MXPA05006047A

MXPA05006047A - Compuestos de triazina y sus usos en la formacion de librerias multidimensionales para cromatografia de afinidad.

Info

Publication number: MXPA05006047A
Application number: MXPA05006047A
Authority: MX
Inventors: Christopher Pearson James
Original assignee: Prometic Biosciences Ltd
Priority date: 2002-12-09
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2005-11-17
Also published as: WO2004052870A1; CA2508452C; AU2003288447B2; DK1569918T3; JP2006519764A; ATE526317T1; AU2003288447A1; GB0228724D0; CN1788003A; US20060052598A1; CN1788003B; EP1569918A1; US7723335B2; EP1569918B1; JP4607760B2; CA2508452A1; NZ541088A

Abstract

Un compuesto de la formula (I) en donde cada Z es la misma o diferente y es de formula (a) 0 -Y en donde cada X es la misma o diferente y es un grupo aminilo multivalente o espaciador terminado en diaminilo, cada Y es el mismo grupo aminilo o diferente; y M es una matriz de soporte.

Description

COMPUESTOS DE TRIAZINA Y SUS USOS EN LA FORMACION DE LIBRERIAS MULTIDIME SIONALES PARA CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Campo de la Invención Esta invención se relaciona a compuestos de triazina y a su uso en la formación de librerías multidimensionales de ligandos de afinidad, y también a la unión de ligandos de afinidad a matrices. La invención además se relaciona al uso de los ligandos para la purificación de materiales proteináceos naturales, recombinantes o transgénicos . Los ligandos también se pueden utilizar en dispositivos médicos y como fármacos terapéuticos. Antecedentes de la Invención El principio de la cromatografía de afinidad se basa en el fenómeno del reconocimiento molecular. Un ligando inmovilizado sobre una matriz de soporte es capaz de formar una interacción reversible, específica con una molécula objetivo en la presencia de una mezcla de otras moléculas. La naturaleza de la interacción puede ser enlace de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, apilamiento como un resultado de la geometría favorable o cualquiera otro aspecto que favorece la relación de huésped-objetivo. Una vez enlazado al objetivo, la interacción de ligando-objetivo debe ser suficientemente fuerte para permitir la remoción de las otras moléculas contaminantes desde una mezcla, mientras que se conserva el complejo de ligando-objetivo intacto. Sin embargo, el enlace debe ser suficientemente débil tal que un cambio inducido en las condiciones locales, por ejemplo, reguladoras causa la rotura de la interacción, liberando de esta manera la molécula objetivo en su forma ahora purificada. El ligando inmovilizado, ahora libre de proteina, se puede usar nuevamente para una purificación subsecuente. Las propiedades deseables de un ligando de afinidad incluyen la estabilidad química y térmica y la alta selectividad. El ligando puede ser diseñado para adaptarse a una molécula objetivo particular mediante el uso de la modelación molecular o se puede seleccionar mediante la clasificación de librerías combinatorias . El procedimiento combinatorio proporciona un número grande de ligandos que pueden ser construidos para incorporar una variedad de porciones químicas incluyendo grupos hidrofílicos, hidrofóbicos, cargados ' o neutros o una mezcla de los mismos. Las librerías combinatorias convenientemente se pueden sintetizar •al incorporar compuestos comercialmente disponibles, incluyendo aminoácidos, ácidos carboxílieos y aminas en una síntesis gradual directamente sobre la superficie de la matriz de soporte. Alternativamente, el ligando puede ser sintetizado y subsecuentemente unido a una matriz de soporte . El cloruro cianúrico o 2, , 6-triclorotriazina (después en la presente referida como triazina) , es una molécula simétrica. Las triazinas 2 , , 6-trisustituidas fácilmente se pueden generar mediante la reacción de cloruro cianúrico con nucleofilos tales como compuestos de amina. Los derivados de triazina son útiles como adsorbentes y para otros propósitos; ver WO-A-87/10887 y WO-A-00/67900. Las librerías de ligando de afinidad se pueden construir en un soporte hidroxilico tal como agarosa reticulada. Hasta la fecha, todas las librerías de ligando basado en triazina construidas en agarosa han comprendido un soporte con un solo componente de triazina sustituida (ver WO-7A-97/10887) o con anillos macrociclicos que incorporan grupos triazina (ver WO-A-01/42228) . Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que librerías de afinidad útiles se pueden obtener al combinar dos o más anillos de triazina en una sola estructura de ligando, para proporcionar ligandos más grandes, con diversidad química incrementada y selectividad aumentada comparada con los ligandos basados en anillos de triazina individuales . De acuerdo con la presente invención, un compuesto novedoso tiene la fórmula I en donde cada Z es la misma o diferente y es en donde cada X es la misma o diferente y es un grupo aminilo multivalente (incluyendo divalente) o espaciador terminado en diaminilo; cada Y es el mismo grupo aminilo o diferente; y M es una matriz de soporte. Otro aspecto de esta invención se relaciona a compuestos de la fórmula en donde Z es como se define en lo anterior. Este compuesto puede hacer reaccionar con un soporte M que tiene un grupo funcional adecuado. Típicamente, un compuesto de la invención se hace mediante la reacción secuencial de una amina inmovilizada en matriz con cloruro cianúrico, un grupo aminilo Y, una diamina X, cloruro cianúrico, un segundo grupo aminilo Y y un tercer grupo aminilo. Más generalmente, mediante la adición iterativa de un espaciador (X) seguida por un núcleo de triazina es posible construir ligandos que tienen una cadena de grupos espaciador-triazina alternantes. Los átomos de cloro de cualquier . triazina terminal pueden ser sustituidos por una amina, que por sí misma puede ser multifuncional, opcionalmente con ciertas f ncionalidades bloqueadas mediante un grupo protector para facilitar la unión orientada. El uso de grupos espaciadores de amina multifuncionales permite la construcción de ligandos más elaborados, conduciendo a estructuras ramificadas, antenarias, tubulares o globulares. Además, una librería de ligandos puede ser producida, en el soporte común M. Esto constituye un aspecto adicional de la invención. Los compuestos de la invención son "multi-dimensionales" . El número de dimensiones corresponde al número de grupos Y diferentes.

