BR122020006914B1 - Anticorpo de domínio único anti-tnf-alfa e seu uso, métodos in vitro para medir os níveis do referido anticorpo e para diagnosticar um distúrbio mediado por um componente intracelular, polipeptídeo isolado e composição compreendendo o referido anticorpo ou polipeptídeo isolado - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece composições e métodos para tratar uma condição ou uma doença sem o uso de sequências de direcionamento exógenas ou composições químicas. A presente invenção refere-se a anticorpos de domínio único (sdAbs), proteínas e polipeptídeos compreendendo os sdAbs que são direcionados contra componentes intracelulares que causam uma condição ou doença. A invenção também inclui ácidos nucleicos que codificam os sdAbs, proteínas e polipeptídeos, e composições compreendendo os sdAbs. A invenção inclui o uso das composições, sdAbs, e ácidos nucleicos que codificam os sdAbs para fins profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS CORRELACIONADOS

[001] Este pedido de patente internacional reivindica o benefício do pedido de patente provisório US n° 62/067,908, depositado em 23 de outubro de 2014, pedido de patente provisório US n° 62/148,656, depositado em 16 de abril de 2015, pedido de patente provisório US n° 62/188,353 depositado em 2 de julho de 2015, e pedido de patente provisório US n° 62/210,795, depositado em 27 de agosto de 2015, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência na íntegra.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma listagem de sequências em formato eletrônico. A listagem de sequências é fornecida como um arquivo intitulado "Sequence_Listing_STP25.txt", criado em 30 de setembro de 2015, modificado pela última vez em 22 de outubro de 2015, o qual tem 83.000 bytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da listagem de sequências estão aqui incorporadas na íntegra, a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O uso de anticorpos de domínio único (sdAbs) como proteínas de ligação a antígeno único ou como um domínio de ligação a antígeno em uma proteína ou um polipeptídeo maior oferece várias vantagens significativas em relação ao uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpo convencionais. As vantagens dos sdAbs incluem: apenas um único domínio é necessário para se ligar a um antígeno com um grau alto de afinidade e com alta seletividade; os sdAbs podem ser expressos a partir de um único gene e não exigem modificação pós-traducional; os sdAbs são altamente estáveis ao calor, ao pH, a proteases e a outros agentes ou condições desnaturantes; os sdAbs são baratos para serem preparados; e os sdAbs podem acessar alvos e epítopos não acessíveis aos anticorpos convencionais.

[004] Há várias doenças ou condições, como câncer, que são causadas por componentes intracelulares ou transmembrana aberrantes como nucleotídeos e proteínas. A eliminação dos componentes aberrantes pode ser usada para evitar ou tratar as doenças ou condições. Há vários compostos farmacológicos disponíveis para tratamento, mas os compostos podem ser ineficazes, não aplicáveis ou tóxicos para as células não afetadas.

[005] Outros tratamentos incluem o uso de proteínas ou agentes terapêuticos que contêm uma sequência de direcionamento exógena para que o agente terapêutico possa ser reconhecido pelos receptores na membrana celular, permitindo ao agente terapêutico cruzar a membrana celular e entrar na célula. Quando o agente terapêutico está dentro da célula, ele pode interagir com o componente alvo de modo a tratar a doença. Entretanto, o uso de uma sequência de direcionamento exógena pode limitar o tipo celular que é direcionado pelo agente terapêutico, e acrescenta o agente terapêutico ao custo de produção.

[006] Pelos motivos anteriores, existe uma necessidade por composições e métodos para tratar ou evitar uma doença que não dependam de sequências de direcionamento exógenas ou de composições químicas para entrarem na célula, e que sejam eficazes no direcionamento apenas das células afetadas no corpo.

[007] A presente invenção refere-se a anticorpos de domínio único (sdAbs), a proteínas e polipeptídeos compreendendo os sdAbs. Os sdAbs são direcionados contra componentes intracelulares que causam uma condição ou uma doença. A invenção também inclui ácidos nucleicos que codificam os sdAbs, proteínas e polipeptídeos, e composições compreendendo os sdAbs. A invenção inclui o uso das composições, dos sdAbs, das proteínas ou dos polipeptídeos para fins profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico. A invenção também inclui o uso de anticorpos monoclonais direcionados contra os sdAbs da invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Uma modalidade da invenção é um anticorpo de domínio único (sdAb) direcionado contra um componente intracelular. O componente intracelular pode ser, por exemplo, uma proteína, um ácido nucleico, um lipídio, um carboidrato, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, TNF-alfa e KRAS.

[009] Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um sdAb anti-STAT3. Opcionalmente, o sdAb anti-STAT3 compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou na SEQ ID NO:4.

[0010] Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos que codifica um sdAb anti-STAT, como, por exemplo, o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO:3 ou na SEQ ID NO:4.

[0011] Em ainda outra modalidade, a invenção é direcionada a uma célula hospedeira, e a célula hospedeira expressa a sequência de aminoácidos do sdAb como, por exemplo, o aminoácido apresentado na SEQ ID NO:3 ou na SEQ ID NO:4.

[0012] Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um sdAb ou um polipeptídeo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, o sdAb compreende um sdAb anti-STAT3 que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4, e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0013] Uma outra modalidade da invenção é um método para diagnosticar um distúrbio mediado por STAT3 em um indivíduo, o método compreendendo as etapas de a) colocar uma amostra biológica em contato com o sdAb, ou um polipeptídeo; b) determinar a quantidade de STAT3 na amostra biológica; e c) comparar a quantidade determinada na etapa (b) com um padrão, uma diferença na quantidade indicando a presença do distúrbio.

[0014] Uma outra modalidade da invenção é um método para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio, ou prevenir a recorrência de uma doença mediada por STAT3, ou para uso no tratamento de câncer, ou doenças causadas por proliferação celular anormal, compreendendo a administração de um sdAb anti-STAT3, ou um polipeptídeo, a um indivíduo que precisa do mesmo. Opcionalmente, o sdAb compreende um sdAb anti-STAT3 que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0015] Uma modalidade da invenção é um sdAb anti-TNF-alfa. Opcionalmente, o sdAb anti-TNF-alfa compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7. A invenção compreende também um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7.

[0016] Uma outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que expressa a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7.

[0017] Em uma outra modalidade, a invenção também é uma composição farmacêutica que compreende um sdAb ou um polipeptídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, o sdAb compreende um sdAb anti-TNF-alfa que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7.

[0018] Uma outra modalidade da invenção é um método para diagnosticar um distúrbio mediado por TNF-alfa em um indivíduo, o método compreendendo as etapas de a) colocar uma amostra biológica em contato com um sdAb ou um polipeptídeo; b) determinar a quantidade de TNF alfa na amostra biológica; e c) comparar a quantidade determinada na etapa (b) com um padrão, a diferença na quantidade indicando a presença do distúrbio.

[0019] Em uma modalidade, a invenção descreve um método de prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio ou a recorrência de uma doença ou distúrbio mediado por TNF-alfa, ou para uso no tratamento de câncer, ou doenças causadas pela proliferação celular anormal, compreendendo administrar um sdAb anti-TNF-alfa, ou um polipeptídeo, a um mamífero que precisa do mesmo. Opcionalmente, o sdAb anti-TNF-alfa compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7.

[0020] Uma modalidade da invenção é um sdAb anti-KRAS. Opcionalmente, o sdAb anti-KRAS compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3 ou na SEQ ID NO:2. Em um aspecto, a invenção compreende um polipeptídeo isolado, sendo que o polipeptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2. Em um outro aspecto, a invenção compreende uma célula hospedeira que expressa a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

[0021] Uma outra modalidade da invenção é uma composição farmacêutica, que compreende um sdAb ou um polipeptídeo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, o sdAb compreende um sdAb anti-KRAS que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

[0022] Uma modalidade adicional da invenção é um método para diagnosticar um distúrbio mediado por KRAS em um indivíduo, o método compreendendo as etapas de a) colocar uma amostra biológica em contato com o sdAb, ou um polipeptídeo; b) determinar a quantidade de KRAS na amostra biológica; e c) comparar a quantidade determinada na etapa (b) com um padrão, uma diferença na quantidade indicando a presença do distúrbio. Opcionalmente, o sdAb compreende um sdAb anti-KRAS que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

[0023] A invenção compreende também um método para tratar uma doença com o uso de um sdAb anti-KRAS, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um sdAb anti-KRAS a um indivíduo que precisa do mesmo.

[0024] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio, ou a recorrência de uma doença ou distúrbio mediado por KRAS, ou para uso no tratamento de câncer, ou doenças causadas por proliferação celular anormal, compreendendo a administração de um sdAb anti-KRAS, ou um polipeptídeo, a um indivíduo que precisa do mesmo. Opcionalmente, o sdAb anti-KRAS compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 e o polipeptídeo compreende um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

[0025] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para administração do sdAb da invenção, o método compreendendo a administração intravenosa, administração intramuscular, administração oral, administração por via retal, administração intraocular, administração enteral, administração parenteral, administração subcutânea, administração transdérmica, administrado como colírios, administrado como aspersão nasal, administrada por inalação ou nebulização, administração tópica, e administrado como um fármaco implantável.

[0026] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para tratar uma doença, prevenir uma doença ou prevenir a recorrência de uma doença com o uso do sdAb da invenção em combinação com um ou mais compostos. Opcionalmente, o um ou mais compostos é um inibidor traducional.

[0027] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para medir os níveis de um sdAb, o método compreendendo as etapas de a) gerar um anticorpo monoclonal de camundongo direcionado contra um ou mais domínios do sdAb; b) executar um imunoensaio para determinar a quantidade de sdAb em um indivíduo; e c) quantificar a quantidade de sdAb no indivíduo.

[0028] Essas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção serão mais bem compreendidas em relação à descrição apresentada a seguir, bem como às reivindicações e aos desenhos em anexo, em que: A Figura 1 é um mapa esquemático do vetor de expressão de sdAb anti- STAT3 VHH13, pTT21-stt VHH13; A Figura 2 é um mapa esquemático do vetor de expressão de sdAb anti- STAT3 VHH14, pTT21-stt VHH14; A Figura 3 retrata os resultados de um ensaio de imunoprecipitação com o uso de VHH13 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) e VHH14 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:4); A Figura 4 retrata os resultados de um ensaio de imunoprecipitação com o uso do VHH13 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3); A Figura 5 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti- STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231, administrado a 0,5 mg/kg/dia; A Figura 6 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti- STAT3 (SEQ. ID NO. 3) no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231 em doses na faixa de 1 mg/kg duas vezes ao dia a 2 mg/kg duas vezes ao dia ou 2mg/kg/dia; A Figura 7 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti- STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231, administrado a 0,5mg/kg/duas vezes ao dia; A Figura 8 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti- STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo xenoenxerto de DU145, administrado a 5mg/kg/duas vezes ao dia; A Figura 9 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti- STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo xenoenxerto de PANC-1, administrado a 5mg/kg/duas vezes ao dia; A Figura 10 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de MCF-7, administrado a 1mg/kg/três vezes ao dia; A Figura 11 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de BT-474, administrado a 1 mg/kg/três vezes ao dia; A Figura 12 ilustra a citotoxicidade de TNF-alfa em células U937; A Figura 13 ilustra a citotoxicidade da estaurosporina em células U937; e A Figura 14 ilustra a inibição da citotoxicidade de TNF-alfa pelos sdAbs anti- TNF-alfa.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0029] Como usados aqui, os termos a seguir e as variações dos mesmos têm os significados dados abaixo, a menos que um significado diferente seja claramente intencionado pelo contexto no qual este termo é usado.

[0030] Os termos "um", "uma" e "o/a" e referentes similares usados aqui devem ser considerados para abranger tanto o singular quanto o plural a menos que seu uso no contexto indique de outro modo.

[0031] O termo "determinante antigênico" se refere ao epítopo no antígeno reconhecido pela molécula de ligação ao antígeno (como um sdAb ou um polipeptídeo da invenção) e mais particularmente, pelo sítio de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno. Os termos "determinante antigênico" e "epítopo" podem, também, ser usados de forma intercambiável. Uma sequência de aminoácidos que pode se ligar a, que tem afinidade por e/ou que tem especificidade por um determinante antigênico, epítopo, antígeno ou proteína específicos é dito ser "contra" ou "direcionado contra" o determinante antigênico, epítopo, antígeno ou proteína.

[0032] Como usados aqui, o termo "compreendem" e variações do termo, como "compreendendo" e "compreende", não são destinados a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

[0033] Contempla-se que os sdAbs, os polipeptídeos e as proteínas aqui descritas possam conter as assim chamadas substituições de aminoácido "conservativas", que podem geralmente ser descritas como substituições de aminoácido nas quais um resíduo de aminoácidos é substituído por outro resíduo de aminoácidos de estrutura química similar e que tem pouca ou essencialmente nenhuma influência sobre a função, a atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. As substituições de aminoácido conservativas são bem conhecidas na técnica. As substituições conservativas são substituições nas quais um aminoácido dentro dos seguintes grupos (a) a (e) é substituído por outro aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares pequenos: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, Glu e Gln; (c) resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d) resíduos alifáticos, não polares grandes: Met, Leu, Ile, Val e Cys; e (e) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. Outras substituições conservativas incluem: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou em His; Asp em Glu; Cys em Ser; Gln em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em Val; Leu em Ile ou em Val; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em Ile; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Val, em Ile ou em Leu.

[0034] Um "domínio" como usado aqui se refere, de modo geral, a uma região globular de uma cadeia de anticorpo, e, em particular, a uma região globular de um anticorpo de cadeia pesada, ou a um polipeptídeo que consiste essencialmente nesta região globular.

[0035] A sequência de aminoácidos e a estrutura de um sdAb é tipicamente feita de quatro regiões estruturais ou "FRs", que são chamadas de "região estrutural 1" ou "FR1"; como "região estrutural 2" ou "FR2"; como "região estrutural 3" ou "FR3"; e como "região estrutural 4" ou "FR4", respectivamente. As regiões estruturais são interrompidas por três regiões determinantes de complementaridade ou "CDRs", que são chamadas de "região determinante de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região determinante de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região determinante de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente.

