JP4733936B2 - Ｒｎａ追跡方法 - Google Patents
Ｒｎａ追跡方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4733936B2 JP4733936B2 JP2004201836A JP2004201836A JP4733936B2 JP 4733936 B2 JP4733936 B2 JP 4733936B2 JP 2004201836 A JP2004201836 A JP 2004201836A JP 2004201836 A JP2004201836 A JP 2004201836A JP 4733936 B2 JP4733936 B2 JP 4733936B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- stabilizer
- complex
- compound
- aqueous solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims description 39
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 149
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 44
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 27
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 11
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 7
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N Phthalic anhydride Natural products C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N butyl 2,2-difluorocyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CCCCOC(=O)C1CC1(F)F JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 2
- -1 lithium aluminum hydride Chemical compound 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- VKJCJJYNVIYVQR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromopropyl)isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(CCCBr)C(=O)C2=C1 VKJCJJYNVIYVQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005462 imide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は、ＲＮＡ安定化剤ならびにこのＲＮＡ安定化剤を用いたＲＮＡ安定化方法および複合体安定化方法に関するものである。
ＲＮＡとは、リボース、プリン塩基またはピリミジン塩基、リン酸基からなる核酸から構成された物質であり、ＤＮＡが保存している遺伝情報に基づいて、タンパク質を生合成する役割を担っている。近年、このＲＮＡを利用して、有用タンパク質や、酵素活性を有するＲＮＡ（リボザイム）からなる医薬品など、様々な工業製品を製造することが期待されている。
しかしながら、ＲＮＡは一般に不安定な物質であるため、室温よりも１０℃高い環境に置かれただけでも、その立体構造が容易に破壊され、かつ生理活性が失われてしまうという欠点があった。そこで、従来、ＲＮＡの安定性を高めるために、ＲＮＡにマグネシウムイオンなどの金属イオンを結合させる方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。
Ｒ．Ｈａｃｈ， 「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９７５，５５，ｐ．２７１−２８４
Ｒ．Ｈａｃｈ， 「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９７５，５５，ｐ．２７１−２８４
しかしながら、特許文献１にかかるＲＮＡ安定化方法にあっては、一般に、生体内において、金属イオンの量が常に一定に保たれているため、生体内におけるＲＮＡの安定化が困難であるという問題があった。
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、
生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させるＲＮＡ安定化剤およびＲＮＡ安定化方法を提供することを目的とする。
また、生体内外に関わらず、ＲＮＡとＲＮＡとの結合能を有する分子とからなる複合体を安定化させる複合体安定化方法を提供することを目的とする。
さらに、ＲＮＡを生体内において追跡可能なＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法を提供することを目的とする。
生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させるＲＮＡ安定化剤およびＲＮＡ安定化方法を提供することを目的とする。
また、生体内外に関わらず、ＲＮＡとＲＮＡとの結合能を有する分子とからなる複合体を安定化させる複合体安定化方法を提供することを目的とする。
さらに、ＲＮＡを生体内において追跡可能なＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法を提供することを目的とする。
かかる課題を解決するため、
請求項１にかかる発明は、４級ポリアミンを構成する元素の一部が安定同位体元素により置換されているＲＮＡトレーサーをＲＮＡに結合させて、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞に導入し、この生体細胞を生体組織又は個体（但し、人間を除く）の中に導入し、このＲＮＡトレーサーを検出することにより、当該ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡するＲＮＡ追跡方法である。
請求項１にかかる発明は、４級ポリアミンを構成する元素の一部が安定同位体元素により置換されているＲＮＡトレーサーをＲＮＡに結合させて、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞に導入し、この生体細胞を生体組織又は個体（但し、人間を除く）の中に導入し、このＲＮＡトレーサーを検出することにより、当該ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡するＲＮＡ追跡方法である。
本発明のＲＮＡ安定化剤およびＲＮＡ安定化方法によれば、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。
また、本発明の複合体安定化方法によれば、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡを含む複合体の立体構造を安定化させることができる。
また、本発明のＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法によれば、ＲＮＡトレーサーがＲＮＡと安定に結合し、かつ安定同位体が容易に検出可能であるため、生体内におけるＲＮＡの位置を正確に追跡することができる。
本発明にかかるＲＮＡ安定化剤の一実施形態を、以下に説明する。
本発明のＲＮＡ安定化剤は４級ポリアミンから構成されている。
この４級ポリアミンは、下記式（１）に示すように、一端にアミノ基を有する４つのアミノアルキル基が窒素原子に結合した化合物である。この４級ポリアミンにおいて、Ｒ１〜Ｒ４はアルキル鎖を示している。このアルキル鎖の炭素原子数は特に限定されない。また、Ｒ１〜Ｒ４の炭素原子数は同一であっても、異なっていてもよい。その中でも、アルキル鎖の炭素原子数が３〜５であるアミノアルキル基を４つ有する４級ポリアミンが、ＲＮＡ安定化剤として好ましい。
この４級ポリアミンは、下記式（１）に示すように、一端にアミノ基を有する４つのアミノアルキル基が窒素原子に結合した化合物である。この４級ポリアミンにおいて、Ｒ１〜Ｒ４はアルキル鎖を示している。このアルキル鎖の炭素原子数は特に限定されない。また、Ｒ１〜Ｒ４の炭素原子数は同一であっても、異なっていてもよい。その中でも、アルキル鎖の炭素原子数が３〜５であるアミノアルキル基を４つ有する４級ポリアミンが、ＲＮＡ安定化剤として好ましい。
４級ポリアミンは、その４つのアミノ基が水溶液中においてカチオンとなるため、プラスに帯電している。一方、ＲＮＡは、そのリン酸基が水溶液中においてアニオンとなるため、マイナスに帯電している。従って、４級ポリアミンとＲＮＡとは、水溶液中において、イオン結合によって良好に結合することができる。
一方、４級ポリアミンを含むポリアミンは、元来、生体細胞内に多く存在しており、生体に対して無害な物質として知られている。特に、４級ポリアミンは好熱菌内に多く存在している物質である。従って、４級ポリアミンは、生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能である。
上記４級ポリアミンの製法の一例を、図１を用いて説明する。
図１において、４級ポリアミンの製法の合成経路が示されている。なお、４級ポリアミンの製法の合成経路は、図１の合成経路に限られることなく、他の合成経路であってもよい。
図１において、４級ポリアミンの製法の合成経路が示されている。なお、４級ポリアミンの製法の合成経路は、図１の合成経路に限られることなく、他の合成経路であってもよい。
先ず、合成経路を概説する。
化合物（１）、（４）は、４級ポリアミン（７）の出発物質である。これら化合物（１）、（４）は市販されており、当業者が容易に入手することができるものである。なお、化合物（１）、（４）におけるＲ１、Ｒ２はアルキル鎖を示している。
化合物（１）からは、（ａ）工程を行うことにより、化合物（２）が得られる。得られた化合物（２）からは、（ｂ）工程を行うことにより、化合物（３）が得られる。
一方、化合物（４）からは、（ｃ）工程を行うことにより、化合物（５）が得られる。この化合物（５）と上記化合物（３）を用いて、（ｄ）工程を行うことにより、化合物（６）が得られる。最後に、得られた化合物（６）からは、（ｅ）工程を行うことにより、４級ポリアミンである化合物（７）が得られる。
化合物（１）、（４）は、４級ポリアミン（７）の出発物質である。これら化合物（１）、（４）は市販されており、当業者が容易に入手することができるものである。なお、化合物（１）、（４）におけるＲ１、Ｒ２はアルキル鎖を示している。
化合物（１）からは、（ａ）工程を行うことにより、化合物（２）が得られる。得られた化合物（２）からは、（ｂ）工程を行うことにより、化合物（３）が得られる。
一方、化合物（４）からは、（ｃ）工程を行うことにより、化合物（５）が得られる。この化合物（５）と上記化合物（３）を用いて、（ｄ）工程を行うことにより、化合物（６）が得られる。最後に、得られた化合物（６）からは、（ｅ）工程を行うことにより、４級ポリアミンである化合物（７）が得られる。
次に、（ａ）〜（ｅ）工程を順に説明する。
（ａ）工程は、化合物（１）のアミド基をアミノ基に還元する工程である。具体的には、化合物（１）をリチウムアルミニウムヒドリドと反応させることにより、還元する。溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル，アセトニトリルなどが用いられるが、その中でもテトラヒドロフランが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり，反応時間は２０〜２４時間である。なお、この反応は無水条件で行われる。
（ａ）工程は、化合物（１）のアミド基をアミノ基に還元する工程である。具体的には、化合物（１）をリチウムアルミニウムヒドリドと反応させることにより、還元する。溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル，アセトニトリルなどが用いられるが、その中でもテトラヒドロフランが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり，反応時間は２０〜２４時間である。なお、この反応は無水条件で行われる。
（ｂ）工程は、化合物（２）のアミノ基をイミド基にして保護する工程である。具体的には、化合物（２）を酢酸ナトリウムの存在下において無水フタル酸と反応させることにより、脱水縮合させる。反応温度は１５０〜２５０℃であり、反応時間は１．５〜２．５時間である。なお、この反応は無水条件で行われる。
反応後、粗生成物は、塩基性水溶液によりｐＨ８〜１０に調製されるとともに抽出された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルなどの溶媒を単独または混合したものが用いられる。
反応後、粗生成物は、塩基性水溶液によりｐＨ８〜１０に調製されるとともに抽出された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルなどの溶媒を単独または混合したものが用いられる。
（ｃ）工程は、化合物（４）の臭素をヨウ素に置換する工程である。具体的には、化合物（４）をヨウ化ナトリウムと反応させることにより、臭素をヨウ素に置換する。溶媒としては、アセトン、ジオキサン、エタノールなどが用いられるが、その中でもアセトンが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２〜３時間である。
（ｄ）工程は、化合物（３）を４級アミンにする工程である。具体的には、化合物（３）を化合物（５）と反応させることにより、４級アミンを合成する。溶媒としては、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアルデヒドなどが用いられるが、その中でもジオキサンが好ましい。また，反応温度は１８０〜２３０℃であり、反応時間は２〜４時間である。なお、この反応は窒素またはアルゴン雰囲気下、無水条件で行われる。
（ｅ）工程は、化合物（６）のアミノ基を保護している無水フタル酸由来の保護基を脱離させる工程である。具体的には、化合物（６）をヒドラジンと反応させることにより、保護基を脱離させる。溶媒としては、エタノール、メタノール、ジオキサンなどが用いられるが、その中でもエタノールが好ましい。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は１．５〜２．５時間である。
反応後、粗生成物は、エタノール、メタノール、ジオキサンなどにより濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、４〜６Ｎの塩酸が用いられる。
以上の製法により、４級ポリアミンが製造される。
反応後、粗生成物は、エタノール、メタノール、ジオキサンなどにより濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製される。なお、展開溶媒としては、４〜６Ｎの塩酸が用いられる。
以上の製法により、４級ポリアミンが製造される。
本発明のＲＮＡ安定化方法は、上記ＲＮＡ安定化剤を用いたものである。以下、ＲＮＡ安定化方法について説明する。
本発明のＲＮＡ安定化方法においては、対象となるＲＮＡは特に限定されず、例えば、ウイルス、ファージ、細菌などの原核細胞または真核細胞などから、公知の方法により採取されたものであってもよい。また、化学合成されたＲＮＡであってもよい。
このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液におけるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり、好ましくは６．８〜７．５である。
このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液におけるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり、好ましくは６．８〜７．５である。
このＲＮＡ水溶液に、ＲＮＡ安定化剤を添加する。添加方法としては、ＲＮＡ安定化剤を直接添加する方法、または、ＲＮＡ水溶液と同様の溶媒を用いてＲＮＡ安定化剤の水溶液を調整した上で、このＲＮＡ安定化剤水溶液を滴下する方法などが用いられる。ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンは水に対して易溶であるため、どの方法であっても、ＲＮＡ水溶液に良好に溶解することができる。なお、ＲＮＡ安定化剤を溶解する際には、シェーカーなどを用いてもよい。
添加するＲＮＡ安定化剤の量は、ＲＮＡに対して０．１〜２０当量である。ＲＮＡ安定化剤の量がこの範囲内であるとき、ＲＮＡ安定化剤は全てのＲＮＡと十分に結合することができる。ＲＮＡ安定化剤と結合したＲＮＡにあっては、変性温度が上昇する。すなわち、ＲＮＡの安定性が向上する。
以下、ＲＮＡ安定化の作用機構について説明する。
一般に、ＲＮＡおよびそのリン酸基は、水溶液中において複雑な立体構造を形成している。一方、本発明のＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンにあっては、柔軟なアルキル鎖により、４つのアミノ基が空間的に異なる位置にあり、また、異なる方向を向くことが可能である。従って、このような４級ポリアミンは、複雑な立体構造を形成しているＲＮＡのリン酸基に巧みに結合して、リン酸基の電荷を中和することができる。電荷が中和されたＲＮＡはリン酸基同士のクーロン反発がなくなるため、その立体構造の安定性が向上する。
一般に、ＲＮＡおよびそのリン酸基は、水溶液中において複雑な立体構造を形成している。一方、本発明のＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンにあっては、柔軟なアルキル鎖により、４つのアミノ基が空間的に異なる位置にあり、また、異なる方向を向くことが可能である。従って、このような４級ポリアミンは、複雑な立体構造を形成しているＲＮＡのリン酸基に巧みに結合して、リン酸基の電荷を中和することができる。電荷が中和されたＲＮＡはリン酸基同士のクーロン反発がなくなるため、その立体構造の安定性が向上する。
このように、４級ポリアミンから構成されるＲＮＡ安定化剤を用いることにより、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。また、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、ＲＮＡの立体構造を安定化させることができる。
一般に、ＲＮＡは複数のＲＮＡ同士で結合して複合体（多量体）を形成することができる。また、ＲＮＡは特定のタンパク質と結合して、リボソームなどの複合体を形成することができる。このようなＲＮＡを含む複合体に関しても、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いることにより、安定化を行うことができる。
以下、ＲＮＡ安定化剤を用いた複合体安定化方法について説明する。
以下、ＲＮＡ安定化剤を用いた複合体安定化方法について説明する。
複合体は、ＲＮＡとＲＮＡとの結合能を有する分子とから構成されている。
ＲＮＡとしては、特に限定されず、あらゆる種類のＲＮＡであってもよい。ＲＮＡとの結合能を有する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などが挙げられる。複合体のの結合様式は、水素結合が一般的であるが、これに限らず、疎水結合、ジスルフィド結合などであってもよい。
ＲＮＡとしては、特に限定されず、あらゆる種類のＲＮＡであってもよい。ＲＮＡとの結合能を有する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などが挙げられる。複合体のの結合様式は、水素結合が一般的であるが、これに限らず、疎水結合、ジスルフィド結合などであってもよい。
上記複合体を用いて複合体水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。この複合体水溶液における複合体の濃度は任意であり、複合体が溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、複合体水溶液のｐＨは６〜８であり，好ましくは６．８〜７．５である。
この複合体水溶液に、ＲＮＡ安定化剤を添加する。添加方法は上述したＲＮＡ安定化方法のものと同様であるので、その説明を省略する。
添加するＲＮＡ安定化剤の量は、複合体に対して０．１〜２０当量である。ＲＮＡ安定化剤の量がこの範囲内であるとき、ＲＮＡ安定化剤は全ての複合体と十分に結合することができる。ＲＮＡ安定化剤と結合した複合体にあっては、変性温度が上昇する。すなわち、ＲＮＡの安定性が向上する。
添加するＲＮＡ安定化剤の量は、複合体に対して０．１〜２０当量である。ＲＮＡ安定化剤の量がこの範囲内であるとき、ＲＮＡ安定化剤は全ての複合体と十分に結合することができる。ＲＮＡ安定化剤と結合した複合体にあっては、変性温度が上昇する。すなわち、ＲＮＡの安定性が向上する。
以下、複合体安定化の作用機構について説明する。
複合体安定化の作用機構としては、上述したＲＮＡ安定化と同様のものが挙げられる。すなわち、４級ポリアミンがＲＮＡのリン酸基の電荷を中和することにより、クーロン反発を低減させる作用機構である。これにより、複合体は、ＲＮＡ単量体の変性による立体構造の崩壊を防止することができる。
また、他の作用機構として、４級ポリアミンによる複合体の結合の補強が挙げられる。すなわち、４級ポリアミンのそれぞれのアミノ基が、複合体の結合部位において、複数の分子にまたがって結合することにより、“つなぎ”分子としての作用を及ぼす作用機構である。これにより、複合体は、それぞれのユニット同士の結合を強化することができるため、その立体構造の安定性が向上する。
複合体安定化の作用機構としては、上述したＲＮＡ安定化と同様のものが挙げられる。すなわち、４級ポリアミンがＲＮＡのリン酸基の電荷を中和することにより、クーロン反発を低減させる作用機構である。これにより、複合体は、ＲＮＡ単量体の変性による立体構造の崩壊を防止することができる。
また、他の作用機構として、４級ポリアミンによる複合体の結合の補強が挙げられる。すなわち、４級ポリアミンのそれぞれのアミノ基が、複合体の結合部位において、複数の分子にまたがって結合することにより、“つなぎ”分子としての作用を及ぼす作用機構である。これにより、複合体は、それぞれのユニット同士の結合を強化することができるため、その立体構造の安定性が向上する。
このように、４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を用いることにより、複合体の立体構造を安定化することができる。また、４級ポリアミンが生体に対して無害であるとともに、生体内において多量に保持されることが可能であるため、生体内外に関わらず、複合体の立体構造を安定化させることができる。
本発明のＲＮＡトレーサーは上記ＲＮＡ安定化剤を用いたものである。以下、ＲＮＡトレーサーについて説明する。
ＲＮＡトレーサーは、ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンを、安定同位体元素により標識することにより得られる。安定同位体元素としては、１３Ｃ，１５Ｎなどが用いられる。これら安定同位体元素を、４級ポリアミンを構成する１２Ｃ，１４Ｎなどと置換することにより、標識が行われる。
ＲＮＡトレーサーの検出方法としては、質量分析法、赤外分析法、核磁気共鳴法などが挙げられる。その中でも、生体内において検出が可能である核磁気共鳴法が好適である。安定同位体元素は、上記検出方法によって特異なスペクトルデータを示すことが知られており、これにより、容易に検出される。
ＲＮＡトレーサーの検出方法としては、質量分析法、赤外分析法、核磁気共鳴法などが挙げられる。その中でも、生体内において検出が可能である核磁気共鳴法が好適である。安定同位体元素は、上記検出方法によって特異なスペクトルデータを示すことが知られており、これにより、容易に検出される。
以下、ＲＮＡトレーサーを用いたＲＮＡ追跡方法について説明する。
本発明のＲＮＡ追跡方法において、対象となるＲＮＡは特に限定されず、生体内における機能や役割を調査したいＲＮＡが用いられる。このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液に置けるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり，好ましくは６．８〜７．５である。
本発明のＲＮＡ追跡方法において、対象となるＲＮＡは特に限定されず、生体内における機能や役割を調査したいＲＮＡが用いられる。このようなＲＮＡを用いてＲＮＡ水溶液を調製する。溶媒としては、純水、またはトリス塩酸緩衝溶液やトリス酢酸緩衝溶液などの緩衝溶液が挙げられる。このＲＮＡ水溶液に置けるＲＮＡの濃度は任意であり、ＲＮＡが溶解する限りにおいて自由に設定できる。なお、ＲＮＡ水溶液のｐＨは６〜８であり，好ましくは６．８〜７．５である。
この複合体水溶液に、ＲＮＡトレーサーを添加する。添加方法は上述したＲＮＡ安定化方法のものと同様であるので、ここでは省略する。ついで、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを、生体細胞中に導入する。導入方法としては、電気パルスを用いたエレクトロポレーション法、ガラス針で直接注入するマイクロインジェクション法、リポソームに包含させて導入する方法などが挙げられる。これらの方法を用いて、ＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞内に導入する。
また、上記生体細胞を生体組織、個体の中に導入してもよい。ただし、個体には人間は含まれない。導入方法としては、皮下注射、腹腔内投与などが挙げられる。
また、上記生体細胞を生体組織、個体の中に導入してもよい。ただし、個体には人間は含まれない。導入方法としては、皮下注射、腹腔内投与などが挙げられる。
次に、生体細胞内に導入されたＲＮＡトレーサーを、上記検出方法により検出する。これにより、ＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡが細胞内に存在しているかどうかを追跡することができる。また、ＲＮＡトレーサーを生体組織や個体内に導入した場合には、ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡することが可能となる。
これらの知見は、ＲＮＡの機能や役割を明らかにする上で、重要な基礎データとなる。
これらの知見は、ＲＮＡの機能や役割を明らかにする上で、重要な基礎データとなる。
このように、本発明のＲＮＡトレーサーおよびＲＮＡ追跡方法を用いると、ＲＮＡトレーサーがＲＮＡと安定に結合し、かつ安定同位体が容易に検出可能であるため、生体内におけるＲＮＡの位置を正確に追跡することができる。
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、下記実施例に何ら制限されるものではない。
［実施例１］
実施例１では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いてＲＮＡの安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。
実施例１では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いてＲＮＡの安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。
先ず、ＲＮＡ安定化剤を構成する４級ポリアミンを製造した。合成経路としては化２に示したものを用いた。出発物質である化合物（１）としては、Ｒ１の炭素数が２である３，３，３−ニトリロトリスイソプロピオンアミド（東京化成工業株式会社）を用いた。また、出発物質である化合物（４）としては、Ｒ２の炭素数が３であるＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いた。
以下、（ａ）〜（ｅ）工程における操作を説明する。
以下、（ａ）〜（ｅ）工程における操作を説明する。
（ａ）工程においては、化合物（１）をリチウムアルミニウムヒドリドと反応させることにより、アミド基をアミノ基に還元した。溶媒としては、テトラヒドロフランを用いた。また、反応温度は１００℃、反応時間は２４時間であった。なお、この反応は無水条件で行われた。
（ｂ）工程においては、化合物（２）を酢酸ナトリウムの存在下において、無水フタル酸と反応させることにより、脱水縮合させた。また、反応温度は２００℃、反応時間は２時間であった。なお、この反応は無水条件で行われた。
反応後、粗生成物を、塩基性水溶液によりｐＨ８に調製するとともに抽出した後、カラムクロマトグラフィーにより精製した。なお、展開溶媒としては、酢酸エチルとヘキサンを等量ずつ混合した混合溶媒を用いた。
反応後、粗生成物を、塩基性水溶液によりｐＨ８に調製するとともに抽出した後、カラムクロマトグラフィーにより精製した。なお、展開溶媒としては、酢酸エチルとヘキサンを等量ずつ混合した混合溶媒を用いた。
（ｃ）工程においては、化合物（４）をヨウ化ナトリウムと反応させることにより、臭素をヨウ素に置換した。溶媒としては、アセトンを用いた。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２時間であった。
（ｄ）工程においては、化合物（３）を化合物（５）と反応させることにより、４級アミンを合成した。溶媒としては、ジオキサンを用いた。また、反応温度は２００℃であり、反応時間は３時間であった。なお、この反応は窒素またはアルゴン雰囲気下、無水条件で行われた。
（ｅ）工程においては、化合物（６）をヒドラジンと反応させることにより、無水フタル酸由来の保護基を脱離させた。溶媒としては、エタノールを用いた。また、反応温度は用いた溶媒が還流する温度であり、反応時間は２時間であった。
反応後、粗生成物は、エタノールと水の混合溶媒により濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製された。なお、展開溶媒は６Ｎの塩酸であった。
以上
の製法により、４級ポリアミンを得た。なお、４級ポリアミンの同定は、核磁気共鳴法、質量分析法により行われた。
反応後、粗生成物は、エタノールと水の混合溶媒により濾過、洗浄された後、カラムクロマトグラフィーにより精製された。なお、展開溶媒は６Ｎの塩酸であった。
以上
の製法により、４級ポリアミンを得た。なお、４級ポリアミンの同定は、核磁気共鳴法、質量分析法により行われた。
次に、４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を用いて、ＲＮＡの安定化を行った。
ＲＮＡとしては、酵母フェニルアラニン転移ＲＮＡ（シグマアルドリッチジャパン株式会社、配列番号１参照）を用いた。また、このＲＮＡの変性温度は４７．８℃である。
上記ＲＮＡを５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて、ＲＮＡ水溶液を調製した。このＲＮＡ水溶液の濃度は６０μＭであった。
一方、本実施で合成した４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を上記緩衝溶液に溶解させて、ＲＮＡ安定化剤水溶液を調製した。このＲＮＡ安定化剤水溶液の濃度は１ｍＭであった。
ついで、上記ＲＮＡ水溶液に、上記ＲＮＡ安定化剤水溶液を滴定して、混合水溶液を調製した。この混合水溶液における最終的なＲＮＡ安定化剤の濃度は０．３ｍＭであった。
ＲＮＡとしては、酵母フェニルアラニン転移ＲＮＡ（シグマアルドリッチジャパン株式会社、配列番号１参照）を用いた。また、このＲＮＡの変性温度は４７．８℃である。
上記ＲＮＡを５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて、ＲＮＡ水溶液を調製した。このＲＮＡ水溶液の濃度は６０μＭであった。
一方、本実施で合成した４級ポリアミンからなるＲＮＡ安定化剤を上記緩衝溶液に溶解させて、ＲＮＡ安定化剤水溶液を調製した。このＲＮＡ安定化剤水溶液の濃度は１ｍＭであった。
ついで、上記ＲＮＡ水溶液に、上記ＲＮＡ安定化剤水溶液を滴定して、混合水溶液を調製した。この混合水溶液における最終的なＲＮＡ安定化剤の濃度は０．３ｍＭであった。
得られた混合水溶液の吸光度を、温度変化に対して測定した。その結果、温度が７６．７℃になった時、吸光度が急激に増加することが明らかとなった。この吸光度の増加は、ＲＮＡが変性したことを示している。従って、ＲＮＡ安定化剤を添加することによって、ＲＮＡの変性温度が上昇することが明らかとなった。
［実施例２］
実施例２では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いて複合体の安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。
実施例２では、本発明のＲＮＡ安定化剤を用いて複合体の安定化を試みた。以下に、実施手順を説明する。
ＲＮＡ安定化剤としては、実施例１で作製した４級ポリアミンを用いた。複合体としては、２量体を形成するＲＮＡ３５（配列番号２参照）を用いた。このＲＮＡ３５は３５塩基の核酸塩基からなっており、その塩基配列は後述する通りである。このＲＮＡ３５により形成される２量体の解離温度は，０．８μＭの濃度において３７℃である。ＲＮＡ安定化剤と複合体の混合水溶液の調製方法は、実施例１と同様であったので、その説明を省略する。
得られた混合水溶液の吸光度を、温度変化に対して測定した。その結果、温度が６５℃を超えた時、吸光度が増加を始めることが明らかとなった。この吸光度の増加は、２量体が解離したことを示している。従って、ＲＮＡ安定化剤を添加することによって、複合体の解離温度が上昇することが明らかとなった。
本発明のＲＮＡ安定化剤は、ＲＮＡおよび複合体を安定化する有効成分として有用であるほか、これ以外のＲＮＡウィルス阻害剤やＲＮＡ医薬品の効果増強剤として使用できる。
Claims (1)
- ４級ポリアミンを構成する元素の一部が安定同位体元素により置換されているＲＮＡトレーサーをＲＮＡに結合させて、このＲＮＡトレーサーが結合したＲＮＡを生体細胞に導入し、この生体細胞を生体組織又は個体（但し、人間を除く）の中に導入し、このＲＮＡトレーサーを検出することにより、当該ＲＮＡが生体のどの部位に移動したかを追跡するＲＮＡ追跡方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004201836A JP4733936B2 (ja) | 2004-07-08 | 2004-07-08 | Ｒｎａ追跡方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004201836A JP4733936B2 (ja) | 2004-07-08 | 2004-07-08 | Ｒｎａ追跡方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006020575A JP2006020575A (ja) | 2006-01-26 |
| JP4733936B2 true JP4733936B2 (ja) | 2011-07-27 |
Family
ID=35794287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004201836A Expired - Lifetime JP4733936B2 (ja) | 2004-07-08 | 2004-07-08 | Ｒｎａ追跡方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4733936B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011162326A1 (ja) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | 株式会社日本遺伝子研究所 | Ｒｎａ鎖の保存溶液 |
| JP6345408B2 (ja) * | 2013-10-24 | 2018-06-20 | 学校法人関西学院 | 動植物用成長促進剤 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192199A (ja) * | 1991-09-23 | 1993-08-03 | Pfizer Inc | 細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法 |
| JPH06502770A (ja) * | 1991-09-12 | 1994-03-31 | シーダーズ−サイナイ・メディカル・センター | Ｃ型肝炎ウイルスｒｎａの直接検出法 |
| JPH09313192A (ja) * | 1996-03-25 | 1997-12-09 | Ngk Insulators Ltd | ＤＮＡ 及びｍ−ＲＮＡ 標識プローブを用いた微生物の測定方法 |
| JP2001228145A (ja) * | 1999-12-07 | 2001-08-24 | Sagami Chem Res Center | ドコサヘキサエン酸欠乏の検査薬 |
| JP2002518026A (ja) * | 1998-06-19 | 2002-06-25 | エムティー テクノロジー， インコーポレイテッド | Ｓｒｐｒｎａを用いる非ウイルス生物の検出 |
| JP2002332295A (ja) * | 2000-05-15 | 2002-11-22 | Ajinomoto Co Inc | 酵素によるタンパク質の同位体標識法 |
| WO2004029254A1 (ja) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | 安定同位体標識タンパク質の製造方法 |
-
2004
- 2004-07-08 JP JP2004201836A patent/JP4733936B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06502770A (ja) * | 1991-09-12 | 1994-03-31 | シーダーズ−サイナイ・メディカル・センター | Ｃ型肝炎ウイルスｒｎａの直接検出法 |
| JPH05192199A (ja) * | 1991-09-23 | 1993-08-03 | Pfizer Inc | 細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法 |
| JPH09313192A (ja) * | 1996-03-25 | 1997-12-09 | Ngk Insulators Ltd | ＤＮＡ 及びｍ−ＲＮＡ 標識プローブを用いた微生物の測定方法 |
| JP2002518026A (ja) * | 1998-06-19 | 2002-06-25 | エムティー テクノロジー， インコーポレイテッド | Ｓｒｐｒｎａを用いる非ウイルス生物の検出 |
| JP2001228145A (ja) * | 1999-12-07 | 2001-08-24 | Sagami Chem Res Center | ドコサヘキサエン酸欠乏の検査薬 |
| JP2002332295A (ja) * | 2000-05-15 | 2002-11-22 | Ajinomoto Co Inc | 酵素によるタンパク質の同位体標識法 |
| WO2004029254A1 (ja) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | 安定同位体標識タンパク質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006020575A (ja) | 2006-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kupryushkin et al. | Phosphoryl guanidines: a new type of nucleic acid analogues | |
| Leung et al. | The mechanism of peptidyl transfer catalysis by the ribosome | |
| Moyle et al. | Method for the synthesis of mono-ADP-ribose conjugated peptides | |
| Shelke et al. | Site-directed nitroxide spin labeling of biopolymers | |
| SE461505B (sv) | Adsorbent bestaaende av en vattenoloeslig baerare bunden till en heterocyklisk foerening med ett distansaemne samt dess anvaendning foer att avlaegsna pyrogener ur en pyrogenhaltig loesning | |
| Weinstein et al. | Novel procedures for derivatization of ribosomes for crystallographic studies | |
| Han et al. | Sequence specific recognition of ligand-DNA complexes studied by NMR | |
| Huang et al. | The α-helical peptide nucleic acid concept: Merger of peptide secondary structure and codified nucleic acid recognition | |
| Edupuganti et al. | New strategy for the synthesis of 3′, 5′‐bifunctionalized oligonucleotide conjugates through sequential formation of chemoselective oxime bonds | |
| Zou et al. | Regulable DNA–Protein interactions in vitro and vivo at epigenetic DNA marks | |
| Nixon et al. | Affinity labeling of Escherichia coli B deoxyribonucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase | |
| JP4733936B2 (ja) | Ｒｎａ追跡方法 | |
| Schulze Wischeler et al. | Stereo‐and Regioselective Azide/Alkyne Cycloadditions in Carbonic Anhydrase II via Tethering, Monitored by Crystallography and Mass Spectrometry | |
| Pokharel et al. | Matching active site and substrate structures for an RNA editing reaction | |
| Baumruck et al. | Native chemical ligation of highly hydrophobic peptides in ionic liquid-containing media | |
| US7351531B2 (en) | Molecules capable of binding to telomere and the like and method with the use of the same | |
| Ban et al. | Nucleobase–guanidiniocarbonyl-pyrrole conjugates as novel fluorimetric sensors for single stranded RNA | |
| Flett et al. | Click chemistry generated model DNA–peptide heteroconjugates as tools for mass spectrometry | |
| Razkin et al. | Enhanced Complexity and Catalytic Efficiency in the Hydrolysis of Phosphate Diesters by Rationally Designed Helix‐Loop‐Helix Motifs | |
| Lundblad | Chemical modification of biological polymers | |
| Yang et al. | Bioconjugation of Oligodeoxynucleotides Carrying 1, 4-Dicarbonyl Groups via Reductive Amination with Lysine Residues | |
| Kimura et al. | Evolution of ZnII–macrocyclic polyamines to biological probes and supramolecular assembly | |
| Rasmussen et al. | Dynamic combinatorial chemistry | |
| Gupta et al. | Biological Importance of Arginine: Roles in Structure, Disorder, and Functionality of Peptides and Proteins | |
| Markham et al. | A Mild and Modular Approach to the Total Synthesis of Desferrioxamine B |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070601 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100518 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100705 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100727 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101015 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20101027 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110315 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110405 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110425 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140428 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4733936 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140428 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |