCl2, 0.01 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) 트윈 80, pH : 6.5 )
- 완충액 6 (고염/고 알콜올 완충액)1.5 M NaCl, 0.02 M CaCl2, 0.02 M L-히스티딘, 0.02% (w/w) 트윈 80, 50% (w/w) 에틸렌 글리콜(EG), pH : 6.5
- 완충액 7 (재생 완충액; 2M NaCl)
상기 컬럼을 컬럼 용량의 20배의 양의 1M NaOH로 재생시키고 추후 사용을 위해 20% (v/v) 에탄올에 보관했다.
결과
(프리온 불포함 실험에서 총 단백질의 검출)
Figure pct00003
na = 총 단백질 분석 방법에 대한 완충액의 간섭(interference) 때문에 분석되지 않음(not analysed)
실시예 2 (프리온 스파이킹(spiking) 실험)
실시예 1에 기재된 크로마토그래피 절차의 프리온 단백질 제거를 결정할 수 있도록, 프리온 스파이킹 실험을 수행하였다. 실시예 1과 동일한 컬럼, 수지, 완충액 및 출발 물질을 이용하였다.
프리온 단백질 감염 출발 물질
스크래피에 적응된 햄스터(hamster adapted scrapie) 263K 스트레인의 미세소체(microsomal)/세포질 분획을 본 실험에서 이용하였다.
117 ㎍/ml 단백질을 포함하는, 약 54 g의 단백질 출발 물질(실시예 1과 동일; 배치 번호: BPP 047 SP eluat)을 25℃ 수조에서 해동시키고 24.0℃(표적: 20-25℃)의 온도까지 가온시켰다. 그 후, 51.12 g(표적: 50 ± 2 g)의 출발 물질을 계량하고 5.1%의 최종 농도까지 2.6 ml (표적: 2.5 ± 0.2 ml)의 미세소체/세포질 분획을 스파이킹하였다. 상기 스파이킹된 출발 물질의 pH는 6.994 (표적: 7.0 ± 0.1)로 확인되었다. 그 후, 6 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 스파이킹된 출발 물질(spiked start material) - SSM).
1.955 g의 트리톤 X-100을 0.582 g의 TnBP와 혼합하고(표적 비: 10 부(parts) + 3 부, 중량 기준) 36분 동안 교반하였다. 0.665 g의 S/D 시약을 스파이킹된 출발 물질의 나머지 47.72 g에 즉시 첨가하고 (표적 비: 스파이킹된 출발 물질 kg 당 14 g S/D-시약) 31분 동안 교반하였다. 개시 시에 출발 물질의 온도는 24.5℃로 확인했으며, 교반 단계의 종료시 온도는 23.7℃였다(표적 범위: 18-25℃).
크로마토그래피 단계
Capto MMC 수지로 충진된 GE Healthcare Tricorn 컬럼 1.8 ml(CV = 1.0 ml, 베드 높이 = 9 cm)을 1.0 ml/분의 유속에서 완충액 1(S/D 포함 평형화 완충액)의 8.3 CV로 평형화시켰다(표적: 1.0 ml/분에서 5 CV). 그 후, 47.29 g의 S/D 처리 스파이킹된 출발 물질을 상기 컬럼에 적재하고 1.0 ml/분의 유속을 적용했다(표적: 1.0 ml/분에서 45 ± 2 g). 적재 후에, 상기 컬럼을 0.8 ml/분의 유속에서 완충액 2(S/D 불포함 평형화 완충액)의 10.0 CV로 플러싱(flushing)시켰다(표적: 1.0 ml/분에서 10 CV). UV 신호가 증가하기 시작할 때 컬럼 통과액(flow through)의 수집을 개시하고 흡광도가 저하되기 시작할 때까지 지속하였다. 통과액 분획의 중량을 측정하고(실제 중량: 48.23 g), 16 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 flow through- FT).
완충액 2에 의한 플러싱 동안 세척 분획 1을 수집하였다. 이 분획의 실제 중량을 12.75 g으로 측정하고 12 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 washl-Wl).
그 후, 상기 컬럼을 0.6 ml/분의 유속으로 완충액 3(라이신 & 에틸렌 글리콜 세척액)의 22.2 CV로 세척하였다(표적: 0.6 ml/분에서 20 CV). 완충액 3에 의한 세척 동안, 세척 분획 2를 수집하고, 이 분획의 실제 중량을 40.35 g으로 측정하였다. 16 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 wash2-W2).
0.9 ml/분의 유속으로 완충액 4(고염 세척액)의 10.0 CV에 의한 컬럼 세척 동안(표적: 1.0 ml/분에서 10 CV), 세척 분획 3을 수집하였다. 18.48 g의 실제 중량을 측정하고, 16 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 wash3-W3).
1.0 ml/분의 유속으로 완충액 5(저염 세척액)의 5.0 CV에 의한 컬럼 세척 동안(표적: 1.0 ml/분에서 5 CV), 세척 분획 4를 수집하였다. 이 분획의 실제 중량을 12.22 g으로 측정하였다. 11.5 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 wash4-W4).
그 후, 생성물을 0.2 ml/분의 유속을 적용하여, 완충액 6(용리 완충액)의 8.3 CV로 용리시켰다(표적: 0.2 ml/분에서 7 CV). 이 용리액의 수집을 완충액 6에 의한 플러싱의 전체 시간 동안 수행하였다. 용리액 분획의 실제 중량은 13.54 g으로 측정되었다. 12.5 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 이하에서 보관하였다(시료 eluate-E).
0.6 ml/분의 유속에서 완충액 7(재생 완충액)의 9.4 CV에 의한 컬럼의 재생 동안(표적: 0.6 ml/분에서 20 CV), 재생 분획을 수집하였다. 17.97 ml의 실제 중량을 측정하고, 16 ml의 분량을 채취하여 분주하고, -60℃ 미만에서 보관하였다(시료 regenaration-Reg).
(프리온 스파이킹 실험의 결과)
Figure pct00004
Figure pct00005

검토
표 3 및 부록 1(도 1 내지 5)에서 알 수 있는 바와 같이, 탁월한 프리온 단백질 제거 값은 완충액 4 내지 7 분획에서 볼 수 있다. 따라서, 이 분획들 내에서 용리된 단백질 생성물은 PrPsc 제거에 대해 매우 우수한 안전성 마진을 가질 것이다. 또한 매우 중요한 것은 적용된 프리온 단백질의 물질 수지(mass balance)는 통과액 및 초기 세척 완충액이 아닌 다른 분획에서 PrPsc가 전혀 발견되지 않는다는 것을 나타낸다는 것이다. 본 발명자들이 알기로는, 이는 선행 기술에서 이전에 입증된 바 없었다. 프리온 단백질 제거 단계로서 크로마토그래피 수지의 발표된 예에서, 비교적 허용가능한 프리온 단백질 감소 값이 달성되었으나, 프리온 단백질은 생성물 분획의 관리 전 및 후 모두에서 여러 분획에서 발견될 수 있고, 이는 교차 오염(cross over contamination)의 위험을 나타낸다.
분석의 설명
Bradford 법에 의한 총 단백질의 결정
Bradford에 따른 단백질 결정은 단백질로의 결합이 일어난 경우, Coomassie Brilliant Blue G-250의 산성 용액에 대한 흡광도 최대가 465 nm에서 595 nm로 변한다는 발견에 기반한다. 소수성 상호작용 및 이온성 상호작용이 상기 염료의 산성 형태를 안정화시켜서, 가시적인 색 변화를 유발한다. 이 분석법은 염료-알부민 복합체 용액이 10-배 농도 범위에서 일정하기 때문에, 유용하다. 추가적인 정보를 위해, Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976을 참조한다.
PrPsc의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석법
웨스턴 블롯 분석은 프로테이나아제 K 내성 스크래피 연관 프리온 단백질(proteinase K resistant Scrapie associated prion protein, PrPsc)의 반-정량적 결정법이다.
DC Lee et al., Journal of Virological Methods 2000;84:77-89에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

Claims (10)

  1. 프리온(PrPsc)을 제거하거나 고갈시키는 크로마토그래피에 의해 표적 단백질을 분리하고 정제하는 방법으로서,
    - 잠재적으로 PrPsc에 의해 오염된, 표적 단백질을 포함하는 시료를 다중 모드(multimodal) 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,
    - 상기 표적 단백질이 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합되고 PrPsc는 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질에 결합하지 않도록 완충액 조건을 설정하는 단계; 및
    상기 표적 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 프리온 용리 후에,
    - 이온 강도를 증가 또는 감소시키는 것에 의해 용리 완충액의 이온 강도를 조정하는 단계,
    - 상기 용리 완충액, 특히, 수용액에, 모노히드록시알칸올 또는 디히드록시알칸올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올 프로판올과 같은 저급 지방족 알코올과 같은 알코올을 첨가하는 단계, 및/또는
    - pH를 상승 또는 저하시키는 것에 의해 상기 용리 완충액의 pH 값을 조정하는 단계에 의해 용리되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 단백질을 포함하는 단백질 분획에서 프리온 단백질 제거 값(prion protein removal value)은 상기 수지에 최초로 적용된 양으로부터 계산된 1 내지 4 lg(1O) 미만(> 1 to 4 lg(10))인 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질 분획의 프리온 단백질 분석값(prion protein analytical value)은 웨스턴 블롯 분석의 검출 한계 미만인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 조건은 하기 단계들 중 두 개 이상을 포함하는 것인 방법:
    i) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하는 적재(loading) 및 평형화 완충액의 이용;
    ii) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하지 않는 세척 완충액의 이용;
    iii) 알코올 및/또는 아미노산을 포함한 세척 완충액의 이용;
    iv) 고염(high salt) 농도를 포함하는 세척 완충액의 이용;
    v) 저염 농도를 포함하는 세척 완충액의 이용;
    vi) 알코올과 고염 농도의 조합을 포함하는 완충액의 이용.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 조건은 하기 단계들 중 두 개 이상을 포함하는 것인 방법:
    i) 용매 및/또는 비이온성 디터전트를 포함하는 적재 및 평형화 완충액의 이용;
    ii) 용매 및 비이온성 디터전트를 포함하지 않는 제1 세척 완충액의 이용;
    iii) 알코올 및 아미노산을 포함한 제2 세척 완충액의 이용;
    iv) 고염 농도를 포함하는 제3 세척 완충액의 이용;
    v) 저염 농도를 포함하는 제4 세척 완충액의 이용;
    vi) 알코올과 고염 농도의 조합을 포함하는 용리 완충액의 이용.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 상기 적재 및 평형화 완충액은 약 0.1 내지 약 10%(w/w) 범위의 농도로 트리-n-부틸포스페이트 및/또는 트리톤 X-100을 포함하고;
    ii) 상기 제2 세척 완충액은 약 5 내지 약 30 % (w/w) 범위의 에틸렌 글리콜 및 약 0.2 내지 약 1.5M 라이신/아르기닌 범위의 에틸렌 글리콜 및/또는 라이신/아르기닌을 포함하고;
    iii) 상기 제3 세척 완충액은 약 0.5 내지 약 4M, 특히, 약 0.5 내지 약 1.5M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하고;
    iv) 상기 제4 완충액은 약 0.01 내지 약 0.2, 특히, 0.01 내지 약 0.1M 범위의 농도로 염화나트륨을 포함하고;
    v) 상기 용리 완충액은 약 25 내지 약 75% (w/w), 특히 약 25 내지 약 50 %의 에틸렌 글리콜 및 약 0.5 내지 약 4M NaCl의 농도로 에틸렌 글리콜 및/또는 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 물질은
    i) 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 리간드;
    ii) 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 리간드;
    iii) 페닐프로필 리간드;
    iv) N-헥실 리간드;
    v) 4-머캅토-에틸-피리딘 리간드;
    vi) 3-[{3-메틸-5-((테트라히드로푸란-2-일메틸)아미노)-페닐}아미노]벤조산 리간드를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득가능한 약제학적으로 적용가능한 단백질을 포함하는, 잠재적 감염성 단백질 함유 출처(source)로부터 분리된 단백질의 프리온 단백질 고갈된 분획.
  10. 제9항에 있어서, 혈장 단백질, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 및 다중클론 면역글로불린 단백질, 피브리노겐, 프로트롬빈, 트롬빈, 프로트롬빈 복합체, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII 및 FXIIIa를 포함하는 인간 및 동물 혈액 인자, 폰 빌리브란트 인자(von Willebrandt factor), 알부민, 트랜스페린, 세룰로플라스민, 합토글로빈(haptoglobin), 헤모글리빈 및 헤모펙신을 포함하는 수송 단백질(transport protein), β-안티트롬빈, α-안티트롬빈을 포함한 프로테아제 억제제, α2-마크로글로불린, Cl-억제제, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor, TFPI), 헤파린 보조인자(heparin cofactor) II, 단백질 C 억제제(PAI-3), 단백질 C 및 단백질 S, α-1 에스테라아제 억제제 단백질, α-1 안티-트립신, 잠재-안티트롬빈(latent-antithrombin)을 포함한 항혈관형성 단백질(antiangionetic protein), α-l-산 당단백질을 포함한 고도의 당화 단백질(highly glycosylated protein), 안티키모트립신, 인터-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-HS 당단백질 및 C-반응성 단백질(C-reactive protein) 및 히스티딘-풍부 당단백질(histidine-rich glycoprotein), 만난 결합 렉틴(mannmman binding lectin), C4-결합 단백질, 피브로넥틴, GC-글로불린, 플라스미노겐을 포함한 기타 단백질, 에리트로포이에틴, 인터페론, 종양 인자, tPA, γCSF와 같은 혈액 인자로부터 선택된 혈장 단백질을 포함하는 것인 분획.
KR1020107003554A 2007-08-23 2008-08-25 프리온 단백질（ＰＲＰｓｃ）이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법 KR20100057614A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07114856.3 2007-08-23
EP07114856A EP2027875A1 (en) 2007-08-23 2007-08-23 A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100057614A true KR20100057614A (ko) 2010-05-31

Family

ID=38720286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107003554A KR20100057614A (ko) 2007-08-23 2008-08-25 프리온 단백질（ＰＲＰｓｃ）이 제거된 표적 단백질의 분리 및 정제 방법

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9296799B2 (ko)
EP (3) EP2027875A1 (ko)
JP (1) JP5797404B2 (ko)
KR (1) KR20100057614A (ko)
CN (1) CN101842121B (ko)
AU (1) AU2008290482B2 (ko)
BR (1) BRPI0815758B1 (ko)
CA (1) CA2696865C (ko)
DK (2) DK3034097T3 (ko)
ES (2) ES2572352T3 (ko)
IL (1) IL203573A (ko)
MX (1) MX2010001919A (ko)
RU (1) RU2491292C2 (ko)
TR (1) TR201807044T4 (ko)
WO (1) WO2009024620A2 (ko)
ZA (1) ZA201001246B (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9375499B2 (en) 2006-07-14 2016-06-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Adsorptive membranes for trapping viruses
AU2008224877B2 (en) 2007-03-14 2013-07-11 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Virus like particle purification
EP2027875A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-25 Octapharma AG A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC)
MX2012011065A (es) 2010-03-30 2012-10-10 Octapharma Ag Proceso para purificacion de proteina de factor de crecimiento.
RU2731720C2 (ru) * 2010-03-30 2020-09-08 Октафарма Аг Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор vii
KR101593766B1 (ko) * 2010-11-05 2016-02-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 혼합식 크로마토그래피에 의한 최적화된 항체 포획 방법
WO2012082933A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Baxter International, Inc. Eluate collection using conductivity gradient
US20120183527A1 (en) * 2011-01-18 2012-07-19 Baxter International Inc. Measurement of anti-amyloid antibodies in human blood
AU2012213432B2 (en) * 2011-02-01 2016-10-13 Novo Nordisk A/S Purification of insulin
CN102675414A (zh) * 2011-03-08 2012-09-19 上海天伟生物制药有限公司 糖蛋白中去除/灭活朊病毒的方法
JP6151640B2 (ja) * 2011-06-29 2017-06-21 協和発酵キリン株式会社 たん白質の精製方法
JOP20130186B1 (ar) 2012-06-22 2021-08-17 Takeda Vaccines Montana Inc تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات
WO2014055552A1 (en) * 2012-10-03 2014-04-10 Csl Behring Llc A method of purifying proteins
US10188965B2 (en) 2012-12-05 2019-01-29 Csl Behring Gmbh Hydrophobic charge induction chromatographic depletion of a protein from a solution
US20140154233A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-05 Csl Limited Method of purifying therapeutic proteins
CN103336124B (zh) * 2012-12-11 2015-07-15 武汉工业学院 一种检测朊病毒蛋白(PrPSC)的方法和试剂盒
CA2951408A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Jhl Biotech, Inc. Methods and reagents for purification of proteins
WO2016207328A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Glycotope Gmbh PROCESS FOR THE PURIFICATION OF γ-CARBOXYLATED POLYPEPTIDES
DE102016004432A1 (de) * 2016-04-12 2017-10-12 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Multimodales Adsorptionsmedium mit multimodalen Liganden, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
CN110314414B (zh) * 2019-07-23 2021-10-19 宝锐生物科技泰州有限公司 凝血因子xiii的分离纯化方法及其应用
CN112409476B (zh) * 2020-08-13 2022-03-29 中元汇吉生物技术股份有限公司 四种血液来源蛋白的纯化方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234991A (en) 1975-07-29 1993-08-10 Pasteur Merieux Serums And Vaccines Porous mineral support coated with an aminated polysaccharide polymer
FR2616437B1 (fr) 1987-06-11 1990-09-07 Ibf Polymeres composites, leur preparation et leur utilisation en chromatographie liquide
US5268097A (en) 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
US5316680A (en) * 1992-10-21 1994-05-31 Cornell Research Foundation, Inc. Multimodal chromatographic separation media and process for using same
AT405119B (de) 1996-06-28 1999-05-25 Poschik Roland Vorrichtung zur betätigung des schiebers eines reissverschlusses, sowie reissverschluss
US5808011A (en) * 1996-07-01 1998-09-15 Biopure Corporation Method for chromatographic removal of prions
WO2000043048A1 (en) * 1999-01-19 2000-07-27 Common Services Agency Treating protein-containing liquids
GB0214007D0 (en) * 2002-06-18 2002-07-31 Common Services Agency Removal of prion infectivity
CA2500903A1 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Pall Corporation Preparation and use of mixed mode solid substrates for chromatography adsorbents and biochip arrays
US7750129B2 (en) * 2004-02-27 2010-07-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Process for the purification of antibodies
SE0400501D0 (sv) * 2004-02-27 2004-02-27 Amersham Biosciences Ab Antibody purification
EP1707634A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
EP2027875A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-25 Octapharma AG A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC)
ES2538706T3 (es) * 2008-06-24 2015-06-23 Octapharma Ag Procedimiento de purificación del factor de coagulación VIII
MX2012011065A (es) * 2010-03-30 2012-10-10 Octapharma Ag Proceso para purificacion de proteina de factor de crecimiento.

Also Published As

Publication number Publication date
TR201807044T4 (tr) 2018-06-21
IL203573A (en) 2013-11-28
ZA201001246B (en) 2010-10-27
CA2696865A1 (en) 2009-02-26
BRPI0815758B1 (pt) 2018-08-07
US9296799B2 (en) 2016-03-29
DK3034097T3 (en) 2018-06-06
WO2009024620A2 (en) 2009-02-26
ES2572352T3 (es) 2016-05-31
CN101842121A (zh) 2010-09-22
RU2010110805A (ru) 2011-09-27
CA2696865C (en) 2019-09-17
US20160152661A1 (en) 2016-06-02
EP3034097A1 (en) 2016-06-22
ES2671026T3 (es) 2018-06-04
DK2190486T3 (en) 2016-07-04
EP2027875A1 (en) 2009-02-25
JP5797404B2 (ja) 2015-10-21
JP2010536832A (ja) 2010-12-02
AU2008290482B2 (en) 2013-10-03
CN101842121B (zh) 2013-10-30
EP3034097B1 (en) 2018-02-28
AU2008290482A1 (en) 2009-02-26
MX2010001919A (es) 2010-03-15
EP2190486B1 (en) 2016-03-23
WO2009024620A3 (en) 2009-04-23
EP2190486A2 (en) 2010-06-02
RU2491292C2 (ru) 2013-08-27
US20100210821A1 (en) 2010-08-19
BRPI0815758A2 (pt) 2014-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2190486B1 (en) A process for isolation and purification of a target protein free of prion protein (prpsc)
KR101293504B1 (ko) 혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ｖⅰⅰⅰ의 정제
KR101700722B1 (ko) 응고 인자 ｖｉｉｉ을 정제하는 방법
JP2012067108A (ja) プロテインａおよびイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製
AU644801B2 (en) Chemical products
JP7458980B2 (ja) アルキルグリコシドによるタンパク質精製およびウイルス不活化
Speziale et al. Purification of human plasma fibronectin using immobilized gelatin and Arg affinity chromatography
JP7144113B2 (ja) 血液製剤から第ｖｉｉｉ因子を分離する方法
Bing [92] Purification of the first component of human complement and its subunit C1 esterase
HRKAL et al. Monoclonal antibodies against human antithrombin III

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination