RS62694B1 - Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena - Google Patents

Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena

Info

Publication number
RS62694B1
RS62694B1 RS20211519A RSP20211519A RS62694B1 RS 62694 B1 RS62694 B1 RS 62694B1 RS 20211519 A RS20211519 A RS 20211519A RS P20211519 A RSP20211519 A RS P20211519A RS 62694 B1 RS62694 B1 RS 62694B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sdab
seq
stat3
sdabs
administration
Prior art date
Application number
RS20211519A
Other languages
English (en)
Inventor
Sunanda Singh
Original Assignee
Singh Molecular Medicine Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Singh Molecular Medicine Llc filed Critical Singh Molecular Medicine Llc
Publication of RS62694B1 publication Critical patent/RS62694B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Description

Opis
OSNOVA
[0001] Upotreba antitela sa jednim domenom (sdAbs) kao proteina koji vezuju jedan antigen ili kao antigen-vezujući domen u većem proteinu ili polipeptidu nudi brojne značajne prednosti u odnosu na upotrebu konvencionalnih antitela ili fragmenata antitela. Prednosti sdAbs uključuju: samo jedan domen je neophodan za vezivanje antigena sa visokim afinitetom i visokom selektivnošću; sdAbs se mogu eksprimirati od jednog gena i ne zahtevaju post-translacionu modifikaciju; sdAbs su veoma stabilna u odnosu na zagrevanje, pH, proteaze i druge denaturišuće agense ili uslove; sdAbs su jeftina za pripremu; i sdAbs mogu pristupiti ciljnim mestima i epitopima kojima konvencionalna antitela nemaju pristup.
[0002] Postoje brojne bolesti ili stanja, kao što je kancer, koja su izazvana aberantnim intracelularnim ili transmembranskim komponentama kao što su nukleotidi i proteini. Eliminacija aberantnih komponenti može se koristiti za prevenciju ili tretiranje bolesti ili stanja. Postoje brojna dostupna farmakološka jedinjenja za tretman, ali jedinjenja mogu biti neefikasna, ne mogu se isporučiti, ili su toksična za nepogođene ćelije.
[0003] Drugi tretmani uključuju upotrebu terapeutskih proteina ili sredstava koja sadrže egzogenu ciljanu sekvencu tako da terapeutsko sredstvo može biti prepoznato od strane receptora u ćelijskoj membrani, omogućavajući da terapeutsko sredstvo prođe ćelijsku membranu i uđe u ćeliju. Kada je terapeutsko sredstvo unutar ćelije, terapeutsko sredstvo može interagovati sa ciljanom komponentom da bi se tretirala bolest. Međutim, upotreba egzogene ciljane sekvence može ograničiti tip ćelija na koji se ciljano deluje sa terapeutskim sredstvom, i dodaje se na cenu proizvodnje terapeutskog sredstva.
[0004] Iz prethodno navedenih razloga, postoji potreba za kompozicijama i postupcima za tretiranje ili prevenciju bolesti koja se ne oslanja na egzogene ciljane sekvence ili hemijske kompozicije da bi ušle u ćeliju, i koje su efikasne u ciljanju samo pogođenih ćelija u telu.
[0005] Predmetno otkriće se odnosi na antitela sa jednim domenom (sdAbs), proteine i polipeptide koji sadrže sdAbs. sdAbs su usmereni protiv intracelularnih komponenti koje uzrokuju stanje ili bolest. Otkriće takođe uključuje nukleinske kiseline koje kodiraju sdAbs, proteine i polipeptide, i kompozicije koje sadrže sdAbs. Otkriće uključuje upotrebu kompozicija, sdAbs, proteina ili polipeptida za profilaktičke, terapeutske ili dijagnostičke svrhe. Otkriće takođe uključuje upotrebu monoklonskih antitela usmerenih ka sdAbs pronalaska, TOMOYUKI TANAKA ET AL (The EMBO Journal, No 26, Vol 13, 2007) su otkrili VHH molekule koji prepoznaju nekoliko onkogenih ras mutanata uključujući Kras, gde su VHH eksprimirani sa subcelularnim lokalizacionim signalima.
REZIME
[0006] Obim predmetnog pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0007] Termin "instanca/slučaj" kao što je ovde korišćen označava drugu informaciju koja nije unutar obima patentnih zahteva, ali može biti korisna u kontekstu razumevanja predmetnog pronalaska ili njegovog stavljanja u rad.
[0008] Otkriće obezbeđuje antitela sa jednim domenom (sdAb) usmerena protiv intracelularne komponente. Intracelularna komponenta može biti, na primer, protein, nukleinska kiselina, lipid, ugljeni hidrat, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STST5a, STAT5b, STAT6, TNF-alfa, i KRAS.
[0009] U jednoj isntanci otkriće je usmereno ka anti-STAT3 sdAb. Izborno, anti-STAT3 sdAb sadži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.
[0010] U sledećoj instanci otkriće je usmereno ka izolovanom polipeptidu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja kodira anti-STAT sdAb, kao što je, na primer, polipeptid dat u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.
[0011] U sledećem slučaju, otkriće je usmereno ka ćeliji domaćinu, i ćelija domaćin eksprimira aminokiselinsku sekvencu sdAb kao što je, na primer, aminokiselina data u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.
[0012] Jedna instanca otkrića je farmaceutska kompozicija koja sadrži sdAb, ili polipeptid, i farmaceutski prihvatljivi nosač. Izborno, sdAb sadrži anti-STAT3 sdAb koje sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4, i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.
