SE461505B - Adsorbent bestaaende av en vattenoloeslig baerare bunden till en heterocyklisk foerening med ett distansaemne samt dess anvaendning foer att avlaegsna pyrogener ur en pyrogenhaltig loesning - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 461 505 Enligt föreliggande uppfinning tíllhandahålles ett förfaran- de för åtminstone reduktion av pyrogenhalten i en pyrogenhaltíg lösning genom att lösningen bringas i kontakt med ett adsorptions- medel innefattande en vattenolöslig bärare och en kvävehaltig heterocyklisk förening med formeln R - A - X (I) vari R betecknar en kvävehaltig heterocyklisk grupp; A betecknar en enkelbindning, alkylen eller alkenylcn; X betecknar väte eller en funktionell grupp, såsom amíno, karboxi eller hydroxi; och den heterocykliska gruppen och alkylen kan eventuellt vara substituerade med en eller flera substituenter, exempelvis karboxi eller hydroxi, och föreningen är bunden di- rekt till bäraren eller genom ett distansämne, dvs en molekyl in- förd mellan den vattenolösliga bäraren och den kvävehaltiga hete- rocyklíska föreningen så att föreningen bringas på avstånd från bäraren.

Adsorptionsmedel som skall användas enligt uppfinningen kan framställas, exempelvis genom kovalent bindning av en kvävehaltig heterocyklisk förening (I) till en vattenolöslig bärare, direkt eller via ett distansämne.

Exempel på kvävehaltiga heterocykliska föreningar enligt uppfinningen är sådana med formeln (I) vari R betecknar en kväve- haltig heterocyklisk grupp exempelvis uppvisande en känuaav nüdazol, pyrazol, pyrimidin, pyridazin, pyrazin, purin, akridín, tríazol, oxadiazol, tetrazol, índazol, bensotriazol, bensopyridazin, ben- sopyrimidin, bensopyrazín eller naftyrídin; A betecknar en enkel- bindning, alkylen med 1-12 kolatomer, exempelvis metylen, etylen, propylen, butylen, hexylen, oktylen, dekametylen eller dodeka- metylen, eller alkenylen med 2-12 kolatomer, exempelvis vínylen, allylen, butenylen, hexenylen eller oktenylen; och X betecknar exempelvis väte, amíno, hydroxí eller karboxi. Den kvävehaltiga heterocyklíska gruppen R och en alkylengrupp A kan eventuellt vara substituerade med en eller flera substituenter (exempelvis karboxi, oxo, alkyl, hydroxi, amíno, alkoxi). Föredragna exempel pà den kvävehaltiga heterocykliska föreningen är sådana med for- meln (I), vari R betecknar en kvävehaltíg heterocyklisk grupp uppvisande en kärna av imídazol, pyrimidin, purin eller akridin, A betecknar en enkelbindníng, etylen eller etylen substítuerad med karboxi, och X betecknar väte, amíno, karboxi eller hydroxi. 10 15 20 25 30 35 40 « 461 sos Speciellt utgöres den föredragna föreningen med formeln (I) av histidin, histamin, urokansyra, uracil, orotinsyra, cytosin, 5-metyl-cytosín, 2-amino-4,6-dimetvlpyrimidin, 2-amino-4-hydroxi- -6-metylpyrimidin, adenin eller 6,9-diamíno-Z-etoxíakridin.

Såsom den vattenolösliga bäraren kan vilken som helst vatten- olöslig bärare som kan bindas till den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (I) direkt eller via ett distansämne, användas enligt uppfinningen. Representativa exempel på vattenolösliga bärare är sådana uppvisande en hydroxigrupp, aminogrupp, karboxígrupp eller en halogenatom. Föredragna exempel på den vattenolösliga bäraren uppvisande en hydroxigrupp är en polysackaríd (exempelvis cellu- losa, agaros, förnätad dextran, etc), ett hydroxialkylpolystyren- harts (exempelvis hydroxialkylerad styren-divínylbensensampolymer, etc), en polyvinylalkohol och liknande. Exempel på den vatten- olösliga bäraren uppvisande en aminogrupp är en amínoalkylpoly- sackarid (exempelvis aminoalkylcellulosa, såsom aminoetylcellulosa eller aminohexylcellulosa, aminoalkylagaros, såsom aminohexyl- agaros, etc), en p-aminobensylpolysackarid (exempelvis p-amino- bensylcellulosa, p-aminobensylagaros, etc), kitosan, ett amino- alkylpolystyrenharts (exempelvis aminoalkylerad styren-divinyl- bensensampolymer), en polyakrylamid, en aminoalkylpolyakrylamid (exempelvis aminoetylpolyakrylamid, etc), och ett aminoalkyl- poröst glas (exempelvis aminopropyl-poröst glas, etc). Exempel på den vattenolösliga bäraren uppvisande en karboxigrupp är karboxialkylpolysackarid (t.ex. karboxialkylagaros, såsom karb- oxihexylagaros eller karboxipentylagaros, karboxialkylcellulosa, såsom karboximetylcellulosa, karboxialkyl-förnätad dextran, så- som karboximetyl-förnätad dextran, etc), karboxialkylpolyakryl- amid (t.ex. karpoximetylpolyakrylamid, etc), och ett karboxyl- syraharts (t.ex. akrylsyra-divinylbensensampolymer, etc){ Exempel på den vattenolösliga bäraren uppvisande en halogenatom är ett halogenalkylpolystyrenharts (t.ex. klorometylerad styren-divinyl- bensensampolymer, etc). När ett halogenalkylpolystyrenharts an- vändes kan det användas såsom det är eller det kan överföras till en mer aktiverad form. Exempelvis kan ett halogenalkylpolystyren- harts överföras till ett dialkyltioalkylpolystyrenharts uppvisan- de en aktivitet högre än den av halogenalkylpolystyrenhartset genom att hartset reageras med dialkylsulfid.

Före bindning av den vattenolösliga bäraren till den kväve- haltíga heterocykliska föreningen (I), kan ett distansämne införas 10 15 20 25 30 35 40 461 505 4 i bäraren eller föreningen (I). Representativa exempel på distans- ämnet är föreningar med formeln: NH2(CH2)nNHZ, HOOC(CH2)nCO0H (eller en syraanhydrid därav), NH2(CH2)nC0OH eller NH2(CH2)nOH, är ett heltal med ett värde av 1-12.

Införandet av distansämnet i bäraren kan exempelvis genomfö- ras med en metod som beskrives i "KOTEIKA KOS0", I. Chibata Editor, sid 11-41, Kodan-sha, Tokyo (1975); "JIKKEN TO OYO AFFINITY CHROMATOGRAPHY", I. Chíbata et al, sid 86-90, Kodan-sha, Tokyo (1976); "Affinity Chromatography", C.R. Lowe et al, sid 205-245, John Wiley & Sons, London, New York, Sydney, Toronto (1974); eller i den amerikanska patentskriften 4 090 919.

När distansämnet införes i bäraren uppvisande en hydroxi- vari n grupp eller den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (I) uppvi- sande en hydroxigrupp)aktiveras exempelvis bäraren eller före- ningen, t.ex. medelst en cyanhalogenid (t.ex. cyanbromid, etc), en monoepoxid (t.ex. epiklorhydrin, etc), en bisepoxid (t.ex. 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butan, etc), en halogenacetylhalogenid (t.ex. kloracetylklorid, etc) och därefter bringas erhållen akti- verad bärare eller förening att reagera med distansämnet uppvi- sande en aminogrupp eller hydroxigrupp, exempelvis NH2GCH2)nNH2, NHz(CH2)nCOOH, NH2(CH2)n0H. När distansämnet införes i bäraren uppvisande en aminogrupp eller den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (I) uppvisande en aminogrupp (1) aktiveras bäraren eller föreningen genom reaktion med en alifatisk dialdehyd (exempelvis glutaraldehyd, etc) och därefter reageras erhàllen aktiverad bärare eller förening med distansämnet uppvisande en amínogrupp, exempelvis NH2(CH2)nNH2, NH2(CH2)nC00H, eller (2) reageras bäraren eller föreningen med distansämnet uppvisande en karboxigrupp, exempelvis HOOC(CH2)nC0OH, NH2(CH2)nC00H, under bildning av en syraamid. När distansämnet införes i båraren upp- visande en karboxigrupp eller den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (I) uppvisande en karboxigrupp reageras bäraren eller föreningen med distansämnet uppvisande en amínogrupp, exempelvis NHz(CH2)nNH2, NHz(CH2)nC00H, under bildning av en syraamid. När distansämnet införes i bäraren uppvisande en halogenatom konden- seras vidare bäraren med distansämnet uppvisande en aminogrupp, karboxigrupp eller hydroxigrupp, exempelvis NH2(CH2)nNH2, NH2(CH2)nCO0H, NH2(CH2)nOH.

För framställning av adsorptíonsmedlet som användes enligt uppfinningen med användning av ovanstående bärare och den kväve- 10 15 20 25 30 35 5 461 505 haltiga heterocykliska föreningen utnyttjas metoderna som beskri- ves i ovan nämnda "KOTEIKA KOSO", sid 11-41, "JIKKEN TO OYO AFFI- NITY CHROMATOGRAPHY", sid 30-82 och den amerikanska patentskriften 4 090 919.

När exempelvis bäraren uppvisande hydroxi (betecknas hädan- efter C)-OH ellerC):gg) användes aktiveras bäraren exempelvis med en cyanhalogeníd (t.ex. cyanbromid, etc), en monoepoxid (exempelvis epiklorhydrín, etc), en bisepoxid (t.ex. 1,4-bis(2,3- epoxipropoxi)butan, etc), halogenacetylhalogeníd (exempelvis kloracetylklorid, etc) och därefter reageras erhàllen aktiverad bärare med den kvävehaltiga heterocykliska föreningen uppvisande en aminogrupp (dvs R - A - NH2), eller den kvävehaltiga hetero- cykliska föreningen vari distansämnet uppvisande en aminogrupp har införts (hädanefter betecknas bägge föreningarnac)-NH2); eller de kvävehaltiga heterocykliska föreningarna uppvisande en hydroxigrupp (dvs R - A -OH) eller den kvävehaltiga heterocyklis- ka föreningen vari distansämnet uppvisande en hydroxígrupp har införts (hädanefter betecknas bägge föreningarnac)-OH).

