JP2577237B2 - 樹脂担体からパイロジェンを除去する方法 - Google Patents
樹脂担体からパイロジェンを除去する方法Info
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- JP2577237B2 JP2577237B2 JP63023966A JP2396688A JP2577237B2 JP 2577237 B2 JP2577237 B2 JP 2577237B2 JP 63023966 A JP63023966 A JP 63023966A JP 2396688 A JP2396688 A JP 2396688A JP 2577237 B2 JP2577237 B2 JP 2577237B2
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- pyrogen
- endotoxin
- resin carrier
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬品の分離、精製に用いるイオン交換ク
ロマトグラフィー用或いは疎水クロマトグラフィー用の
樹脂担体からパイロジェンを除去する方法に関する。
ロマトグラフィー用或いは疎水クロマトグラフィー用の
樹脂担体からパイロジェンを除去する方法に関する。
〔従来の技術〕 パイロジェン（Pyrogen）は静脈内注射により恒温動
物に対して発熱反応を引き起こす発熱性物質の総称であ
り、このパイロジェンに汚染された血液、輸液及び注射
剤を投与すると微量で発熱反応が起こり、悪寒、発熱、
戦慄等の現象が見られる。またパイロジェンについて
は、血管作用、骨髄反応、細胞傷害作用、抗腫瘍作用、
致死作用、内毒素過敏症等多くの生体反応も報告されて
いる。
物に対して発熱反応を引き起こす発熱性物質の総称であ
り、このパイロジェンに汚染された血液、輸液及び注射
剤を投与すると微量で発熱反応が起こり、悪寒、発熱、
戦慄等の現象が見られる。またパイロジェンについて
は、血管作用、骨髄反応、細胞傷害作用、抗腫瘍作用、
致死作用、内毒素過敏症等多くの生体反応も報告されて
いる。
細胞の内毒素であるエンドトキシン（Endotoxin）は
最も発熱に関与する物質であり、これがパイロジェンと
考えてよく、特に大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、緑膿
菌、霊菌等、グラム陰性菌の細胞壁リン脂質多糖体（Li
popolysaccharide:LPS）の発熱性が強力である。
最も発熱に関与する物質であり、これがパイロジェンと
考えてよく、特に大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、緑膿
菌、霊菌等、グラム陰性菌の細胞壁リン脂質多糖体（Li
popolysaccharide:LPS）の発熱性が強力である。
そのために注射剤製造等の医薬分野では、パイロジェ
ン汚染を防ぐことが重要な問題となっている。
ン汚染を防ぐことが重要な問題となっている。
従来、パイロジェンの除去方法としては、加熱による
方法、吸着による方法、イオン交換による方法、逆浸透
又は限外濾過による方法、γ線又は超音波による方法、
酸又はアルカリによる方法、酸化還元による方法、化学
的修飾による方法等が提案されている。
方法、吸着による方法、イオン交換による方法、逆浸透
又は限外濾過による方法、γ線又は超音波による方法、
酸又はアルカリによる方法、酸化還元による方法、化学
的修飾による方法等が提案されている。
一方、医薬品等を製造する際には、有効物質の分離、
精製が不可欠であり、イオン交換クロマトグラフィーや
疎水クロマトグラフィー等の手法が用いられている。
精製が不可欠であり、イオン交換クロマトグラフィーや
疎水クロマトグラフィー等の手法が用いられている。
ところが、パイロジェンの主成分であるリポポリサッ
カライドは、高分子素材からなる膜表面や微細構造中に
吸着されやすい性質を持っており、従って、分離、精製
に用いる樹脂等にパイロジェンが吸着され、蓄積され
る。この吸着、蓄積されたパイロジェンは、従来の酸や
アルカリによる洗浄では十分に溶出除去出来ず、再度こ
の樹脂を用いてクロマトグラフィーを行う際に、有効物
質と共にパイロジェンが溶出されると言う問題があっ
た。
カライドは、高分子素材からなる膜表面や微細構造中に
吸着されやすい性質を持っており、従って、分離、精製
に用いる樹脂等にパイロジェンが吸着され、蓄積され
る。この吸着、蓄積されたパイロジェンは、従来の酸や
アルカリによる洗浄では十分に溶出除去出来ず、再度こ
の樹脂を用いてクロマトグラフィーを行う際に、有効物
質と共にパイロジェンが溶出されると言う問題があっ
た。
本発明は、医薬品等を製造する際に有効成分の分離、
精製に用いるイオン交換クロマトグラフィー或いは疎水
クロマトグラフィーに用いる樹脂担体から、パイロジェ
ンを有効に除去する方法を提供することを目的とする。
精製に用いるイオン交換クロマトグラフィー或いは疎水
クロマトグラフィーに用いる樹脂担体から、パイロジェ
ンを有効に除去する方法を提供することを目的とする。
本発明は、溶出液の塩濃度を段階溶出で変化させるこ
とにより、イオン交換クロマトグラフィー或いは疎水ク
ロマトグラフィーに用いる樹脂担体からパイロジェンを
除去するものである。
とにより、イオン交換クロマトグラフィー或いは疎水ク
ロマトグラフィーに用いる樹脂担体からパイロジェンを
除去するものである。
本発明は、樹脂担体を通常の酸又はアルカリ、アルコ
ール等による洗浄を行った後にも、残存するパイロジェ
ンを除去することができる。
ール等による洗浄を行った後にも、残存するパイロジェ
ンを除去することができる。
塩としては、例えばイオン交換クロマトグラフィーに
は、食塩等が、疎水クロマトグラフィーには、硫酸アン
モニウム等が用いられる。溶出液の塩濃度は樹脂担体の
種類やこれに含まれるパイロジェンの濃度によって変え
ることができ、特に本発明では一段階または二段階以上
の段階溶出で変化させる。溶出液の塩濃度は、各段階溶
出において繰り返し同じ濃度で、または繰り返し変化さ
せた異なる濃度、或いは漸進的に減少させた濃度で使用
できる。
は、食塩等が、疎水クロマトグラフィーには、硫酸アン
モニウム等が用いられる。溶出液の塩濃度は樹脂担体の
種類やこれに含まれるパイロジェンの濃度によって変え
ることができ、特に本発明では一段階または二段階以上
の段階溶出で変化させる。溶出液の塩濃度は、各段階溶
出において繰り返し同じ濃度で、または繰り返し変化さ
せた異なる濃度、或いは漸進的に減少させた濃度で使用
できる。
本発明で用いられるイオン交換クロマトグラフィーの
イオン交換樹脂及び疎水クロマトグラフィーの樹脂担体
は、特に限定されるものではない。
イオン交換樹脂及び疎水クロマトグラフィーの樹脂担体
は、特に限定されるものではない。
本発明によると、医薬品等を製造する際に有効成分の
分離、精製に用いるイオン交換クロマトグラフィー用或
いは疎水クロマトグラフィー用樹脂担体から通常のアル
カリ及びアルコールによる洗浄で許容量以下に除くこと
のできないパイロジェンを効果的に除去できる。特に、
イオン交換クロマトグラフィー或いは疎水クロマトグラ
フィーを行う際に、パイロジェンと同様の挙動を示す物
質の分離、精製工程で、パイロジェン汚染を極めて低く
抑えることができる。
分離、精製に用いるイオン交換クロマトグラフィー用或
いは疎水クロマトグラフィー用樹脂担体から通常のアル
カリ及びアルコールによる洗浄で許容量以下に除くこと
のできないパイロジェンを効果的に除去できる。特に、
イオン交換クロマトグラフィー或いは疎水クロマトグラ
フィーを行う際に、パイロジェンと同様の挙動を示す物
質の分離、精製工程で、パイロジェン汚染を極めて低く
抑えることができる。
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。
樹脂担体の前処理 イオン交換クロマトグラフィー用及び疎水クロマトグ
ラフィー用の樹脂担体それぞれに、0.2N水酸化ナトリウ
ム−95％エチルアルコールを加えて攪拌した後、静置し
て上清液を捨て、再度0.2N水酸化ナトリウム−95％エチ
ルアルコールを加えて一夜放置した。翌日、上清液を捨
て、パイロジェン・フリー水を加えて攪拌した後、静置
して上清液を捨て、再度パイロジェン・フリー水を加え
て攪拌した後、静置して上清液を捨てた。この操作を数
回繰り返して、水酸化ナトリウム−エチルアルコールを
パイロジェン・フリー水に置換した。
ラフィー用の樹脂担体それぞれに、0.2N水酸化ナトリウ
ム−95％エチルアルコールを加えて攪拌した後、静置し
て上清液を捨て、再度0.2N水酸化ナトリウム−95％エチ
ルアルコールを加えて一夜放置した。翌日、上清液を捨
て、パイロジェン・フリー水を加えて攪拌した後、静置
して上清液を捨て、再度パイロジェン・フリー水を加え
て攪拌した後、静置して上清液を捨てた。この操作を数
回繰り返して、水酸化ナトリウム−エチルアルコールを
パイロジェン・フリー水に置換した。
一方樹脂担体を充填する各カラムについても、パイロ
ジェン・フリー水を流して洗浄した後、上記の通り前処
理した樹脂をカラムに充填した。そして、パイロジェン
・フリー水を一夜（約10時間）通液したものを用いた。
ジェン・フリー水を流して洗浄した後、上記の通り前処
理した樹脂をカラムに充填した。そして、パイロジェン