[0013] Sledeća instanca otkrića je postupak za dijagnozu poremećaja posredovanog sa STAT3 kod subjekta, pri čemu postupak sadrži korake a) dovođenja u kontakt biološkog uzorka sa sdAb, ili polipeptidom; b) određivanje količine STAT3 u biloškom uzorku; i c) poređenje količine određene u koraku (b) sa standardom, pri čemu razlika u količini ukazuje na prisustvo poremećaja.
[0014] Sledeća instanca otkrića je postupak za prevenciju ili tretiranje bolesti ili poremećaja, ili prevencija ponovne pojave bolesti posredovane sa STAT3, ili za upotrebu u tretmanu u tretmanu kancera, ili bolesti izazvane abnormalnom ćelijskom proliferacijom, koji sadrži primenu anti-STAT3 sdAb, ili polipeptida, na subjekta kome je to potrebno. Izborno, sdAb sadrži anti-STAT3 sdAb koje sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.
[0015] Jedna istanca prema otkriću je anti-TNF-alfa sdAb. Izborno, anti-TNF-alfa sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7. Otkriće takođe sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
[0016] Sledeći primer izvođenja pronalaska je ćelija domaćin koja eksprimira aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
[0017] U sledećoj instanci otkrića je takođe farmaceutska kompozicija koja sadrži sdAb ili polipeptid i farmaceutski prihvatljiv nosač. Izborno, sdAb sadrži anti-TNF-alfa sdAb koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO:7.
[0018] Sledeća instanca otkrića je postupak za dijagnozu poremećaja posredovanog sa TNF-alfa kod subjekta, pri čemu postupak sadrži korake a) dovođenja u kontakta uzorka sa sdAb ili polipeptidom; b) određivanje količine TNF-alfa u biološkom uzorku; i c) poređenje količine određene u koraku (b) sa standardom, pri čemu razlika u količini ukazuje na prisustvo poremećaja.
[0019] U jednoj instanci, otkriće opisuje postupak za prevenciju tretiranja bolesti ili poremećaja ili ponovne pojave bolesti ili poremećaja posredovanog sa TNF-alfa, ili za upotrebu u tretmanu kancera, ili bolesti izavane abnormalnom proliferacijom ćelija, koji sadrži primenu anti-TNF-alfa sdAb, ili polipeptida, na sisara kome je to potrebno. Izborno, anti-TNF-alfa sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid, pri čemu izolovani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:7.
[0020] Jedna instanca otkrića je anti-KRAS sdAb. Izborno, anti-KRAS sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, pronalazak sadrži izolovani polipeptid, naznačeno time da izolovani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2. U sledećoj instanci, pronalazak sadrži ćeliju domaćina koja eksprimira aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2.
[0021] Sledeća instanca otkrića je farmaceutska kompozicija, koja sadrži sdAb ili polipeptid, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Izborno, sdAb sadrži anti-KRAS sdAb koje sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2.
[0022] Dodatna instanca otkrića je postupak za dijagnozu poremećaja posredovanog sa KRAS kod subjekta, pri čemu postupak sadrži korake a) dovođenja u kontakt uzorka sa sdAb ili polipeptidom; b) određivanje količine KRAS u biološkom uzorku; i c) poređenje količine određene u koraku (b) sa standardom, pri čemu razlika u količini ukazuje na prisustvo poremećaja. Izborno, sdAb sadrži anti-KRAS sdAb koje sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 2 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:2.
[0023] Otkriće takođe sadrži postupak za tretiranje bolesti korišćenjem anti-KRAS sdAb, pri čemu postupak sadrži primenu efikasne kolličine anti-KRAS sdAb na subjekta kome je to potrebno.
[0024] U jednoj instanci, otkriće opisuje postupak za prevenciju ili tretiranje bolesti ili poremećaja, ili ponovne pojave bolesti, posredovane sa KRAS, ili za upotrebu u tretmanu kancera, ili bolesti izazvane sa abnormalnom ćelijskom proliferacijom, koji sadrži primenu anti-KRAS sdAb ili polipeptida, na sisara kome je to potrebno. Izborno, anti-KRAS sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 2 i polipeptid sadrži izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 2.
[0025] U jednoj instanci otkriće opisuje postupak za primenu sdAb prema pronalasku, pri čemu postupak sadrži intravensku primenu, intramuskularnu primenu, oralnu primenu, rektalnu primenu, intraokularnu primenu, enteralnu primenu, parenteralnu primenu, potkožnu primenu, transdermalnu primenu, primenu kao kapi za oči, primenu kao sprej za nos, primenu inhalacijom ili nebulizacijom, topikalnu primenu, i primenu kao implantabilni lek.
[0026] U sledećoj instanci otkriće opisuje postupak za tretiranje oboljenja, prevencije bolesti ili prevenciju ponovne pojave bolesti korišćenjem sdAb prema pronalasku u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja. Izborno, jedno ili više jedinjenja je transkripcioni inhibitor.
[0027] U sledećoj instanci otkriće opisuje postupak merenja nivoa sdAb, pri čemu postupak sadrži korake a) stvaranja mišjeg monoklonskog antitela usmerenog protiv jednog ili više domena sdAb; b) izvođenje imunološke analize da se odredi količina sdAb kod subjekta; i c) kvantifikacija količine sdAb kod subjekta.
CRTEŽI
[0028] Ove i druge karakteristike, aspekti, i prednosti predmetnog pronalaska bolje će se shvatiti u odnosu na sledeći opis, priključene patentne zahteve, i prateće slike gde:
Slika 1 je šematska mapa VHH13 anti-STAT3 sdAb ekspresionog vektora pTT21-stt VHH13;
Slika 2 je šematska mapa VHH14 anti-STAT3 sdAb ekspresionog vektora pTT21-stt VHH14;
Slika 3 prikazuje rezultate testa imunoprecipitacije korišćenjem anti-STAT3 bakterijskog VHH13 STAT3 (SEQ ID NO:3) i anti-STAT3 bakterijskog VHH14 STAT3 (SEQ ID NO:4);
Slika 4 prikazuje rezultate testa imunoprecipitacije korišćenjem anti-STAT3 bakterijskog VHH13 STAT3 (SEQ ID NO:3);
Slika 5 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u MDA-MB-231 modelu ksenografta, doziranog 0.5mg/kg/dan;
Slika 6 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ. ID. NO. 3) sdAb u MDA-MB-231 modelu ksenografta na dozama u opsegu od 1 mg/kg dva puta dnevno do 2 mg/kg dva puta dnevno ili 2mg/kg/dan;
Slika 7 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u MDA-MB-231 modelu ksenografta, dozirano sa 5mg/kg/dva puta dnevno; Slika 8 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u DU145 modelu ksenografta, dozirano sa 5mg/kg/dva puta dnevno;
Slika 9 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u PANC-1 modelu ksenografta, dozirano sa 5mg/kg/dva puta dnevno;
Slika 10 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u MCF-7 modelu ksenografta, dozirano sa 1mg/kg/tri puta dnevno;
Slika 11 ilustruje inhibiciju rasta anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u BT-474 modelu ksenografta, dozirano sa 1mg/kg/tri puta dnevno;
Slika 12 ilustruje citotoksičnost TNF-alfa na U937 ćelije;
Slika 13 ilustruje citotoksičnost Staurosporine na U937 ćelije; i
Slika 14 ilustruje inhibiciju TNF-alfa citotoksičnosti sa anti-TNF-alfa sdAbs.
OPIS
[0029] Kao što je ovde korišćeno, sledeći termini i njihove varijante imaju značenja data u nastavku, osim ukoliko različito značenje nije jasno iz konteksta u kome je takav termin korišćen.
[0030] Termini na engleskom jeziku "a," "an," i "the" i slični referenti korišćeni ovde pokrivaju i jedninu i množinu osim ukoliko njihova upotreba u kontekstu ne ukazuje drugačije.
[0031] Termin "antigena determinanta" odnosi se na epitop na antigenu prepoznat od strane antigen-vezujućeg molekula (kao što je sdAb ili polipeptid prema pronalasku) i naročito sa antigen-vezujućim mestom antigen-vezujućeg molekula. Termin "antigena determinanta" i "epitop" mogu se takođe koristiti naizmenično. Aminokiselinska sekvenca koja se može vezati za, koja ima afinitet za i/ili koja ima specifičnost za specifičnu antigenu determinantu, epitop, antigen ili protein kaže se da je "protiv" ili "usmerena protiv" antigene determinante, epitopa, antigena ili proteina.
[0032] Kao što je ovde korišćeno, termin "sadrži" i varijante termina, kao što su "koji sadrži" i "sadrži," ne isključuju druge aditive, komponente, cele brojeve ili korake.
[0033] Predviđeno je da sdAbs, polipeptidi i proteini opisani ovde mogu sadržati takozvane "konzervativne" aminokiselinske supstitucije, koje se generalno mogu opisati kao aminokiselinske supstitucije u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom slične hemijske strukture i koji ima mali ili nema uticaj na funkciju, aktivnost ili druge biološke osobine polipeptida. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su dobro poznate u tehnici. Konzervativne supstitucije u kojima je jedna aminokiselina unutar sledećih grupa (a)-(e) supstituisana sa drugom aminokiselinom unutar iste grupe: (a) mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i Gly; (b) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani) amidi: Asp, Asn, Glu i Gln; (c) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (d) veliki alifatični, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val i Cys; i (e) aromatični ostaci: Phe, Tyr i Trp. Druge konzervativne supstitucije uključuju: Ala u Gly ili u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln ili u His; Asp u Glu; Cys u Ser; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Ala ili u Pro; His u Asn ili u Gln; Ile u Leu ili u Val; Leu u Ile ili u Val; Lys u Arg, u Gln ili u Glu; Met u Leu, u Tyr ili u Ile; Phe u Met, u Leu ili u Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp; i/ili Phe u Val, u Ile ili u Leu.
[0034] "Domen" kao što je ovde korišćeno generalno se odnosi na globularni region lanca antitela, i naročito globularni region teškog lanca antitela, ili na polipeptid koji se suštinski sastoji od takvog globularnog regiona.
[0035] Aminokiselinska sekvenca i struktura sdAb je tipično sastavljena od četiri okvirna regiona ili "FRs," koij se označavaju kao "Okvirni region 1" ili "FR1"; kao "Okvirni region 2" ili "FR2"; kao "Okvirni region 3" ili "FR3"; i kao "Okvirni region 4" ili "FR4," respektivno. Okvirni regioni su isprekidani sa pri regiona koji određuju komplementarnost ili "CDRs," koji se označavaju kao "Region koji određuje komplementarnost 1" ili "CDR1"; kao "region koji određuje komplementarnost 2" ili "CDR2"; i kao "region koji određuje komplementarnost 3" ili "CDR3," respektivno.
[0036] Kao što je ovde korišćeno, termin "humanizovano sdAb" označava sdAb koje je imalo jednan ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci prirodne VHH sekvence zamenjene sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućem položaju u VH domenu konvencionalnog 4-lančanog humanog antitela. Ovo se može izvesti postupcima koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, FRs sdAbs se mogu zameniti sa humanim varijabilnim FRs.
[0037] Kao što je ovde korišćeno, "izolovana" nukleinska kiselina ili aminokiselina je razdvojena od najmanje jedne druge komponente sa kojom je obično povezana, kao što je njen izvor ili medijum, druga nukleinska kiselina, drugi protein/polipeptid, druga biološka komponenta ili makromolekul ili kontaminant, nečistoća ili minorna komponenta.