Enligt dessa förfaranden kan adsorptionsmedel erhållas med följande formler: :glo = N -@ ®-oco-Na-@ enar ®Loc-Nn-@ NH ® -o-cflzcuçoæncuzun- @ ® -o-cnzcnconycflz-çcnz)m-cnzcncofl)cnzna-@ ® -o-cflzcounf (I) ® -o-cocazun- Q.) ® -o-cnzcnwfncuz-o- Q.) C)-O-CH2CH(0H)CH2-(CH2)m-CH2CH(0H)-CH2-O-(D vari C) och C) har ovan angiven betydelse och m betecknar ett hßltal med ett värde av 1-16.

När den vattenolösliga bäraren uppvisande en aminogrupp (betecknas hädanefter (:)-NH2) användes (1) aktiveras bäraren med en alifatísk díaldehyd (exempelvis glutaraldehyd, etc), den aktiverade bäraren reageras med den kvävehaltiga heterocyklíska föreningen C)-NH2, vari C) har ovan angiven betydelse, och där- efter reduceras bildad Schiffs-bas med ett reduktíonsmedel (exempelvis natriumborhydrid, etc); (2) bärarcn reageras med den 461 505 e kvävehaltiga heterocykliska föreningen uppvisande en karboxigrupp (dvs R - A - COOH) eller den kvävehaltiga heterocyklíska förening- en vari distansämnet uppvisande en karboxigrupp har införts (bägge föreningarna betecknas hädanefterc)-COOH) under bildning av en 5 syraamid; (3) bäraren aktiveras med en monoepoxid eller en bis- epoxid och därefter reageras erhållen aktiverad bärare med den kvävehaltiga heterocykliska föreningen C)-NH2 eller C)-OH; (4) bäraren aktiveras med cyanurhalogenid (t.ex. cyanurklorid) och därefter reageras erhâllen aktiverad bärare med den kvävehal- 10 tiga heterocykliska föreningen av Q)-NH2; eller (5) bäraren diazoteras och reageras därefter med den kvävehaltiga heterocyk- liska föreningen C)-NH2.

Enligt dessa förfaranden kan adsorptionsmedlen erhållas med följande formler: 15 ® -Nncnz (CHQm-cnz-NH- (L) ® -Nu-co- (Q ® -NH-cflzcncorncnznn-(I).

® -NH-cnzcfnoæncnz-o- @ ® -Nn-cnzcxuofncnz (cnflmcnzcnfon) cnznfl-Q) 20 ® -Nn-cnzcnwlncnz (cnfmcnzcacon) cnz-o- @ N NH- ® -NH-r, nr ® N ~ N c1 ®-N=N-® vari ® , @ och m har ovan angiven betydelse.

När den vattenolösliga bäraren uppvisande en karboxigrupp 25 (betecknas hädanefter C)-COOHJ användes reageras bäraren med den kvävehaltiga heterocykliska föreningen C)-NH2 under bild- ning av en syraamid.

Enligt detta förfarande kan adsorptionsmedlet med formeln ®-CONH-@ , vari ® och (I) har ovan angiven betydelse, 30 erhållas.

, När bäraren uppvisande en halogenatom (betecknas hädanefter C)-X, vari X betecknar halogen) användes kan dessutom bäraren reageras med den kvävehaltiga heterocyk1iSka föreningen (:)~NH2, (IQ-on eller @-coon. 35 Enligt detta förfarande kan adsorptionsmedel erhållas med 10 15 20 25 30 35 " 461 505 följande formler: e -NH- e o -O-o ® -ooc-(Q vari (D och C) har ovan angiven betydelse.

När den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (:)-NH2 eller(:)-OH användes kan adsorptíonsmedlet som användes enligt uppfinningen också erhållas genom reaktion av föreningen med en epoxiförening och efterföljande reaktion av erhállen aktiverad förening med bäraren C)-NH2 eller C)-OH. När uracil användes såsom den kvävehaltiga heterocykliska föreningen kan dessutom adsorptíonsmedlet också erhållas genom aktivering av bäraren C)-NH2 eller C)-OH med en epoxiförening och efterföljande reak- tion med uracil.

I adsorptíonsmedlet som användes enligt uppfinningen är den kvävehaltiga heterocykliska föreningen (I) som utgör liganden företrädesvis bunden i en mängd av cirka 2-300 pmol per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet.

Eftersom det vattenolösliga adsorptíonsmedlet som erhålles på detta sätt adsorberar en pyrogen specifikt kan en pyrogenfri lösning erhållas från en pyrogenhaltig lösning genom att den pyro- genhaltiga lösningen bringas i kontakt med adsorptíonsmedlet följt av separation av lösningen från adsorptíonsmedlet.

En pyrogenhaltig lösning som skall bringas i kontakt med adsorptíonsmedlet har företrädesvis ett pH-värde av 4-10 och en specifik ledningsförmåga av 0-10 m mho. När en lösning ej uppvisar dessa värden kan en förbehandling, såsom avsaltning, spädning el- ler neutralisering, åstadkommas för reglering av lösningens till- stånd. ' När en pyrogenhaltig lösning bringas i kontakt med adsorp- tíonsmedlet kan antingen ett kontinuerligt förfarande med utnytt- jande av en kolonn eller ett satsvis förfarande exempelvis an- vändas. I När exempelvis en kolonn användes kan adsorptíonsmedlet pac- kas ikolonnen och tvättas med en saltlösning, vatten, en buffert- lösning och därefter bringas en pyrogenhaltig lösning att passera genom kolonnen för adsorption av pyrogen pà adsorptíonsmedlet och för erhållande av en pyrogenfri lösning såsom ett utflöde. I detta fall bringas företrädesvis en pyrogenhaltig lösning att passera 10 15 20 25 30 35 40 461 sqs genom kolonnen med en flödeshastíghet av i allmänhet 2-13 dis- tanshastighetenheter (space velocíty,SV). Förhållandet av pyrogen- haltig lösning till adsorptionsmedlet är företrädesvis cirka 5-1500 ml av lösningen per 1 ml av adsorptionsmedlet.

När ett satsvis förfarande genomföres sättes däremot en pyro- genhaltig lösning till adsorptionsmedlet, erhållen blandning om- röres för adsorption av pyrogen på adsorptionsmedlet och därefter separeras lösningen från adsorptionsmedlet för erhållande av en pyrogenfri lösning. I detta fall är förhållandet av pyrogenhaltig lösning till adsorptionsmedlet företrädesvis cirka 5-S0 ml av lös- ningen per 1 ml av adsorptionsmedlet.

Företrädesvis genomföres förfarandet vid 4-5000 i bägge fal- len av ett kontinuerligt förfarande och ett satsvis förfarande.

Eftersom en pyrogen som adsorberats på adsorptionsmedlet kan avlägsnas från adsorptionsmedlet genom tvättning i följd med vattenhaltigt natriumdeoxikolat, vattenhaltig natriumhydroxid, vattenhaltig natríumklorid och liknande, kan adsorptíonsmedlet an- vändas upprepade gånger.

Förfarandet enligt uppfinningen kan användas för reduktion av pyrogenhalten i en pyrogenhaltig fysíologiSktaktiv substans, exempelvis en aminosyra (t.ex. histidin, alanin, prolin, etc), en nukleinsyrabas (exempelvis cytosin, etc), ett antibiotikum (exempelvis penicillin, etc), ett hormon (exempelvis insulin, etc), ett vitamin (exempelvis flavinadenindinukleotid, etc), ett serum- protein (exempelvis albumin, etc), ett enzym (exempelvis urokinas, asparaginas, lysozym, etc) eller en antikropp (exempelvis immuno- globulín, etc). Dessutom kan förfarandet enligt uppfinningen an- vändas för framställning av pyrogenfritt vatten.

Följande beredningar och utföríngsexempel belyser uppfin- ningen ytterligare men är ej avsedda att begränsa omfattningen därav.

I exemplen uppmättes koncentrationen av pyrogen med en enzymologisk metod med användning av enzymet i extrakt av blod- celler från Limulus och det syntetiska substratet därav (J. Med.

Enzymol., 3, 43-60 (1978))och eventuellt genom en kombination av Limulus-testet och ett pyrogentest med användning av kaniner som beskrivits i Japanese Pharmacopeia IX, P-681.

I beredningarna beräknades halten av kvävehaltig heterocyk- lisk förening i adsorptíonsmedlet utgående från skillnaden mellan resultatet av en ninhydrínreaktion eller UV-absorption av lös- 10 15 20 25 30 35 9 461 505 ningen innehållande föreningen före reaktionen i beredningen och före tvättlösningarna efter reaktionen.

Beredning 1 (1) Sepharoséâ CL-4B (agarosderivat från Pharmacia Fine Chemicals, 30 g, våt form) tvättades noggrant med vattenhaltig 1-M natríumklorid och därefter med vatten och uppslammades i vat- ten (4S ml) 2-N vattenhaltig natriumhydroxid (19,S ml) och epi- klorhydrin (4,5 ml) sattes till suspensionen och blandningen om- rördes vid 40°C under 2 timmar. Efter fullbordande av reaktionen filtrerades blandningen och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-Sepharose CL-4B. Epoxi-Sepharose CL-4B som erhölls sålunda uppslammades i en 0,625-procentig vattenhaltig lösning av hexametylendiamin (120 ml) och suspensionen omrördes vid 6006 under 2 timmar. Reaktionsblandníngen filtrerades och återstoden tvättades med vatten för erhållande av amínohexyl- CL-4B (32,8 g, våt form). När aminohexylhalten i er- mättes medelst títrering var den cirka -Sepharose hållen Sepharose 65 /amoUg (våt form). ® (2) Amínohexyl-Sepharose CL~4B (6 g, våt form) uppslamma- des i 0,05~M fosfatbuffert (1S,2 ml, pH 7,0). En 25-procentig vattenhaltig lösning av glutaraldehyd (6,4 ml) sattes till sus- pensionen och blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvätta- des med 0,1-M fosfatbuffert (pH 7,0) och uppslammades därefter i en lösning av 15-mM histamin i 0,1-M fosfatbuffert (19,S ml, pH 7,0). Suspensionen omrördes vid rumstemperatur i 2 timmar.

Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återsto- den tvättades med 1~M vattenhaltig natriumklorid (cirka 200 ml) och uppslammades därefter i 0,1~M fosfatbuffert (10 ml, pH 7,0).

Natriumborohydrid (100 mg) sattes till suspensionen och bland- ningen omrördes vid rumstemperatur under 1 timme. Reaktionsbland- ningen filtrerades och återstoden tvättades noggrant med 1-M vattenhaltig natriumkloríd och vatten för erhållande av det vat- tenolösliga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln", -o-oæzoæcoxncflzmacoazaörvnccriz) 5-m{(cH2)2-[--|_ HN\¿;N Halten histamin per 1 g (våt form) av.adsorptíonsmedlet som er- hölls sålunda var 6,5 Pmol. 10 15 20 25 30 35 10 461 505 Beredning 2 (1) Cellu1osa,90 g (våt form),uppslammades i 1 N vattenhal- tig natriumhydrorid (900 ml). Epiklorhydrin (100 ml) sattes till suspensionen och blandningen omrördes vid 60°C under 30 minuter.

Efter fullbordad reaktion sattes isvatten till reaktionsbland- ningen. Blandningen filtrerades och återstoden tvättades med vat- ten för erhållande av epoxiaktiverad cellulosa (82 g, våt form).

En 0,625-procentig vattenhaltig lösning av hexametylendiamin (400 ml) sattes till epoxi-aktiverad cellulosa som erhållits så- lunda (82 g, våt form) och blandningen omrördes vid 60°C under 2 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvätta- des med vatten för erhållande av aminohexylcellulosa (78 g, våt form). När aminohexylhalten i erhållen cellulosa uppmättes me- delst titrering var den cirka 69,4 pmol/g (våt form). (2) Aminohexylcellulosan som erhållits sålunda (2 g, våt form) uppslammades i 0,05-M fosfatbuffert (1S,2 ml, pH 7,0) och en ZS-procentig vattenhaltig lösning av glutaraldehyd (6,4 ml) sattes till suspensionen och blandningen omrördes vid rumstempe- ratur under 2 timmar. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med 0,1~M fosfat- buffert (pH 7,0) och uppslammades därefter i en lösning av 10-mM histamin i 0,1-M fosfatbuffert.(19,S ml, pH 7,0). Suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natrium- klorid (cirka 200 ml) och uppslammades därefter i 0,1-M fosfat- buffert no mi, pa 1,11). Natfiumborohyaria (wo mg) sattes :in suspensionen som omrördes vid rumstemperatur under 1 timme. Reak- tíonsblandningen filtrerades och återstoden tvättades noggrant med 1-M vattenhaltíg natriumklorid och vatten för erhållande av vattenolösligt adsorptionsmedel (2,0 g, våt form) med formeln: -o-ofzcflcornmzwumgómzccuz) S-Nncmzaz-Es Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet som er- hållits sålunda var 11,2 Pmol.

Beredning 3.

Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom att histidin fick ersätta histamin för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: 10 15 20 25 11 __ 461 sus Icel lul o så -O-CHZGKOH) CHZNI-KCHZ) 6I\IH(G-I2)5-NH Halten hístidín per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 8,6 Pmol.

Beredning 4 Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom att cytosín användes i stället för histamín för erhållande av det vattenolöslíga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: -o- oxzofcofocnziaccflznówccrfgs- / i 1 O N H Halten cytosin fier 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 8,6 pmol.

Beredning 5 Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom att 5-metylcytosin användes i stället för hístamin för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: -o-mzo+{ofooæzim(oizaómæ(mz)š- CH H 3 Halten S-metylcytosin per 1 g (våt form) av.adsorptionsmedlet var 9,3 ymol. ' Beredning 6 Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom.att 2-amino-4,6-dimetylpyrimídin användes i stället för histamín för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: m3 Nz l Icenuiosal -o-mzcææcoxaycxazmacoafimæccnz)S-NH-ß s Halten 2~amíno-4,6-dimetylpyrimidin per 1 g (våt form) adsorp- tionsmedel var 10,0 Fmol. 12 461 sne Beredning 7 Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom att 2-amino-4-hydroxí-6-metylpyrímídin användes i stället för hístamín för erhållande av det vattenolöslíga adsorptíonsmed- let (2,0 g, våt form) med formeln: Icellulosal -0-CH2C}{(OH)Cl~lzNl-I(Gí2)6hII-I(Clí2) S-NH 3 Halten 2-amíno-4-hydroxí-6-metylpyrimídín per 1 g (vàt form] av adsorptíonsmedlet var 8,8 pmol.

Beredning 8 Samma förfarande som beškrívits i beredning 2 upprepades förutom att adenín användes i stället för histamin för erhållande av det vattenolöslíga adsorptionsmedlet (2,0 g, vàt form) med formeln: ' Icellulosal--0-CH2CH(OH)CHZNH(CH2)6NH(CH2)S H , /NI \= 1 Halten adenín per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 5,0 Pmol.

Beredning 9" Samma förfarande som beskrivits í beredning 2 upprepades förutom att 6,9-díamíno-2-etoxíakridín användes i stället för hístamin för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: “Hz c e 1 1 ul o s a ß-Cl-IZG-KG-DG-IZNI-l (CHZ) óNl-KG-lz) S-NH :j f ”WS eller -omzmrornwzmcmzaómflmgs-m ' OC H ÉII, II;/' ZS Halten 6,9-díamino-2-etoxiakrídín per 1 g (våt form) av adsorp- H tionsmedlet var 6,8 Pmol. 10 15 20 25 30 35 13 " 461 505 Beredning 10 CH-Sepharose 4B (agarosderívat från Pharmacia Fine Chemicals, 6 g, våt form) uppslammades i en vattenhaltig lösning av 20-mM 5-metylcytosin (9,9 ml) och pH för suspensionen justerades till 4,5-5,0 med O,5'N klorvätesyra. En 10-procentig vattenhaltig lös- ning av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (1 ml) sattes droppvís till suspensionen under cirka 10 minuter under det att pH för suspensionen bibehölls vid 4,5-5,0 genom tillsats av 0,5-N klorvätesyra. Suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 20 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natriumklorid (200 ml) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: [ašaroslïglc = Nccflzasco-nn CH ”ä” 3 oää Halten 5-metylcytosin per 1 g våt form) av adsorptionsmedlet var 3,0 pmol.

Beredning 11 1'N vattenhaltig natriumhydroxid (10 ml) och epiklorohydrin (2 ml) sattes till hydroximetylpolystyrenharts (hydroxímetylerad styren-dívinylbensensampolymer, S g, våt form] och blandningen om- rördes vid 60°C under 1 timme. Efter fullbordad reaktion filtrera- des blandningen och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-aktiverat hydroxímetylpolystyrenharts. En vattenhaltig lösning av 15-mM histamin och 1-M natríumbikarbonat (19,8 ml) sat- tes till hartset och blandningen omrördes vid 60°C under 2 timmar.

Reaktionsblandníngen fíltrerades och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natriumklorid (200 ml) för erhållande av det vatten- olösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-divinyl- bensen-sampolymer -CH 0-CH CHCOHICH NH(Cfl )'“-r1:- 2 2 2 2 2 H&\5å 'Ha1ten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var_ 12,5 umol. ' Beredning 12 Aminopropyl-poröst glas (1 g, torr form) uppslammades i 0,05'M fosfatbuffert (1S,2 ml, pH 7,0). En 25-procentig vatten- haltig lösning av glutaraldehyd (6§4 ml) sattes till suspensionen och blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reak- 461 50.5 10 15 20 25 30 14 tionsblandningen fíltrerades och återstoden tvättades noggrant med 0,1-M fosfatbuffert (pH 7,0) och uppslammades därefter i en lösning av 20-mM histamin i 0,1-M fosfatbuffert (9,9 ml, pH 7,0).

Blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reak- tíonsblandningen filtrerades, återstoden tvättades med 1-M vat- tenhaltig natriumklorid och reducerades därefter med natríum- borohydrid såsom beskrivits i beredning 1 för erhållande av det vattenolöslíga adsorptionsmedlet (1,8 g, våt form) med formeln: lporöst glas!-(CH2)3NH(CH2)SNH(CH2)š-11:-1 HN¶çN Halten hístamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var ' 10,1 pmol.

Beredning 13 Cyanbromid-aktiverad Sepharoség CL-4B (6 g, våt form) upp- slammades i en vattenhaltig lösning av 20-mM histamín och 1-M natriumbíkarbonat (9,9 ml) och uppslamníngen omrördes vid rums- temperatur under 20 tímmar. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltíg natrium- klorid (200 ml) för erhållande av det vattenolöslíga adsorptíons- medlet (5,9 g, våt form) med formeln: -0 ac = Nrcfl »Hm - -01 2 2 \<$ Halten hístamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 30,8 pmol.

Beredning 14 Histamin-dihydrokloríd (1,84 g) löstes i en blandad lösning av metanol (30 ml) och 2-N vattenhaltig natríumhydroxíd (20 ml) och klorometylpolystyrenharts (klorometylerad styren-divinylben- sensampolymer, 3 g, torr form) uppslammades i denna lösning. Sus- pensionen återloppskokades vid 70-80°C under 4 timmar. Efter full- bordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med vatten för erhållande av det vattenolöslíga adsorp- tionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: -CH2NH(CH2)ï-šííg H r Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var styren-divinyl- bensen-sampolymer 251 Pmol. 10 15 20 25 30 SS 15 -- 461 sus Beredning 15 > Cellulosa (29 g, våt form) tvättades med vatten (1 liter) och uppslammadcs i vatten (150 ml). Suspensionen reglerades till pH 11-12 medelst 10-N vattenhaltig natriumhydroxid. En lösning av cyanbromid (6 g) í vatten (120 ml) sattes till suspensionen por- tionsvis under omröring under det att pH för suspensionen bibe- hölls vid 11-12. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandning- en och återstoden tvättades med kallt vatten (1 liter) och en vat- tenhaltíg iskyld lösning av 0,1-M natriumbikarbonat för erhållande av cyanbromid-aktiverad cellulosa (21 g, våt form). Cyanbromid- aktiverad cellulosa som erhölls sålunda (7 g, våt form) sattes till en lösning av etylendiamin (framställd genom reglering av en vattenhaltig lösning av 50~mM etylendíamin och 0,1-M natriumbi- karbonat (S0 ml) till pH 8) och omrördes vid rumstemperatur under 20 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvät- tades noggrant med vattenhaltig 1-M natriumklorid och vatten för erhållande av aminoetylcellulosa (4,5 g, våt form). Samma förfa- rande som beskrivits i beredning 2 upprepades förutom att amino- etylcellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stäl- let för amínohexylcellulosa för framställning av det vattenolös- liga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: fi=r1(mZ)ZNH(mZ)SNHcmZJZ-Ü H / wfltaihistamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 8,5 pmel.

Beredning 16 .

Cvanbromídaktíverad cellulosa (16,4 g, våt form) erhållen i beredning 15 sattes till en lösning av butylendiamin (framställd genom reglering av en vattenhaltig lösning av 40~mM butylendiamin och 0,1-M natriumbikarbonat (S0 ml) till pH 10) och blandningen omrördes vid rumstemperatur under 20 timmar. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med 1-M vattenhaltig natríumklorid och vatten för erhållande av aminobutylcellulosa (10,7 g, våt form). Samma förfarande som be- skrivits i beredning 2 upprepades förutom att aminobutylcellulosa som erhållits sålunda (2,0 g, våt form) användes i stället för aminohexylcellulosa för erhållande.av det vattenolösliga adsorp- tionsmedlet (ZQO gr våt form) med formeln: 16 4 6 1 5 f) :Siam(cn2)4mx(cu2)5m1(cr12)¶:-í1 Halten histamin per 1 g (våt form) av adsozptionsxnedlet var 10,3 Pmol.

Beredning 17 Cellulosa (177 g, våt form) uppslammades i 1 N vattenhaltig nan-iumhyaroxid nsoo m1) vid eo°c. Epiklorohyarin (zoo m1) sattes till suspensionen och suspensionen omrördes vid 60°C under 30 mi- nuter. Isvatten sattes till reaktionsblandningen. Blandningen filtrerades och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-aktiverad cellulosa (150 g, våt form). En vattenhaltig lös- ning av etylendiamin (100 ml, innehållande 5,26 mmol etylendiamin och reglerad till pH 11) sattes till sålunda erhållen epoxi-akti- verad cellulosa (25 g, våt form) och omrördes vid 60°C under 2 timmar. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med vatten för erhållande av amino- etylcellulosa (22 g, våt form). Samma förfarande som beskrivits i beredning 2 (2) upprepades förutom att amínoetylcellulosa som er- hållits sålunda (2,0 g, våt form) användes i stället för amino- hexylcellulosa för erhållande av det vattenolösliga adsorptions- medlet (2,0 g, våt form) med formeln: flwzømfawzuumz) zmcmz) Swmmza-Ü 2 H Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 11,5 pmol.

Beredning 18 Samma förfarande som beskrivits i beredning 17 upprepades förutom att butylendiamin användes i stället för etylendiamin för erhållande av aminobutylcellulosa (22 g, våt form). Aminobutyl- cellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stället för amínohexylcellulosa i förfarandet i beredning 2 (2) för er- hållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formelnf -o-cazcmoznaazrnumz) ilman) srmcmz) z-HÜ I' Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 12,8 Pmol. 10 15 20 25 30 17 a 461 505 Beredning 19 Samma förfarande som beskrivits i beredning 17 upprepades förutom att hexametylendiamin användes i stället för etylendiamin för erhållande av aminohexylcellulosa (22 g, våt form). Aminohexyl- cellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stället för aminohexylcellulosa i förfarandet i beredning 2 (2) för erhål- lande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: -o- cnzcfuoaymzmaccuzyómæcoaz)SNH(o12)2----Fns _ , \5N Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 13,6 pmol.

Beredning 20 Samma förfarande som beskrivits i beredning 17 upprepades förutom att oktametylendiamin användes i stället för etylendiamin för erhållande av aminooktylcellulosa (22 g, våt form). Aminooktyl- cellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stället för aminohexylcellulosa i förfarandet i beredning 2 (2) för erhål- lande av vattenolösligt adsorptionsmedel (2,0 g, våt form) med formeln -o- cflzofloxnoazmflmåsmaçcfaz) Srmçoafí) Halten hístamin per 1 g (våt fornflav adsorptionsmedlet var 12,6lpmol.

*Beredning 21 _ En lösning av dekametylendiamin (framställd genom reglering av en lösning av 5,26 mmol dekametylendiamin i S0 % etanol (100 ml) till pH 11) sattes till epoxi-aktiverad cellulosa erhållen i beredning 17 (25 g, våt form) och skakades vid 60°C under 2 timmar.

Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades nog- grant med 50-procentig vattenhaltig etanol och vatten för erhål- lande.av aminodecylcellulosa (22 g, våt form). Aminodecylcellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stället för amino- hexylcellulosa i förfarandet i beredning 2 (2) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln; e -o-oazcnçonyoazuæmcfxz) wmflcflz) smxzoaz) z Ü 10 15 20 ZS 30 35 461 sqs ” Halten hístamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 10,8 Pmol.

Beredning 22 Samma förfarande som beskrivits i beredning 21 upprepades 5 förutom att dodekametylendiamín användes i stället för dekametyl- endiamin för erhållande av aminododecylcellulosa (22 g, våt form).

Aminododecylcellulosa som erhölls sålunda (2 g, våt form) användes i stället för aminohexylcellulosa i förfarandet i beredning 2 (2) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (2,0 g, våt form) med formeln: 'Ofizaflaflmzmflmzlnmflmfsmïmfiz l “z I Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 11,3 pmol.

Beredning 23 Klorometylpolystyrenharts (klorometylerad-styren-divinylben- sensampolymer, 5 g, torr form) uppslammades i en blandad lösning av diklorometan (15 ml) och metanol (15 ml), och trietylamín (1,42 ml) sattes till suspensionen. Blandningen återloppskokades vid 70°-80°C under 4 timmar och hartset filtrerades av och tvät- tades noggrant med vatten. Etylendiamindihydroklorid (2,66 g) löstes i ett blandat lösningsmedel av metanol (30 ml) och 2-N vat- tenhaltig natriumhydroxid (20 ml) och ovan erhållet harts uppslam- mades i erhållen lösning. Suspensionen återloppskokades vid 70- 80°C under 4 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och åter- stoden tvättades noggrant med vatten för erhållande av ett harts (8,4 g, våt form). Hartset (5,0 g, våt form) uppslammades i 0,05-M fosfatbuffert (12 ml, pH 7,0) och en ZS-procentig vatten- haltig lösning av glutaraldehyd (12 ml) sattes till suspensionen.

Blandníngen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reaktions- blandningen filtrerades och återstoden tvättades noggrant med 0,1-M fosfatbuffert (pH 7,0). Aterstoden uppslammades i en lös- ning av IS-mM histamín i 0,1-M fosfatbuffert (19,S ml, pH 2,0) och omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Efter fullbordad reak- tion filtrerades blandningen och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natriumklorid (ca 200 ml) och uppslammades därefter i 0,1-M fosfatbuffert (10 ml, pH 7,0). Natríumborohydrid (100 mg) sattes till uppslamníngen. Blandningen omrördes vid rumstemperatur under 1 timme. Reaktionsblandningen fíltrerades och återstoden tvättades noggrant med vattenhaltíg 1-M natriumklorid och vatten 10 15 20 25 30 35 19 -_ 461 505 för erhållande av det vattenolöslíga adsorptíonsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: - m2m1(cfl2)ZNH(cH2)5m+(ox2)¿~_-_- HU styren-dívinyl- bensensampolymer Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 28,6 Pmol.

Beredning 24 Samma förfarande som beskrivits i beredning 23 upprepades förutom att hexametylendiamin (2,32 g) användes i stället för etylendiamíndíhydrokloríd för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-dívinyl- ul jbensensam ol mer 2M{(m2)6m(m2)5m(m2)2 |"' . ;š,l- Halten hístamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 58,8 Pmol.

Beredning 25 (1) N-t-butoxikarbonyl-Eèaminokaproinsyra (2,31 g), 1-hydroxibensotriazol (1,49 g) och dicyklohexylkarbodiimid (2,27 g) löstes i tetrahydrofuran (10 ml). Histamindihydroklorid (1,84 g) och trietylamin {2,84 ml) sattes till lösningen och blandningen omrördes vid rumstemperatur under S timmar. Efter fullbordad reaktion avfiltrerades bildad fällníng och filtratet extraherades med etylacetat. Extraktet tvättades med 1-procentíg klorvätesyra och därefter med mättat vattenhaltigt natríumbíkar- bonat, torkades och lösningsmedlet avdestíllerades för erhållande av N-t-butoxikarbonyl-íraminokaproylhistamin såsom en olja. Oljan uppvisade en enda fläck (Rf: 0,76) vid tunnskiktskromatografi (lösningsmedel: kloroform-metanol-ättiksyra (9S:5:3)). Sålunda erhâllen olja behandlades med trifluoroättiksyra (5 ml) vid rums- temperatur under SO minuter och eter sattes till blandningen för erhållande av E¥aminokaproylhistamín (1,12 g) såsom en olja.

Oljan uppvisade en enda fläck (Rf: 0,47) vid tunnskiktskromato- grafi (lösningsmedel: n-butanol-ättiksyra-vatten (4:1:1)). (2) Klorometylpolystyrenharts (klorometylerad styren-díví- nylbensensampolymer, S g, torr form) uppslammades i en blandad lösning av diklorometan (15 ml) och metanol (15 ml). Tríetylamin (1,4Z ml) sattes till suspensíonen och blandningen àterloppskoka- 10 1S 20 ZS 30 35 461 5o§ 2° des vid 70-80°C under 4 timmar. Hartset filtrerades och tvättades noggrant med vatten. 2-Amínokaproylhistamin som erhölls ovan i (1) (1,12 g) löstes i en blandning av metanol (30 ml) ooh 2-N vattenhaltig natríumhydroxid (20 ml) och ovan erhållet harts upp- slammades i denna lösning. Blandningen reagerades vid 45-S0°C un- der 24 timmar. Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med vatten för erhållande av det i vatten olösliga adsorptionsmedlet (8,4 g, våt form) med formeln: 'mzmallzlsæmalizlïT HU Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 59,5 Pmol.

Beredning 26 Amínohexyl-Sepharoséñ CL-4B (6 g, våt form, framställd i beredning 1 (1)) uppslammades i en vattenhaltig lösning av 30-mM urokansyra (9,9 ml). Suspensionen justerades till pH 4,5-5,0 med 0,5“N klorvätesyra och 40-procentig vattenhaltig lösning av 1-etyl-3-(3-dimetylamínopropyl)-karbodiimid (1 ml) sattes dropp- vis till suspensionen under 10 minuter, under det att suspensionen bibehölls vid pH 4,5-5,0 genom tillsats av 0,5-N klorvätesvra.

Efter tillsats omrördes reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 20 timmar. Reaktionsblandningen fíltrerades och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natriumklorid (ca 200 ml) för er- hållande av det vattenolöslíga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: -o-m2oi(of1)o42NH(æ2)6N1ncm=o1-Û H / Halten urokansyra per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 3,1 pmm. ' Beredning 27 Samma förfarande som beskrivits i beredning 26 upprepades förutom att en vattenhaltig lösning av 10-mM orotinsyra (19,9 ml) användes i stället för 30-mM vattenhaltig urokansyralösning (9,9 ml) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: -o-axzonorncnzrnfloæfómaoc j? I .f (gun 10 15 20 21 m 461 sos Halten orotinsyra per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var' 15,3 Pmol.

Beredning 28 Aminohexyl-Sepharoséä CL-4B (6 g, våt form, framställd i beredning 1 (1)) uppslammades i vatten (9 ml)3 2-N vattenhaltig natriumhydroxíd (3,9 ml) och epiklorhydrín (0,9 ml) sattes till suspensionen och blandningen omrördes vid 40°C í 2 timmar. Reak- tionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-aktiverad aminohexyl-Sepharose CL-4B.

Epoxí-aktiverad aminohexyl-Sepharose CL-4B som erhölls sålunda uppslammades i en vattenhaltíg lösning av 30-mM uracil (9,9 ml, justerad till pH 12 med 2-N natríumhydroxid) och suspensionen om- rördes vid 60°C under 2 timmar. Efter fullbordad reaktion filtre- rades blandningen och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltíg natriumklorid (200 ml) för erhållande av det vattenolösliga ad- sorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: o -o-cnzcn (os) ca ZNH (caz) suncnzcn (om cnz-ÅÜ o -o-cazcu (om cazrm (C112) Gnxcuzcn (om caz-NÅNH \ OH -o-cazcu (omcnzufl (cnz) Guacnzcx (om cnz-otu Tf . / eller -o-cnzca (om cnzmi (C212) enncnzcn (om cnz-o-I//N I N* on Halten uracil per 1 g (våt form).av.adsorptionsmedlet var 4,1 Fmol.

Beredning 29 (1) Dimetylsulfid (20 g) löstes í en blandad lösning av diklorometan (60 ml), metanol (60 ml) och destillerat vatten '(90 ml) och poröst klorometylpolystyrenharts (klorometylerad styren-divínylbensensampolymer , 20 g, torr form)'upp51ammades i 22 461 505 10 15 20 ZS 30 35 lösningen. Suspensionen áterloppskokades vid 60°C under 48 timmar.

Efter fullbordad reaktion filtrerades blandningen och återstoden tvättades noggrant med vatten och metanol för erhållande av di- metyltiometylpolystyrenharts (33 g, våt form).

(Z) Histamindihydroklorid (1,84 g) löstes i en blandad lösning av 2-N vattenhaltig natriumhydroxid (20 ml) och metanol (10 ml) och dímetyltiometylpolystyrenhartset som erhållits ovan (1) (S g, våt form) uppslammades i denna lösning. Blandningen återloppskoka- des vid 80-85°C under 21 timmar. Reaktionsblandningen avfiltrera- des och återstoden tvättades noggrant med vatten för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-divinyl- \bensensam;ol;merl _w2mí(m2)2 HI ~ I / Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 179 Pmol.

Beredning 30 Det aminoetylerade polystyrenhartset (5,0 g, våt form) som erhållits på samma sätt som beskrivits i beredning 23 uppslamma- des i en vattenhaltíg 50-mM urokansyralösning (9,9 ml) och pH för suspensionen justerades till 4,5-5,0 med 0,5-N klorvätesyra. En 40-procentig vattenhaltig lösning av 1-etyl-3-(3-dimetylamino- propyl)karbodiimid (1 ml) sattes droppvis till suspensionen under cirka 10 minuter under det att suspensionens pH-värde bibehölls vid 4,5-5,0 genom tillsats av 0,5-N klorvätesyra. Suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 20 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med 1-M vattenhaltig natrium- klorid (200 ml) för erhållande av det vattenolösliga adsorptíons- medlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-divínyl- _ _ _____ Ibensen-samEolXmed_ CH2NH(CH2)2NHC0CH_CH !°'! I Halten urokansyra per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 44,3 Pmol.

Beredning 31 Samma förfarande som beskrivits i beredning 30 upprepades förutom att en vattenhaltig 10-mM orotinsyralösníng (19,9 ml) an- vändes i stället för den vattenhaltiga 30-mM urokansyralösningen (9,9 ml) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: 23 ._ 461 505 styren-dívinyl- _ __ bensensampolymer CH2NH(CH2)2NHCO H§::šf , U O Halten orotinsyra per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 27 pmol.

Beredning 32 Samma förfarande som beskrivits i beredning 30 upprepades förutom att det aminohexylerade polystyrenhartset (5,0 g, våt form) som erhölls på samma sätt som beskrivits i beredning 24 an- VÜRES i stället för det aminoetylerade polystyrenhartset för er- hållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-divinyl- _ _ _____ bensensampolyme CH2NH(CH2)6NHC0CH"CH}¿::L / Halten urokansyra per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 33 pmol. _ Beredning 33 Samma förfarande som beskrivits i beredning 31 upprepades förutom att det aminohexylerade polystyrenhartset (5,0 g, våt form) som erhållits på samma sätt som beskrivits i beredning 24 användes i ställetför det.amínoety1erade polystyrenhartset för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (8,0 g våt form) med formeln: 'Styren-dívinyl-! _ __ .bensensam ol me CH2NH(CH2)6NHCOI¿:;;Éf 0 Halten orotinsyra per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 17,2'pmol.

Beredning 34 Samma förfarande som beskrivits i beredning 23 upprepades förutom att S-metylcytosin användes i stället för Histamin för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (5,0 g, våt form) med formeln: styren-divíny1- _ _ bensensampolymer CH2NH(CH2)2NH(cH2)5NH / H3 I 0/ H 24 461 505 Halten Sflmetylcytosin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 1,7 pmol.

Beredning 35 Klorometylpolystyrenharts (klorometylerad-styren-divinylben- sensampolymer) behandlades på samma sätt som beskrivits i J. Am.

Chem. Soc., 98, 7357 (1976) för erhållande av aminometylerat polystyrenharts. Det amínometylerade polystyrenhartset (5,0 g, torr form) som erhållits sålunda uppslammades í en vattenhaltig 0,1-M natriumtetraboratlösníng (40 ml) och cyanurklorid (3,69 g) sattes därtill. Blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reaktionsblandningen avfiltrerades och återstoden tvät- tades med metanol och vatten för erhållande av ett harts (13,2 g, våt form). En vattenhaltíg 25-mM histamín-0,1-M natrium- tetraboratlösning (19,9 ml) sattes till hartset (6,6 g, våt form) som erhållits ovan, och blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Reaktíonsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med 1-M natriumklorid (200 ml) för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (6,6 g, våt form) med formeln: styren-divinyl- _ *bensensampolymer CH2NHšÉï:pNH(CH2)2;3?"3 \ / i cl Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 64,46pmol.

Beredning 36 Hartset (6,6 g, våt form) som erhållits genom reaktion av det aminometylerade polystyrenhartset med cyanurklorid på samma sätt som beskrivits i beredning 35 sattes till en vattenhaltig S00-mM 2-aminokaproinsyra-0,1-M natríumtetraboratlösning (20,3 ml). Blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 tim- mar. Reaktionsblandníngen fíltrerades och återstoden tvättades med en vattenhaltig 1-M natriumkloridlösning (200 ml) för erhål- lande av ett harts (6,6 g, våt form). Sålunda erhållet harts upp- slammades i en vattenhaltíg 30-mM histamínlösning (9,9 ml) och suspensionen behandlades på samma sätt som beskrivits i beredning 30 för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (6,6 g, våt form) med formeln: styren-divínyl- _ ______ bensensampolymer CHZNH'E:ɧ_NH(CH2)5coNH(CH2)2 l"Å HN (\ Cl 10 15 20 25 30 35 ZS “ 461 505 Halten hístamin per 1_g (våt form) av adsorptíonsmedlet var 5,3 pmol. * Beredning 37 (1) En vattenhaltig 3-N natriumhydroxidlösníng (10 ml) och epiklorhydrin (10 ml) sattes till Toyopearl HW-SS (polyvínyl- alkohol från Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd) (13 g, våt form).

Blandningen skakades vid SOOC under 2 timmar. Reaktionsblandningen fíltrerades och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-ToyopearfE HW-SS (13,7 g, våt form). Epoxi-Toyopearl HW-55 (13,7 g, våt form) uppslammades i en vattenhaltig lösning av koncentrerad ammoniak (20 ml) och suspensionen skakades vid 50°C under 1 timme. Reaktíonsblandningen filtrerades och återsto- den tvättades med vatten för erhållande av aminopropylerad HW-SS (14,3 g, våt form). Halten aminopropylgrupp per HW-SS var Cirka Toyopearfß 1 g (våt form) av aminopropylerad Toyopear 125 mol. (2) Aminopropylerad Toyopearfß HW-S5 (6, g, våt form) upp- slammades i 0,05-M fosfatbuffertlösning (pH 7,0, 12 ml) och en vattenhaltig ZS-procentig glutaraldehydlösning (12 ml) sattes där- till. Suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 30 minuter.

Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med en 0,1-M fosfatbuffertlösning (pH 7,0). Återstoden uppslammades i en lösning av 15-mM histamín och 0,1-M fosfatbuffertlosning (pH 7,0, 19,8 ml) och sušpensionen omrördes vid rumstempratur under 2 timmar. Reaktionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med en vattenhaltig I-M natriumkloridlösning (cirka 200 ml). återstoden uppslammades i 0,1-M fosfatbuffertlösning (pa 7,0", 10 mi) ooh ootrmmborhyario (wo mg) sattes därtill.

Suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 1 timme. Reak~ tionsblandningen filtrerades och återstoden tvättades med en vattenhaltig 1-M natriumkloridlösning och vatten för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: lpolyvinyl- alkohol I '°'°*z(f'mzm(mz)sm(mz) 2 HiQ/Q! .. on ' Halten histamin per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 18,2 Pmol. __ Beredning 38 1) Epoxi-Toyopearfæ HW-55 (9,0 g, våt form) som erhållits 26 461 505 10 15 20 25 30 35 på samma sätt som beskrivits i beredning 37 (1) uppslammades i en vattenhaltig 0,625-procentig hexametylendiaminlösníng (36 ml) och suspensionen skakades vid 60°C under 2 timmar. Reaktions- blandningen filtrerades och återstoden tvättades med vatten för HW-55 (8,5 g, våt form). Hal- ten amínohexylgrupp per 1 g (våt form) av aminohexyl~Toyopearl HW-55 var cirka 174 pmol. erhållande av aminohexyl-Toyopearl (2) Samma förfarande som beskrivits i beredning 37 (2) upp- repades förutom att aminohexyl-Toyopear HW-55 användes i stället för aminopropyl-Toyopearl HW-SS för erhållande av det vattenolös- liga adsorptionsmedlet (6,0 g, våt form) med formeln: gllšlíällyl l 'o'mz§flmzm(c"z)em(mz)sm(mz)ï"frl on NKJ* lmlten histænhi per 1 g (våt form) av adsorptionsmedlet var 21,8 Pmol.

Beredning 39 (1) Kitosan (S g, torr form) löstes vid S0°C i 0,1-N klor- vätesyra (350 ml) och koncentrerad klorvätesyra sattes till lös- ningen. Fällningarna tillvaratogs genom filtrering och disperge- rades därefter i en vattenhaltig 6-N natriumhydroxidlösning (200 ml). Metanol (300 ml) sattes till dispersionen och fällning- arna tillvaratogs genom filtrering. Fällningarna som erhölls så- lunda tvättades med metanol, torkades och fick därefter passera genom en sikt (20 mesh) för erhållande av merceriserad kitosan (3,44 g, torr form).

(Z) Samma förfarande som beskrivits i beredning 37 upprepa- HW-55 för erhållande av det vattenolösliga adsorptionsmedlet (3,3 g, des förutom att merceriserad kitosan ersatte Toyopearl våt form) med formeln: -cazclucnzurucuzlsNaccaz)ï-r-:ï OH HN\¿7N Halten histamín per 1 g (våt form) av adscrptionsmedlet var 59,7 pmol. ” Beredning 40 (1) SepharoseCL-48 (varumärke för ett agarosderivat till- verkat av Pharmacía Fine Chemicals, 350 g, våt Form) uppslamma_ des i vatten (500 ml). 2-N natriumhydroxid (200 ml) och epikloro- hydrin (50 ml) sattes till suspensionen och blandningen omrördes 10 15 20 25 30 35 27 -- 461 505 vid 4008 under 2 h. Efter fullbordad reaktion filtrerades bland- ningen och återstoden tvättades med vatten för erhållande av epoxi-SepharoseCL-AB. Epoxi-SepharoseCL-AB som erhölls sålunda uppslammades i en vattenhaltig 0,6-procentig hexametylendiamin- lösning (1,4 1) vid 6006 och suspensionen omrördes vid 6000 under 2 h. Efter fullbordandc av reaktionen filtrerades blandningen och återstoden tvättades med vatten för erhållande av aminohexyl~ SepharoseCL-48 (370 g, våt form). När aminohexylhalten hos er- hållen Sepharose mättes genom titrering var den cirka 37,6 mol/9 (våt form). (2) Aminohexy1-SepharoseCL-48 (370 g, våt form) uppslammades i &-N natriumhydroxid (700 ml). Epiklorohydrin (700 ml) sattes till suspensionen vid 6500 och blandningen omrördes. Efter det att temperaturen höjts till 9000 omrördes blandningen ytterligare under 8 minuter. Efter fullbordad reaktion sattes vatten till blandningen och nämnda blandning kyldes till en temperatur lägre än 5000 och filtrerades. Återstoden tvättades med vatten För er- hållande av epoxi-aminohexyl-SepharoseCL-4B. Epoxi-aminohexyl- SepharuseCL-48 som erhölls sålunda uppslammades i en vattenhaltig 20-procentig histidinhydrokloridmonohydratlösning (2,1 1, juste- rad till pH 12 med en vattenhaltig natriumhydroxidlösning) och suspensionen omrördes vid 80-9000 under 30 minuter. Efter full- bordad reaktion filtrerades blandningen. Återstoden tvättades med vatten och uppslammades därefter i vatten (1 Q). Suspen- sionen autoklaverades vid 12000 under 20 minuter och blandningen filtrerades. Återstoden tvättades med 0,2-N klorvätesyra, 0,2-N natriumhydrnxid, 1,5-M natriumklorid och vatten För erhållande av den vattenolösliga adsorhenten (370 g, våt form) med formeln: ]agaros]-0CH2CH(0H)CH2NH(CH2)6NHCH2CH(0H)CH2NHçHCHE-T==ï CÛÛH Hflvøfl Halten hístidin per 1 g (våt form) av adsorptíonsmedlet var Z0,& mnl.

Exempel 1. Ådsorptionsmedlet som erhållits i beredning 1 (ligand: histamin, bärare: aminohexylagaros, 8 ml) tvättades med 1,5-M vattenhaltig natriumklorid och packades i en steriliserad kolonn (innerdíameter 13 mm, längd 100 mm). Kolonnen tvättades i följd med 1,5-M vattenhaltig natriumklorid (250 ml), rent vatten (100 ml) 10 15 20 461 sus 28 och 0,05-M natriumhaltig natriumklorid (100 ml) vilka samtliga var pyrogenfria. En lösning av varje pyrogen (100 pg) härstamman- de från olika slags bakterier i 0,05-M natriumhaltig natriumklorid (100 ml) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV =12. kolonnen användes pá nytt efter successiv tvättning med 0,2-N I detta fall användes endast en kolonn och den använda vattenhaltig natriumhydroxid (16 ml),,0,S-procentig vattenhaltig lösning av natriumdeoxikolat (32 ml), 0,2-N vattenhaltig natrium- hydroxid (160 ml), rent vatten (S0 ml), 1,5-M vattenhaltig natríum- klorid (250 ml) och rent vatten (100 mD för reproducering av adsorptionsmedlets pyrogenadsorptionsförmága. Koncentrationen av pyrogenen i utflödet mättes och ett Limulus-test utfördes därpå.

Resultaten anges i tabell 1. I tabell 1 användes såsom pyro- gen härstammande från Klebsiella pneumoniae, LPS framställd enligt metoden enligt Westphal (Angwt, Chem., 66, 407 (1954)) och övriga pyrogener utgjordes av LPS tillverkad av Difco Lab, USA.

Tabell 1 Pyrogener harstammande Koncentration Limulus- från bakterier axgyšïoâêglöde) test Escherichia coli 0128: B12, LPS 0,2 f Klebsiella pneumoniae, LPS 0 - Salmonella abortus eqüi, LPS 0,6 - Salmonella enteritidis, LPS 0,6 - Salmonella flexinerí, LPS 0 - Salmonella minnesota 0700- LPS 0,1 - Exemgel 2. Varje adsorptionsmedel som erhållits i beredningarna 2-9 (8 ml) packades i en kolonn (innerdíameter 13 mm, längd 100 um) och kolonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1.

En lösning av pyrogen i 0,05-M vattenhaltíg natriumkloríd (100 ml, innehållande 1000 ng Escherichía coli 0128: B12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12. Koncentrationen av pyrogen i utflödef uppmättes. Resul- taten anges i tabell 2. 10 15 29 461 sus Tabell 2 Koncentration av pyrogen (ng/ml utflöde) Nr Adsorptíonsmedel 1 Adsorptionsmedel från beredning 2 (ligand: histamín,-bärare: amino- hexylcellulosa) 9,1 Z Adsorptionsmedel från beredning 3 (ligand: histidin, bärare: amino- hexylcellulosa) 3 Adsorptionsmedel från beredning 4_ (ligand: cytosin, bärare: amino- hexylcellulosa) -4 Adsorptíonsmedel från beredning 5 (ligand: S-metylcytosin, bärare: aminohexylcellulosa) 5 Adsorptionsmedel fràn beredning 6 (ligand: 2-amíno-4,6-dimety1pyri- midin, bärare: aminohexylcellulosa 6 Adsorptionsmedel från beredning 7 (ligand: 2-amino-4-hydroxi-6-metyl- pyrimidin, bärare: aminohexyl- cellulosa) 7 Adsorptionsmedel från beredning 8 (ligand: adenin, bärare: aminohexyh cellulosa) 8 Adsorptionsmedel från beredning 9 (ligand: akrinol, bärare: amino- hexylcellulosa 1 ' ' 0,1 0,6 0,5 0,9 4,0 1,6 Exemgel 3.

Sëmetylcytosin, bärare: karboxihexylagaros, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och kolonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 1000 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12 var koncentrationen av pyrogenen i utñlödet 1,2 ng/ml.

Exem2el'4. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 11 (ligand: histamin, bärare: hydroximetylerad-styren-divinylbensen~ sampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och kolonnen tvättades pà samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natríumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV ='12 var koncentrationen av pyrogen i v°1 K .Vfif-'u fl~ Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 10 (ligand: 10 15 20 25 30 35 40 461 5o§ 'Exémgél . 30 utflödet 4,8 ng/ml.

Exempel 5. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 12 (ligand: histamin, bärare: poröst glas, 1 g, torr form) uppslam- mades i en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natrium- kloríd (S0 ml, innehållande 100 ng Klebsiella pneumoníae, LPS per 1 ml av lösningen). När suspensionen omrördes under Z timmar och fick stå var koncentrationen av pyrogen i övervätskan 2 ng/ml.

Exempel . Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 13 (ligand: histamin, bärare: agaros, 8 ml) packades i en kolonn (innerdíameter 13 mm, längd 100 mm) och kolonnen tvättades på sam- ma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i en 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick pas- sera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12 var koncen- trationen av pyrogen i utflödet 9 ng/ml.

Exempel . Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 14 (lígand: histamin, bärare: styren-divinylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter: 13 mm, längd 100 mm) och ko- lonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Salmonella flexineri, LPS per I ml av lösningnü fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12 var koncentrationen av pyrogen i utflödet 4,6 ng/ml.

Kolonnen som användes i exempel 1 (packad med adsorp- tionsmedlet, varvid liganden var histamin och bäraren var amino- hexylagaros) tvättades i följd med 0,2-N vattenhaltig natriumhydr- oxid(16 ml), 0,5-procentig vattenhaltig lösning av natriumdeoxi- kolat (32 ml), 0,2-N vattenhaltig natriumhydroxid (160 ml), rent vatten (50 ml), 1,5-M vattenhaltig natriumklorid (250 ml) och rent vatten (100 ml) som samtliga var pyrogenfria. En 2-procentig vattenhaltig lösning av L-histidin (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick pas- sera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV ='3. I utflödet utvanns mer än 90 t L-histidin och Limulus-test pà utflödet var negativt (-). När utflödet utsattes för pyrogentest vid en dos av 10 ml/kg steg kanínens kroppstemperatur 0°C, 0,1°C respektive 0,2S°C och pyrogeniciteten av utflödet bedömdes vara negativ.

När den vattenhaltiga lösningen av L-histidin späddes direkt S gånger med vatten utan att utsättas för kolonnbehandlingen och därefter utsattes för pyrogentest vid en dos av 1 ml/kg steg kani- 10 15 20 ZS 30 35 40 *EXemEél'11. 461 505 31 nehs kroppstemperatur 1,15°C, 1,1S°C respektive 1,30°C, varvid pyrogeniciteten av lösningen bedömdes vara positiv.

Exempel 9. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En 2-procentig vattenhaltíg lös- ning av L-alanin (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolon- nen med en flödeshastighet av SV ='3. Mer än 90 % L-alanin ut- vanns i utflödet och koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0,1 ng/ml. Limulus-test på utflödet var negativt (-).

Exempel 10._ Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En vattenhaltíg lösning innehål- lande 0,08 % 6-aminopenicillansyra och 0,08 % natriumcitrat (100 ml, innehållande 100 ng Escherichía coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 3. Mer än 90 S 6-aminopenicillansyra utvanns i utflödet och Limulus-testet på utflödet var negativt (-).

Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En 0,25-procentig vattenhaltig lösning av flavin-adenin-dinukleotid (FAD) (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastíghet av SV = 3. Mer än 85 $ FAD utvanns i utflödet och Limulus-testet av utflödet var negativt ¶-). ' "Exempel'12. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En 0,5-procentig vattenhaltig lösning av cytosin.(100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1'ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV ='3. Mer än 95 $ cytosin utvanns ur utflödet och koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0 ng/ml.

Limulus-test på utflödet var negativt (-). ' Exempel 13. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades pa samma sätt som beskrivits i exempel 8. En S-procentig vattenhaltig lös- ning av glukos (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV ='3. Mer än 90 % glukos utvanns ur utflö- det och_Limülus-test på utflödet var negativt (-).

Exempel 14. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En ra L-prolínlösning som erhål- lits från ett filtrat vid L-prolinjäsníng (S0 ml, innehållande 20 % L-prolin) fick passera genom kolonnen med en flödeshastíghet 10 15 20 25 30 35 40 461 505 32 av 25 ml/h.Koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0 ng/ml och Limulus-testet på utflödet var negativt (-). Dessutom var koncen- trationen av pyrogen i ra L-prolinlösning 8,8 ng/ml och Límulus- testet därpå var positivt (++).

Exempel 15. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8. En lösning av lysozymklorid (0,5 g) i 0,005-M trisflhydrokloridbuffert (100 ml, pH 9,0) inne- hållande cirka 10 ng/ml pyrogen fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV ='3. Mer än 90 % lysozym utvanns ur ut- flödet och koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0,1 ng/ml.

När utflödet utsattes för pyrogentest vid en dos av 10 ml/kg steg kroppstemperaturen hos kaniner 0°C, 0,20°C respektive 0,20°C och utflödets pyrogenicitet bedömdes vara negativ. När vidare lysozymlösningen utsattes direkt för ett pyrogentest vid en dos av 10 ml/kg (utan att ha utsatts för kolonnbehandling) steg kaniners kroppstemperatur 1,00°C, 1,1S°C respektive 1,20°C och lösningens pyrogenicitet bedömdes vara positiv.

Exempel 16. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 2 (1ígand: histamín, bärare: aminohexylcellulosa) packades i en ko- lonn (innerdiameter 20,8 mm, längd 27 mm) och en lösning av rått urokinas (150 mg) i 0,01-M fosfatbuffert (35 ml, pH 8,0) (Limulus- test: ++) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 4. 64"! urokinas utvanns ur utflödet och Limnlus-test på ut- flödet var negativt (-).

Exempel 17. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 10 (lígand: S-metylcytosin, bärare: karboxihexylagaros) packades i en kolonn (innerdiameter 20,8 mm, längd 27 mm) och en lösning av kristallin asparaginas (116 mg) i 0,05 M vattenhaltig natriumklo- rid (20 ml) (Limnlus-test: ++).fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 4. 94 iaasparaginas utvanns ur utflödet och Limulus-test på utflödet var negativt (-).

Exempel 18. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades pa samma sätt som beskrivits i exempel 8 och en lösning av immunoglobulin G (S0 mg) i 0,01 M fosfatbuffert (S0 ml, pH 7,5) (limnlus-test: ++) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 3. 76 $ immunoglobulin G utvanns ur utflödet och Limulus-test på ut- flödet var negativt (-).

Exempel 19. Kolonnen som användes i exempel 1 tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 8 och en lösning av bovininsulin _ (100 mg) i 0,004°N klorvätesyra (S0 ml) innehållande S ng/ml av .ar 10 15 20 ” 461 505 en pyrogen fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 3. 85,6 % insulin utvanns ur utflödet och koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0,4 ng/ml. I Exempel 20. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 14 (ligand: histamín, bärare: styren-divinylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och ko- lonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. Däref- ter fick rent vatten innehållande 4 ng/ml pyrogen (1 liter, Límulus-test: ++) passera genom kolonnen med en flödeshastíghet av 100 ml/h. Koncentrationen av pyrogen i utflödet var 0,4 ng/ml och Límulus-testet i utflödet var negativt (-).

Exempel 21. Följande operation genomfördes med användning av ad- sorptionsmedlet som erhållits i beredningarna 10 och 15-21.