Un compuesto de la invención (que incluye librerías) se puede utilizar para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación, cuantificación o descubrimiento de péptidos y proteínas. En particular, se puede usar para la separación, purificación o descubrimiento de un material proteináceo, que comprende someter una muestra que contiene el material a cromatografía de afinidad. El material proteináceo puede ser una inmunoglobulina o una subclase, fragmento, precursor o derivado de la misma, incluyendo proteínas de fusión, ya sea derivado de fuentes naturales o recombinantes . Además, un compuesto de la invención se puede usar para la remoción de contaminantes, incluyendo entidades tóxicas o patogénicas, a partir de una preparación de compuesto biológico o farmacéutico. También se puede utilizar para el descubrimiento de fármacos. Descripción de la Invención El material de soporte M puede ser cualquier compuesto o material adecuado, particulado o no particulado, soluble o insoluble, poroso o no poroso. En conjunción con una leyenda de afinidad, como es definido, este proporciona un medio conveniente para separar leyendas de afinidad a partir de solutos en una solución llevada en contacto con la misma . Con el fin de preparar un compuesto de la invención, un material de soporte tal como agarosa se somete la reacción controlada con un agente de activación tal como epiclorohidrina para introducir grupos reactivos que facilitan la unión de un grupo amina o espaciador X. La cantidad de grupos reactivos introducidos se pueden medir mediante el ensayo adecuado y expresada en unidades de µp???/g de gel asentado. El solvente en exceso se puede remover mediante succión o filtración bajo gravedad antes de la unión de un grupo espaciador de amina. La agarosa activada primero se puede hacer reaccionar como una amina de modo que proporciona un espaciador (X) . Mínimamente, X es divalente y un enlace. Cuando se enlaza M a una triazina, éste debe ser por lo menos divalente con aquellas valencias que contiene la amina. De manera similar, cuando X enlaza dos triazinas, éste es por lo menos divalente y aquellas valencias deben ser las que contiene la amina. Típicamente, X es inicialmente por lo menos ya sea "monovalente tal como amoníaco, divalente tal como 1,2- diaminoetano o trivalente tal como dietilentriamina o tris (aminoetil) amina. No obstante será apreciado que X puede ser sustituido por grupos tales como hidroxilo, sin perder su función, y está dentro del alcance de la invención. Ejemplos del producto de esta primera reacción se muestran en las fórmulas II, III, IV y V.

Agarosa Agarosa Agarosa Agarosa El número de grupos amino introducidos se puede determinar mediante cualquier ensayo adecuado, tal como TNBS, y se puede expresar como umol de amina/g de gel asentado. Cada una de las aminas alifáticas introducidas en esta etapa luego se hace reaccionar con cloruro cianúrico. Por ejemplo, un compuesto de la fórmula II se hace reaccionar para generar una agarosa activada con tripsina de la fórmula VI Agarosa El contenido de cloruro total en la resina activada con triazina se puede medir como el ion cloruro después de la hidrólisis alcalina. Con el fin de preparar una librería 3D, es decir un compuesto que contiene 2 o más grupos triazina y tres grupos Y independientemente disponibles, uno de los átomos de cloro es sustituido por una amina ??. El segundo átomo de cloro es reemplazado por un segundo espaciador (X2) que puede ser una diamina, trlamina o tetramina, de cualquier longitud de cadena. 2 puede ser di alente o trivalente (ejemplos dados en lo anterior) . Cada adición de una amina al anillo de triazina resulta en la eliminación de un ion cloruro, que puede ser analizado. Los resultados se pueden expresar en términos de µ?a?? de ion cloruro liberado por gramo de gel . asentado . Si el resultado del ensayo de activación = A; el resultado del ensayo de amina = B; el resultado de un ensayo de cloruro donde un cloruro sea eliminado = C (i) , entonces se asume 100% de conversión del material de partida al producto: A = B = C(i) (umol/g de gel asentado) Cuando el segundo ion cloruro, C(ii) se ha eliminado, entonces: A = B = C(i) = C(ii) ; y C(i) + C(ii) = 2A = 2B Una segunda etapa de sustitución de triazina genera una estructura de la fórmula VII En una librería 3D, ambos átomos de cloro sobre el segundo núcleo de triazina son sustituidos secuencialmente por las aminas Y2 y Y3 para dar un producto de la fórmula VIII Ejemplos de otras estructuras construidas a partir de estos bloques de construcción se muestran como las fórmulas IX y X Los grupos espaciadores multi alentes y de triazina alternantes permiten la producción de ligandos con cualquier número de posiciones de sustitución de amina independientemente variables, como es ejemplificado en las fórmulas XI a XIII ?? Las fórmulas XI y XII tienen diferentes grados de ramificación, pero el mismo grado de dimensionalidad. Esto es en parte, debido a que la ramificación adicional en XIII es en X, es decir, dos anillos de. triazina idénticos son introducidos en este punto, antes que en una triazina adicional . Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra la preparación de la resina PuraBead activada con epóxido. PuraBead es un soporte de agarosa empanado poroso que es reticulado para ayudar en la durabilidad. Activación con epóxido: Una muestra de PuraBead 6XL (333 g) se suspendió en agua (213 mL) y se mezcló con NaOH 10M (26.6 mL) . La mezcla se agitó usando un agitador superior hasta que se alcanzó una temperatura constante de 34 °C. Epicloclorhidrina (24 mL) se adicionó en dos porciones iguales y la temperatura se incrementó a 40°C. Después de 1 h, la suspensión se filtró y se lavó con agua (10 x 350 mL) . El ensayo de epóxido sobre la resina activada, lavada indicó un nivel de sustitución de 23.3 µp??? de epóxido/g de gel asentado . Ej emplo 2 Este ejemplo ilustra la preparación de gel aminado a partir de un gel activado con epóxido.

Activación con amina: El gel activado con epóxido obtenido en el Ejemplo 1 (226 g) se suspendió en agua (180 mL) y se trató con amoniaco 0.88 (45 mi). La mezcla de reacción se dejó agitar durante la noche a 40 °C. Después de este periodo, el gel se filtró y se lavó con agua (10 x 500 mL) para obtener la resina de amina activada (aproximadamente 220 g) . El ensayo de TNBS sobre una porción de gel mostró que el nivel de amina fue de 23.2 µGa??/g de gel asentado. Ejemplo 3 Este Ejemplo ilustra la reacción de la resina aminada con cloruro cianúrico para dar un gel activado con diclorotriazina . Activación con Triazina: El gel activado con amina (200 g) preparado en el ejemplo 2 se lavó con una solución reguladora con fosfato de potasio 1.0 M (200 mL, pH 7) . El gel asentado se transfirió a un vaso y se mezcló con agua (50 mL) y solución reguladora de fosfato de potasio 1.0 M ( 50 mL, pH 7) . La mezcla completa se transfirió a un matraz de fondo redondo de 1 litro de tres cuellos. La agitación vigorosa se mantuvo a medida que se adicionó acetona (100 mL) . El matraz se enfrió a una temperatura permanente de 0°C. Una solución de cloruro cianúrico (5 g) en acetona fría (60 mL) se adicionó desde el brazo lateral. La reacción se detuvo después de 1 h y los contenidos del matraz se transfirieron a un embudo sinterizado. El gel de diclorotriazina se lavó con acetona al 50% (1 L) ,. agua (1L), acetona al 50% (1 L) y agua (2 L) para dar la resina activada con triazina (aproximadamente 200 g) . Un ensayo de cloruro determinó que el contenido de ion cloruro fue de 46 µp???/g de gel asentado. Ejemplo 4 Este Ejemplo ilustra la adición de la primera amina al gel de diclorotriazina . Sustitución de ??·. Gel de diclorotriazina (200 g) preparado en el Ejemplo 3 se suspendió en agua (100 mL) y se trató con una solución de ß-alanina (0.2 M) en agua (100 mL) que se ha basificado con NaOH 10 M (4 mL) . El recipiente se reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente después de lo cual los contenidos se filtraron y se lavaron con D F al 50% (5 x 125 mi) y agua (10 x 125 mL) . Ej emplo 5 Este Ejemplo ilustra el desplazamiento a una temperatura más alta del segundo ion de cloruro con un espaciador de diamina. Segunda sustitución para adicionar el espaciador ¾: El gel sustituido con ?? obtenido en el Ejemplo 4 se suspendió en agua (100 mL) y se trató con una solución de etilendiamina (0.4 M) en agua (100 mL) . El recipiente de reacción se dejó agitando a 60 °C durante 2 dias. Después del enfriamiento, el resultante se lavó con DMF al 50% (5 x 125 mL) , agua (5 x 125 mL), HC1 0.1 M (5 x 125 mL) , isopropanol al 30%/NaOH 0.2 M (5 x 125 mL) y agua (10 x 125 mL) . Un ensayo de TNBS sobre una muestra de gel indicó una sustitución de amina de 26.7 pmol/g. Un ensayo de cloruro sobre el sobrenadante indicó la liberación de cloruro de 27.2 ymol/g. Segunda Etapa de Triazina: El procedimiento fue idéntico a la primera etapa de activación de triazina, como es descrito en el Ejemplo 3. Ejemplo 6 Este Ejemplo ilustra la adición de la primera amina al segundo anillo de triazina. Sustitución de Y2: El gel obtenido de la segunda etapa de acoplamiento de triazina en el Ejemplo 5 se pesó en ocho botellas (12.5 g de cada botella). Las muestras se suspendieron en DMF al 50% (6.25 mL) . Cada botella 'luego se cargó con una solución de la amina seleccionada (0.2 M, 6.25 mL) . Las aminas que contienen porciones de carboxilato o aquellas obtenidos como sales de clorhidrato se basificaron con' el volumen requerido de NaOH 10 M para llevar el pH global a aproximadamente 9-10. Las muestras se agitaron a temperatura ambiente durante 1 h. Los sobrenadantes (100 mL) se retiraron de cada botella para estimar el progreso de la reacción mediante el ensayo de ion cloruro. La Tabla 1 muestra las cifras de liberación de cloruro después de la primera sustitución de amina .

Tabla 1 Los ocho geles intermediarios se lavaron con DMF al 50% (5 x 12.5 mL) y agua (10 x 12.5 mL) . Ejemplo 7 Este Ejemplo ilustra la adición combinatoria de la amina final (Y3) sobre el segundo anillo de triazina para dar una librería de ligandos 3D de acuerdo con la Fórmula VIII. Segunda sustitución Y3: Esto se dio mediante una variación en el método adaptado de la sustitución del segundo brazo espaciador (X2) dado en el Ejemplo 5. Las síntesis se realizaron directamente en columnas microspin.

Alternativamente, también se puede utilizar un bloque de 96 cavidades . Cada uno de los ocho intermediarios (4.0 g) obtenidos en el Ejemplo 6 se suspendió en Tween 20 al 0.4% (2 mL) . Una suspensión del primer intermediario (0.375 inL) se suministró a úna hilera de ocho cavidades (0.375 mL por cavidad) . El proceso se repitió para el segundo intermediario depositado en la segunda hilera de cavidades y asi sucesivamente hasta que todos los ocho intermediarios de la primera etapa se han suministrado en cada hilera respectiva. Una solución de la primera amina de etapa final (Y3) (0.4 M) en DMF al 50% se suministró a través de la primera hilera (0.125 mL por cavidad) hasta que todas las ocho cavidades se han cargado. El procedimiento se repitió hasta que todas las ocho hileras se han cargado con la amina de etapa final seleccionada (Y3) . Así cada cavidad del arreglo 8 x 8 constituye una estructura de ligando individual diferente. Una vez que se completó la adición de Y,3, el bloque de librería se agitó en un horno a 60 °C durante 2 dias. En la remoción y el enfriamiento (1 h) el bloque se dejó drenar en una placa microtitulo de cavidad profunda. El filtrado recolectado se analizó para determinar la liberación de ion cloruro, determinando asi el grado de la reacción. El bloque de librería se lavó con DMF al 50% (2 x 1 mi) , agua (2 x 1 mL) , HC1 0.1 M (2 x 1 mi), agua (2 x 1 mL) , NaOH 0.2 M/isopropanol al 30% (2 1 mL) , agua (2 x 1 mL) y etanol al 20% (2 1 mL) .

Los resultados en la Tabla 2 enseguida muestran los datos de liberación de cloruro obtenidos después de la segunda sustitución (Y3) , reportados como pmol de cloruro liberado por g de gel. Tabla 2 librería resultante se clasificó para la prueba para el enlace de actividad/afinidad contra varias proteínas objetivo. La Tabla 3 enseguida da detalles de una clasificación realizada sobre plasma humano. Primero el conservador de etanol se quitó lavando de cada porción en la librería al adicionar 2 mL de fosfato de sodio 25 mL pH 7.0 a la parte superior del lecho de gel; y este, se dejó correr bajo gravedad para desplazar el conservador de etanol al 20% en el gel. El plasma humano se diluyó 1:20 (v/v) en solución salina regulada de fosfato, se adicionaron 2 mL a la parte superior de cada lecho de gel y se dejaron correr bajo gravedad. El flujo a través (FT) de esa corrida de cada componente de librería se recolectó por separado. Cada lecho de gel luego se lavó para remover la proteína no enlazada mediante la aplicación de 2 mL de solución reguladora de fosfato de sodio pH 7.0 de una manera similar; la fracción de lavado (W) que corrió de cada componente de librería se recolectó por separado. En las primeras dos etapas de elución (El) diseñadas para remover la proteína enlazada, 1 mL de fosfato de sodio 10 mM/ácido cítrico pH 6.5 se adicionó a la parte superior de cada lecho de gel y se dejó correr bajo gravedad y se recolectó por separado. Enseguida la segunda etapa de elución (E2) se aplicó, diseñada para remover la proteína no liberada en la primera 'etapa de elución: 1 mL de ácido acético 50 mM se adicionó a la parte superior de cada lecho de gel y se dejó correr bajo gravedad y se recolectó por separado. Finalmente se aplicó una etapa de limpieza (San) , diseñada para remover todo el material contaminante restante sobre el gel: 1 mL de hidróxido de sodio 0.2 M/isopropanol al 30% se adicionó a la parte superior de cada lecho de gel y se dejó correr bajo gravedad y se recolectó por separado.

La proteína liberada en cada etapa se analizó en cada una de las fracciones de elución colectadas: FT, W, El, E2 y San. Los resultados se muestran en las Tablas 3A-E . Cada fracción recolectada de la librería se presenta como una cuadrícula según la Tabla 2. Las cifras dan la proteína recuperada de cada componente de librería en µ?. Tabla 3A Tabla 3B w Primera Amina Segunda 1 2 3 4 5 6 7 8 Amina 9 740 885 809 740 927 846 971 809 774 846 809 1071 774 740 885 740 11 846 846 809 846 1071 740 971 774 12 927 927 809 971 971 774 1128 971 13 1019 971 971 971 1019 846 1128 1071 14 971 1071 1071 971 971 1071 1189 885 971 1326 1128 1128 1255 971 1403 1071 16 846 885 885 846 809 774 ' 885 675 Tabla 3C El Primera Amina Segunda 1 2 3 4 5 6 7 8 Amina 9 878 1727 1459 782 782 694 1544 828 464 1101 828 537 464 427 1101 574 11 1165 1930 1826 1164 1459 929 1826 1544 12 1727 2407 1826 1459 1727 1459 1930 1727 13 1633 2407 2041 1544 « 2041 1380 1826 1826 14 1165 2684 1930 1459 1633 1233 18265 1459 1930 2988 2684 1633 2407 1727 2041 2041 16 653 2041 1304 694 574 '613 1233 694 Tabla 3D E2 Primera Amina Segunda 1 2 3 4 5 6 7 8 Amina 9 25 178 25 25 0 0 79 25 0 25 0 0 0 0 0 25 11 129 904 599 225 270 79 519 225 12 255 1006 810 397 397 129 1614 519 13 313 1793 1531 397 856 225 2213 479 14 438 1531 954 397 558 313 1701 519 270 1793 1118 356 680 225 1453 479 16 0 129 25 0 0 0 79 0 Tabla 3E San Primera Amina Segunda 1 2 3 4 5 6. 7 8 Amina 9 10 10 0 0 0 0 159 63 0 63 0 10 0 0 159 10 11 10 243 159 113 63 10 202 63 12 159 316 281 202 202 63 316 281 13 113 349 316 159 243 113 437 281 14 63 281 202 202 243 202 409 281 113 316 243 159 409 63 511 380 16 0 63 0 10 10 0 63 10 Naturaleza de las aminas (Yi, Y-¿ y Y3) Las aminas seleccionados para la síntesis de librerías 3D pueden ser primarias, secundarias, alifáticas, aromáticas, heterocíclicas , arílicas, quirales, cargadas o cualquier combinación de estos . Las condiciones de reacción pueden variar con la solubilidad de la amina seleccionada. El agua, DMF al 50% y DMF puro son solventes de elección. Todas las aminas obtenidas como sales de clorhidrato o que contienen una porción de carboxilato se neutralizan con la cantidad molar requerida de NaOH antes de la reacción. Un ejemplo de un ligando hidrofilico generado en la librería 3D anterior es representado por la Fórmula XIV.

En este caso, Xi es derivado de amoníaco; ?? es derivado de ß-alanina; X2 es derivado de 1, 2-diaminoetano; Y2 es derivado del ácido 3-aminobenzoico; y Y3 es derivado de 1- ( 3-aminopropil) morforlina . Ejemplo 8 Este Ejemplo ilustra el uso de otro ligando 3-D, que se ha encontrado que es especialmente útil para, el aislamiento y la purificación de anticuerpos monoclonales a partir del caldo de cultivo de células y anticuerpos policlonales a partir del plasma y fracciones de plasma. Este es representado por la fórmula XV En este caso, Xi es derivado de 1, 2-diaminoetano; Yi es derivado de ß-alanina; X2 es derivado de 1, 2-diaminoetano; Y2 es derivado de 2-aminofenol; y Y3 es derivado de 3 aminofenol. En este ejemplo, el adsorbente mostrado en la-fórmula XV se usa para la purificación de Inmunoglobulina G de CEA (Extracto Clarificado A del precipitado A obtenido del plasma por el método de Kistler/Nitschmann) . El adsorbente (cargado a 22 mmol/g sobre agarosa) se empacó en una columna de vidrio (10 mL) , se equilibró con 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 y se cargó con CEA (que contiene ~400 mg de Inmunoglobulina G) . La columna luego se lavó con fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 (5 volúmenes de columna) , seguido por 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM (equilibrado a pH 6.5 con ácido cítrico) . La proteína enlazada se eluyó con citrato de sodio 10 mM pH 3.0, seguido por ácido cítrico 50 mM. Después del uso, la columna se limpió con 10 volúmenes de columna de hidróxido de sodio 0.5 M. La capacidad de enlace de este adsorbente se encontró que es de 43.2 mg/mL, y la capacidad de elución (proteína total eluída en las dos fracciones de elución) se encontró que es de 32.8 mg/mL. Las primera elución contuvo IgG en aproximadamente 95% de pureza y una capacidad de elución de 27 mg/mL de adsorbente. Ej emplo 9 Este Ejemplo ilustra la síntesis combinatoria de una librería de librerías' usando aminas agrupadas en cuatro clases de amina amplias, aromáticas, hidrofóbicas , positivas y polares. Cada una de las doce librerías se sinterizó de manera idéntica a la librería descrita en los Ejemplos 1-7, usando las aminas Yl7 Y2 y Y3 de las clases detalladas en la Tabla 4. Tabla 4 Número Yi Y2 3 1 Hidrofóbica Aromática Aromática 2 Hidrofóbica Aromática Aromática 3 Positiva Aromática Aromática 4 Positiva Aromática Aromática Polar Hidrofóbica Hidrofóbica 6 Polar Aromática Hidrofóbica 7 Polar Hidrofóbica Hidrofóbica 8 Polar Aromática Hidrofóbica 9 Positiva Aromática Aromática 10 Positiva Hidrofóbica Aromática 11 Hidrofóbica Aromática Aromática 12 Hidrofóbica Hidrofóbica Aromática Para cada librería, una primera amina Y1 idéntica se adicionó a todos los 64 miembros de la librería, las aminas restantes Y2 y Y3, se adicionaron después del brazo espaciador y la adición de triazina (como es descrito en los e emplos previos) , que describen los 64 geles diferentes que comprenden cada librería. Los ensayos de liberación de cloruro y TNBS se realizaron en cada etapa de la síntesis de fase sólida como es descrito en los ejemplos previos. Las aminas Yi, Y2 y Y3 para cada una de las librerías 1-12 son mostradas (Tabla 5) . Tabla 5 Librería Yi Y2 Y3 1 28 4,5,14,18,19,26,29,30 4,5,14,18,19,26,29,30 2 28 4,5,14,18,19,26,29,30 6,9,13,19,23,25,31,34 3 7 1,4,5,14,18,19,29,30 1,4,5,14,18,19,29,30 4 7 1,4,5,14, 18,19,29,30 2,3,6,7,9,25,31,34 24 15,16,17,20,27,28,32, 15,16,17,20,27,28,32, 36 36 6 24 15,16, 17,20,27,28,32, 4,11,12,14,21,22,18,33 36 7 35 15,16,17,20,27,28,32, 15,16,17,20,27,28,32, 36 36 8 35 15,16,17,20,27,28,32, 4,11,12,14,21,22,18,33 36 9 8 1,4,5,14,18,19,29,30 1,4,5,14,18,19,29,30 8 1,4,5,14,18,19,29,30 6,7,9,10,11,25,31,34 11 16 1,4,5,14,18,19,29,30 1,4,5,14,18,19,29,30 12 16 1,4,5,14,18,19,29,30 6,7,9,10,11,25,31,34 donde las aminas numeradas son como sigue: 1 = Anilina; 2 = 2-Aminofenol; 3 = 4-7Aminofenol; 4 = m-Toluidina; 5 . = 4 -Amino- 1-bcncilpiperidina ; 6 = 2- (2-Aminoetil ) -1-metilpirrolidina; 7 = 1- (2-Aminoetil ) piperidina; 8 = 2- (2-Aminoetil) iridina; 9 = 1- (2-Aminoetil) -pirrolidina; 10 = 4- (Aminometil) piperidina; 11 = (+/-) -2-Aminonorbornano; 12 = Alcohol 3-Aminobencilico; 13 = 4-Amino-l-naftol; 14 = Fenetilamina; 15 = Butilamina; 16 = Isobutilamina; 17 = (+/-) -sec-Butilamina; 18 = Bencilamina; 19 = Triptamina; 20 = N-Metil isopropilamina; 21 = 4-Metilbencilamina; 22 = 2- (p-Tolil) etilamina; 23 = 4-Amino-_n-cresol ; 24 ,= 3-Aminobenzamida; 25 = 1-Aminoindano; 26 = N,N-Dimetil-l,-3-fenilenediamina; 27 = 2-Amino-6-metilheptano; 28 = 2-Amino-5-metilhexano; 29 = 3-Amino-l-fenilbutano; 30 = (S) - (-) -1- (1- Naftil) etilamina; 31 = (S) -1, 2, 3, 4-Tetrahidro-l-naftilamina; 32 = (S) - (+) -3-Metil-2-butilamina; 33 = 2-Metilbencilamina; 34 = (S) - (-) Prolinol; 35 = L-Alaninaamida; 36 = 3-Isopropoxipropilamina . Una estructura 3-D ejemplar de la síntesis de "Librería de Librerías" descrito en el Ejemplo 9, es: Ejemplo 10 Este ejemplo describe el uso de la "librería de librerías', la síntesis de la cual es descrita en el Ejemplo 9, en una clasificación para el enlace de la proteí-na alfa-1-antitripsina (también conocida como inhibidor de alfa-1-proteinasa) a partir de una preparación de la pasta Cohn IV-I. La pasta Cohn IV-I se preparó al disolver la pasta congelada a -80 °C (20 g) en solución reguladora de fosfato de sodio 15 mM pH 8.1 (300 mL) en una baño de agua durante la noche a 25°C con agitación continua. Esta mezcla luego se centrifugó a 25 °C a 15, 000 rpm durante 15 minutos, antes de la filtración a través de los filtros de 1.0 MI y 0.45 mm. El conservador de etanol se quitó lavando en cada posición en cada, librería al adicionar porciones 4 x 0.5 mL de Tris 10 ni , citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5 a la parte superior del lecho de gel . Cada porción se dejó correr bajo gravedad para desplazar el conservador de etanol al ,20% en el gel. El fondo de cada componente de librería luego se selló antes de que se adicionara una preparación de pasta Cohn IV-I (0.25 mL) a la parte superior de cada lecho • de gel y se mezcló con el gel equilibrado. La librería luego se incubó con la carga de Cohn IV-I durante 30 minutos. Después de este tiempo, la librería se destapó, y el flujo a través (FT) de cada componente de librería se recolectó por separado. Cada lecho de gel luego se lavó para remover la proteína no enlazada usando porciones 3 x 0.25 mL de Tris 10 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5. La fracción de lavado (W) que se recolecto de cada componente de librería se recolectó por separado. En una sola etapa de elución, urea 8 M, Tris 25 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5 (3 x 0.25 mL) se adicionó a la parte superior de cada lecho de gel, y la elución E de cada componente de librería se recolectó por separado. Finalmente, una etapa de limpieza (San) (diseñada para remover cualquier material enlazado residual sobre el gel) , que comprende 1 mL de hidróxido de sodio 0.2 M/isopropanol al 30%, se adicionó a la parte superior de cada lecho de gel, se dejó correr bajo gravedad y se recolectó por separado. La fracciones FT y E de cada componente de librería luego se corrieron sobre geles SDS PAGE y se analizaron a simple vista para el agotamiento de alfa-1-anti ripsina en la fracción FT, y la aparición de alfa-1-an itripsina en la fracción E. La presencia o agotamiento de alfa-l-antitripsina en las fracciones de candidatos prometedores también se confirmó mediante nefelometría . Ejemplo 11 A partir de los 768 componentes de librería individuales clasificados, cuatro se seleccionaron para ser sintetizados individualmente en una escala de 30 mL, usando la química idéntica y los ensayos como es descrito para la síntesis de librería en los Ejemplos 1-7. La composición de amina (Yi, Y2, Y3) de estas cuatro resinas se muestra en la Tabla 6. Los números de amina son como para la Tabla 5. Tabla 6 Estas cuatro resinas se estimaron como sigue: Columnas de aproximadamente volumen de 10. mL y altura de 12. cm (ver la Tabla 7 para detalles) se equilibraron usando 4 volúmenes de columna de Tris 10 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5. La pasta Cohn IV-I, preparada como es descrito en el Ejemplo 9 (para volumen ver la Tabla 7), se introdujo en la columna a un gasto de flujo de 50 cmh-1. Después de la carga, la proteina no enlazada se lavó de la columna usando 4 volúmenes de columna de Tris 10 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5 a 200 cmh-1. Se emplearon dos eluciones; los primeros 4 volúmenes de columna de fosfato de sodio 100 mM, citrato de sodio 20 mM, - pH 6.1, y los segundos 4 volúmenes de columna de urea 8 M, Tris 25 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7.5. Cada una se corrió a un gasto de flujo de. 200 cmh-1. Tabla 7 Las fracciones no enlazadas (FT) y de elución (El y E2) se analizaron para la alfa-l-antitripsina mediante nefelometría. Los resultados son mostrados, junto con las capacidades de enlace calculadas (BC) y las capacidades de elución (EC) para estos materiales bajo estas condiciones en la Tabla 8. Tabla 8 Ejemplo 12 Este ejemplo describe la síntesis de una librería de ^cuatro dimensiones' , que comprende 3 grupos triazina y cuatro grupos Y independientemente variables. La matriz de soporte PuraBead se activó con epóxido como es descrito en el Ejemplo 1 a una carga de epóxido final de 5.6 mmol/g de gel asentado, luego el Espaciador ?? incorporado mediante el tratamiento de la resina de epóxido con etilendiamina de una manera análoga a la adición del espaciador descrito en el Ejemplo 5. Esta resina se hizo reaccionar con triclorotriazina como es descrito en el Ejemplo 3 para generar un gel de diclorotriazina. El nivel de cloruro se analizó y se encontró que es de 12.5 mmol/g de gel asentado. La primera amina Y% (estructura XI) se adicionó mediante la adición de una solución de triptamina a la diclorotriazina de una manera análoga a la adición de amina descrita en el Ejemplo 4. El nivel de cloruro fue de 5.4 mmol/g de gel asentado. El espaciador X2 (estructura XI) se incorporó mediante la adición de una solución de etilendiamina de una manera análoga a la adición del espaciador descrito en el Ejemplo 5. Un ensayo de TNBS mostró el nivel de amina que es de 5.4 mmol/g de gel asentado. Una segunda adición de triclorotriazina luego se realizó usando condiciones análogas a aquellas de lo primero (ver lo anterior). El nivel de cloruro fue de 12.1 mmol/g de gel asentado. La segunda amina Y2 (estructura XI) se adicionó mediante la adición de una solución de tiramina a la diclorotriazina de una manera análoga a la adición de amina descrita en el Ejemplo 4. El nivel de cloruro fue de 12.1 mmol/g de gel asentado. El espaciador X3 (estructura XI) se incorporó mediante la adición de amoniaco 0.88 de una manera análoga a la adición del espaciador descrito en el Ejemplo 2. Un ensayo de TNBS sobre el material generado se realizó (5.7 mmol/g de gel asentado) .

Una tercera adición de triclorotriazina luego se realizó usando condiciones análogas a las primeras dos. El nivel de cloruro fue de 12.5 umol/g de gel asentado. El gel de bis-cloro-bis-triazina obtenido de la etapa previa se pesó en ocho botellas y se hizo reaccionar con ocho- aminas diferentes de una manera análoga a aquella descrita en el Ejemplo 6, incorporando de esta manera la amina Y3 (estructura XI) . Las cifras de liberación de cloruro (umol/g de gel asentado) para estas adiciones se muestran en la Tabla 9. Tabla 9 Después de la adición de las aminas intermediarias mostradas en lo anterior, cada uno de los ocho geles se suspendió y se distribuyó en una hilera de ocho cavidades como es descrito en el Ejemplo 7. Ocho aminas diferentes Y luego se adicionaron a través de las ocho hileras para generar un total de 64 resinas cuadrú 1emente sustituidas con amina diferentes. Los resultados en la Tabla 10 muestran los datos de liberación de cloruro obtenidos después de esta sustitución final Y4 como mmol de cloruro liberado por g de gel . Tabla 10 Una estructura 4-D ejempl ??

Claims

REIVINDICACIONES compuesto de la fórmula en donde cada X es la misma o diferente y es un grupo aminilo multivalente o espaciador terminado en diaminilo; cada Y es el mismo grupo aminilo o diferente; y M es una matriz de soporte.
2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es de la fórmula
3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque cualquiera o cada Z es Y.
4. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque cada X independientemente representa un grupo amino secundario o un diaminoalcano .
5. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque cada Y es independientemente seleccionada de aminas alifáticas opcionalmente sustituidas y aromáticas primarias.
6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es de la fórmula
7. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X que enlaza dos anillos de triazina es derivado de amoniaco.
8. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X que enlaza dos anillos de triazina es derivado de un diaminoalcano .
9. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X que enlaza dos anillos de triazina es derivado de 1, 2-diaminoetano, dietilentriamina o tris (aminoetil) amina.
10. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque contiene 2 o más grupos triazina y 3 grupos Y independientemente disponibles .
11. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque contiene 3 o más grupos triazina y 4 grupos Y independientemente variables .
12. Una librería de compuestos relacionados de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque está sobre un soporte común M.
13. Un método para la producción de una librería de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende la síntesis de estructuras intermediarias, ya sea individualmente o en múltiplos, la división de las estructuras en porciones más pequeñas y llevar a cabo las etapas de reacción subsecuentes apropiadas.
14. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación, cuantificación o descubrimiento de péptidos y proteínas.
15. Un proceso para la separación, purificación o descubrimiento de un material proteináceo, caracterizado porque comprende someter a una muestra que contiene el material a la cromatografía de afinidad usando un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
16. Un proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el material proteináceo es una inmunoglobulina o una subclase, fragmento, precursor o derivado de la misma, incluyendo proteínas de fusión, ya sea derivadas de fuentes naturales o recombinantes .
17. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es para la remoción de contaminantes, incluyendo entidades tóxicas o patogénicas, a partir de una preparación de compuesto biológico o farmacéutico.