[0038] Termin "sisar" je definisan kao individua koja pripada klasi Mammalia i uključuje, bez ograničenja, ljude, domaće i poljoprivredne životinje, i životinje iz zoološkog vrta, sportske, i životinje kućne ljubimce, kao što su krave, konji, ovce, psi i mačke.
[0039] Kao što je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva koja odlažu apsorpciju, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington’s Pharmaceutical Sciences, standardnog referentnog teksta u oblasti. Poželjni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološki rastvor, Ringer rastvore, rastvor dekstroze, PBS (fosfatpuferovani fiziološki rastvor), i 5% humani serum albumin. Takođe se mogu koristiti lipozomi, katjonski lipidi i nevodeni vehikulumi kao što su neisparljiva ulja. Korišćenje takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznato u tehnici. Izuzev ukoliko je bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nekompatibilno sa terapeutskim sredstvom kao što je prethodno definisano, predviđena je njihova upotreba u kompoziciji prema predmetnom pronalasku.
[0040] "Kvantitativna imunoanaliza" odnosi se na bilo koja sredstva merenja količine antigena prisutnog u uzorku korišćenjem antitela. Postupci za izvođenje kvantitativnih imunoanaliza uključuju, ali nisu ograničeni na, enzimsku imuno analizu (ELISA), analizu specifičnog obeležavanja analita i ponovnog hvatanja (SALRA), tečnu hromatografiju, masenu spektrometriju, ćelijsko sortiranje aktivirano fluorescencijom, i slično.
[0041] Termin "rastvor" odnosi se na kompoziciju koja sadrži rastvarač i supstancu koja se rastvara, i uključuje prave rastvore i suspenzije. Primeri rastvora uključuju čvrstu supstancu, tečnost ili gas rastvoren u tečnosti i čestice ili micele suspendovane u tečnosti.
[0042] Termin "specifičnost" odnosi se na brojne različite tipove antigena ili antigenih determinanti za koju se može vezati određeni antigen-vezujući molekul ili antigen-vezujući protein. Specifičnost antigen-vezujućeg proteina može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen ravnotežnom konstantnom disocijacije antigena sa antigenvezujućim proteinom (KD), je mera snage vezivanja između antigene determinante i antigenvezujućeg mesta na antigen-vezujućem proteinu: što je manja vrednost KD, snaga vezivanja je veća između antigene determinante i antigen-vezujućeg molekula (alternativno, afinitet takođe može biti izražen kao konstanta afiniteta (KA), koja je 1/KD). Kao što će stručnjaku biti jasno, afinitet se može odrediti u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa. Aviditet je mera snage vezivanja između antigen-vezujućeg molekula i antigena. Aviditet je vezan i za afinitet između antigene determinante i njenog antigen vezujućeg mesta na antigen-vezujućem molekulu i broj relevantnih vezujućih mesta prisutnih na antigen-vezujućem molekulu. Specifilno vezivanje antigen-vezujućeg proteina za antigen ili antigenu determinantu može se odrediti bilo kojim poznatim načinom, kao što je, na primer, Scatchard analiza i/ili analiza kompetivnog vezivanja, kao što su radioimunoanalize (RIA), enzimske imunoanalize (EIA) i sendvič kompetitivne analize.
[0043] Kao što je ovde korišćeno, termin "rekombinantan" odnosi se na upotrebu postupaka genetskog inženjeringa (na primer, kloniranje i amplifikacija) koje se koriste za proizvodnju sdAbs prema pronalasku.
[0044] "Antitelo sa jednim domenom," "sdAb" ili "VHH" može se generalno definisati kao polipeptid ili protein koji sadrži aminokisleinsku sekvencu koja se sastoji od četiri okvirna regiona isprekidana sa tri regiona koji određuju komplementarnost. Ovo je predstavljeno kao FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. sdAb prema pronalasku takođe uključuje polipeptid ili protein koji sadrži sdAb aminokiselinsku sekvencu. Tipično, sdAbs su proizvedeni kod kamelida kao što su lame, ali se mogu takođe veštački stvoriti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Kao što je ovde korišćeno, varijabilni domeni prisutni u teškim lancima prirodnih antitela takođe će biti označeni kao "VHH domeni," da bi se razlikovali od varijabilnih domena teškog lanca koji su prisutni u konvencionalnim 4-lančanim antitelima, označeni kao "VH domeni," i formiraju varijabilne domene lakog lanca koji su prisutni u konvencionalnim 4-lančanim antitelima, označeni kao "VL domeni." "VHH" i "sdAb" su ovde korišćeni naizmenično. Numerisanje aminokiselinskih ostataka sdAb ili polipeptida je prema generalnom numerisanju VH domena dato od strane Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest," US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91). Prema ovom numerisanju, FR1 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 1-30, CDR1 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 31-36, FR2 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 36-49, CDR2 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 50-65, FR3 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 66-94, CDR3 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 95-102, i FR4 sdAb sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 103-113.
[0045] Termin "veštački" odnosi se na proizvodnju in vitro hemijskim ili enzimskim sintezama.
[0046] Termin "target" kao što je ovde korišćeno odnosi se na komponentu, antigen, ili deo koji je prepoznat od strane sdAb. Termin "intracelularni target" odnosi se na bilo koju komponentu, antigen, ili deo prisutan unutar ćelije. "Transmembranski target" je komponenta, antigen, ili deo koji je lociran unutar ćelijske membrane. "Ekstracelularni target" odnosi se na komponentu, antigen, ili deo koji je lociran izvan ćelije.
[0047] "Terapeutska kompozicija" kao što je ovde korišćeno označava supstancu koja treba da ima terapeutski efekat kao što su farmaceutske kompozicije, genetički materijali, biološki materijali, i druge supstance. Genetički materijali uključuju supstance koje treba da imaju direktan ili indirektan genetički terapeutski efekat kao što su genetički vektori, genetički regulatorni elementi, genetički strukturni elementi, DNK, RNK i slično. Biološki materijali su supstance koji su živa materija ili izvedene iz žive materije koja treba da ima terapeutski efekat.
[0048] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "terapeutski efikasna količina" i "profilaktički efikasna količina" odnose se na količinu koja obezbeđuje terapeutski benefit u tretmanu, prevenciji, ili rukovanju bolešću ili očiglednim simptomima bolesti. Terapeutski efikasna količina može tretirati boelst ili stanje, simptom oboljenja, ili predispoziciju za bolest, u svrhu lečenja, ozdravljenja, umanjivanja, olakšanja, izmene, remedijacije, popravljanja, poboljšanja,
1
ili uticaja na bolest, simptome bolesti, ili predispoziciju za bolest. Specifična količina koja je terapeutski efikasna može se lako odrediti od strane medicinskog radnika, i može varirati u zavisnosti od faktora pozantih u tehnici, kao što su, npr., tip bolesti, istorija pacjenta i starost, stadijum bolesti, i primena drugih terapeutskih sredstava.
[0049] Predmetni pronalazak odnosi se na antitela sa jednim domenom (sdAbs) koja su usmerena protiv intracelularnih komponenti, kao i na proteine i polipeptide koji sadrže sdAbs i nukleotide koji kodiraju proteine i polipeptide. Pronalazak se takođe može odnositi na sdAbs koji su usmereni protiv intercelularnih, transcelularnih i ekstracelularnih targeta ili antigena. Pronalazak takođe uključuje nukleinske kiseline koje kodiraju sdAbs, proteine i polipeptide, i kompozicije koje sadrže sdAbs. Pronalazak uključuje upotrebu kompozicija, sdAbs, proteina ili polipeptida za profilaktičke, terapeutske ili dijagnostičke svrhe.
[0050] SdAbs imaju brojne jedinstvene strukturne karakteristike i funkcionalne osobine koje daju sdAbs visoku prednost za upotrebu kao funkcionalni antigen-vezujući domeni ili proteini. SdAbs se funkcionalno vezuju za antigen u odsustvu varijabilnog regiona lakog lanca, i mogu funkcionisati kao pojedinačna, relativno mala, funkcionalna antigen-vezujuća strukturna jedinica, domen ili protein. Ovo razlikuje sdAbs od domena konvencionalnih antitela, koji sami po sebi ne funkcionišu kao antigen-vezujući protein ili domen, već se moraju kombinovati sa konvencionalnim fragmentima kao što su Fab fragmenti ili ScFv fragment da bi se vezali za antigen.
[0051] SdAbs se mogu dobiti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, jedan postupak za dobijanje sdAbs uključuje (a) imunizaciju kamelide sa jednim ili više antigena, (b) izolovanje perifernih limfocita iz imunizovane kamelide, dobijanje ukupne RNK i sintetisanje odgovarajućih cDNK, (c) konstruisanje biblioteke cDNK fragmenata koji kodiraju VHH domene, (d) transkripciju VHH domen-kodirajućih cDNK dobijenih u koraku (c) u iRNK korišćenjem PCR, pretvaranje iRNK u format za prikazivanje u ribozomima, i selekcija VHH domena ribozomalnim prikazom, i (e) ekspresija VHH domena u pogodnom vektoru i, izborno prečišćavanje eksprimiranog VHH domena.
[0052] Sledeći postupak za dobijanje sdAbs pronalaska je priprema nukleinske kiseline koja kodira sdAb korišćenjem tehnika za sintezu nukelinskih kiselina, što je praćeno ekspresijom nukleinske kiseline in vivo ili in vitro. Dodatno, sdAb, polipeptidi i proteini prema pronalasku mogu se pripremiti korišćenjem sintetičkih ili polu-sintetičkih tehnika za pripremu proteina, polipeptida ili drugih aminokiselinskih sekvenci.
[0053] sdAbs pronalaska će se generalno vezivati za sve prirodne ili sintetičke analoge, varijante, mutante, alele, delove i fragmente targeta, ili najmanje za one varijante, mutante, alele, delove i fragmente targeta koji sadrže jednu ili više antigenih determinanti ili epitopa koij su suštinski isti kao antigena determinanta ili epitop za koji se sdAbs prema pronalasku vezuje kod targeta divljeg tipa. sdAbs pronalaska se mogu vezati za takve analoge, varijante, mutante, alele, delove i fragmente sa afinitetom i/ili specifičnošću koja je ista kao, ili koja je veća ili manja od afiniteta i specifičnosti sa kojom se sdAbs pronalaska vezuje za target divljeg tipa. Takođe je predviđeno unutar obima pronalaska da se sdAbs pronalaska vezuju za neke analoge varijante, mutante, alele, delove i fragmente targeta ali ne za druge. Dodatno, sdAb pronalaska mogu biti humanizovani, i mogu biti monovalentni ili multivalentni, i/ili multispecifični. Dodatno, sdAbs pronalaska se mogu vezati za fosforilovani oblik target proteina kao i nefosforilisani oblik target proteina. sdAbs se mogu vezati za druge molekule kao što su albumin ili drugi makromolekuli.
[0054] Dodatno, unutar obima pronalaska je da se sdAbs multivalentna, odnosno, sdAb mogu imati dva ili više proteina ili polipeptida koji su usmereni protiv dva ili više različitih epitopa targeta. U takvom multivalentnom sdAb, protein ili polipeptid može biti usmeren, na primer, protiv istih epitopa, suštinski istih epitopa, ili različitih epitopa. Različiti epitopi mogu se nalaziti na istom targetu, ili mogu biti na dva ili više različitih targeta.
[0055] Takođe je predviđeno da sekvenca jednog ili više sdAbs pronalaska može biti povezana ili spojena sa jednom ili više linker sekvenci. Linker može biti, na primer, proteinska sekvenca koja sadrži kombinaciju serina, glicina i alanina.
[0056] Takođe je unutar obima pronalaska korišćenje delova, fragmenata, analoga, mutanata, varijanti, alela i/ili derivata sdAbs pronalaska, sve dok su pogodni za opisane upotrebe.
[0057] Kako su sdAbs pronalaska uglavnom namenjeni za terapeutsku i/ili dijagnostičku upotrebu, usmereni su protiv sisarskih, poželjno humanih, targeta. Međutim, moguće je da sdAbs opisani ovde su unakrsno reaktivni sa targetima iz drugih vrsta, na primer sa targetima iz jedne ili više drugih vrsta primata ili drugih životinja (na primer, miša, pacova, zeca, svinje ili psa), i naročito u životinjskim modelima za bolesti i poremećaje povezane sa bolestima povezanim sa targetom.
[0058] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira sdAb pronalaska. Takva nukleinska kiselina može biti, na primer, u obliku genetičkog konstrukta.
[0059] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na domaćina ili ćeliju domaćina koja eksprimira ili je sposobna da eksprimira sdAb pronalaska, i/ili koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sdAb pronalaska. Sekvence sdAbs se mogu koristiti za inserciju u genom bilo kog organizma da bi se stvorio genetički modifikovan organizam (GMO). Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, biljke, bakterije, viruse, i životinje.
[0060] Pronalazak se dalje odnosi na postupke za pripremu ili stvaranje sdAbs, nukleinskih kiselina koje kodiraju sdAbs, ćelije domaćine koje eksprimiraju ili su sposobne da eksprimiraju takve sdAbs, proizvode i kompozicije koje sadrže sdAbs pronalaska.
[0061] Pronalazak se dalje odnosi na primene i upotrebe sdAb, nukleinskih kiselina koje kodiraju sdAbs, ćelija domaćina, proizvoda i kompozcija opisanih ovde. Takv proizvod ili kompozicija može, na primer, biti farmaceutska kompozicija za tretman ili prevenciju bolesti, ili proizvod ili kompozicija za dijagnostičku upotrebu. sdAbs se mogu korisiti u različitim analizama, na primer ELISA analizama i analizama masene spektrometrije da bi se izmerili nivoi sdAbs u serumu i tkivima.
[0062] U sledećem aspektu, nukleinska kiselina koja kodira jedno ili više sdAb pronalaska može se insertovati u genom organizma da bi se tretirale ili sprečile bolesti.
[0063] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na sdAbs, kao i na proteine ili polipeptide koji sadrže ili se suštinski sastoje od jednog ili više takvih sdAbs, koji se mogu korisiti u profilaktičke, terapeutske i/ili dijagnostičke svrhe.
[0064] Postupci i kompozicije detaljno date u predmetnom pronalasku mogu se korisiti za tretiranje bolesti opisanih ovde, i mogu se koristiti sa bilo kojom dozom i/ili formulacijom opisanom ovde ili poznatom na drugi način, kao i sa putem primene opisanim ovde ili na drugi način poznat stručnjaku.
[0065] sdAbs pronalaska, naročito anti-STAT3 VHH, anti-KRAS VHH, i anti-TNF-alfa VHH predmetnog pronalaska, mogu se koristiti za tretman i prevenciju malignih bolesti uključujući, ali se ne ograničavajući na: multipni mijelom, leukemije (HTLV-1 zavisna, eritroleukemija, akutna mijelogena leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), i leukemija velikih granularnih limfocita (LGL), limfome (EBV-povezani/Burkitt mycosis fungoides, kožni T-ćelijski limfom, ne-Hodgkin limfomi (NHL), anaplastični limfomi velikih ćelija (ALCL), kanceri dojke, trostruko negativni kanceri dojke, kanceri glave i vrata, melanom, kanceri jajnika, kanceri pluća, kanceri pankreasa, kanceri prostate, sarkom, osteosarkom, Kaposi sarkom, Ewing sarkom, hepatocelularne kancere, gliome, neuroblastome, astrocitome, kolorektalne kancere, Wilm tumore, kancere bubrega, kancere bešike, kancere endometrijuma, cervikalne kancere, kancere jednjaka, kožene kancere skvamoznih ćelija, kancere bazalnih ćelija, i bilo koje metastazirajuće kancere. sdAbs se mogu koristiti kod pacijenata sa kancerom da bi se pomoglo u sprečavanju ili smanjenju gubitka težine ili kaheksije usled kancera.
[0066] sdAb, naročtio anti-STAT3 i anti-TNF-alfa sdAbs predmetnog pronalaska, mogu se takođe koristiti za tretman i prevenciju bolesti kao što su, ali se ne ograničavajući na:
1
autoimune bolesti (npr., reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis, Crohn bolest, bakterijski indukovani kolitis, astma, skleroderma, lupus, encefalomijelitis, arteritis, vaskulitis, glomerulonefritis, uveitis, uveoretinitis, multipla skleroza), policistična bolest bubrega, dermatološke bolesti (npr., psorijaza, alopecia areata, atopijski deramtitis, keloidi/hipertrofirani ožiljci, lipom, Padget bolest, i aktinska keratoza), Hidradenitis suppurativa, transplantaciju (npr., čvrstog organa, kostne srži, ruke, lica, udova, bilo kog dela tela), mišićnu distrofiju i gubitak mišićne mase povezan sa kancerima i starenjem, endometriozu, makularnu degeneraciju, retinalnu degeneraciju, šlog, epilepsiju, traumatične povrede mozga i kičmene moždine, hipertenziju, srčanu hipertrofiju, Alzheimer bolest, hipertenziju plućne arterije, dijabetes melitus tipa 2, i ankilozni spondilitis. Dodatno sdAbs mogu targetirati retke bolesti. Primeri ovih retkih bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, trostruko negativne kancere, kancere pankreasa, AML (akutna mijeloidna leukemija), kancere glave i vrata, multipni mijelom, i hemorezistentne kancere.
[0067] Virusne infekcije se mogu tretirati ciljanim dejstvom na intracelularne virusne proteine u inficiranim ćelijama. Virusni proteini, kao što je HIV reverzna transkriptaza, mogu blokirati životni ciklus virusa. sdAb pronalaska mogu takođe targetirati intracelularne virusne proteine kao što su Ebola VP24 i stoga blokirati sposobnost Ebola virusa da ugasi anti-virusni imuni odgovor domaćina. sdAbs pronalaska se mogu koristiti za targetiranje bolesti kada postoji prekomerna ekspresija intracelularnog molekula. Huntington bolest se može tretirati sa sdAbs.
[0068] sdAbs pronalaska se mogu koristiti sa jednim ili više jedinjenja. Na primer, sdAb pronalaska može se koristiti sa JAK/STAT inhibitorima kao što su, na primer, Kurkumin, Resveratrol, Kukurbitacin A, B, E, I, Q, Flavopiridol, Dezoksitetrangomicin, derivati Ciklopentanona, N-Acilhomoserin Lakton, Indirubin derivati, Meizoindigo, Tirfostini, koordinaciona jedinjenja platine (npr., IS3-295), peptidomimetici, antisense oligonukleotidi, S3I-201, fosfotirozin tripeptid derivati, inhibitori HIV proteaze (npr., nelfinavir, indinavir, sakvinavir, & ritornavir), JSI-124, XpYL, Ac-pYLPQTV-NH2, ISS 610, CJ-1383, pirimetamin, Metformin, Atiprimod, S3I-M2001, STX-0119; N-[2-(1,3,4-oksadiazolil)]-4 hinolinkarboksamid derivat, S3I-1757, LY5; 5,8-diokso-6(piridin-3-ilamino)-5,8,-dihidronaftalen-1-sulfonamid, witacinstin, Static, STA-21, LLL-3, LLL12, XZH-5, SF-1066, SF-1087, 17o, Kriptotansinon, FLL32, FLL62, C188-9, BP-1108 i BP-1075, Galielalakton, JQ1, 5, 15 DPP, WP1066, Niklozamid, SD1008, Nifuroksazid, Kriptotansinon, BBI hinon, i Ruksolitnib fosfat. Jedno ili više jedinjenja može povećati terapeutski odgovor i poboljšati efiaksnost sdAb pronalaska. Dodatno, efikasnost sdAb se može povećati njegovim kombinovanjem sa peptidima, peptidomimeticima, i drugim lekovima, kao što su, na primer, ali se ne ograničavajući na, cimetidin, atorvastatin, celekoksib, metformin, i cimetidin. Dodatno, anti-STAT3 sdAbs mogu pretvoriti radiorezistentne kancere u radiosenzitivne kancere u odnosu na terapiju zračenjem.
[0069] Takođe je predviđeno da jedno ili više od sdAbs pronalaska može biti kombinovan, ili sdAbs pronalaska se može kombinovati sa drugim sdAbs.
[0070] Predviđeno je da određeni sdAbs pronalaska mogu proći ćelijsku membranu i ući u ćeliju bez pomoći dodatnih targeting proteinskih sekvenci na sdAb, i bez pomoći egzogenih jedinjenja koja usmeravaju sdAb da se veže za receptore na površini ćelije i pređu ćelijsku membranu.
[0071] Nakon prelaska ćelijske membrane, ovi sdAbs mogu targetirati transmembranske ili intracelularne molekule ili antigene. Ovi intracelularni ili transmembranski targeti mogu biti, na primer, proteini, ugljeni hidrati, lipidi, nukleinske kiseline, mutirani proteini, virusni proteini, i prioni. sdAb targeti mogu funkcionisati kao enzimi, strukturni proteini ćelije, intracelularni delovi molekula ćelijske membrane, molekuli unutar membrana organela, bilo koji tip RNK molekula, bilo koji regioni DNK ili hromozoma, metilovane ili nemetilovane nukleinske kiseline, delimično sastavljeni molekuli unutar sintetičkog mehanizma ćelije, molekuli sekundarnih glasnika, i molekuli unutar mehanizama ćelijske signalizacije. Targeti mogu uključivati sve molekule u citoplazmi, nukleusu, organelama, i ćelijskoj membrani. Molekuli predodređeni za sekreciju ili postavljanje u ćelijsku membranu mogu se targetirati unutar citoplazme pre nego što napuste ćeliju.