Varje adsorptionsmedel (8 ml) tvättades med 1,5-M vattenhal- tig natriumklorid och packades i en sterilíserad kolonn (inner- diameter 13 mm, längd 100 mm). Kolonnen tvättades i följd med 1,S°M vattenhaltig natriumklorid (250 ml), rent vatten (100 ml) och 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml) som samtliga var pyrogenfria; En lösning av en pyrogen i 0,0S~M vattenhaltíg nat- riumklorid (400 ml, innehållande 1000 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12. Xoncentrationen av pyrogen i ut- flödet uppmättes. Resultaten anges i tabell 3. 10 15 34 461 505 Tabell 3 Koncentratíon av pyrogen (ng/ml utflöde) Nr Adsorptionsmedel 1 Adsorptionsmedel från beredning 10 (ligand: S-metylcytosin, bärare; karboxihexylagaros) 5,0 2 Adsorptionsmedel från beredning 15 (ligand: histamin, bärare: aminoetylcellulosa) 4,6 3 Adsorptionsmedel från beredning 16 (ligand: histamin, bärare: aminobutylcellulosa) 0,46 4 Adsorptionsmedel från beredning 17 (ligand: histamín, bärare: aminoetylcellulosa) 0,06 5 Adsorptionsmedel från beredning 18 (ligand: histamin, bärare: aminobutylcellulosa) 0,24 6 Adsorptíonsmedel från beredning 19 (ligand; histamin, bärare: aminohexylcellulosa) 0,05 '7 Adsorptionsmedel från beredning 20 (ligand: histamin, bärare: aminooktylcellulosa) “ 0,18 8 Adsorptionsmedel från beredning 21 (ligand: histamin bärare: aminodecylcellulosa) 1,6 Exempel 22. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 23 (ligand: histamín, bärare: styren-divinylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm] och ko- lonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12, var koncentrationen av pyrogenen i utflödet 1,4 ng/ml.

"Exempel 23. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 24 (ligand: histamin, bärare: styren-divinylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och tvät- tades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escheríchia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick pas- sera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV -'12 var koncen- trationen av pyrogenen i utflödet 1,8 ng/ml. f: 10 15 20 ZS 55 461 505 ExemBe1'24. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 25 (ligand: histamin, bärare: styren-dívínylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdíameter 13 mm, längd 100 mm) och ko- lonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12 var koncentrationen av pyrogen i utflödet 1,3 ng/ml.

Exemgel 25. Varje adsorptionsmedel som erhållits i beredning 26 till 28 (8 ml) packades i en kolonn (innerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och kolonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. En lösning av en pyrogen i 0,05-M vattenhaltig natrium- klorid (400 ml, innehållande 1000 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12. Koncentrationen av pyrogenen i utflö- det uppmättes. Resultaten finns angivna i tabell 4. i'TabélI 4 Koncentration av pyrogen (ng/ml utflöde) Nr ' Adsorptionsmedel 1 Adsorptionsmedel från beredning 26 (ligand: urokansyra, bärare: aminohexylagaros) 2 Adsorptionsmedel från beredning 27 (ligand: orotinsyra; bärare: aminohexylagaros)_ 3 Adsorptionsmedel från beredning 28 Cligandzfluracil, bärare: aminohexylagàros) 11 0,02 0,15 Exemgel 26. Adsorptionsmedlet som erhållits i beredning 29 (ligand: histamin, bärare: styren-dívinylbensensampolymer, 8 ml) packades i en kolonn (innerdíameter 13 mm, längd 100 mm) och ko- lonnen tvättades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. När en lösning av en pyrogen i 0,0S*M vattenhaltig natriumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12 var koncentrationen av pyrogen i utflödet 4,9 ng/ml.

Exemgel 27. adsorptionsmedel som erhållits i beredning 31, 33 och 37 (8 ml) packades i en kolonn (ínnerdiameter 13 mm, längd 100 mm) och kolonnen tvättades på samma sätt som beskrivits Varje 461 505 36 10 15 20 i exembel 1. En lösning av en pyrogen í 0,05-M vattenhaltig nat- riumklorid (100 ml, innehållande 100 ng Escherichia coli 0128: B 12, LPS per 1 ml av lösningen) fick passera genom kolonnen med en flödeshastighet av SV = 12. Koncentrationen av pyrogen i ut- flödet uppmättes. Resultaten finns sammanställda i tabell S.

Tabell 5 Nr Adsorptionsmedel Koncentration av PYTOgGII (ng/ml utflöde) 1 Adsorptionsmedel från beredning 31 (ligand: orotinsyra, bärare: aminoetylerad~styren- -divinylbensensampolymer) 8,4 2 Adsorptíonsmedel från beredning 33 (ligand: orotinsyra, bärare: aminohexylerad-styren- -dívinylbensensampolymer) 9,9 3 Adsorptionsmedel från beredning 37 (lígand: histamin, ~ bärare: amínopropylerad-poly~ vinylalkoholl 7,6 Jämförande experiment 1 Jämförande experiment genomfördes med avseende på pyrogen- adsorptionsförmåga hos adsorptíonsmedel enligt föreliggande upp- finning (dvs adsorptionsmedel erhållna i beredningarna 1-9 och 22) och tidigare kända adsorptionsmedel (dvs polypropenpärlor beskrivna i de amerikanska patentskrifterna 3 959 128 och 4 059 512 samt Scphadex-DVS-rivanol beskriven i SE-8561320).

Varje adsorptionsmcdel (8 ml) packades i en kolonn (inre diameter 13 mm, längd 100 mm). Kolonnen tvättades i följd med 1,5 M vattenhaltig natriumklorid (250 ml), rent vatten (100 ml) och 0,05 M vattenhaltig natriumklorid (100 ml) vilka samtliga var pyrogenfria. En lösning av en pyrogen i 0,04 M vattenhaltig natríumklorid (100 ml innehållande 1000 ng Escherichia coli 0128:B 12, LPS per 1 ml av lösningen) drevs genom kolonnen med en Flödeshastighet av SV : 12. Koncentrationen av pyrogen i uflödet ,mättes.

Resultaten finns sammanställda i tabell 6. »r 37 Tabell 6 461 505 Nr Adsorptionsmedel Koncentration av pyrogen (ng/ml utflöde) (Adsorptionsmedel enligt uppfinningen) Adsorptionsmedel enligt beredning Z (ligand: histamin, bärare: aminohexylcellulosa ' Adsorptionsmedel enligt beredning 3 (ligand: histidin, bärare:-aminohexylcellulosa Adsorptionsmedel enligt beredning 4 (ligand: cytosin, bärare: aminohexylcellulosa Adsorptionsmedel enligt beredning 5 (ligand: 5-metylcytosin, bärare: aminohexylcellulosa Adsorptionsmedel enligt beredning 6 (ligand: 2-amino-4,6-dimetylpyrimidín, bärare: aminohexylcellulosa Adsorptionsmedel enligt beredning 7 (ligand: 2-aminn-4-hydroxi-6-metylpyrimidin bärare: aminohexylcellulosa) Adsorptionsmedel enligt beredning 8 (ligand: adenin bärare: aminohexylcellulosa Adsorptíonsmedel enligt beredning 9 (ligand: akrinol bärare: aninuhexylcellulosa) Adsorption§medel.enligt beredning 40 (ligand: histidin, bärare: aminnhexylagaros) 10 (Adsorptionsmedel enligt US-A-3 959 128 & 6 059 512 polypropenpärlbr* 390 11 (Adsorptíonsmedel enligt SE-B-361320) Sephadex-DVS-rivanol** 690 Anmärkning: *) Polypropenpärlor (diameter: 3 mm) Nikko Co., Ltd. (Japan) användes. all) exempel 3 i SE-B-361320. tillverkade av Sephadex-DVS~rivan0l framställes med metoden i 38 461 505 Jämförande experiment 2 Jämförande experiment med avseende på adsorptionsspecificitet ' genomfördes på adsorptionsmedel enligt föreliggande uppfinning (dvs adsorptionsmedlen erhållna i beredning 1 och 40) och ett 5 adsorptionsmedel enligt teknikens ståndpunkt (nämligen amino- hexylagaros enligt DE-A-2 319 495). 0,1 g (våt Form, 0,14 ml) av vart och ett av adsorptionsmed- len uppslammades i 2 ml Fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 0,5 % bovinserumalbumin (BSA) och suspensionen omrördes vid 10 }Û0C under 3 timmar. Efter omröringen mättes absorbansen hos ovanvätskan vid 280 nm. Därur beräknades utvinningsförhållandet för BSA.

Resultaten Finns sammanställda i tabell 7.

Tabell 7 Nr Adsorptionsmedel Utvínningsförhål- - lande av BSA (% (Adsorptionsmedel enligt uppfinningen) 9 Adsorptionsmedel enligt beredning 40 (ligand: hístidin, bärare: aminohexylagaros) 97 12 Adsorptionsmedel enligt beredning 1 (ligand: histamín, bärare: aminohexylagaraos) 96 (Adsorptionsmedel enligt DE-A-2 319 495) 13 aminohexylagaros* 70 *) Aminohexylagaros framställdes med metoden i exempel 3 i DE-A-2 319 495. m

Claims (3)

39 « 461 505 Patentkrav

1. Adsorbent, k ä n n e t e c k n a d därav, att den utgöres av en vattenelöslig bärare bunden vid en heterocyklisk förening innehållande kväve genom en grupp med formeln -CH2CH(0H)CH2- eller ~(CH2J5-, vilken vattenolösliga bärare utgöres av en polysackarid vari ett distansled med formeln NHZ ( CHZ )nNH2 , vari n är ett heltal med värdet 1-12, är infört medelst epiklorobydrin, och vilken heterocykliska förening innehållan- de kväve utgöres av histidin, histamin, urokansyra, uracil, orotsyra, cytosin, 5-metylcytosin, 2-amino-4,6-dimetylpyrimi- din, 2-amino-4-hydroxi-S-metyl-pyrimidin, adenin eller 6,Q-di- amino-2-etoxiakridin.

2. Adsorbent enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a d därav, att polysackariden utgöres av cellulosa eller agaros.

3. Användning av en adsorbent enligt krav 1 för avlägs- nande av pyrogener ur en pyrogenhaltig lösning.