・フリー水を一夜（約10時間）通液したものを用いた。
実施例１ 上記の通り前処理した樹脂担体（三菱化成工業社製、
SEPABEADS FPシリーズ、FP-DA 13）5,400mlを充填した
イオン交換クロマトグラフィー用カラム（φ25cm×11c
m）に、20℃にて流速1cm/分の割合で、1M食塩水を通液
後、パイロジェン・フリー水を通液することを順次３回
繰り返した（第１図参照）。
SEPABEADS FPシリーズ、FP-DA 13）5,400mlを充填した
イオン交換クロマトグラフィー用カラム（φ25cm×11c
m）に、20℃にて流速1cm/分の割合で、1M食塩水を通液
後、パイロジェン・フリー水を通液することを順次３回
繰り返した（第１図参照）。
各回の食塩水を通液後の溶出液中のエンドトキシンの
量は、一回目の操作により溶出除去した量が40.1μｇ、
二回目の操作により溶出除去した量が7.48μｇ、三回目
の操作により溶出除去した量が2.20μｇで、合計49.78
μｇのエンドトキシンを溶出除去できた。
量は、一回目の操作により溶出除去した量が40.1μｇ、
二回目の操作により溶出除去した量が7.48μｇ、三回目
の操作により溶出除去した量が2.20μｇで、合計49.78
μｇのエンドトキシンを溶出除去できた。
このエンドトキシンを溶出除去したカラムを用いて、
エンドトキシン630μｇを含む核酸系の物質を精製した
ところ、目的画分に含まれるエンドトキシンの量は、60
μｇ（除去率90.5％）であった。
エンドトキシン630μｇを含む核酸系の物質を精製した
ところ、目的画分に含まれるエンドトキシンの量は、60
μｇ（除去率90.5％）であった。
一方、前処理のみを行い、エンドトキシンの溶出除去
を行わないカラムを用いて、同様にエンドトキシン630
μｇを含む核酸系の物質を精製したところ、目的画分に
含まれるエンドトキシンの量は、110μｇ（除去率82.5
％）であった。
を行わないカラムを用いて、同様にエンドトキシン630
μｇを含む核酸系の物質を精製したところ、目的画分に
含まれるエンドトキシンの量は、110μｇ（除去率82.5
％）であった。
この結果から、前処理を行った後、エンドトキシンを
溶出除去することにより、目的物質へのエンドトキシン
混入量を低く抑えることができたといえる。
溶出除去することにより、目的物質へのエンドトキシン
混入量を低く抑えることができたといえる。
実施例２ 上記の通り前処理した樹脂担体（三菱化成工業社製、
SEPABEADS FPシリーズ、FP-PH 12）3,700mlを充填した
疎水クロマトグラフィー用カラム（φ11.3cm×37cm）
に、2.3M硫酸アンモニウム水溶液で平衡化した後、20℃
にて流速1cm/分の割合で、パイロジェン・フリー水を通
液後、2.3M硫酸アンモニウム水溶液を通液することを順
次３回繰り返した（第２図参照）。
SEPABEADS FPシリーズ、FP-PH 12）3,700mlを充填した
疎水クロマトグラフィー用カラム（φ11.3cm×37cm）
に、2.3M硫酸アンモニウム水溶液で平衡化した後、20℃
にて流速1cm/分の割合で、パイロジェン・フリー水を通
液後、2.3M硫酸アンモニウム水溶液を通液することを順
次３回繰り返した（第２図参照）。
各回のパイロジェン・フリー水を通液後の溶出液中の
エンドトキシンの量は、一回目の操作により溶出除去し
た量が1,689.4ng、二回目の操作により溶出除去した量
が595.3ng、三回目の操作により溶出除去した量が378.2
ngで、合計2,662.9ngのエンドトキシンを溶出除去でき
た。
エンドトキシンの量は、一回目の操作により溶出除去し
た量が1,689.4ng、二回目の操作により溶出除去した量
が595.3ng、三回目の操作により溶出除去した量が378.2
ngで、合計2,662.9ngのエンドトキシンを溶出除去でき
た。
このエンドトキシンを溶出除去したカラムを用いて、
エンドトキシン9,450ngを含む核酸系の物質を精製した
ところ、目的画分に含まれるエンドトキシンの量は、99
0ng（除去率89.5％）であった。
エンドトキシン9,450ngを含む核酸系の物質を精製した
ところ、目的画分に含まれるエンドトキシンの量は、99
0ng（除去率89.5％）であった。
一方、前処理のみを行い、エンドトキシンの溶出除去
を行わないカラムを用いて、同様にエンドトキシン9,45
0ngを含む核酸系の物質を精製したところ、目的画分に
含まれるエンドトキシンの量は、2,780ng（除去率70.6
％）であった。
を行わないカラムを用いて、同様にエンドトキシン9,45
0ngを含む核酸系の物質を精製したところ、目的画分に
含まれるエンドトキシンの量は、2,780ng（除去率70.6
％）であった。
この結果から、前処理を行った後、エンドトキシンを
溶出除去することにより、目的物質へのエンドトキシン
混入量を低く抑えることができたといえる。
溶出除去することにより、目的物質へのエンドトキシン
混入量を低く抑えることができたといえる。
第１図は、本発明実施例１による食塩水の濃度変化によ
るエンドトキシン除去量を示すグラフ、 第２図は、本発明実施例２による硫酸アンモニウム水溶
液の濃度変化によるエンドトキシン除去量を示すグラフ
である。
るエンドトキシン除去量を示すグラフ、 第２図は、本発明実施例２による硫酸アンモニウム水溶
液の濃度変化によるエンドトキシン除去量を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川島 利行 栃木県下都賀郡石橋町石橋58―２番地 松原マンション (72)発明者 熊沢 栄太郎 栃木県小山市天神町１丁目４番25号 一 徳ハイツ２―612号 (56)参考文献 特開 昭58−73371（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−183712（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】イオン交換クロマトグラフィー用の樹脂担
体を洗浄するに際し、溶出液の塩濃度を段階溶出で変化
させることを特徴とするイオン交換クロマトグラフィー
用の樹脂担体からパイロジェンを除去する方法。 - 【請求項２】疎水クロマトグラフィー用の樹脂担体を洗
浄するに際し、溶出液の塩濃度を段階溶出で変化させる
ことを特徴とする疎水クロマトグラフィー用の樹脂担体
からパイロジェンを除去する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63023966A JP2577237B2 (ja) | 1988-02-05 | 1988-02-05 | 樹脂担体からパイロジェンを除去する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63023966A JP2577237B2 (ja) | 1988-02-05 | 1988-02-05 | 樹脂担体からパイロジェンを除去する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01203046A JPH01203046A (ja) | 1989-08-15 |
| JP2577237B2 true JP2577237B2 (ja) | 1997-01-29 |
Family
ID=12125293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63023966A Expired - Lifetime JP2577237B2 (ja) | 1988-02-05 | 1988-02-05 | 樹脂担体からパイロジェンを除去する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2577237B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526225A (ja) * | 2003-06-24 | 2007-09-13 | ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン | 不燃性溶媒によるタンパク質−リポ多糖類複合体からのリポ多糖類の除去 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4381239A (en) * | 1981-02-10 | 1983-04-26 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Method for reducing the pyrogen content of or removing pyrogens from substances contaminated therewith |
| JPS5873371A (ja) * | 1981-10-27 | 1983-05-02 | 旭化成株式会社 | パイロジェン汚染膜の洗浄方法 |
-
1988
- 1988-02-05 JP JP63023966A patent/JP2577237B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01203046A (ja) | 1989-08-15 |
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