[0036] Como usado aqui, o termo "sdAb humanizado" significa um sdAb que teve um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da sequência VHH de ocorrência natural substituídos por um ou mais dos resíduos de aminoácido que ocorrem na posição correspondente em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano. Isto pode ser feito por métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as FRs dos sdAbs podem ser substituídas por FRs variáveis humanas.

[0037] Como usado aqui, um ácido nucleico ou aminoácido "isolado" foi separado de ao menos um outro componente com o qual ele está geralmente associado, como sua fonte ou meio, um outro ácido nucleico, uma outra proteína/polipeptídeo, um outro componente biológico ou macromolécula ou contaminante, impureza ou componente secundário.

[0038] O termo "mamífero" é definido como um indivíduo que pertence à classe Mammalia e inclui, sem limitação, seres humanos, animais domésticos e de criação, e animais de zoológico, para fins esportivos, e de estimação, como vacas, cavalos, ovelha, cães e gatos.

[0039] Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" destina- se a incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e que retardam a absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Os veículos adequados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão no campo. Os exemplos preferenciais destes veículos ou diluentes incluem, mas não se limitam a água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose, PBS (solução salina tamponada com fosfato), e albumina sérica humana a 5%. Lipossomas, lipídios catiônicos e veículos não aquosos como óleos fixos podem também ser usados. O uso destes meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto nos casos em que quaisquer meios ou agentes convencionais são incompatíveis com um agente terapêutico, conforme aqui definido, o uso dos mesmos na composição da presente invenção é contemplado.

[0040] Um "imunoensaio quantitativo" se refere a quaisquer meios para medir uma quantidade de antígeno presente em uma amostra pelo uso de um anticorpo. Os métodos para fazer imunoensaios quantitativos incluem, mas não se limitam a ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), marcação analito- específica e ensaio de recaptura (SALRA), cromatografia líquida, espectrometria de massas, separação celular ativada por fluorescência, e similares.

[0041] O termo "solução" se refere a uma composição que compreende um solvente e um soluto e inclui soluções verdadeiras e suspensões. Exemplos de soluções incluem um sólido, um líquido ou um gás dissolvido em um líquido e particulados ou micelas suspensas em um líquido.

[0042] O termo "especificidade" se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma molécula de ligação ao antígeno específica ou uma molécula de proteína de ligação ao antígeno pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação ao antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou na avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação ao antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um sítio de ligação ao antígeno na proteína de ligação ao antígeno: quanto menor o valor de KD, mais forte a força da ligação entre um determinante antigênico e a molécula de ligação ao antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD). Conforme será evidente a alguém versado na técnica, a afinidade pode ser determinada dependendo do antígeno específico de interesse. A avidez é a medida da força da ligação entre uma molécula de ligação ao antígeno e o antígeno. A avidez está relacionada à afinidade entre um determinante antigênico e seu sítio de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno e o número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula de ligação ao antígeno. A ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada por qualquer maneira conhecida, como, por exemplo, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e ensaios competição do tipo sanduíche.

[0043] Como usado aqui, o termo "recombinante" se refere ao uso de métodos de engenharia genética (por exemplo, clonagem e amplificação) usados para produzir os sdAbs da invenção.

[0044] Um "anticorpo de domínio único", "sdAb" ou "VHH" pode ser geralmente definido como um polipeptídeo ou uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que é compreendido de quatro regiões estruturais interrompidas por três regiões determinantes de complementaridade. Isto é representado como FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4. O sdAb da invenção inclui também um polipeptídeo ou proteína que compreende a sequência de aminoácidos de sdAb. Tipicamente, os sdAbs são produzidos em camelídeos como lhamas, mas também podem ser gerados sinteticamente usando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Como usados aqui, os domínios variáveis presentes em anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural também serão chamados de "domínios VHH", de modo a distingui-los dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais, chamados de "domínios VH", e dos domínios de cadeia leve variável que estão presentes nos anticorpos de 4 cadeias convencionais, chamados de "domínios VL." "VHH" e "sdAb" são usados de forma intercambiável na presente invenção. A numeração dos resíduos de aminoácidos de um sdAb ou de um polipeptídeo é de acordo com a numeração geral para os domínios VH dados por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicação n° 91). De acordo com esta numeração, a FR1 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 1-30, a CDR1 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 31-36, a FR2 de um sdAb compreende os aminoácidos nas posições 36-49, a CDR2 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 50-65, a FR3 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 66-94, a CDR3 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 95-102, e a FR4 de um sdAb compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 103-113.

[0045] O termo "sintético" se refere à produção por síntese química ou enzimática in vitro.

[0046] O termo "alvo" como usado aqui, refere-se a qualquer componente, antígeno, ou porção que é reconhecido pelo sdAb. O termo "alvo intracelular" se refere a qualquer componente, antígeno, ou porção presente dentro de uma célula. Um "alvo transmembrana" é um componente, antígeno, ou porção que está localizado dentro da membrana celular. Um "alvo extracelular" se refere a um componente, antígeno, ou porção que está localizado fora da célula.

[0047] Uma "composição terapêutica", conforme usado aqui, significa uma substância que se destina a ter um efeito terapêutico, como composições farmacêuticas, materiais genéticos, agentes biológicos, e outras substâncias. Os materiais genéticos incluem substâncias destinadas a ter efeito terapêutico genético direto ou indireto, como vetores genéticos, elementos genéticos reguladores, elementos genéticos estruturais, DNA, RNA e similares. Os agentes biológicos incluem substâncias que são matéria viva ou derivada de matéria viva destinada a ter um efeito terapêutico.

[0048] Como usadas aqui, as expressões "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" se referem a uma quantidade que fornece um benefício terapêutico no tratamento, prevenção, ou gerenciamento de uma doença ou um sintoma evidente da doença. A quantidade terapeuticamente eficaz pode tratar uma doença ou condição, um sintoma da doença, ou uma pré-disposição a uma doença, com o propósito de curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, aprimorar, ou afetar a doença, os sintomas da doença, ou a pré-disposição à doença. A quantidade específica que é terapeuticamente eficaz pode ser prontamente determinada por um profissional médico comum e pode variar dependendo de fatores conhecidos na técnica, como, por exemplo, o tipo de doença, o histórico e a idade do paciente, o estágio da doença, e a administração de outros agentes terapêuticos.

[0049] A presente invenção refere-se a anticorpos de domínio único (sdAbs) que são direcionados contra componentes intracelulares, bem como a proteínas e polipeptídeos compreendendo os sdAbs e nucleotídeos que codificam as proteínas e os polipeptídeos. A invenção também pode se referir a sdAbs que são direcionados contra alvos ou antígenos intercelulares, transcelulares e extracelulares. A invenção também inclui ácidos nucleicos que codificam os sdAbs, proteínas e polipeptídeos, e composições que compreendem os sdAbs. A invenção inclui o uso das composições, dos sdAbs, das proteínas ou dos polipeptídeos para fins profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico.

[0050] Os sdAbs têm várias características estruturais e propriedades funcionais que tornam os sdAbs altamente vantajosos para uso como domínios de ligação ao antígeno ou proteínas funcionais. Os sdAbs se ligam funcionalmente a um antígeno na ausência de um domínio variável da cadeia leve, e podem funcionar como uma unidade, domínio ou proteína estrutural de ligação ao antígeno única, relativamente pequena e funcional. Isto distingue os sdAbs dos domínios de anticorpos convencionais, que por si só não funcionam como uma proteína ou domínio de ligação ao antígeno, mas precisam ser combinados com fragmentos de anticorpo convencionais como fragmentos Fab ou fragmento de ScFv's de modo a se ligar a um antígeno.

[0051] Os sdAbs podem ser obtidos com o uso de métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método para obter sdAbs inclui (a) imunizar um camelídeo com um ou mais antígenos, (b) isolar os linfócitos periféricos do camelídeo imunizado obtendo o RNA total e sintetizar os cDNAs correspondentes, (c) construir uma biblioteca de fragmentos de cDNA que codificam os domínios VHH, (d) transcrever os cDNAs que codificam o domínio VHH obtidos na etapa (c) em mRNA com o uso de PCR, converter o mRNA para o formato de apresentação em ribossomo, e selecionar o domínio VHH por apresentação em ribossomo, e (e) expressar o domínio VHH em um vetor adequado e, opcionalmente purificar o domínio VHH expresso.

[0052] Outro método de obter os sdAbs da invenção é preparando-se um ácido nucleico que codifica um sdAb com o uso de técnicas para síntese ácido nucleico, seguido de expressão do ácido nucleico in vivo ou in vitro. Adicionalmente, o sdAb, os polipeptídeos e as proteínas da invenção podem ser preparados com o uso de técnicas sintéticas ou semi-sintéticas para preparar proteínas, polipeptídeos ou outras sequências de aminoácidos.

[0053] Os sdAbs da invenção irão geralmente se ligar a todos os análogos de ocorrência natural ou sintéticos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do alvo, ou ao menos aos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do alvo que contêm um ou mais determinantes antigênicos ou epítopos que são essencialmente iguais ao determinante antigênico ou epítopo ao qual os sdAbs da invenção se ligam no alvo de tipo selvagem. Os sdAbs da invenção podem se ligar a estes análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos com uma afinidade e/ou especificidade que é igual, ou que é maior ou menor que a afinidade e a especificidade com a qual os sdAbs da invenção se ligam ao alvo de tipo selvagem. Também é contemplado dentro do escopo da invenção que os sdAbs da invenção se ligam a alguns análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do alvo, mas não a outros. Além disso, o sdAb da invenção pode ser humanizado, e pode ser monovalente ou multivalente, e/ou multiespecífico. Adicionalmente, os sdAbs da invenção podem se ligar à forma fosforilada da proteína-alvo bem como à forma não fosforilada da proteína-alvo. Os sdAbs podem ser ligados a outras moléculas como albumina ou outras macromoléculas.

[0054] Além disso, está dentro do escopo da invenção que os sdAbs são multivalentes, isto é, o sdAb pode ter duas ou mais proteínas ou polipeptídeos que são direcionados contra dois ou mais diferentes epítopos do alvo. Em tal sdAb multivalente, a proteína ou o polipeptídeo pode ser direcionado, por exemplo, contra os mesmos epítopos, epítopos substancialmente equivalentes ou epítopos diferentes. Os diferentes epítopos podem estar situados no mesmo alvo ou poderiam estar em dois ou mais alvos diferentes.

[0055] Também é contemplado que a sequência de um ou mais sdAbs da invenção pode ser conectada ou unida com uma ou mais sequências ligantes. O ligante pode ser, por exemplo, uma sequência de proteína que contém uma combinação de serinas, glicinas e alaninas.

[0056] Também está dentro do escopo da invenção usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos e/ou derivados dos sdAbs da invenção, contanto que estes sejam adequados para os usos descritos.

[0057] Já que os sdAbs da invenção são principalmente destinados para uso terapêutico e/ou diagnóstico, eles são direcionados contra alvos de mamífero, de preferência, humanos. Entretanto, é possível que os sdAbs aqui descritos façam reação cruzada com alvos de outras espécies, por exemplo, com alvos de uma ou mais outras espécies de primatas ou outros animais (por exemplo, camundongo, rato, coelho, porco ou cachorro), e, em particular, em modelos animais para doenças e distúrbios associados à doença associada aos alvos.

[0058] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica um sdAb da invenção. Tal ácido nucleico pode estar, por exemplo, sob a forma de um construto genético.

[0059] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um hospedeiro ou célula hospedeira que expressa ou é capaz de expressar um sdAb da invenção, e/ou que contém um ácido nucleico que codifica um sdAb da invenção. As sequências dos sdAbs podem ser usadas para serem inseridas no genoma de qualquer organismo para criar um organismo geneticamente modificado (GMO). Os Exemplos incluem, mas não são limitados a plantas, bactérias, vírus e animais.

[0060] A invenção refere-se adicionalmente a métodos para preparar ou gerar os sdAbs, ácidos nucleicos que codificam os sdAbs, células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar estes sdAbs, produtos e composições contendo os sdAbs da invenção.

[0061] A invenção refere-se adicionalmente a aplicações e uso do sdAb, aos ácidos nucleicos que codificam os sdAbs, células hospedeiras, produtos e composições aqui descritas. Esse tipo de produto ou composição pode, por exemplo, ser uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma doença, ou um produto ou composição para usar diagnóstico. Os sdAbs podem ser usados em uma variedade ensaios, por exemplo, ensaios ELISA e ensaios de espectrometria de massa para medir os níveis séricos e teciduais dos sdAbs.

[0062] Em um outro aspecto, um ácido nucleico que codifica um ou mais sdAb da invenção pode ser inserido no genoma de um organismo para tratar ou evitar doenças.

[0063] A presente invenção refere-se, de modo geral, a sdAbs, bem como a proteínas ou polipeptídeos que compreendem ou que consistem essencialmente em um ou mais destes sdAbs, que podem ser usados para fins profiláticos, terapêuticos e/ou de diagnóstico.

[0064] Os métodos e as composições detalhadas na presente invenção podem ser usados para tratar as doenças aqui descritas, e podem ser usados com qualquer dosagem e/ou formulação aqui descrita ou conhecida de outro modo, bem como com qualquer via de administração aqui descrita ou conhecida de outro modo do elemento versado na técnica.

[0065] Os sdAbs da invenção, em particular, o VHH anti-STAT3, o VHH anti-KRAS, e o VHH anti-TNF-alfa da presente invenção, podem ser usados para o tratamento e a prevenção de doenças malignas incluindo, mas não se limitando a: mieloma múltiplo, leucemias (dependente de HTLV-1, eritroleucemia, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (CML), e leucemia de linfócitos grandes granulares (LGL), linfomas (Burkitt/relacionado ao EBV, micose fungoide, linfoma de células T cutâneo, linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de células anaplásicas grandes (ALCL), cânceres de mama, cânceres de mama triplo negativos, cânceres de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres de ovário, cânceres de pulmão, cânceres pancreáticos, cânceres de próstata, sarcomas, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, cânceres hepatocelulares, glioma, neuroblastoma, astrocitoma, cânceres colorretais, tumores de Wilm, cânceres renais, cânceres de bexiga, cânceres endometriais, cânceres cervicais, cânceres de esôfago, cânceres de célula escamosa cutânea, cânceres de células basais e quaisquer cânceres metastáticos. Os sdAbs podem ser usados em pacientes com câncer para ajudar a evitar ou reduzir a perda de peso ou caquexia causada pelo câncer.