[0072] sdAb targeti mogu biti u ljudima, životinjama, biljkama, gljivama, parazitima, protistima, bakterijama, virusima, prionima, prokariotskim ćelijama, i eukariotskim ćelijama. Neki primeri inter- i intracelularnih signalnih molekula i grupa proteina koji se mogu targetirati sa sdAbs pronalaska su: onkogeni proizvodi, hormoni, citokini, faktori rasta, neurotransmiteri, kinaze (uključujući tirozin kinazu, serin kinazu, i treonin kinazu), fosfataze, ubikvitin, ciklični nukleotidi, ciklaze (adenilil i guanilil), G proteini, fosfodiesteraze, superfamilija GTPaza, imunoglobulini (antitela, Fab fragmenti, vezujuća sredstva, sdAbs), suprfamilija imunoglobulina, inozitol fosfat lipidi, steroidni receptori, kalmodulin, CD grupa (npr., CD4, CD8, CD28, itd.), transkripcioni faktori, TGF-beta, TNF-alfa i beta, superfamilija TNF liganda, notch receptor signalni molekuli, hedgehog receptor signalni molekuli, Wnt receptor signalni molekuli, signalni molekuli toll-sličnom receptoru, kaspaze, aktin, miozin, miostatin, 12-lipoksigenaza, 15-lipoksigenaza, superfamila lipoksigenaza, reverzna transkriptaza, virusi i njihovi proteini, amiloidni proteini, kolagen, G protein kuplovani receptori, mutirani normalni proteini, prioni, Ras, Raf, Myc, Src, BCR/ABL, MEK, Erk, Mos,
1
Tpl2, MLK3, TAK, DLK, MKK, p38, MAPK, MEKK, ASK, SAPK, JNK, BMK, MAP, JAK, PI3K, ciklooksigenaza, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, Myc, p53, BRAF, NRAS, KRAS, HRAS i hemokini.
[0073] KRAS je homolog Kirsten ras onkogena iz sisarske familije ras gena. KRAS kodira protein koji je član superfamilije male GTPaze. Protein je impliciran u različitim malignitetima, uključujući adenokracinom pluća, mukozni adenom, duktalni karcinom pankreasa, i kolorektalni karcinom. Pod normalnim uslovima, članovi Ras familije utiču na događaje rasta i diferencijacije ćelije u subcelularnom membranskom signalnom sistemu zasnovanom na kompartmentalizaciji. Međutim, onkogeni Ras može deregulisati procese koji kontrolišu i ćelijsku proliferaciju i apoptozu.
[0074] Anti-KRAS sdAbs su razvijena za targeting KRAS (G12D) divljeg tipa i mutirani da bi se poremetila njegova uloga u malignim ćelijama kao što je, na primer, ćelije uključene u kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer žučnog trakta, kancer pluća, leukemije, i druge metastazirajuće malignitete. Bez vezivanja za određeni mehanizam, smatra se da anti-KRAS sdAb vezuju KRAS i blokiraju nishodnu signalizaciju KRAS u malignim ćelijama. Dodatno, anti-KRAS sdAb mogu uspešno tretirati malignitete koji su rezistentni na anti-EGFR biološke preparate (npr., cetuksimab i panitumumab).
[0075] Korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici, rekombinantni humani mutantni KRAS (G12D) protein je korišćen za stvaranje sdAbs koja su usmerena protiv ili se mogu vezati za epitop KRAS ili mutiranog KRAS (G12D), ili druge KRAS mutante. Dodatno, sdAbs se mogu stvoriti protiv drugih KRAS mutanat. Da bi se stvorila anti-KRAS sdAbs, rekombinantni humani KRAS pune dužine (Gen ID: 3845) je eksprimiran u Escherichia coli.
[0076] Nekoliko sdAbs je dobijeno i podvrgnuto skriningu. DNK sekvenca jednog anti-KRAS (G12D) sdAb, nazvanog KRAS_13 (SEQ ID NO:1), je prikazana u nastavku:
[0077] Aminokiselinska sekvenca anti-KRAS (G12D) sdAb (SEQ ID NO. 2), KRAS_13, je prikazana ispod, sa podvučenim CDR:
1
[0078] Dodatno, predmetni pronalazak sadrži jedno ili više mišjih monoklonskih antitela koja su usmerena protiv jednog ili više domena anti-KRAS sdAb pronalaska. Mišje monoklonsko antitelo može se stvoriti postupcima koji su poznati stručnjaku, na primer, mišje monoklonsko antiotelo se može proizvesti u mišjem hibridomu. Mišje monoklonsko antitelo može se koristiti u dijagnostičkim analizama, na primer, antitelo se može koristiti u imunoanalizi kao što je ELISA ili maseno spektroskopskoj analizi da bi se merila količina anti-KRAS sdAb prisutna u serumu pacijenta. Citotoksičnost KRAS (G12D) sdAbs na PANC-1 ćelije humanog kancera pankreasa je testirana, kao što je opisano u nastavku.
[0079] STAT3 je član prenosilaca signala i aktivatora transkripcije (STAT) familije proteina koji nose i signalnu transdukciju i aktivaciju transkripcionih funkcija. STAT3 je široko eksprimiran i aktivira se preko fosforilacije na tirozinu i/ili serinu kao DNK vezujući protein u odgovoru na različite citokine i faktore rasta kao što su EGF, IL-6, PDGF, IL-2 i G-CSF. STAT3 fosfoprotein formira homodimere i heterodimere sa drugim članovima STAT familije i premešta se u nukleus da bi modulirao transkripciju različitih gena, i kao rezultat ima ključnu ulogu u mnogim ćelijskim procesima kao što je rast ćelija, apoptoza, angiogeneza, izbegavanje imunog sistema, i preživljavanje.
[0080] Anti-STAT3 sdAb se može dati pacijentima i drugim organizmima da bi se tretirale bolesti izvane fosforilisanim i ne-fosforilisanim STAT3, kao i da se spreči razvoj ili ponovna pojava bolesti. Na primer, pacijenti koji su imali transplantaciju organa i transplantaciju kostne srži su u većem riziku od kožnog SCCA i BCCA usled imunosupresivnih lekova koje uzimaju. Primena anti-STAT3 sdAb može smanjiti ili eliminisati ovaj rizik. