CN1788003A - 三嗪化合物及其在形成用于亲合色谱的多维库中的应用 - Google Patents

三嗪化合物及其在形成用于亲合色谱的多维库中的应用 Download PDF

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Abstract

一种式(I)化合物，其中每个Z相同或不同且为式(a)或－Y，其中每个X相同或不同且为多价胺基或二胺基－末端间隔基；每个Y为相同或不同的胺基；以及M为载体基质。

Description

三嗪化合物及其在形成用于亲合色谱 的多维库中的应用
技术领域
本申请涉及三嗪化合物及其在形成多维亲合配体库中的应用，还涉及亲合配体至基质上的连接。本申请还涉及配体在纯化天然、重组或转基因蛋白质类(proteinaceous)物质中的应用。这些配体也可用于医疗设备和作为治疗性药物。
发明背景
亲合色谱的原理是以分子识别现象为基础的。固定在载体基质上的配体能够在其它分子混合物存在下与靶分子形成一种特异性的、可逆的相互作用。这种相互作用的本质可以是氢键键合、静电力，基于有利的几何学或任何其它加强宿主-靶体联系的因素的叠加。一旦与靶体结合，配体-靶体的相互作用应足够强从而可以在去除其它杂质分子的同时保持配体-靶体复合物完整。然而，结合必须足够弱以致引发的局部变化(例如缓冲液条件)可以导致相互作用的中断，从而释放出此时处于纯化形式的靶分子。此时去除了蛋白质的固定化的配体，可再次用于之后的纯化。期望的亲合配体的属性包括化学和热稳定性，以及高选择性。
可以利用分子模拟设计出适用于特定目标分子的配体，或者可以通过筛分组合库挑选出配体。组合研究提供了大量配体，可以将它们构造合并成各种化学部分，包括亲水的、疏水的、带电的或中性的基团或它们的混合物。可以简单地通过将市售化合物(包括氨基酸、羧酸和胺)在逐段合成中直接结合于载体基质的表面上从而合成组合库。配体也可以被合成之后再连接至载体基质。
氰尿酰氯，或者2，4，6-三氯三嗪(在下文中称为三嗪)，是一种对称分子。2，4，6-三取代三嗪可以通过氰尿酰氯与亲核试剂(例如胺化合物)的反应轻易制得。三嗪衍生物可用作吸附剂和用于其它目的；参见WO-A-97/10887和WO-A-00/67900。
亲合配体库可以建立在诸如交联琼脂糖的羟基载体上。迄今为止，所有以三嗪为基础的建立在琼脂糖上的配体库都包含具有单取代三嗪组分(参见WO-A-97/10887)或者具有结合了三嗪基团的大环(参见WO-A-01/42228)的载体。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现：有效的亲合库可以通过将两个或两个以上的三嗪环结合为一个配体结构得到，从而提供较大的配体，所述较大的配体与以单个三嗪环为基础的配体相比具有增加的化学多样性和提高的选择性。
根据本发明，一种新化合物具有式I结构：
其中每个Z相同或不同并为
或者-Y；
其中每个X相同或不同并为多价(包括二价)胺基(aminyl)或二胺基-末端间隔基；
每个Y为相同或不同的胺基；以及
M为载体基质。
本发明另一方面是下式的化合物：
Figure A20038010552000071
其中Z如前述定义。该化合物可以与具有适当官能团的载体M反应。
本发明的化合物典型地通过基质-固定化胺与氰尿酰氯、胺基Y、二元胺X、氰尿酰氯、第二种胺基Y以及第三种胺基依次反应制得。更普遍地，通过一个间隔基(X)接着一个三嗪核的重复加成，有可能构建具有交替间隔基-三嗪基链的配体。任意末端三嗪的氯原子可以被自身即为多官能化的胺所取代，在所述胺中任选地将某些官能团用保护基团阻断从而有利于定向连接。多官能化胺间隔基的使用使得有可能构建更精细的配体，得到支化的、触角状的、管状的或者球状的结构。此外，配体库可以在共用的载体M上制备。这构成了本发明的另一方面。
本发明的化合物是“多维的”。维数与不同基团Y的数目一致。
本发明的化合物(包括库)可以用于肽和蛋白质的分离、离析、纯化、表征、鉴别、定量化或发现。这些化合物尤其被用于分离、纯化或发现蛋白质类物质，包括使含有该类物质的试样经历亲合色谱。该蛋白质类物质可以是免疫球蛋白或其亚类、片段、前体或衍生物，包括或衍生自天然原料或衍生自重组源的融合蛋白。此外，本发明的化合物可用于从生物或药物化合物制剂中除去包括有毒物质或病原体的污染物。其亦可用于药物发现。
发明详述
载体物质M可以是任何适宜的化合物或者材料，颗粒的或非颗粒的、可溶的或不可溶的、多孔的或无孔的。按定义地与亲合配体结合提供了一种从被引入的与之反应的溶液里的溶质中分离亲合配体的简单方法。
为制得本发明的化合物，使载体物质(例如琼脂糖)与一种活化剂(例如表氯醇)进行受控的反应从而引入有利于胺基或间隔基X连接的活化基团。引入的活化基团的量可以通过适当的检测而测量出来并用μmol/g沉积凝胶为单位表示。过量的溶剂可以在连接胺间隔基之前在重力下通过抽吸或过滤被去除。活化的琼脂糖可以首先与提供间隔基(X)的胺反应。
X至少为二价并用于连接。当连接M至一个三嗪时，其与含有胺的化合价一起必须至少为二价。类似地，当X连接两个三嗪时，其至少为二价同时该化合价必须是含有胺的化合价。典型地，X最初至少为单价的(例如氨)、二价的(例如1，2-二氨基乙烷)或三价的(例如二亚乙基三胺或三(氨基乙基)胺)。然而仍然可以理解X可以被诸如羟基的基团所取代，而不丧失其功能，并且该认识在本发明范围之内。
第一步反应的产物实例示于式II、III、IV和V：
可以通过任何适当的检测(例如TNBS)确定引入胺基的数目，并可用μmol/g沉积凝胶加以表示。这一阶段引入的每个脂肪族胺下一步将与氰尿酰氯反应。例如，使式II化合物反应生成式VI的三嗪活化琼脂糖。
Figure A20038010552000092
三嗪活化树脂上总的氯化物含量可以通过测量碱性水解后产生的氯离子得到。
为了制备3D库，即含有2个或2个以上三嗪基团和三个独立可利用的Y基团的化合物，氯原子之一被胺Y1取代。第二个氯原子被第二种间隔基(X2)替换，其可以为任意链长的二元胺、三元胺或四元胺。X2可以为二价或三价(如前述实例)。
每加成一个胺至三嗪环上则导致脱除一个氯离子，对此可以进行检测。结果可以用每克沉积凝胶所释放的氯离子的μmol数表示。如果活化测定结果＝A；胺测定结果＝B；氯测定结果(其中一个氯离子已脱除)＝C(i)，此时假定起始原料100％转化为产物：
A＝B＝C(i)(μmol/g沉积凝胶)
当第二个氯离子C(ii)被脱除，则：
A＝B＝C(i)＝C(ii)；且
C(i)+C(ii)＝2A＝2B。
第二个三嗪的取代步骤产生式VII结构：
Figure A20038010552000101
在3D库中，第二个三嗪核上的氯原子相继地都被胺Y2和Y3取代得到式VIII产物：
Figure A20038010552000102
由这些构件建构的其它结构的实例如式IX和X所示：
Figure A20038010552000111
交替的三嗪和多价间隔基能够使配体产物具有任意数目的独立可变的胺取代位置，例证于式XI至XIII：
Figure A20038010552000112
式XI和XII具有不同程度的支化，但是具有相同的维数。这部分地是因为XIII中增加的分支是在X上的，也就是说，两个相同的三嗪环是在这一点而不是在另外的三嗪上引入。
下列实施例举例说明本发明。
实施例1
本实施例阐述了环氧活化的PuraBead树脂的制备。PuraBead是一种多孔面包状琼脂糖载体，其是交联的，以支持耐用性。
环氧活化：将PuraBead 6XL样品(333g)在水(213mL)中形成浆液然后与10M NaOH(26.6mL)混合。用架设的搅拌器搅拌该混合物直至达到34℃恒温。加入被分成两等份的表氯醇(24mL)并将温度升高至40℃。1小时之后，过滤该浆液并用水(10×350mL)洗涤。对洗过的活化树脂上环氧化物的检测显示取代水平为23.3μmol环氧化物/g沉积凝胶。
实施例2
本实施例阐述了由环氧活化凝胶制备胺化凝胶。
胺活化：将实施例1中得到的环氧活化凝胶(226g)在水(180mL)中形成浆液然后用0.88氨水(45mL)处理。将该反应混合物在40℃搅拌整夜。之后，过滤该凝胶并用水(10×500mL)洗涤，得到胺活化树脂(约220g)。对部分凝胶上TNBS的检测显示胺水平为23.2μmol/g沉积凝胶。
实施例3
本实施例阐述了胺化树脂与氰尿酰氯反应制备二氯三嗪活化凝胶。
三嗪活化：将实施例2中制备的胺活化凝胶(200g)用1.0M磷酸钾缓冲液(200mL，pH 7)洗涤。将沉积凝胶转移至烧杯中并与水(50mL)和1.0M磷酸钾缓冲液(50mL，pH 7)混合。将全部混合物转移至的1升3颈圆底烧瓶中。添加丙酮(100mL)时持续剧烈搅拌。烧瓶冷却至稳定温度0℃。从侧臂加入氰尿酰氯(5g)在冷丙酮(50mL)中的溶液。反应在1小时后停止，将烧瓶中的物质转移至烧结漏斗。用50％丙酮(1L)、水(1L)、50％丙酮(1L)及水(2L)洗涤该二氯三嗪凝胶，得到三嗪活化树脂(约200g)。氯化物检测确定了总的氯离子含量为46μmol/g沉积凝胶。
实施例4
本实施例阐述了加成第一个胺至二氯三嗪凝胶。
Y1的取代：将实施例3中制备的二氯三嗪凝胶(200g)在水(100mL)中形成浆液然后用被10M NaOH(4mL)碱化过的β-丙氨酸(0.2M)在水(100mL)中的的溶液处理。反应容器在室温下振荡1小时，之后过滤其中的物质并用50％DMF(5×125mL)和水(10×125mL)洗涤。
实施例5
本实施例阐述了较高温度下第二个氯离子被二元胺间隔基替换。
第二次取代以添加间隔基X2：将实施例4中得到的Y1取代凝胶在水(100mL)中形成浆液并用1，2-乙二胺(0.4M)在水(100mL)中的溶液处理。使反应容器在60℃振荡2天。冷却之后，用50％DMF(5×125mL)、水(5×125mL)、0.1M HCL(5×125mL)、30％异丙醇/0.2M NaOH(5×125mL)和水(10×125mL)洗涤生成的凝胶。凝胶试样上TNBS的检测显胺取代为26.7μmol/g。上清液上的氯化物检测显示释放的氯化物为27.2μmol/g。
第二次三嗪步骤：该过程与实施例3中所述的第一次三嗪活化步骤相同。
实施例6
本实施例阐述了将第一个胺加成至第二个三嗪环上。
Y2的取代：将实施例5第二个三嗪偶联步骤中得到的凝胶称重放入8个瓶中(每瓶12.5g)。试样在50％DMF(6.25mL)中形成浆液。每瓶装填选定的胺(0.2M，6.25mL)溶液。将含有羧酸酯成分或含有以盐酸盐形式制得的那些成分的胺用使总的pH达到约9-10的必需量的10MNaOH碱化。这些试样在室温下振荡1小时。
从每瓶取出上层清液(100mL)通过氯离子测定以确定反应进度。表1列出第一个胺取代后的氯化物释放量。
                                 表1
  最终库中的柱编号   中间体胺   氯化物释放量(μmol/g)
  1   β-丙氨酸   15.61
  2   3-氨基苯甲酸   17.13
  3   4-氨基苯甲酸   9.83
  4   L-谷氨酸   17.52
  5   DL-缬氨酸   13.97
  6   4-氨基丁酸   18.77
  7   L-酪氨酸   19.73
  8   6-氨基正己酸   17.16
将这8个中间体凝胶用50％DMF(5×12.5mL)和水(10×12.5mL)洗涤。
实施例7
本实施例阐述了在第二个三嗪环上组合加成最后一个胺(Y3)从而制得如式VIII所示的3D配体库。
第二次取代Y3：此过程是通过改变实施例5给出的第二种间隔臂(X2)取代的改进方法从而实现的。该合成法直接在microspin柱中进行。或者，还要用到一个96孔(well)的板块(block)。
实施例6中得到的8个中间体(4.0g)分别在0.4％Tween-20(2mL)中形成浆液。分配第一种中间体的浆液(0.375mL)沿一行八个孔流下(每个孔0.375mL)。对第二种中间体重复该过程使其沿第二行的孔流下，重复直至八个第一阶段中间体全部被分配沿各自的一行流下。
第一个最后阶段的胺(Y3)(0.4M)在50％DMF中的溶液被分配流过第一行(每个孔0.125mL)直至八个孔全部被装满。重复该过程直至八行全部被选定的最后阶段的胺(Y3)装满。从而8×8阵列中的每个孔构造了不同的独立的配体结构。
一旦完成Y3的加成，在烘箱中60℃下振荡该库板块(libraryblock)2天。经转移和冷却(1小时)，可以将该库板块排入深孔微滴定板中。检测收集的滤液确定释放的氯离子，从而确定反应程度。用50％DMF(2×1mL)、水(2×1mL)、0.1M HCl(2×1mL)、水(2×1mL)、0.2MNaOH/30％异丙醇(2×1mL)、水(2×1mL)和20％乙醇(2×1mL)洗涤该库板块。
下表2中的结果显示第二次取代(Y3)之后氯化物释放数据，用μmol被释放的氯化物/g凝胶表示。
                                   表2
  1   2   3   4   5   6   7   8
  4-(2-氨基乙基)吗啉   13.32   16.68   15.75   16.68   16.45   15.07   16.33   12.8
  1-(2-氨基乙基)哌啶   14.29   17.40   14.62   15.52   15.75   15.98   16.92   14.29
  3-氨基苄基醇   13.53   16.92   12.18   17.64   15.29   16.56   16.80   14.4
  酪胺   11.49   14.29   11.10   14.07   12.80   13.64   11.88   12.39
  2-(对甲苯基)乙胺   13.43   16.80   15.63   18.63   17.16   16.68   15.41   15.75
  苄胺   13.11   16.68   14.29   16.21   16.21   16.21   15.29   14.29
  色胺   16.68   20.95   19.90   21.08   21.35   20.29   26.74   19.39
  1，5-二氨基庚烷二盐酸盐 14.82 19.31 15.5 21.6 15.0 20.9 254.0 16.3
生成的库被筛选测试对不同靶蛋白的结合活性/亲合性。下表3给出在人的血浆上进行筛分的具体描述。通过向凝胶床顶部加入pH为7.0的2mL 25mM磷酸钠首先将乙醇保存液从库中各个位置洗去，并使其在重力下流过从而移走凝胶中的20％乙醇保存液。将人血浆在磷酸盐缓冲盐水中以1∶20(v/v)稀释，向每个凝胶床的顶部加入2mL并使其在重力下流过。分别收集洗出各库组分的流过液(FT)。然后各个凝胶床被2mL pH为7.0的磷酸钠缓冲液以类似方式洗涤去除非结合蛋白；分别收集洗出各库组分的洗涤液部分(W)。在设计为去除结合蛋白的两次洗脱步骤中的第一步(E1)中，将pH为6.5的1mL 10mM磷酸钠/柠檬酸加入各凝胶床顶部并使其在重力下流过，然后分别收集。然后进行第二次洗脱步骤(E2)，其设计为去除在第一次洗脱步骤中未释放出的蛋白质：将1mL 50mM柠檬酸加入各凝胶床顶部并使其在重力下穿过，然后分别收集。最后进行消毒步骤(San)，设计去除凝胶上剩余的全部污染物质：将1mL 0.2M氢氧化钠/30％异丙醇加入各凝胶床顶部并使其在重力下流过，然后分别收集。
对收集的每个洗脱部分(FT、W、E1、E2和San)中各步释放的蛋白质进行检测。结果示于表3A-E中。从库中收集的每一部分如表2那样用1个格表示。数字给出的从各库组分中回收的蛋白质为μg。
                                       表3A
  FT   第一种胺
  第二种胺   1   2   3   4   5   6   7   8
  9   20967   13050   13863   14722   9075   13050   13863   14722
  10   17601   8546   7154   17601   18667   13050   12284   10880
  11   18667   7587   9639   15630   7587   7587   9075   10240
  12   17601   8546   12284   13863   11561   11561   9639   9075
  13   15630   8050   9075   13050   8546   11561   9075   11561
  14   17601   7154   10880   13050   14722   12284   10240   13050
  15   18667   4572   10880   7154   6749   10880   5094   7587
  16   18667   12284   8546   13050   14722   12284   15630   12284
                                   表3B
  W   第一种胺
  第二种胺   1   2   3   4   5   6   7   8
  9   740   885   809   740   927   846   971   809
  10   774   846   809   1071   774   740   885   740
  11   846   846   809   846   1071   740   971   774
  12   927   927   809   971   971   774   1128   971
  13   1019   971   971   971   1019   846   1128   1071
  14   971   1071   1071   971   971   1071   1189   885
  15   971   1326   1128   1128   1255   971   1403   1071
  16   846   885   885   846   809   774   885   675
                                       表3C
  E1   第一种胺
  第二种胺   1   2   3   4   5   6   7   8
  9   878   1727   1459   782   782   694   1544   828
  10   464   1101   828   537   464   427   1101   574
  11   1165   1930   1826   1165   1459   929   1826   1544
  12   1727   2407   1826   1459   1727   1459   1930   1727
  13   1633   2407   2041   1544   2041   1380   1826   1826
  14   1165   2684   1930   1459   1633   1233   1826   1459
  15   1930   2988   2684   1633   2407   1727   2041   2041
  16   653   2041   1304   694   574   613   1233   694
                                         表3D
  E2   第一种胺
  第二种胺   1   2   3   4   5   6   7   8
  9   25   178   25   25   0   0   79   25
  10   0   25   0   0   0   0   0   25
  11   129   904   599   225   270   79   519   225
  12   225   1006   810   397   397   129   1614   519
  13   313   1793   1531   397   856   225   2213   479
  14   438   1531   954   397   558   313   1701   519
  15   270   1793   1118   356   680   225   1453   479
  16   0   129   25   0   0   0   79   0
                                      表3E
  San   第一种胺
  第二种胺   1   2   3   4   5   6   7   8
  9   10   10   0   0   0   0   159   63
  10   0   63   0   10   0   0   159   10
  11   10   243   159   113   63   10   202   63
  12   159   316   281   202   202   63   316   281
  13   113   349   316   159   243   113   437   281
  14   63   281   202   202   243   202   409   281
  15   113   316   243   159   409   63   511   380
  16   0   63   0   10   10   0   63   10
胺(Y1、Y2和Y3)的性质
挑选出的用于合成3D库的胺可以是一级胺、二级胺、脂肪族胺、芳香族胺、杂环胺、芳香基胺、手性胺、带电的胺或这些胺的组合。反应条件随所选胺的溶解性而变化。可选的溶剂有水、50％DMF和纯DMF。所有以盐酸盐形式得到的或含有羧酸酯部分的胺都要在反应之前用必需摩尔量的NaOH中和。
在上述3D库中产生的亲水配体的实例由式XIV表示。
在此情况下，X1衍生自氨；Y1衍生自β-丙氨酸；X2衍生自1，2-二氨基乙烷；Y2衍生自对3-氨基苯甲酸；以及Y3衍生自1-(3-氨基丙基)吗啉。
实施例8
本实施例阐述了另一个3-D配体的应用，认为其对于从细胞培养基液中和从血浆成分里的多克隆抗体中分离和纯化单克隆抗体特别有效。其由式XV表示：
Figure A20038010552000201
在此情况下，X1衍生自1，2-二氨基乙烷；Y1衍生自β-丙氨酸；X2衍生自1，2-二氨基乙烷；Y2衍生自对2-氨基苯酚；以及Y3衍生自3-氨基苯酚。
在此实施例中，式XV所示的吸附剂用于从CEA(利用Kistler/Nitschmann方法由血浆中的沉淀物A得到的澄清提取液A)中纯化免疫球蛋白G。将吸附剂(以22mmol/g装填于琼脂糖上)填充进玻璃柱(10mL)，用10柱体积的pH为7.0的25mM磷酸钠使之平衡化，然后装填CEA(含有约400mg的免疫球蛋白G)。然后用pH为7.0的25mM磷酸钠(5柱体积)接着用5柱体积的10mM磷酸钠(用柠檬酸使之平衡化至pH为6.5)洗涤该柱。用pH为3.0的10mM柠檬酸钠接着用50mM柠檬酸洗脱结合蛋白。使用之后用10柱体积的0.5M氢氧化钠对该柱消毒。
该吸附剂的结合能力为43.2mg/mL，洗脱能力(两部分洗脱液中全部被洗脱的蛋白质)为32.8mg/mL。第一次洗脱液含有约95％纯度的IgG和27mg/mL的吸附剂洗脱能力。
实施例9
本实施例阐述了使用分成四个大组的胺(芳香族胺、疏水胺、带正电的胺和极性胺)组合合成“库的库”(library of libraries)。12个库分别以与实施例1-7中描述的相同的方式被合成到库中，其中使用的Y1、Y2和Y3详细描述于表4。
                             表4
  编号   Y1   Y2   Y3
  1   疏水的   芳香族的   芳香族的
  2   疏水的   芳香族的   芳香族的
  3   带正电的   芳香族的   芳香族的
  4   带正电的   芳香族的   芳香族的
  5   极性的   疏水的   疏水的
  6   极性的   芳香族的   疏水的
  7   极性的   疏水的   疏水的
  8   极性的   芳香族的   疏水的
  9   带正电的   芳香族的   芳香族的
  10   带正电的   疏水的   芳香族的
  11   疏水的   芳香族的   芳香族的
  12   疏水的   疏水的   芳香族的
对于每个库，将相同的第一种胺Y1加入全部64个库组成部分中，剩余的胺Y2和Y3在加成间隔臂和三嗪(如前述实施例描述的)之后被加入，描述构成各个库的64个不同的凝胶。按前述实施例在固相合成的各个阶段进行氯化物释放和TNBS检测。
列出分别用于库1-12的胺Y1、Y2和Y3(表5)。
                                表5
  库   Y1   Y2   Y3
  1   28   4，5，14，18，19，26，29，30库   4，5，14，18，19，26，29，30
  2   28   4，5，14，18，19，26，29，30   6，9，13，19，23，25，31，34
  3   7   1，4，5，14，18，19，29，30   1，4，5，14，18，19，29，30
  4   7   1，4，5，14，18，19，29，30   2，3，6，7，9，25，31，34
  5   24   15，16，17，20，27，28，32，36   15，16，17，20，27，28，32，36
  6   24   15，16，17，20，27，28，32，36   4，11，12，14，21，22，18，33
  7   35   15，16，17，20，27，28，32，36   15，16，17，20，27，28，32，36
  8   35   15，16，17，20，27，28，32，36   4，11，12，14，21，22，18，33
  9   8   1，4，5，14，18，19，29，30   1，4，5，14，18，19，29，30
  10   8   1，4，5，14，18，19，29，30   6，7，9，10，11，25，31，34
  11   16   1，4，5，14，18，19，29，30   1，4，5，14，18，19，29，30
  12   16   1，4，5，14，18，19，29，30   6，7，9，10，11，25，31，34
其中编号的胺如下：
1＝苯胺；2＝2-氨基苯酚；3＝4-氨基苯酚；4＝间甲苯胺；5＝4-氨基-1-苄基哌啶；6＝2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷；7＝1-(2-氨基乙基)哌啶；8＝2-(2-氨基乙基)吡啶；9＝1-(2-氨基乙基)吡咯烷；10＝4-(氨基甲基)哌啶；11＝(+/-)-2-氨基降冰片烷；12＝3-氨基苄基醇；13＝4-氨基-1-萘酚；14＝苯乙胺；15＝丁胺；16＝异丁胺；17＝(+/-)-仲丁胺；18＝苄胺；19＝色胺；20＝N-甲基异丙胺；21＝4-甲基苄胺；22＝2-(对甲苯基)乙胺；23＝4-氨基间甲酚；24＝3-氨基苯甲酰胺；25＝1-氨基-2，3-二氢化茚；26＝N，N-二甲基-1，3-苯二胺；27＝2-氨基-6-甲基庚烷；28＝2-氨基-5-甲基己烷；29＝3-氨基-1-苯基丁烷；30＝(S)-(-)-1-(1-萘基)乙胺；31＝(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；32＝(S)-(+)-3-甲基-2-丁胺；33＝2-甲基苄胺；34＝(S)-(-)-吡咯烷-2-基甲醇(prolinol)；35＝L-丙氨酸酰胺；36＝3-异丙氧基丙胺。
实施例9描述的“库的库”合成的典型的3-D结构是：
实施例10
本实施例描述了“库的库”(其合成描述于实施例9中)在从CohnIV-I糊剂制剂中筛选蛋白质α-1-抗胰蛋白酶(也被称为α-1-蛋白酶抑制剂)结合物中的应用。Cohn IV-I糊剂的制备是通过将-80℃下冻结的糊剂(20g)溶入pH为8.1的15mM磷酸钠缓冲液(300mL)中，整夜置于25℃水浴中并持续搅拌。然后将该混合物在25℃以15,000rpm的转速离心分离15分钟以上，之后经1.0mm和0.45mm过滤器过滤。通过向凝胶床顶部加入4×0.5mL部分的10mM Tris、20mM柠檬酸钠、pH为7.5的150mM氯化钠从而将乙醇保存液从各库中的各个位置洗出。每部分都是在重力下流过，以置换凝胶中20％乙醇保存液。将各库组分的底部密封，然后向凝胶床顶部加入Cohn IV-I糊剂制剂(0.25mL)并与平衡化凝胶混合。用Cohn IV-I装填物培养库30分钟。之后将库打开，分别收集库各组分的流过液(FT)。然后用3×0.25部分的10mMTris、20mM柠檬酸钠、pH为7.5的150mM氯化钠洗涤各凝胶床以去除非结合蛋白。分别收集库各组分的洗涤液(W)部分。在一次洗脱步骤中，向凝胶床顶部加入8M尿素、25mM Tris、pH为7.5的150mM氯化钠(3×0.25mL)，分别收集库各组分的洗脱液(E)。最后，消毒(San)步骤(设计为去除凝胶上所有残留结合物质)包括将1mL的0.2M氢氧化钠/30％异丙醇加到各凝胶床顶部，使其在重力下流过，然后分别收集。使得自于库各成分的FT和E部分在SDS PAGE凝胶上流过，目视观察α-1-抗胰蛋白酶在FT部分中耗尽以及α-1-抗胰蛋白酶在E部分中出现。α-1-抗胰蛋白酶的在预计的其它成分中的存在和耗尽同样通过比浊法被证实。
实施例11
对768个独立的库组分进行筛选，选出4个以30mL的规模独立的合成，其采用与实施例1-7所述的库合成相同的化学过程和检测。这4个树脂的胺组成(Y1、Y2、Y3)列于表6中。胺的编号见表5。
                  表6
  树脂   胺(Y1)   Y2   Y3
  A   7   4   9
  B   24   28   36
  C   35   27   20
  D   35   16   11
对这四个树脂评述如下：
将体积约10mL高约12cm的柱体(参见表7具体描述)用4柱体积的10mM Tris、20mM柠檬酸钠、pH为7.5的150mM氯化钠平衡化。以50cmh-1的流速引入按照实施例9(体积参见表7)所述方法制备的CohnIV-I糊剂。装填后，以200cmh-1流速用4柱体积的10mM Tris、20mM柠檬酸钠、pH为7.5的150mM氯化钠将非结合蛋白从柱上洗掉。用两部分洗脱液：4柱体积的100mM磷酸钠、pH为6.1的20mM柠檬酸钠组成的第一部分以及4柱体积的8M尿素、25mM Tris、pH为7.5的150mM氯化钠组成的第二部分。它们分别以200cmh-1的流速流过。
                               表7
  体积(mL)   高度(cm)   加入的体积(mL)   平衡化体积，洗涤液，E1，E2
  A   9.5   12.2   48   4CV
  B   10.7   13.5   51   4CV
  C   11.0   13.9   53   4CV
  D   9.0   11.4   45   4CV
通过比浊法检测非结合(FT)和洗脱液(E1和E2)部分中的α-1-抗胰蛋白酶。其结果与计算得到的在这些条件下对于这些物质的结合能力(BC)以及洗脱能力(EC)一起列于表8。
                                 表8
  填充量(mg)   NB(mg)   E1(mg)   E2(mg)   BC(mg/mL)   EC(mg/mL)   BC(％)   EC(％)
  A   221.0   108   0   25.0   11.8   2.6   52   11
  B   244.8   111   0   53.3   12.5   5.0   55   22
  C   245.4   87.4   0   81.8   14.4   7.4   64   33
  D   202.5   148   0   6.83   6.1   0.8   27   3
实施例12
本实施例阐述了“四维”库的合成，其含有3个三嗪基团和4个独立可变的Y基团。按实施例1所述方法对PuraBead载体基质环氧活化，直至最终的环氧化物负载为5.6mmol/g沉积凝胶，然后使间隔基X1按照与实施例5中所描述的间隔基加成类似的方式，用环氧树脂和1，2-乙二胺处理从而被结合。
该树脂按照实施例3所述方法与三氯三嗪反应从而制备二氯三嗪凝胶。检测氯化物水平为12.5mmol/g沉积凝胶。
第一个胺Y1(结构XI)按照与实施例4中描述的胺加成类似的方式，通过将色胺溶液添加到二氯三嗪中从而被加入。氯化物水平是5.4mmol/g沉积凝胶。
间隔基X2(结构XI)按照与实施例5中描述的间隔基加成类似的方式，通过添加1，2-乙二胺溶液从而被结合。TNBS检测显示胺水平为5.4mmol/g沉积凝胶。
第二次加成三氯三嗪采用与第一次加成(参见前文)类似的条件。氯化物水平为12.1mmol/g沉积凝胶。
第二个胺Y2(结构XI)按照与实施例4所述的胺nmol类似的方法，通过将酪胺溶液加成至二氯三嗪从而被加入。氯化物水平是12.1mmol/g沉积凝胶。
间隔基X3(结构XI)按照与实施例2所述的间隔基nmol类似的方式，通过添加0.88氨从而被结合。进行生成物质上的TNBS检测(5.7mmol/g沉积凝胶)。
采用与前两次加成(参见前文)类似的条件完成三氯三嗪的第三次加成。氯化物水平为12.5μmol/g沉积凝胶。
前面步骤得到的双氯双三嗪凝胶被称量放入八个瓶中，并按照与实施例6所述相似的方式，使其与八个不同的胺反应，从而结合胺Y3(结构XI)。此次胺得到的氯化物释放量(μmol/g沉积凝胶)列于表9。
                               表9
  最终库中的柱编号   中间体胺Y3   氯化物释放量
  1   β-丙氨酸   8.0
  2   3-氨基苯酚   8.0
  3   3-氨基苄基醇   8.0
  4   酪胺   8.0
  5   异丁胺   8.0
  6   苄胺   8.0
  7   色胺   9.0
  8   2-乙基硫(乙胺)   0.0
加成上文所示的中间体胺之后，使八种凝胶分别形成浆液，然后按照实施例7所述方式将其分配沿一行的八个孔流下。将八种不同的胺Y4加入到全部八行中从而产生总共64种不同的四重胺取代树脂。表10中的结果用mmol被释放的氯化物/g凝胶来显示最终取代Y4后得到的氯化物释放数据。
                                        表10
  1   2   3   4   5   6   7   8
  β-丙氨酸   4.4   7.1   6.0   6.3   4.4   9.9   5.9   7.3
  3-氨基苯酚   4.4   6.6   6.2   7.6   6.4   3.9   6.7   8.1
  3-氨基苄基醇   4.6   7.2   7.1   7.1   5.7   4.0   6.6   8.4
  酪胺   5.1   6.6   7.1   4.6   6.9   6.1   7.5   8.3
  异丁胺   4.2   5.1   6.4   4.7   4.8   3.4   3.7   4.9
  苄胺   4.8   4.2   6.1   5.7   6.9   6.9   5.7   7.5
  色胺   4.5   7.0   4.6   7.0   7.1   3.2   7.7   8.5
  2-乙基硫(乙胺)   16.1   16.5   21.0   16.0   15.1   14.6   14.4   14.9
典型的4-D结构是：
Figure A20038010552000271

Claims (15)

1、下式所示的化合物：
其中每个Z相同或不同并为
Figure A2003801055200002C2
或者-Y；
其中每个X相同或不同并为多价胺基或二胺-末端间隔基；
每个Y是相同或不同的胺基；以及
M为载体基质。
2、权利要求1所述的化合物，如下式所示：
3、权利要求2所述的化合物，其中任一个或每个Z为Y。
4、前述权利要求中任何一项所述的化合物，其中每个X独立地代表仲氨基或二氨基烷烃。
5、前述权利要求中任何一项所述的化合物，其中每个Y独立地选自任选取代的脂肪族和芳香族伯胺。
6、权利要求1所述的化合物，如下式所示：
Figure A2003801055200003C1
7、如下式所示的化合物：
Figure A2003801055200003C2
其中Z如权利要求1中定义。
8、权利要求1-6中任何一项所述化合物的合成方法，该方法包括权利要求7所述的化合物与含有胺的载体基质的反应。
9、权利要求7所述化合物的合成方法，该方法包括二氯三嗪依次与胺基Y、基团X、氰尿酰氯、第二种胺基Y和第三种胺基Y的反应。
10、权利要求1-6中任何一项所述的相关化合物的库，例如在共用的载体M上。
11、权利要求10所述库的制备方法，该方法包括单独地或多个一起地合成中间体结构，将这些结构分成小份，然后进行适当的后续反应步骤。
12、权利要求1-6中任何一项所述化合物的用途，用于肽和蛋白质的分离、离析、纯化、表征、鉴别、定量化或发现。
13、分离、纯化或发现蛋白质类物质的方法，该方法包括使含有该类物质的试样经历使用权利要求1-6中任何一项所述化合物的亲合色谱。
14、权利要求13所述的方法，其中蛋白质类物质是免疫球蛋白或其亚类、片断、前体或衍生物，包括衍生自天然或重组源的融合蛋白。
15、权利要求1-6中任何一项所述化合物的用途，用于从生物或药物化合物制剂中除去包括有毒物质或病原体的污染物。
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