[0066] O sdAb, em particular, os sdAbs anti-STAT3 e anti-TNF-alfa da presente invenção também podem ser usados para o tratamento e a prevenção de doenças como por exemplo, mas não se limitando a: doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, doença de Crohn, colite induzida por bactérias, asma, escleroderma, lúpus, encefalomielite, arterite, vasculite, glomerulonefrite, uveíte, uveoretinite, esclerose múltipla), doença renal policística, doenças dermatológicas (por exemplo, psoríase, alopecia areata, dermatite atópica, queloides/cicatrizes hipertróficas, lipoma, doença de Padget, e ceratose actínica), hidradenite supurativa, transplante (por exemplo, órgão sólido, medula óssea, mão, face, membros e qualquer parte do corpo), distrofia muscular e perda de massa muscular associada a cânceres e ao envelhecimento, endometriose, degeneração macular, degeneração da retina, derrame, epilepsia, lesões traumáticas cerebrais e da coluna vertebral, hipertensão, hipertrofia cardíaca, doença de Alzheimer, hipertensão arterial pulmonar, diabetes mellitus do tipo 2, e espondilite anquilosante. Adicionalmente, os sdAbs podem direcionar doenças orfãs. Exemplos destas doenças órfãs raras incluem, mas não se limitam a cânceres de mama triplo negativos, cânceres pancreáticos, LMA (leucemia mielóide aguda), cânceres de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo, e cânceres quimiorresistentes.

[0067] As infecções virais podem ser tratadas pelo direcionamento de proteínas virais intracelulares em células infectadas. As proteínas virais, como transcriptase reversa de HIV, podem bloquear o ciclo de vida. O sdAb da invenção também pode ter como alvo proteínas virais intracelulares como VP24 de Ebola e assim, bloquear a capacidade de o Ebola desligar a resposta imunológica antiviral do hospedeiro. Os sdAbs da invenção podem ser usados tendo como alvo doenças quando há uma superexpressão de uma molécula intracelular. A doença de Huntington pode ser tratada com sdAbs.

[0068] Os sdAbs da invenção podem ser usados com um ou mais compostos. Por exemplo, o sdAb da invenção pode ser usado com inibidores de JAK/STAT como, por exemplo, curcumina, resveratrol, cucurbitacina A, B, E, I, Q, flavopiridol, desoxitetrangomicina, derivados de ciclopentenona, lactona de N- acil-homoserina, derivados de indirrubina, meisoindigo, tirfostinas, compostos contendo platina (por exemplo, IS3-295), peptídeomiméticos, oligonucleotídeos antissenso, S3I-201, derivados de tripeptídeo de fosfotirosina, inibidores de protease de HIV (e.g., nelfinavir, indinavir, saquinavir, & ritornavir), JSI-124, XpYL, Ac-pYLPQTV-NH2, ISS 610, CJ-1383, pirimetamina, metformina, atiprimode, S3I-M2001, STX-0119; derivado de N-[2-(1,3,4-oxadiazolila)]-4 quinolinacarboxamida, S3I-1757, LY5; 5,8-dioxo-6(piridin-3-ilamino)-5,8,-di- hidro-naftaleno-1-sulfonamida, withacinstin, Stattic, STA-21, LLL-3, LLL12, XZH- 5, SF-1066, SF-1087, 17o, criptotanchinona, FLL32, FLL62, C188-9, BP-1108 e BP- 1075, galielalactona, JQ1, 5, 15 DPP, WP1066, niclosamida, SD1008, nifuroxazida, criptotanchinona, BBI quinona, e fosfato de ruxolitnibe. O um ou mais compostos podem aumentar a resposta terapêutica e aumentar a eficácia do sdAb da invenção. Além disso, a eficácia do sdAb pode ser aumentada pela combinação do mesmo com peptídeos, peptídeomiméticos, e outros fármacos, como, por exemplo, mas não se limitando a, cimetidina, atorvastatina, celecoxibe, metformina e cimetidina. Além disso, os sdAbs anti-STAT3 podem converter cânceres radio resistentes em cânceres radio sensíveis no que diz respeito à radioterapia.

[0069] Também é contemplado que um ou mais sdAbs da invenção podem ser combinados, ou os sdAbs da invenção podem ser combinados com outros sdAbs.

[0070] Contempla-se que certos sdAbs da invenção podem cruzar a membrana celular e entrar na célula sem o auxílio de sequências de proteínas de direcionamento adicionais no sdAb, e sem o auxílio de compostos exógenos que direcionam o sdAb a se ligar aos receptores de superfície celular e cruzar a membrana celular.

[0071] Após cruzar a membrana celular, estes sdAbs podem ter como alvo moléculas ou antígenos transmembrana ou intracelulares. Estes alvos intracelulares ou transmembrana podem ser, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos, proteínas mutadas, proteínas virais e príons. Os alvos do sdAb podem funcionar como enzimas, proteínas estruturais da célula, porções intracelulares de moléculas da membrana celular, moléculas dentro das membranas de organelas, qualquer tipo de molécula de RNA, quaisquer regiões do DNA ou cromossomo, ácidos nucleicos metilados ou não metilados, moléculas parcialmente montadas dentro do mecanismo e síntese da célula, moléculas mensageiras secundárias e moléculas dentro de mecanismos de sinalização celular. Os alvos podem incluir todas as moléculas no citoplasma, núcleo, organelas, e membrana celular. As moléculas destinadas à secreção ou colocação na membrana celular podem ser direcionadas dentro do citoplasma antes de saírem da célula.

[0072] Os alvos de sdAb podem ser em seres humanos, animais, plantas, fungos, parasitas, protistas, bactérias, vírus, príons, células procarióticas e células eucarióticas. Alguns exemplos de moléculas de sinalização inter- e intracelular e de grupos de proteína que podem ser direcionados pelos sdAbs da invenção são: produtos de oncogene, hormônios, citocinas, fatores de crescimento, neurotransmissores, quinases (inclusive tirosina quinase, serina quinase, e treonina quinase), fosfatases, ubiquitina, nucleotídeos cíclicos, ciclases (adenilil e guanilil), proteínas G, fosfodiesterases, superfamília de GTPase , imunoglobulinas (anticorpos, fragmentos Fab, ligantes, sdAbs), superfamília da imunoglobulina, lipídios de fosfato de inositol, receptores de esteróide, calmodulina, grupo de CD (por exemplo, CD4, CD8, CD28, etc.), fatores de transcrição, TGF-beta, TNF-alfa e beta, superfamília de ligantes de TNF, moléculas de sinalização do receptor notch, moléculas de sinalização do receptor hedgehog, moléculas de sinalização do receptor Wnt, moléculas de sinalização do receptor toll-like, caspases, actina, miosina, miostatina, 12- lipoxigenase, 15-lipoxigenase, superfamília de lipoxigenases, transcriptase reversa, vírus e suas proteínas, proteínas amilóides, colágeno, receptores acoplados à proteína G, proteínas normais mutadas, príons, Ras, Raf, Myc, Src, BCR/ABL, MEK, Erk, Mos, Tpl2, MLK3, TAK, DLK, MKK, p38, MAPK, MEKK, ASK, SAPK, JNK, BMK, MAP, JAK, PI3K, ciclooxigenase, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, Myc, p53, BRAF, NRAS, KRAS, HRAS e quimiocinas.

[0073] O KRAS é um homólogo do oncogene Kirsten ras da família do gene ras de mamífero. O KRAS codifica uma proteína que é um elemento da superfamília de pequenas GTPases. A proteína está implicada em várias malignidades, inclusive adenocarcinoma de pulmão, adenoma mucinoso, carcinoma ductal do pâncreas, e carcinoma colorretal. Sob condições normais, os membros família Ras influenciam os eventos de crescimento celular e de diferenciação em um sistema de sinalização à base de compartimentalização de membrana subcelular. Entretanto, o Ras oncogênico pode desregular processos que controlam a proliferação celular e a apoptose.

[0074] Os sdAbs anti-KRAS foram desenvolvidos para ter como algo KRAS de tipo selvagem e mutado (G12D) de modo a interromper seu papel em células malignas como, por exemplo, células envolvidas no câncer colorretal, câncer pancreático, câncer do trato biliar, câncer de pulmão, leucemias, e outras malignidades metastáticas. Sem se ater a um mecanismo específico, acredita-se que o sdAb anti-KRAS se liga ao KRAS e bloqueia a sinalização a jusante de KRAS em células malignas. Adicionalmente, o sdAb anti-KRAS pode tratar corretamente malignidades que são resistentes aos agentes biológicos anti- EGFR (por exemplo, cetuximabe e panitumumabe).

[0075] Usando métodos que são bem conhecidos na técnica, a proteína KRAS mutante humana recombinante (G12D) foi usada para gerar sdAbs que são direcionados contra ou que podem se ligar a um epítopo de KRAS ou KRAS mutante (G12D), ou outros mutantes de KRAS. Adicionalmente, os sdAbs podem ser gerados para outros mutantes de KRAS. Para gerar os sdAbs anti-KRAS, o KRAS humano recombinante de comprimento completo (Gene ID: 3845) foi expresso em Escherichia coli.

[0076] Vários sdAbs foram obtidos e selecionados. A sequência de DNA de um sdAb anti-KRAS (G12D), chamada KRAS_13 (SEQ ID NO:1), é mostrada abaixo: 5’Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgagactctcctgtgc agtttctggaaatatcggcagcagctactgcatgggctggttccgccaggctccagggaagaagcgcgaggcgg tcgcacgtattgtacgtgatggtgccactggctacgcagactacgtgaagggccgattcaccatctcccgagaca gcgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacaggctgatacctgaggacactgccatctactactgtgcggca gacctgcccccaggttgtttgactcaggcgatttggaattttggttatcggggccagggaaccctggtcaccgtct cctca-3’

[0077] A sequência de aminoácidos do sdAb anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO. 2), KRAS_13, é mostrada abaixo, com as CDRs sublinhadas: EVQLVESGGGSVQTGGSLRLSCAVSGNIGSSYCMGWFRQAPGKKREAVARIVRDG ATGYADYVKGRFTISRDSAKNTLYLQMNRLIPEDTAIYYCAADLPPGCLTQAIWNFGYRG QGTLVTVSS

[0078] Adicionalmente, a presente invenção compreende um ou mais anticorpos monoclonais de camundongo que são direcionados contra um ou mais domínios do sdAb anti-KRAS da invenção. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser gerado por métodos que são conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, o anticorpo monoclonal de camundongo pode ser produzido por um hibridoma de camundongo. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser usado em ensaios diagnósticos, por exemplo, o anticorpo pode ser usado em um imunoensaio como um ensaio ELISA ou espectrometria de massas de modo a medir a quantidade de sdAb anti-KRAS presente no soro de um paciente. A citotoxicidade de sdAbs KRAS (G12D) em células de câncer pancreático humanas PANC-1 foi testada, conforme descrito abaixo.

[0079] STAT3 é um membro da família de proteínas de transdutores e ativadores de sinal da transcrição (STAT) que executam tanto as funções de transdução de sinal e de ativação da transcrição. O STAT3 é amplamente expresso e se torna ativado através da fosforilação na tirosina e/ou na serina como uma proteína de ligação ao DNA em resposta a várias citocinas e fatores de crescimento como EGF, IL-6, PDGF, IL-2 e G-CSF. A fosfoproteína STAT3 forma homodímeros e heterodímeros com outros membros da família STAT e transloca para o núcleo de modo a modular a transcrição de vários genes, e como resultado, desempenha um papel importante em muitos processos celulares como crescimento celular, apoptose, angiogênese, evasão imune e sobrevida.

[0080] Um sdAb anti-STAT3 pode ser dado aos pacientes e a outros organismos para tratar doenças causadas pelo STAT3 fosforilado e não- fosforilado, bem como para prevenir o desenvolvimento de doença ou a recorrência de doença. Por exemplo, pacientes foram submetidos a transplante de órgão e transplante de medula óssea estão em alto risco para SCCA e BCCA cutâneo devido aos medicamentos imunossupressores que eles tomam. A administração de um sdAb anti-STAT3 pode reduzir ou eliminar este risco. Pacientes tratados para uma malignidade que estão em risco para recaída se beneficiarão do tratamento com o sdAb anti-STAT3. Com base no histórico médico familiar e no tipo de HLA, alguns indivíduos estarão em maior risco para alguns tipos de doenças autoimunes e podem se beneficiar do tratamento com sdAbs para reduzir os riscos de desenvolver esta doença autoimune. O risco de câncer de mama pode ser reduzido com a administração de medicamento anti- STAT3, como GLG-302, conforme demonstrado em um estudo recente feito pelo NCI.

[0081] Além de inibir STAT3, o sdAb anti-STAT3 também pode inibir STAT1, STAT2, STAT4, STAT5a, STAT5b, e STAT6 devido ao elevado grau de homologia entre estas moléculas.

[0082] A proteína STAT3 humana recombinante foi usada para produzir sdAbs anti-STAT que foram dirigidos contra ou que podem se ligar a um epítopo de STAT3. Para gerar os sdAbs anti-STAT3, o STAT3 humano recombinante de comprimento completo (Gene ID: 6774) foi expresso por baculovírus em células de inseto Sf9. Os sdAbs anti-STAT foram clonados em vetores que podem ser expressos em células bacterianas e de mamífero, conforme mostrado nas figuras 1 e 2.

[0083] O sdAb anti-STAT3 da invenção pode ser usado para direcionar STAT3 e todas as outras moléculas STAT dentro da célula de modo a inibir o crescimento celular, como, por exemplo, supressão de crescimento celular do câncer. Além disso, o sdAb anti-STAT3 pode inibir o crescimento celular em outras doenças proliferativas como psoríase e degeneração macular através de VEGF.

[0084] Sem se ater a um mecanismo específico de ação, acredita-se que o sdAb anti-STAT3 pode eliminar a supressão imune induzida pelo câncer pela redução dos níveis STAT3 em células apresentadoras de antígeno como, por exemplo, células dendríticas do hospedeiro. A inibição de STAT3 promove resposta anti-câncer pelos sistemas imune e adaptativo e inato do paciente (isto é, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T, células NK, e células B).

[0085] Usando métodos que são bem conhecidos na técnica, vários sdAbs anti-STAT foram obtidos e selecionados pela capacidade de suprimir o crescimento celular do câncer e induzir apoptose em linhagens de células de câncer, conforme descrito abaixo. A citotoxicidade e as atividades antiproliferativa dos sdAbs anti-STAT3 foi testada. Além disso, a tolerância dos sdAbs anti-STAT3 foi testada in vitro e in vivo. A produção de anticorpo monoclononal de camundongo direcionado contra um ou mais domínios dos sdAbs anti-STAT é descrita abaixo.

[0086] A sequência de aminoácidos de um sdAb anti-STAT3, chamado VHH13 (SEQ ID NO. 3), é mostrado abaixo: HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR FDCYRGSWFNRYMYNSWG QGTQVTVSS

[0087] As três CDRs estão sublinhadas.

[0088] A sequência de aminoácidos de um segundo sdAb anti-STAT3, chamado VHH14 (SEQ ID NO. 4), é mostrada abaixo: QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS

[0089] Novamente, as três CDRs estão sublinhadas. As sequências de proteínas de outros sdAbs anti-STAT3 que foram obtidos são as seguintes: STAT3_10 (SEQ ID NO. 5): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS STAT3_34 (SEQ ID NO. 6): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS STAT3_19 (SEQ ID NO. 7): (1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS STAT3_14 (SEQ ID NO. 8): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_35 (SEQ ID NO. 9): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_9 (SEQ ID NO. 10): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_30 (SEQ ID NO. 11): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_23 (SEQ ID NO. 12): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGSHTYWGQGTLVTVSS STAT3_24 (SEQ ID NO. 13): (1) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_36 (SEQ ID NO. 14): (1) DVQLVESGGGSVQAGDSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS STAT3_12 (SEQ ID NO. 15): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_16 (SEQ ID NO. 16): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTNNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_11 (SEQ ID NO. 17): (1) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_20 (SEQ ID NO. 18): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_2 (SEQ ID NO. 19): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_15 (SEQ ID NO. 20): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_6 (SEQ ID NO. 21): (1) HVQLVESEGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS STAT3_33 (SEQ ID NO. 22): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_17 (SEQ ID NO. 23): (1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_25 (SEQ ID NO. 24): (1) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMSSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_32 (SEQ ID NO. 25): (1) DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_13 (SEQ ID NO. 26): (1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_39 (SEQ ID NO. 27): (1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_4 (SEQ ID NO. 28): (1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS STAT3_29 (SEQ ID NO. 29): (1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS

[0090] As sequências de DNA anti-STAT3 correspondentes são as seguintes: Stat3_VHH-10 (SEQ ID NO. 30): 5’- gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctg agactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagc gcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctcca tctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtact actgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactg gggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-14 (SEQ ID NO. 31): 5’- caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctc tgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggag cgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctcc atctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgta ctactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctact ggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-12 (SEQ ID NO. 32): 5’- caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct gagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccag ggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggcc gattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacact gccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagtt ggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-13 (SEQ ID NO. 33): 5’- catgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct gagactctcctgtgcagcctctggagccaacggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttcca gggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggc cgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggaca ctgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagt tggggccaggggacccaggtcactgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-20 (SEQ ID NO. 34): 5’- gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct gagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccag ggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggcc gattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacact gccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagtt ggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-23 (SEQ ID NO. 35): 5’- caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctct gagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggag cgcgagggagtcgcagctcttagcagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctcc atctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgta ctactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggagccatacctac tggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-24 (SEQ ID NO. 36): 5’- gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctct gagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggag cgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctcc atctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgta ctactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccgaaccgccgggggccatacctac tggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-25 (SEQ ID NO. 37): 5’- gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctg agactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagg gaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggtcg attcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgagcagcctgaaacctgaggacactg ccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttg gggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-19 (SEQ ID NO. 38): 5’- catgtgcagctggtggagtctggggggggctcggtgcaggctggaggctctctga gactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcg cgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatc tcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtacta ctgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactgg ggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3‘ Stat3_VHH-32 (SEQ ID NO. 39): 5’- gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtc tctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttc cagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagg gccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgagga cactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataac agttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-33 (SEQ ID NO. 40): 5’- caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtct ctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttcc agggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaaggg ccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggac actgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataaca gttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-36 (SEQ ID NO. 41): 5’- gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagactctctga gactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcg cgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatc tcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtacta ctgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactgg ggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’ Stat3_VHH-11 (SEQ ID NO. 42): 5’- gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgag actctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccaggga aggagcgtgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgatt caccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgcc atgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggg gccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’ Stat3_VHH-6 (SEQ ID NO. 43): 5’- gtgcagctggtggagtctgagggaggctcggtgcaggctggagggtctctgaga ctctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaa ggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattc accatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgcca tgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttgggg ccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’ Stat3_VHH-1 (SEQ ID NO. 44): 5’- gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgaga ctctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaa ggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattc accatctcccaagacaacaccaataacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccat gtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggc caggggaccctggtcactgtctcctca-3’

[0091] Adicionalmente, a presente invenção compreende um ou mais anticorpos monoclonais de camundongo que são direcionados contra um ou mais domínios do sdAb anti-STAT3 da invenção. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser gerado por métodos que são conhecidos por alguém versado na técnica, por exemplo, o anticorpo monoclonal de camundongo pode ser produzido por um hibridoma de camundongo. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser usado em ensaios diagnósticos, por exemplo, o anticorpo pode ser usado em um imunoensaio como um ensaio ELISA de modo a medir a quantidade de sdAb anti-STAT3 presente no soro de um paciente. Deve-se apreciar que o método não se limita a aos sdAbs anti-STAT3, e poderia ser usado para produzir um anticorpo de camundongo direcionado para qualquer um dos sdAbs da presente invenção.

[0092] O gene TNF-alfa codifica uma citocina pró-inflamatória multifuncional que pertence à superfamília do Fator de Necrose Tumoral (TNF). Esta citocina é secretada principalmente por macrófagos. A citocina está envolvida na regulação de um amplo espectro de processos biológicos incluindo regulação do crescimento, diferenciação, inflamação, replicação viral, tumorigênese, e doenças autoimunes; e em infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas. Além de induzir a necrose hemorrágica dos tumores, o TNF foi encontrado estando envolvido na tumorigênese, metástase tumoral, replicação viral, choque séptico, febre, inflamação, caquexia, e doenças autoimunes inclusive doença de Crohn, e artrite reumatoide bem como doença enxerto-versus-hospedeiro.

[0093] A presente invenção fornece sdAbs, proteínas, e polipeptídeos que são direcionados contra TNF-alfa, em particular, contra TNF-alfa humano dentro da célula ou membrana celular, de modo a impedir a secreção de TNF-alfa pelas células.

[0094] Contempla-se que os sdAbs e polipeptídeos anti-TNF-alfa da invenção podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento de doenças e distúrbios associados a e/ou mediados por TNF-alfa, como inflamação, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome intestinal inflamatória, esclerose múltipla, doença de Addison, hepatite autoimune, parotite autoimune, diabetes tipo 1, epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistêmico, infertilidade masculina, esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo, psoríase, febre reumática, artrite reumatoide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, tireoidite, vasculite, e perda de peso causada pelo câncer e caquexia.

[0095] O TNF-alfa existe em diferentes formas; há as formas monoméricas e as multiméricas, incluindo a forma trimérica. Está dentro do escopo da invenção que os sdAbs, as proteínas e os polipeptídeos da invenção se ligam ao TNF-alfa nas suas diferentes formas, isto é, forma monomérica ou formas multiméricas. Dessa forma, quando os sdAbs, as proteínas e os polipeptídeos da invenção são direcionados contra TNF-alfa, deve-se compreender que isto compreende também sdAbs, proteínas e polipeptídeos dirigidos contra TNF-alfa na sua forma trimérica.

[0096] Sabe-se que a transdução de sinal por TNF envolve a reticulação pelos receptores de TNF por um trímero de moléculas de TNF, que contém três sítios de ligação ao receptor (consulte, por exemplo, Peppel et al, J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489).

[0097] A proteína TNF-alfa humana recombinante foi usada para gerar sdAbs que são dirigidos contra ou que podem se ligar a um epítopo de TNF-alfa. Para gerar os sdAbs anti-TNF-alfa, o TNF-alfa humano recombinante de comprimento completo (Gene ID: 7124) foi expresso em Escherichia coli e usado como o antígeno alvo.

[0098] Trinta e cinco sdAbs contra a proteína TNF-alfa foram obtidos. Estes anticorpos anti-TNF-alfa foram divididos em três grupos com base na homologia de sequência.

[0099] A sequência de aminoácidos do primeiro sdAb anti-TNF-alfa, chamado sdAb VHH66 TNF-alfa (SEQ ID NO. 45), é mostrada abaixo: HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRG-QGTLVTVSS

[00100] As três CDRs estão sublinhadas.

[00101] A sequência de aminoácidos do segundo sdAb anti-TNF-alfa, chamado sdAb VHH69 TNF-alfa (SEQ ID NO. 46), é mostrada abaixo: EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKERE GVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTA MYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSS

[00102] As três CDRs estão sublinhadas.

[00103] A sequência de aminoácidos do terceiro sdAb anti-TNF-alfa, chamado sdAb VHH62 TNF-alfa (SEQ ID NO. 47), é mostrada abaixo: QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSS

[00104] As três CDRs estão sublinhadas. Outras sdAbs anti-TNF-alfa que foram encontrados incluem as sequências abaixo, novamente com as CDRs sublinhadas: TNF_2 (SEQ ID NO.48): QVQLVESGGGSVEAGRSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_46 (SEQ ID NO. 49): QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNVKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_71 (SEQ ID NO. 50): QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_21 (SEQ ID NO. 51): QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_38 (SEQ ID NO. 52): EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_18 (SEQ ID NO. 53): EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_37 (SEQ ID NO. 54): DVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_66 (SEQ ID NO. 55): HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_68 (SEQ ID NO. 56): HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGLATHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_78 (SEQ ID NO. 57): HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADRKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS TNF_67 (SEQ ID NO. 58): HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKVRE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_6 (SEQ ID NO. 59): QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKERE GVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSA MYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSS TNF_7 (SEQ ID NO. 60): DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQTPGKERE GVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSA MYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSS TNF_13 (SEQ ID NO. 61): DVQLVESGGGSVQVGGSLTLSCAVSGYTDSYGVMAWFRQAPGKERE GVASIYRNSGITYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLKPEDSA TYYCAVRSFGSVSTWAGYVYWGQGTQVTVSS TNF_60 (SEQ ID NO. 62): DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKERE GVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSA MYYCAARTYGSVSSWTGYKYWG RGTQVTVSS TNF_73 (SEQ ID NO. 63): DVQLVESGGGSVRAGGSLRLSCTASGDTSKSDCMAWFRQAPGKERE RVGAIYTRNGYTHYADSVNGRFTISQDNAKNALYLQMSGLKPEDTA MYYCAARFRIYGQCVEDDDIDYWGQGTLVTVSS TNF_69 (SEQ ID NO. 64): EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKERE GVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTA MYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSS TNF_76 (SEQ ID NO. 65): QVQVVEYGGGSVQAGETVRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHEWE LVSNITTEGITSEASSSYADSVRGRFTIFDNAKN MVYLQMNSLKHEDTA VYYCAPDPYAYSTYREYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_62 (SEQ ID NO. 66): QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSS TNF_43 (SEQ ID NO. 67): QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_15 (SEQ ID NO. 68): QVQPVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGAQGTLVTVSS TNF_11 (SEQ ID NO. 69): QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS TNF_17 (SEQ ID NO. 70): QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS TNF_63 (SEQ ID NO. 71): QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_20 (SEQ ID NO. 72): HVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS TNF_58 (SEQ ID NO. 73): EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGALVTVSS TNF_27 (SEQ ID NO. 74): EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_28 (SEQ ID NO. 75): EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS TNF_4 (SEQ ID NO. 76): EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS TNF_14 (SEQ ID NO. 77): DVQLVESRGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_3 (SEQ ID NO. 78): DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHVCE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS TNF_1 (SEQ ID NO. 79): DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGLECE LVSTITTEGITSEASSYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCA P DPYAYSTYS EYCT WAQGTQGTLVTVSS TNF_45 (SEQ ID NO. 80): DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_22 (SEQ ID NO. 81): DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSVASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS

[00105] A inibição do crescimento in vitro de vários sdAbs para TNF- alfa foi testada, conforme descrito abaixo. Adicionalmente, a presente invenção compreende um ou mais anticorpos monoclonais de camundongo que são direcionados contra um ou mais domínios do sdAb anti-TNF-alfa da invenção. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser gerado por métodos que são conhecidos por alguém versado na técnica, conforme descrito acima. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser usado em ensaios diagnósticos, por exemplo, um imunoensaio como um ensaio ELISA para medir a quantidade de sdAb anti-TNF-alfa presente no soro de um paciente.

[00106] As proteínas RAF são uma família de quinases específicas de serina/treonina que servem como um intermediário central na transmissão de sinais extracelulares para a cascata de proteína quinase ativada por mitogênio, que controla o crescimento celular, a diferenciação e a sobrevivência. BRAF é um membro da família RAF que é ativado por membros da família Ras mediante estimulação induzida por fator de crescimento. Ras ativo pode induzir heterodimerização de cRaf e BRAF e isto pode explicar a cooperatividade observada de cRaf e BRaf em células que respondem aos sinais do fator de crescimento. Mutações de ativação no gene BRAF estão presentes em uma grande porcentagem de melanomas malignos humanos e em uma proporção de cânceres de cólon. A grande maioria destas mutações causa uma alteração de valina para ácido glutâmico no resíduo 599 dentro do segmento de ativação de BRAF.

[00107] Os sdAbs anti-BRAF foram desenvolvidos para ter como algo BRAF de tipo selvagem e mutado de modo a interromper seu papel em células malignas como, por exemplo, células envolvidas no câncer de cólon e outras malignidades.

[00108] Usando métodos que são bem conhecidos na técnica, a proteína BRAF humana recombinante foi usada para gerar sdAbs que são direcionados contra ou que podem se ligar a um epítopo de BRAF.

[00109] Adicionalmente, a presente invenção compreende um ou mais anticorpos monoclonais de camundongo que são direcionados contra um ou mais domínios do sdAb anti-BRAF da invenção. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser gerado por métodos que são conhecidos por alguém versado na técnica. O anticorpo monoclonal de camundongo pode ser usado em ensaios diagnósticos, por exemplo, o anticorpo pode ser usado em um imunoensaio como um ensaio ELISA de modo a medir a quantidade de sdAb anti- BRAF presente no soro de um paciente. EXEMPLOS Exemplo 1: SDAB VHH13 ANTI-STAT3 (SEQ ID NO. 3) SE LIGA A STAT3

[00110] Neste exemplo, a afinidade de dois alvos de VHH contra STAT3 foi medida com o uso do ensaio de ligação isento de marcador à base de Octet. O sdAb anti-STAT3 VHH 13 (SEQ ID NO:3), anti-KRAS (controle negativo) e GST-STAT3 (antígeno monovalente de 16kDa, Creative BioMart n° STAT3-1476H) foram usados como sondas antigênicas neste teste. A proteína GST-STAT3 foi capturada a 20 μg/mL em PBS com o uso de imersão em aminopropilsilano (APS) e biossensores de leitura, especificamente destinados à proteína hidrofóbica. As sondas foram então imersas em poços com a proteína GST-STAT3, sdAb VHH anti-STAT3 13 (SEQ ID NO:3) ou anti-KRAS em uma concentração indicada. A taxa de associação ("on rate") do antígeno foi medida. Os sensores foram paralisados com 1% de BSA em água. As sondas foram imersas em tampão de ensaio (PBS) e a taxa de dissociação ("off rate") foi medida.

[00111] A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação ao antígeno (KD) foi determinada da constante de afinidade (KA) obtida, e a KD com o uso do programa de análise de ajuste global 1:1 Fortebio, conforme mostrado abaixo na Tabela 1. A afinidade foi determinada pela medida dos valores de KD para as curvas com valores de R2 >0,95. O ponto de dados de VHH13 anti-STAT3 de 250 nM foi omitido já que é um ponto fora da curva. Foi constatado que a afinidade do sdAb anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) foi de 1,16 x 10-7. A afinidade do VHH anti-KRAS não foi determinada. TABELA 1

EXEMPLO 2: ESTUDOS DE IMUNOPRECIPITAÇÃO

[00112] A especificidade de sdAbs STAT3 foi testada em células de câncer de mama humanas. Neste exemplo, as células de câncer de mama humanas MDA-MB-231 foram cultivadas até confluência de 50% a 70%. As células foram então rompidas em tampão de lise gelado recém preparado (HEPES 20 mM, pH 7,9, NaCl 400 mM, 0,1% de NP-40, 10% de glicerol, vanadato de sódio a 1 mM, fluoreto de sódio de 1 mM, ditiotreitol a 1 mM, fluoreto de fenilmetilssulfonila a 1 mM , 10 μg/mL de aprotinina, 10 μg/mL de leupeptina) durante 45 minutos em gelo. Os lisados foram então centrifugados, o sobrenadante foi coletado, e a concentração de proteína foi determinada com o uso de um método de Lowry modificado (Bio Rad, Hercules, CA). A proteína total (1 mg) foi incubada com 1,5 mg de Dynabeads (Invitrogen) com sdAbs contra STAT3, um controle positivo (STAT3, n° de catálogo SC-482, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), ou controle negativo (STAT-1, n° de catálogo 9172, Cell Signaling, Danvers, MA) durante 1 h a 4 °C. As microesferas foram então lavadas. Após a lavagem final, 60 μL de tampão de lise foram adicionados e o sobrenadante resultante foi submetido a uma análise por Western blot. Resumidamente, as amostras foram separadas em géis de poliacrilamida a 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas e, então, incubadas com anticorpos primários e secundários adequados. O anticorpo anti-STAT3 usado como um controle positivo foi obtido junto à Cell Signaling (n° de catálogo 4904, Danvers, MA). A reação de quimioluminescência foi feita usando o sistema ECL da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).

[00113] Conforme ilustrado na figura 3, o STAT3 endógeno imunoprecipitado com todos os sdAbs testados em diferentes quantidades. M é a coluna de Marcador contendo o marcador, a coluna 1 continha STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) produzido e isolado de células de mamífero, a coluna 2 continha STAT3 VHH14 (SEQ ID NO:4) produzido e isolado de células de mamífero, a coluna 3 continha STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) produzido e isolado de células bacterianas, a coluna 4 continha STAT3 VHH14 (SEQ ID NO:4) produzido e isolado de células de mamífero, a coluna 5 era o anticorpo para STAT3 positivo, a coluna 6 usou STAT-1 como um controle negativo, não mostrou banda. EXEMPLO 3: VHH13 BACTERIANO ANTI-STAT3 SE LIGA COM UM ALTO GRAU DE AFINIDADE A LINHAGENS CELULARES CONTENDO STAT3 ATIVADA CONSTITUTIVAMENTE

[00114] A especificidade do VHH13 anti-STAT3 bacteriano (SEQ ID NO:3) usando STAT3 constitutivamente ativada em linhagens celulares humanas (PANC-1 e DU145) e de murino (4T1) foi testada. As células HeLa comerciais também foram tratadas com interferon gama (INFT) de modo a induzir STAT3 fosforilada. A linhagem celular nula para STAT3 PC-3 foi usada como um controle negativo.

[00115] As células foram cultivadas a 50% a 70% de confluência e, então, rompidas em tampão de lise gelado recém preparado, conforme descrito acima durante 45 minutos em gelo. Os lisados foram então centrifugados, o sobrenadante foi coletado, e a concentração de proteína foi determinada conforme descrito acima. A proteína total (1 mg) foi incubada com 1,5 mg de Dynabeads (Invitrogen) contendo VHH13 anti-STAT3 bacteriano (SEQ ID NO:3) ou controle negativo (KRAS, Creative Biolabs, Shirley, NY) durante 1 hora a 4°C. As microesferas foram então lavadas. Após a lavagem final, 60 μL de tampão de lise foram adicionados e o sobrenadante resultante foi submetido a uma análise por Western blot, conforme descrito no Exemplo 2.

[00116] Conforme ilustrado na figura 4, a STAT3 endógena foi imunoprecipitada por VHH13 STAT3 bacteriana (SEQ ID NO:3) nas linhagens celulares com STAT3 ativada constitutivamente: PANC-1 (coluna 1), DU145 (coluna 2), e 4T1 (coluna 4). Além disso, VHH13 STAT3 bacteriana (SEQ ID NO:3) se ligou à fosfo-STAT3 em lisado de HeLa (coluna 3). Nenhuma banda foi observada para PANC-1 KRAS, coluna 3, e PC-3 (controle negativo), coluna 6. EXEMPLO 4: ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE DE SDABS ANTI-STAT3 EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER MDA-MB-231

[00117] Neste exemplo, os efeitos antiproliferativos de sdAbs anti- STAT3 foram testados com o uso da linhagem celular de câncer de mama humana MDA-MB-231. Para os experimentos, as células MDA-MB-231 foram cultivadas até atingirem uma confluência de 90%. Neste momento, as células foram lavadas, tripsinizadas e contadas usando um contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Os estudos de proliferação foram executados com o uso do ensaio com brometo de 3-[4,5-dimetiltiaolil]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Para isto, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 5 x 103 por poço, conforme indicado pelo fabricante (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). As células foram deixadas aderir durante 24 horas e, então, os sdAbs foram adicionados nas concentrações adequadas (isto é, 0, 0,5, 1,0, 10,0, ou 100 μg/mL). As células foram contadas no dia 3. Para as células tratadas por 5 dias, meio fresco contendo os sdAbs foi renovado no dia 3. No momento do término, 10 μL de reagente MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço, conforme indicado pelo fabricante. Após um período de incubação de 4 horas, 100 μL de solução de solubilização foram adicionados e a placa foi colocada na incubadora de um dia para o outro. Todas as placas foram lidas em comprimento de onda de 570 nm com o uso do leitor de placas Biotek (Winooski, VT).

[00118] Todos os dados foram analisados com o uso de GraphPad InStat 3 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Os grupos de tratamentos foram comparados com o grupo de controle com veículo com o uso de ANOVA unidirecional. Se uma diferença significativa (p <0,05) for observada, o teste de comparação múltiplas de Tukey-Kramer foi conduzido.

[00119] Com base no experimento de MTT, o sdAb VHH13 anti-STAT3 bacteriano (SEQ ID NO. 3) foi observado sendo eficaz na inibição do crescimento celular nos dias 3 e 5 após o tratamento, conforme mostrado nas Tabelas 2 a 5 abaixo. TABELA 2

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 3

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 4 Absorbância média (570nM) ± S.E. no dia 5 após o tratamento com sdAb anti-STAT3 em células MDA-MB-231

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 5 Efeitos do tratamento com sdAb anti-STAT3 sobre a proliferação celular de MDA-MB-231 após 5 dias de tratamento

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer EXEMPLO 5: ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE DE SDABS ANTI-STAT3 EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA (MDA-MB-231) E PANCREÁTICO (PANC-1) HUMANAS

[00120] Neste exemplo, os efeitos antiproliferativos de sdAbs antiSTAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) e VHH14 (SEQ ID NO. 4) foram testados com o uso da linhagem celular de câncer de mama humanas MDA-MB-231 e da linhagem celular de câncer pancreático humano PANC-1. Para os experimentos, as células MDA-MB-231 e PANC-1 foram cultivadas até atingirem uma confluência de 90%. Neste momento, as células foram lavadas, tripsinizadas e contadas usando um contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Os estudos de proliferação foram executados com o uso do ensaio MTT descrito acima. Para as células tratadas por 5 dias, meio fresco contendo os sdAbs anti-STAT3 foi renovado no dia 3.

[00121] Todos os dados foram analisados com o uso de GraphPad InStat 3. Os grupos de tratamentos foram comparados com o grupo de controle com veículo com o uso de ANOVA unidirecional. Se uma diferença significativa (p <0,05) for observada, o teste de comparação múltiplas de Tukey-Kramer foi conduzido.

[00122] Com base no experimento de MTT, tanto VHH13 (SEQ ID NO. 3) quanto VHH14 (SEQ ID NO. 4) foram observados inibindo o crescimento celular nas células de câncer MDA-MB-231 e PANC-1, conforme mostrado nas Tabelas 6 a 13 abaixo. TABELA 6 Absorbância média (570nM) ± S.E. no dia 3 após o tratamento com sdAbs nas células MDA-MB-231

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 7 Absorbância média (570nM) ± S.E. no dia 5 após o tratamento com sdAbs anti-STAT3 em células MDA-MB-231

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 8

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 9

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 10 Inibição média do crescimento após 3 dias de tratamento com sdAbs anti- STAT3 sobre a proliferação de células MDA-MB-231

a. Análise de variância unidirecional (ANOVA); b. pós-teste =teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer TABELA 11 Inibição média do crescimento após 5 dias de tratamento com sdAbs anti- STAT3 sobre a proliferação de células MDA-MB-231

a. Análise de variância unidirecional (ANOVA); b. pós-teste = teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer TABELA 12 Inibição média do crescimento após 3 dias de tratamento com sdAbs anti- STAT3 sobre a proliferação de células PANC-1

a. Análise de variância unidirecional (ANOVA); b. pós-teste = teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer TABELA 13 Inibição média do crescimento após 5 dias de tratamento com sdAbs anti- STAT3 sobre a proliferação de células PANC-1

a. Análise de variância unidirecional (ANOVA); b. pós-teste =teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer EXEMPLO 6: AÇÕES ANTIPROLIFERATIVAS DE SDABS STAT3 NAS LINHAGENS CELULARES DE CÂNCER DE MAMA HUMANO E CÂNCER DE PRÓSTATA HUMANO

[00123] Os efeitos antiproliferativos do sdAb STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) foram testados na linhagem celular de câncer de mama humana MDA- MB-231 e nas linhagens celulares de câncer de próstata humana DU145. Para os experimentos, as células de câncer foram cultivadas até atingirem 90% de confluência. Neste momento, as células foram lavadas, tripsinizadas e contadas usando um contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Os estudos de proliferação foram feitos com o uso do ensaio MTT descrito acima.

[00124] As propriedades antiproliferativas do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO. 3) sobre as células MDA-MB-231 foram comparadas às suas ações sobre as células DU145. Conforme mostrado na Tabela 14, células MDA-MB-231 tratadas com os sdAbs anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) mostraram uma inibição do crescimento média de 29,6 e 91,2 a 50,0 e 100 μg/mL, respectivamente. Nas células DU145, uma inibição do crescimento similar (31,2 e 92,1% para 50,0 e 100 μg/mL, respectivamente) foi vista, conforme apresentado na Tabela 15. TABELA 14 Ações antiproliferativas de sdAbs anti-STAT3 bacteriano VHH13 sobre as células de câncer de mama MDA-MB-231

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer TABELA 15 Ações antiproliferativas de sdAbs anti-STAT3 bacteriano VHH13 sobre as células de câncer de próstata DU145

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer EXEMPLO 7: EFEITOS ANTIPROLIFERATIVOS DOS SDABS STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER HUMANAS

[00125] Para testar os efeitos antiproliferativos de sdAbs STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) com o uso das linhagens de células de câncer humanas: MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, BT474, e DU145 conforme mostrado na Tabela 16.

[00126] Todas as linhagens de células de câncer humanas foram obtidas junto à American Type Culture Collection (Manassas, VA). As linhagens celulares foram mantidas e cultivadas em meio RPMI 1640 (MDA-MB-231, MDA- MB-468, MCF-7, BT474) ou MEM-E (DU145) contendo 10% de soro fetal bovino, L-glutamina 2 mM e 1% de solução de antibiótico-antimicótico (10 unidades/mL de penicilina, 10 μg/mL de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B). As células foram mantidas a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Os suprimentos da cultura celular foram obtidos junto à Life Technologies, Inc., (Grand Island, NY). O reagente MTT foi comprado junto à Sigma Aldrich (St. Louis, MO).

[00127] Para os experimentos, as células de câncer foram cultivadas até atingirem 90% de confluência. Neste momento, as células foram lavadas, tripsinizadas e contadas usando um contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Os estudos de proliferação foram executados com o uso do ensaio MTT descrito acima.

[00128] As propriedades antiproliferativas dos sdAbs anti-STAT3 bacterianos VHH13 (SEQ ID NO:3) foram avaliadas em cinco células de câncer de mama representando várias classificações (Tabela 34). Conforme mostrado na Tabela 17, todas as linhagens celulares 72 horas após o tratamento mostraram inibição significativa do crescimento. A maior inibição do crescimento foi notada na dose de 100 e 200 μg/mL para todas as linhagens celulares. A concentração inibitória máxima média (IC50) para crescimento nas linhagens celulares testadas foram: 10,1 ± 2,4; 12,36 ± 1,5; 14,8 ± 1,6; e 25,2 ± 14,7 para as linhagens celulares MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, e BT474, respectivamente. Estes dados sugerem que as linhagens celulares de câncer de mama triplo negativas exigem a menor concentração de sdAbs VHH13 (SEQ ID NO:3) para atingir a IC50 em comparação com as linhagens celulares positivas para estrogênio/progesterona (isto é, MCF-7) ou as linhagens celulares amplificadas HER2 (isto é, BT474). TABELA 16 Características da linhagem celular de câncer de mama

TABELA 17 Inibição das características da linhagem celular de câncer de mama por sdAbs anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3)

[00129] As ações do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) também foram avaliadas na linhagem de células de câncer de próstata humana DU145, conforme mostrado na Tabela 18. O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) mostrou inibição do crescimento dose-dependente em todas as células de câncer testadas. TABELA 18 Efeito dos sdAbs anti-STAT3 VHH13 sobre linhagens celulares de câncer de próstata

EXEMPLO 8: DOSE MÁXIMA TOLERADA DE ANTI-STAT3 BACTERIANO VHH13 (SEQ ID NO:3) EM CAMUNDONGOS BALB/C

[00130] Neste exemplo, a tolerância do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi testada em animais de teste com o uso da linhagem celular de câncer de mama humana MDA-MB-231. Para o experimento, um total de 9 camundongos fêmeas BALB/C nuas (6 a 7 semanas de idade) foi dividido em três grupos de acordo com os pesos corporais. (Tabela 19) Os camundongos (n=3) receberam veículo (PBS) ou sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) a 250 ou 500 μg/kg de peso corporal/dia durante cinco dias. Durante o estudo, a mortalidade/morbidade foi avaliada duas vezes ao dia. Os pesos corporais foram registrados nos dias 1, 4, e 6 do estudo bem como no dia de terminação do estudo (dia 13). A toxicidade foi avaliada pelas medições do peso corporal e pelo comportamento do camundongo em comparação com camundongos de controle com veículo. Ao término da fase de tratamento, os animais foram acompanhamos por mais uma semana para se observar quaisquer anormalidades nos pesos corporais e/ou na saúde geral após o tratamento. TABELA 19 Delineamento experimental do estudo de dose máxima tolerada

[00131] Conforme ilustrado na Tabela 20, não houve uma diferença significativa nos pesos corporais entre os grupos, e o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) não foi associado com nenhum óbito relacionado a droga em nenhum nível de dosagem. Adicionalmente, nenhuma alteração comportamental foi observada nos animais tratados com sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) em comparação com os camundongos de controle. TABELA 20 Pesos corporais médios ± S.E

*Análise de variância unidirecional (ANOVA); teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer EXEMPLO 9: ATIVIDADE DE ANTI-STAT3 VHH13 BACTERIANO (SEQ ID NO:3) EM XENOENXERTO DE CAMUNDONGOS NUS BALB/C E EM CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA HUMANO E DE CÂNCER PANCREÁTICO HUMANO

[00132] Neste exemplo, a atividade de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi avaliada em camundongos com o uso da linhagem de células de câncer de mama humana MDA-MB-231. Resumidamente, a atividade de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi avaliada com o uso de: modelo de xenoenxerto de câncer de mama humano MDA-MB-231 e modelo de xenoenxerto de câncer pancreático humano PANC-1. Os cronogramas de administração foram os seguintes: grupo 1 (n=6; PBS; IP) diariamente durante 14 dias [QDx14]; e grupo 2 (n=12; 500 μg/kg de peso corporal; IP), todos os dias durante 14 dias [QDx14]. Um período de observação de 5 dias seguiu a administração do fármaco.

[00133] As linhagens celulares de câncer de mama humano (MDA- MB-231 e PANC-1) foram obtidas junto à American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). As células MDA-MB-231 foram cultivadas em MEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de SFB (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA) e penicilina-estreptomicina-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). As células PANC-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (RPMI: Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de SFB e penicilina-estreptomicina-glutamina. As células foram cultivadas na presença de 5% de CO2 a 37 °C em uma incubadora.

[00134] Camundongos machos atímicos nus-Foxn1nu com idade de 4 a 5 semanas foram comprados junto à Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Os animais foram deixados em quarentena durante uma semana e cinco camundongos por gaiola foram alojados com um ciclo de 12 h luz-escuro, e uma umidade relativa de 50%. Água potável e dieta foram supridos aos animais ad libitum. Todos os animais foram alojados sob condições isentas de patógeno e os experimentos foram feitos de acordo com o comitê de uso de cuidado de animais do Instituto de Pesquisa IIT. Para o estudo de xenoenxerto de MDA-MB- 231, as células (4 x 106) em um volume final de 100 μL de meio MEM foram injetadas subcutaneamente nos flancos direitos dos camundongos. Para o estudo em xenoenxerto PANC-1, as células (5 x 106) em um volume final de 100 μL de meio RPMI foram injetadas subcutaneamente nos flancos direitos dos camundongos. As medições do tumor para ambos os modelos foram iniciadas assim que os tumores eram palpáveis. Depois disso, os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os animais foram randomizados quando os tumores atingiram um intervalo de tamanho de 75 a 175 mm3, e os grupos de controle (n = 6) e de tratamento (n=12) foram randomizados com o uso do algoritmo estratificado de amostragem aleatória. O tratamento (sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3)) ou veículo (PBS) foi iniciado no dia após a randomização. O tratamento foi bem tolerado e não estava associado com mortes relacionadas ao fármaco. Nenhuma perda de peso corporal significativa foi notada.

[00135] Para o estudo de xenoenxerto de MDA-MB-231, o tamanho do tumor médio da randomização (± SE) foi: 103,01 ± 11,89 e 102,61 ± 9,60 para os grupos de controle e grupos de tratamento, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) na randomização foram: 32,08 ± 0,76 e 30,27 ± 0,75 para o grupo 1 e o grupo 2, respectivamente. A Tabela 21 mostra os pesos corporais médios (± S.E) para todo o estudo. TABELA 21 Pesos corporais médios ± S.E

*Teste-T de bicaudal

[00136] No dia 14 da dosagem, o tamanho médio do tumor (± SE) para o controle foi 179,11 ± 19,39 versus 118,86 ± 15,94 para o grupo de tratamento. Os pesos corporais médios (± S.E) no término foram: 31,98 ± 0,71 e 30,55 ± 0,74 para o grupo 1 e grupo 2, respectivamente. A Tabela 22 resume os volumes do tumor (± S.E) para todo o estudo. A % inibição média do crescimento tumoral no grupo de tratamento foi 33,64%. Os tempos de duplicação do tumor foram os seguintes: grupo 1: 44,27 dias; e grupo 2: 61,06 dias. A Figura 5 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231. O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) mostrou inibição significativa do crescimento (p= 0,047). Dessa forma, o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) tem atividade quimioterapêutica sistema modelo de câncer de mama MDA-MB-231 humano. TABELA 22 Medições individuais do tumor (mm3) para o modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231

[00137] Para o estudo de xenoenxerto PANC-1, os tamanhos do tumor médios (+SE) na randomização foram 107,01 ± 4,54 nos grupos de controle e 110,58 ± 6,18 no de tratamento. Os pesos corporais médios (± S.E) na randomização foram: 29,0 ± 0,81 e 28,5 ± 0,70 para o grupo 1 e grupo 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) no término foram: 31,2 ± 0,99 e 30,1 ± 0,75 para o grupo 1 e grupo 2, respectivamente. A Tabela 23 resume os pesos corporais médios (± S.E) para todo o estudo. No dia 14 da dosagem, o tamanho médio do tumor (± SE) para o controle foi 287,30 ± 33,94 versus 318,74 + 29,76 para o grupo de tratamento. A Tabela 24 resume os volumes do tumor (± S.E) para todo o estudo. TABELA 23 Pesos corporais médios ± S.E

[00138] Os tempos de duplicação do tumor foram os seguintes: grupo 1: 22,44 dias; e grupo 2: 23,02 dias. O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) não mostrou inibição do crescimento significativa no sistema modelo de câncer pancreático humano PANC-1. TABELA 24 Medições individuais do tumor (mm3) para o modelo de xenoenxerto de PANC-1

EXEMPLO 10: ESTUDO COM XENOENXERTO DE MDA-MB-231

[00139] Neste exemplo, a eficácia do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de mama humano MDA-MB- 231 foi adicionalmente avaliada. Os cronogramas de administração foram os seguintes: grupo 1 (n=4; PBS; IP) duas vezes ao dia durante 14 dias [BIDx14]; grupo 2 (n=4; 1 mg/kg de peso corporal; IP), duas vezes ao dia durante 14 dias [BIDx14]; grupo 3 (n=4; 2 mg/kg de peso corporal; IP) duas vezes ao dia durante 14 dias [BIDx14]; e grupo 4 (n=4; 2 mg/kg de peso corporal; IP) uma vez ao dia durante 14 dias [QDx14]. Um período de observação de 7 dias seguiu a administração do fármaco.

[00140] As linhagens celulares de câncer de mama humano MDA-MB- 231 e camundongos nus-Foxn1nu fêmeas atímicos foram descritos acima.

[00141] As células MDA-MB-231 em uma densidade de 5x106 foram injetadas subcutaneamente no flanco direito dos camundongos em um volume final de 100 μL em meio MEM. As medições do tumor foram iniciadas assim que os tumores eram palpáveis. Depois disso, os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os animais foram randomizados quando os tumores atingiram um intervalo de tamanho de 55 a 150 mm3 com o uso do algoritmo estratificado de amostragem aleatória. O tratamento (sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3)) ou veículo (PBS) foi iniciado no dia após a randomização.

[00142] O tamanho médio (± SE) do tumor na randomização foi: 92,08 ± 13,24; 82,38 ± 5,17; 77,47 ± 7,17; e 104,71 ± 14,64 para os grupos 1, 2, 3, e 4 respectivamente. Conforme mostrado na Tabela 25, os pesos corporais médios (± SE) na randomização foram: 23,65 ± 0,72; 23,45 ± 0,66; 23,10 ± 0,20; e 22,45 ± 1,25 para os grupos 1, 2, 3, e 4, respectivamente.

[00143] Conforme mostrado na Tabela 26, no dia 14 da dosagem, o tamanho médio do tumor (± SE) para o grupo de controle foi 221,51 ± 57,32 versus 67,12 ± 10,66; 58,27 ± 22,54; e 131,44 ± 22,86; para o grupo de tratamento 2, 3, e 4, respectivamente. No momento do término (dia 42) o tamanho médio do tumor (± S.E) foi: 255,42 ± 65,46; 55,98 ± 6,94; 41,15 ± 13,21; e 145,51 ± 52,32; para os grupos 1, 2, 3, e 4, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) no término foram: 24,80 ± 0,49; 23,25 ± 1,20; 24,00 ± 0,32; e 23,2 ± 1,46 para os grupos 1, 2, 3, e 4, respectivamente. A % média máxima da perda de peso líquida (dia) foi: 0,7 (36); 1,5 (23); 1,8 (36); e 2,2 (29) para os grupos 1, 2, 3, e 4, respectivamente.

[00144] Conforme também mostrado na Tabela 26, a inibição média do crescimento nos grupos de tratamento foi 78,3; 75,2; e 55,9; para os grupos 2, 3, e 4, respectivamente. Os tempos de duplicação do tumor foram: grupo 1: 20,56 dias; grupo 2: 34,54 dias; grupo 3: 30,07 dias; e grupo 4: 27,17 dias. Houve um retardo no crescimento de 13,99; 9,52, e 6,61 dias para os grupos 2, 3 e 4, respectivamente. A % dos valores de tratamento/controle para os grupos de tratamento foram: grupo 2: -33,75 (estase tumoral); grupo 3: -54,4 (regressão do tumor); e grupo 4: 10,28 (inibição do tumor). A Figura 6 ilustra a inibição do crescimento de sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231.

[00145] A administração de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi associada a uma inibição significativa do crescimento no grupo 2 (p=0,02) [1 mg/kg; BID X 14] e grupo 3 (p= 0,02) [2 mg/kg; BID x 14]. Além disso, três dentre quatro tumores mostraram regressão significativa. Com base nestes dados, conclui-se que o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) tem atividade quimioterapêutica no sistema modelo de câncer de mama humano MDA-MB-231. TABELA 25 Pesos corporais médios ± S.E

TABELA 26 Medições individuais do tumor (mm3) para o modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231

EXEMPLO 11: EFICÁCIA DE SDAB ANTI-STAT3 BACTERIANO VHH13 (SEQ ID NO:3) EM TRÊS MODELOS DE XENOENXERTO DE CÂNCER HUMANOS

[00146] Neste exemplo, a eficácia do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi avaliada nos modelos de xenoenxerto humano de câncer de mama MDA-MB-231, pancreático PANC-1, e de próstata DU145.

[00147] Camundongos atímicos Nus-Foxn1nu, células de câncer de mama MDA-MB-231, linhagens celulares câncer pancreático PANC-1 e de câncer de próstata DU145 foram descritos acima. O peso corporal dos camundongos situava-se na faixa de 17 a 19 g (34 fêmeas) e 21 a 23 g (16 machos) no dia 1 do estudo.

[00148] As células nas passagens precoces (4 a 10) foram usadas para implantação nos camundongos e foram coletadas durante o crescimento da fase logarítmica. MDA-MB-231 (5x106), DU145 (5x106), e PANC-1 (1,5 x106) foram injetados subcutaneamente no flanco direito dos camundongos em um volume final de 100 μL de meio. As medições do tumor foram iniciadas assim que os tumores eram palpáveis. Depois disso, os tumores foram medidos duas vezes por semana.

[00149] Os animais foram randomizados com o uso do algoritmo estratificado de amostragem aleatória quando os tumores atingem um intervalo de tamanho de: 74-120 mm3 (MDA-MB-231), 89-146 mm3 (DU145), ou 60-160 mm3 (PANC-1). O tratamento (contendo sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) e chamado na presente invenção de SBT-100) ou veículo (PBS) foi iniciado dia após a randomização, chamado de dia 1.

[00150] O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi fornecido como uma solução pré-formulada a uma concentração de 0,651 mg/mL e foi armazenada a -20°C até estar pronta para o uso. A solução de estoque foi diluída em PBS estéril pH 7,6 para fornecer 5 mg/kg em um volume de dosagem de 10 mL/kg. A solução de trabalho foi preparada a cada 7 dias, aliquotada em sete frascos e armazenada a 4°C. Em cada dia de tratamento, apenas o frasco necessário foi levado para a temperatura ambiente. Todo o material de sdAb restante foi retido a 4°C, conforme necessário para a dose seguinte. No dia 8, qualquer material de sdAb remanescente foi descartado e um lote novo preparado.

[00151] Dois grupos (controle e SBT-100) de camundongos por modelo de tumor foram administrados de acordo com o protocolo mostrado na Tabela 27. Os cronogramas de administração foram os seguintes: grupo 1 (n=4; PBS) duas vezes ao dia durante 14 dias [BIDx14]; grupo 2 (n=4; SBT-100, 5 mg/kg peso corporal), duas vezes ao dia durante 14 dias [BIDx14]. Tanto o veículo (PBS pH 7,6) quanto SBT100 foram administrados intraperitonealmente (i.p.) duas vezes ao dia, com um intervalo de seis horas durante 14 dias. A dosagem foi conduzida de acordo com os pesos individuais dos animais. Um período de recuperação de 7 dias seguiu a administração. TABELA 27 Delineamento experimental do modelo de estudo de xenoenxerto

[00152] O programa Study Log Study Director Animal Study Management Software (San Francisco, CA, EUA) foi usado para randomizar os animais, coletar dados (por exemplo, dosagem, pesos corporais, medições dos tumores, observações clínicas), e conduzir análises dos dados.

[00153] No modelo de xenoenxerto de tumor MDA-MB-231, os animais foram randomizados no dia 23 após a inoculação com um tamanho de tumor médio (± SE) de: 77,98 ± 21,58 e 84,71 ± 5,56 para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) na randomização foram: 20,04 ± 0,62 e 23,7 ± 1,84 para os grupos 1 e 2, respectivamente. A Tabela 28 resume os pesos corporais médios (± S.E) para todo o estudo. No último dia da administração (dia 14), o tamanho médio do tumor (± SE) para o grupo de controle foi 168,28 ± 51,57 versus 83,81 ± 22,65 para camundongos tratados com SBT-100. A Tabela 29 resume os volumes do tumor (± S.E) para todo o estudo. No momento do término (dia 28), o tamanho médio do tumor (± S.E) foi: 270,49 ± 112,35 e 91,72 ± 33,17, para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) no término randomização foram: 25,36 ± 1,07 e 24,25 ± 1,68 para os grupos 1 e 2, respectivamente. No final do estudo, a inibição média do crescimento tumoral no grupo tratado com SBT-100 foi 85,8% (p= 0,006). A Figura 7 ilustra o volume médio do tumor. Os tempos de duplicação do tumor foram 25,78 dias versus 111,6 dias para o grupo 1 e o grupo 2, respectivamente. A % tratamento/controle para o grupo 2 foi de 13,35 (inibição do tumor). TABELA 28 Pesos corporais médios para os camundongos em MDA-MB-231

TABELA 29 Volumes tumorais para MDA-MB-231

[00154] No modelo de xenoenxerto de tumor DU145, os animais foram randomizados no dia 17 após a inoculação com um tamanho de tumor médio (± SE) de: 111,87 ± 20,53 e 111,23 ± 25,16 para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) na randomização foram: 29,10 ± 1,94 e 30,68 ± 1,56 para os grupos 1 e 2, respectivamente. A Tabela 30 resume os pesos corporais médios (± S.E) para todo o estudo. No último dia da administração (dia 14), o tamanho médio do tumor (± SE) para o grupo de controle foi de 621,81 ± 276,25 versus 364,14 + 51,64 para os camundongos tratados com SBT-100. A Tabela 31 resume os volumes do tumor (± S.E) para todo o estudo. No momento do término (dia 28), o tamanho médio do tumor (± S.E) foi: 819,42 ± 351,88 e 601,83 +± 131,51, para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) no término randomização foram: 29,20 ± 2,33 e 29,60 ± 1,04 para os grupos 1 e 2, respectivamente. No final do estudo, a inibição média do crescimento tumoral no grupo tratado com SBT-100 foi 26,6% (p= 0,29). A Figura 8 ilustra o volume médio do tumor. Os tempos de duplicação do tumor foram 14,57 dias versus 18,19 dias para o grupo 1 e o grupo 2, respectivamente. A % tratamento/controle para o grupo 2 foi de 74,8. TABELA 30 Pesos corporais médios para os camundongos em DU 145

TABELA 31 Volumes tumorais para DU145

[00155] No modelo de xenoenxerto de tumor PANC-1, os animais foram randomizados no dia 22 após a inoculação com um tamanho de tumor médio (± SE) de: 78,74 ± 40,21 e 93,84 ± 36,31 para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) na randomização foram: 22,50 ± 1,47 e 24,23 ± 1,63 para os grupos 1 e 2, respectivamente. A Tabela 32 resume os pesos corporais médios (± S.E) para todo o estudo. No último dia da administração (dia 14), o tamanho médio do tumor (± SE) para o grupo de controle foi de 204,95 ± 178,90 versus 159,03 ± 28,01 para os camundongos tratados com SBT-100. A Tabela 33 resume os volumes do tumor (± S.E) para todo o estudo. No momento do término (dia 28), o tamanho médio do tumor (± S.E) foi: 284,77 ± 288,88 e 203,02 ± 30,34, para os grupos 1 e 2, respectivamente. Os pesos corporais médios (± S.E) no término randomização foram: 27,38 ± 1,07 e 26,23 ± 1,19 para os grupos 1 e 2, respectivamente. No final do estudo, a inibição média do crescimento tumoral no grupo tratado com SBT-100 foi 41,78% (p= 0,35). A Figura 9 ilustra o volume médio do tumor. Os tempos de duplicação do tumor foram 18,51 dias versus 35,70 dias para o grupo 1 e o grupo 2, respectivamente. A % tratamento/controle para o grupo 2 foi de 52,79. TABELA 32 Pesos corporais médios para os camundongos em PANC-1

EXEMPLO 12: EFICÁCIA DO SDAB ANTI-STAT3 BACTERIANO VHH13 (SEQ ID NO:3) NO MODELO DE XENOENXERTO DE TUMOR DE MAMA HUMANO ER+/PR+ (MCF-7)

[00156] Este exemplo demonstra a eficácia do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) no modelo de xenoenxerto de tumor de mama humano MCF-7 em camundongos nus.

[00157] Camundongos nus atímicos fêmea (Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu, Charles River) tinham doze semanas de idade com uma faixa de peso corporal (BW) de 23,0 a 30,1 g no dia 1 do estudo. Os animais foram alimentados e alojados, conforme descrito acima.

[00158] Células de carcinoma de mama humano MCF-7 foram obtidas e cultivadas conforme descrito acima, e usadas para o xenoenxerto de camundongo. Três dias antes da implantação da célula tumoral, péletes de estrogênio (0,36 mg estradiol, liberação por 60 dias, Innovative Research of America, Sarasota, FL) foram implantados subcutaneamente entre as escápulas de cada animal de teste com o uso de um trocarte esterilizado.

[00159] As células tumorais usadas para implantação foram coletadas durante a fase logarítmica do crescimento e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 1 x 108 células/mL. No dia do implante, cada camundongo de teste recebeu 1 x 107 células MCF-7 (0,1 mL suspensão de células) implantadas subcutaneamente no flanco direito e o crescimento tumoral foi monitorado como o tamanho médio atingindo o intervalo alvo de 100 a 150 mm3. Vinte e um dias depois, designado como dia 1 do estudo, os animais foram classificados em dois grupos cada um consistindo em quatro camundongos com volumes tumorais individuais na faixa de 108 a 144 mm3 e os volumes tumorais médios do grupo de 117 a 123 mm3.

[00160] O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi fornecido como uma solução de dose pré-formulada pronta para uso em uma concentração de 0,41867 mg/mL em alíquotas de 1 mL e foram armazenadas a - 20° C até serem necessárias. A solução de 0,41867 mg/mL forneceu uma dosagem de 1 mg/kg em um volume de dosagem de 23,88 mL/kg. Em cada dia do tratamento, apenas os frascos necessários de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foram descongelados até a temperatura ambiente. Todas as suspensões de dosagem restantes foram retidas a 4 °C, conforme necessário para a próxima dose.

[00161] Dois grupos de camundongos nus atímicos foram administrados de acordo com o protocolo mostrado na Tabela 34. Todas as doses de veículo (controle) e sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foram administradas intraperitonealmente (i.p.) três vezes por dia, com seis horas de intervalo por 14 dias, com duas doses sendo aplicadas no dia 1 e uma dose aplicada na manhã do dia 15 (tid x 14, primeiro dia 2 doses). O volume da administração para o veículo e sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi de 0,478 mL por 20 gramas de peso corporal (23,88 mL/kg) e foi escalonado para o peso corporal de cada animal individual. O grupo 1 recebeu o veículo e serviu como o grupo de teste de desempenho para enxertia e progressão do tumor, bem como o controle. O grupo 2 foi administrado com o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) em 1 mg/kg. TABELA 34 Delineamento do protocolo para o estudo

[00162] Os tumores foram medidos duas vezes por semana, e cada animal foi eutanasiado quando sua neoplasia atingiu o volume de desfecho predeterminado (1000 mm3) ou no final do estudo, dia 39, o que ocorresse primeiro. Quando um tumor atingiu o volume de desfecho, o animal foi documentado como eutanasiado para progressão do tumor (TP), com a data da eutanásia. O tempo até o desfecho (TTE) para cada camundongo foi calculado a partir da seguinte equação:

sendo que TTE é expresso em dias, o volume no desfecho é expresso em mm3, b é a interceptação e m é o coeficiente angular da linha obtida por regressão linear de um conjunto de dados de crescimento tumoral transformado em log. O conjunto de dados consiste na primeira observação que excedeu o volume do desfecho usado na análise e as três observações consecutivas que precederam imediatamente a obtenção deste o volume do desfecho. O TTE calculado é geralmente menor que a data de TP, e neste dia o animal foi eutanasiado para medição do tamanho do tumor. Os animais que não atingiram o volume de desfecho foram designados com um valor de TTE igual ao último dia do estudo (D39). Qualquer animal classificado como tendo morrido de causas relacionadas ao tratamento (TR) foi designado com um valor de TTE igual ao do dia da morte. Qualquer animal classificado como tendo morrido de causas não relacionadas ao tratamento (NTR) foi excluído dos cálculos de TTE.

[00163] A eficácia do tratamento foi determinada a partir do retardo do crescimento do tumor (TGD), que é definido como o aumento no TTE mediano, em dias, para um grupo de tratamento em comparação ao grupo de controle: TGD = T — C

[00164] O aumento percentual no TTE mediano em relação ao grupo de controle, é

em que: T = TTE mediano para um grupo de tratamento, e C = TTE mediano para o grupo de controle designado.

[00165] A eficácia do tratamento em cada grupo pode ser indicada pelo volume mediano do tumor, MTV(n), que foi definido como o volume mediano do tumor no último dia do estudo (D39) no número de animais remanescentes (n) cujos tumores não atingiram o volume de desfecho.

[00166] A eficácia do tratamento pode, também, ser determinada a partir da incidência e da magnitude das respostas de regressão observadas durante o estudo. O tratamento pode causar regressão parcial (PR) ou regressão completa (CR) do tumor em um animal. Em uma resposta de PR, o volume do tumor foi de 50%, ou menos, do seu volume no D1 para três medições consecutivas durante o curso do estudo, e igual a ou maior que 13,5 mm3 para uma ou mais destas três medições. Em uma resposta de CR, o volume do tumor foi menor que 13,5 mm3 para três medições consecutivas durante o curso do estudo. Qualquer animal com uma resposta de CR no final de um estudo foi classificado ainda como um sobrevivente livre de tumor.

[00167] Os animais foram pesados diariamente pelos primeiros cinco dias e, então, duas vezes por semana pelo restante do estudo. Os camundongos foram observados frequentemente para a saúde e sinais evidentes de quaisquer efeitos colaterais adversos relacionados ao tratamento TR, e as observações clínicas notáveis foram registradas. A perda de peso corporal individual foi monitorada por protocolo, e qualquer animal com perda de peso superior a 30% para uma medição, ou superior a 25% para três medições, deveria ser eutanasiado para saúde como uma morte por TR. Se o peso corporal médio do grupo for recuperado, a dosagem pode recomeçar naquele grupo, mas em um cronograma de administração com dose menor ou menos frequente. A toxicidade aceitável foi definida como perda de peso corporal médio do grupo menor que 20% durante o estudo e de no máximo uma morte por TR dentre dez animais tratados, ou 10%. Qualquer regime de dosagem que resulte em maior toxicidade é considerado acima da dose máxima tolerada (MTD). Uma morte devia ser classificada como TR se fosse atribuível aos efeitos colaterais do tratamento, conforme evidenciado pelos sinais clínicos e/ou necrópsia, ou poderia, também, ser classificada como TR se fosse causada por causas desconhecidas durante o período de administração ou em um prazo de 14 dias da última dose. Uma morte foi classificada como NTR se houvesse evidências de que a morte estava relacionada ao modelo do tumor e não relacionada ao tratamento. As mortes por NTR são adicionalmente categorizadas como NTRa (causada por acidente ou erro humano), NTRm (causada por disseminação do tumor confirmada por necrópsia por invasão ou metástase), e NTRu (por causas desconhecidas).

[00168] O programa Prism 6.07 (GraphPad) para Windows foi empregado para as análises gráficas. As estatísticas não foram empregadas devido ao pequeno tamanho da amostra.

[00169] Um gráfico de dispersão foi construído para mostrar os valores de TTE para os camundongos individuais, por grupo; este plotagem mostra as mortes por NTR que foram excluídas de todas as outras figuras. Os volumes tumorais do animal individual e da mediana do grupo foram plotados como funções do tempo. Quando um animal saiu do estudo por causa do tamanho do tumor ou morte por TR, seu volume tumoral final registrado foi incluído com os dados usados para calcular o volume mediano em pontos no tempo subsequentes. Um gráfico de Kaplan-Meier foi construído para mostrar a porcentagem de animais em cada grupo remanescente no estudo em função do tempo. As curvas de crescimento tumoral foram truncadas após duas mortes por TR ocorridas no mesmo grupo. As alterações médias de peso corporal do grupo ao longo do decorrer do estudo foram representadas graficamente como alteração percentual ± SEM, desde o dia 1. As de curvas crescimento tumoral e alteração de peso corporal foram truncadas após mais de metade dos camundongos avaliáveis em um grupo terem saído do estudo. A Figura 10 ilustra o volume médio do tumor no estudo.

[00170] A Tabela 35 fornece as perdas de peso corporal médias, mortes por TR e NTR para os camundongos. Os sinais clínicos foram registrados quando observados, conforme mostrado nas Tabelas 36 a 38. Nenhuma morte por TR ocorreu durante o estudo. As perdas de peso corporal foram variáveis, graves para um animal em cada grupo, e resultaram de efeitos do estrogênio. Observações clínicas incluindo perda de peso, trompas uterinas dilatadas e cristais na bexiga estavam presentes em ambos os grupos e também foram atribuídas aos efeitos do estrogênio. A toxicidade do estrogênio resultou em duas mortes não relacionadas ao tratamento em cada grupo. O tratamento avaliado no estudo foi aceitavelmente tolerado. TABELA 35 Sumário da resposta

TABELA 36

TABELA 37 Medição do tumor

TABELA 38

[00171] Pelo fato de que dois dos quatro camundongos no grupo de controle e também no grupo de tratamento morreram devido à toxicidade do estrogênio, nenhuma conclusão estatística pode ser determinada. Com os dados disponíveis, o crescimento tumoral mediano e o volume tumoral médio foram reduzidos no grupo de tratamento em comparação ao grupo de controle. Esta diferença estava presente durante os 14 dias tratamento, mas também até o dia 25 do estudo. Levou ao grupo de controle 25 dias para atingir um volume tumoral de 1000 mm3, enquanto que o grupo tratamento levou 36 dias para atingir um volume tumoral de 1000 mm3. Isto sugere que o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) retarda o crescimento do tumor MCF-7 in vivo. Ao longo do estudo, tanto o grupo de controle quanto o grupo de tratamento mantiveram pesos similares. Isto sugere que o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) não causou toxicidade com relação à perda de peso. EXEMPLO 13: TRATAMENTO DE CÂNCER DE MAMA HUMANO HER2+ (BT474) COM SDAB ANTI-STAT3 BACTERIANO VHH13 (SEQ ID NO:3) EM CAMUNDONGOS DE XENOENXERTO

[00172] Neste exemplo, a eficácia do sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi determinada no xenoenxerto de tumor de mama humano BT474 em camundongos SCID CB.17.

[00173] Dois grupos de camundongos SCID CB.17 com 8 a 12 semanas de idade contendo xenoenxertos de fragmentos de tumor de 1 mm3 de BT474 nos seus flancos foram tratados de acordo com o protocolo mostrado na Tabela 39 quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 a 150 mm3. Todas as doses de veículo (controle de PBS) e sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) (mostradas na Tabela 39 como SB-01) foram administradas intraperitonealmente (i.p.) três vezes por dia, com seis horas de intervalo durante 14 dias, com duas doses sendo dadas no dia 1 (tid x 14, primeiro dia 2 doses). O volume da administração para o veículo e sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi de 0,478 mL por 20 gramas de peso corporal (23,88 mL/kg) e foi escalonado para o peso corporal de cada animal individual. O grupo 1 recebeu o veículo e serviu como o grupo de teste de desempenho para enxertia e progressão do tumor, bem como o controle. O grupo 2 foi administrado com o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) em 1 mg/kg. TABELA 39 Protocolo do estudo

[00174] Durante os primeiros 14 dias do estudo, o grupo de tratamento recebeu anti-STAT3 B VHH13 e o grupo de controle recebeu apenas o veículo. Conforme mostrado na Tabela 40, durante este tempo, o grupo de tratamento manteve e ganhou peso ao longo do estudo enquanto o grupo de controle tinha pesos menores ao longo do estudo. Isto sugere que o grupo de tratamento não experimentou toxicidade pelo sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) com relação à perda de peso. Tanto o volume tumoral médio quanto o volume do tumor mediano dos grupos foram similares, e exatamente iguais no dia 15 do estudo. No dia 59 do estudo, ambos os grupos atingiram um volume tumoral de 700 mm3. Isto sugere que o sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) não reduziu o crescimento dos tumores BT474 in vivo em comparação com o grupo de controle. A Figura 11 ilustra o volume tumoral médio do grupo. TABELA 40

EXEMPLO 14: PRODUÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL DE CAMUNDONGO DIRECIONADOS CONTRA SDAB ANTI-STAT3 BACTERIANO VHH13 (SEQ ID NO:3)

[00175] Neste exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo foram gerados contra o sdAb da invenção. Os animais usados eram camundongos fêmeas BALB/c com 8 a 10 semanas. Um adjuvante solúvel em água foi usado (CBL). O HAT e o HT usados foram Sigma-Aldrich.

[00176] O sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3) foi usado para imunizar três camundongos e fazer linhagens celulares de hibridoma. Os camundongos foram imunizados três vezes cada com adjuvante solúvel em água. Em um camundongo, o título sérico atingiu 1/51200. O camundongo foi sacrificado e as linhagens celulares de hibridoma foram feitas por células de baço em fusão com a linhagem celular de mieloma Sp2/0.

[00177] As células fundidas foram semeadas em placas de 96 poços por diluição limitada. As células fundidas foram cultivadas na presença de HAT, e 651 clones individuais foram testados. Dos 651 clones individuais, 27 clones positivos foram identificados, os quais se ligaram especificamente ao antígeno sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO:3). EXEMPLO 15: CITOTOXICIDADE DE ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO KRAS (G12D) EM CÉLULAS DE CÂNCER PANCREÁTICO HUMANAS PANC-1

[00178] Este exemplo demonstra os efeitos antiproliferativos do sdAb anti-KRAS (Gl2D) (SEQ ID NO:2) com o uso da linhagem de células de câncer pancreático humano PANC-1. Para os experimentos, as células PANC-1 foram cultivadas até atingirem uma confluência de 90%. Neste tempo, os estudos de proliferação foram executados com o uso do ensaio MTT, conforme descrito acima.

[00179] As propriedades antiproliferativas de sdAB anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) em células PANC-1 três dias após o tratamento são mostradas na Tabela 41. Células PANC-1 tratadas com sdAb anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) mostraram uma inibição do crescimento média de 19,9 e 37,7 a 50,0 e 100 μg/mL, respectivamente. TABELA 41 Ações antiproliferativas de sdAb Anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) sobre células de câncer PANC-1

[00180] Dessa forma, o sdAb anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) mostrou inibição do crescimento dose-dependente nas células de câncer pancreático humanas PANC-1. EXEMPLO 16: INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO IN VITRO POR SDAB ANTI TNF- ALFA

[00181] Este exemplo demonstra o desenvolvimento do método para determinar a concentração de TNF-alfa e a avaliação da inibição da função de TNF-alfa. A concentração de TNF-alfa necessária para mostrar modulação mensurável da atividade na linhagem de células linfoblásticas de pulmão humanas U937 foi avaliada por quantificação do ATP presente, que sinalizam a presença de células metabolicamente ativas com o uso do ensaio de viabilidade celular Promega's Cell Titer-GJo® Luminescent Cell Viability assay.

[00182] As células U937 foram semeadas e uma placa de microcultura de 96 poços de poliestireno transparente (placa de fundo plano Corning® Costar® de 96 poços, n° de Catálogo 3997) em um volume total de 90 μL/poço. Após 24 horas de incubação em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2 e 95% de ar, 5 μL de 20X TNF-alfa diluído serialmente em meio de cultura foram adicionados a cada poço em duplicata (resposta à dosagem de 10 pt, concentração mais elevada de 20 ng/mL). Adicionalmente, 5 μL de estaurosporina 20X diluída em meio de cultura foram adicionados a cada poço em duplicata (concentração de 1 nM).

[00183] Após 24 horas de cultura na presença dos agentes de teste, a concentração do composto necessária para mostrar modulação mensurável da atividade de TNF-alfa na linhagem de células U937, conforme avaliado por quantificação do ATP presente. O percentual de crescimento celular foi calculado em relação aos poços de controle não tratados. Todos os testes foram feitos em duplicata em cada nível de concentração.

[00184] O valor de EC50 para os agentes de teste foi estimado com o uso do programa Prism 6.05 por ajuste dos dados da curva com o uso da seguinte equação logística de quatro parâmetros:

onde Max é o % máximo de absorbância do controle, Min é o % mínimo de absorbância do controle na concentração de agente mais elevada, Y é o % de absorbância do controle, X é a concentração de agente, IC50 é a concentração de agente que inibe o crescimento celular em 50% em comparação com as células de controle, e n é o coeficiente angular da curva.

[00185] As figuras 12 e 13 demonstram que o TNF-alfa é citotóxico para as células U937. A IC50 para TNF-alfa contra U937 é 95,10 pg/mL. A curva de TNF-alfa mostra um efeito de morte com titulação da dose.

[00186] A Figura 14 demonstra que a citotoxicidade TNF-alfa contra U937 é inibida pelos três diferente VHHs anti-TNF-alfa. Quando o sdAb VHH62 anti-TNF-alfa (SEQ ID NO:47), sdAb VHH 66 anti-TNF-alfa (SEQ ID NO:45), e sdAb anti-TNF-alfa VHH69 (SEQ ID NO:46) foram incubados com uma dose constante de TNF-alfa, a EC50, todos os três VHHs anti-TNF-alfa inibem a morte de U937 pelo TNF-alfa. A IC50 do sdAb anti-TNF-alfa VHH62 (SEQ ID NO:47) foi de aproximadamente 713,6 ug/mL. A IC50 do sdAb anti-TNF-alfa VHH69 (SEQ ID NO:46) foi maior que 208,055 ug/mL. A IC50 do sdAb anti-TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO:45) não pode ser determinada porque ele inibiu completamente a citotoxicidade do TNF-alfa a partir de concentrações de cerca de 1X102ug/mL a 1 X 102 ug/mL de sdAb VHH66 anti-TNF-alfa (SEQ ID NO:45). Neste intervalo de concentração de sdAb anti-TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO:45), há um aumento no crescimento celular de U937, e dessa forma, a inibição completa da atividade de TNF-alfa.

[00187] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe considerável com referência a determinadas modalidades preferenciais, outras modalidades são possíveis. As etapas reveladas para os presentes métodos, por exemplo, não se destinam a limitar nem se destinam a indicar que cada etapa é necessariamente essencial para o método, mas em vez disso são apenas etapas exemplificadoras. Portanto, o escopo das reivindicações em anexo não deve ser limitado à descrição das modalidades preferenciais contidas nesta revelação. Todas as referências citadas na presente invenção estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades.

Claims (13)

1. Anticorpo de domínio único (sdAb) anti-TNF-alfa, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 45.

2. SdAb anti-TNF-alfa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser multiespecífico para dois ou mais antígenos.

3. Uso do sdAb anti-TNF-alfa definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença compreende uma ou mais doenças selecionadas a partir do grupo que inclui mieloma múltiplo, leucemias, linfomas, cânceres da mama, cânceres da mama triplo-negativos, cânceres da cabeça e pescoço, melanoma, cânceres dos ovários, cânceres de pulmão, cânceres pancreáticos, cânceres da próstata, sarcomas, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, cânceres hepatocelulares, glioma, neuroblastoma, astrocitoma, cânceres colorretais, tumores de Wilm, cânceres renais, cânceres de bexiga, cânceres de endométrio, cânceres cervicais, cânceres esofágicos, cânceres das céulas cutâneas escamosas, cânceres basocelulares, cânceres metastáticos, doenças autoimunes, doença renal policística, doenças dermatológicas, hidradenite supurativa, transplante, distrofia muscular e perda de massa muscular associada a cânceres e envelhecimento, endometriose, degeneração macular, degeneração da retina, acidente vascular cerebral, epilepsia, lesões traumáticas de cérebro e medula espinhal, hipertensão, hipertrofia cardíaca, doença de Alzheimer, hipertensão arterial pulmonar, diabetes mellitus tipo 2, espondilite anquilosante e infecções virais.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o sdAb anti-TNF-alfa é usado em combinação com um ou mais compostos.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o um ou mais compostos são um inibidor transcricional.

7. Método in vitro para medir os níveis de um sdAb em uma amostra de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) gerar um anticorpo monoclonal de camundongo direcionado contra o sdAb anti-TNF-alfa definido na reivindicação 1; b) realizar um imunoensaio quantitativo com o anticorpo monoclonal de camundongo e a amostra para determinar a quantidade de sdAb anti-TNF-alfa no indivíduo; e c) quantificar a quantidade de sdAb anti-TNF-alfa no indivíduo.

8. Método in vitro de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio quantitativo compreende um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), marcação analito-específica e ensaio de recaptura (SALRA), cromatografia líquida, espectrometria de massas, separação celular ativada por fluorescência ou uma combinação dos mesmos.

9. Método in vitro para diagnosticar um distúrbio mediado por um componente intracelular em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com o sdAb anti-TNF-alfa definido na reivindicação 1; b) determinar a quantidade do componente intracelular na amostra biológica; e c) comparar a quantidade determinada na etapa (b) com um padrão e determinar a diferença na quantidade entre a amostra e o diagnóstico padrão do distúrbio.

10. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 45.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o sdAb anti- TNF-alfa definido na reivindicação 1 ou 2, ou um polipeptídeo definido na reivindicação 10, em combinação com um veículo adequado.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais compostos adicionais.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o um ou mais compostos compreendem um inibidor transcricional.

Images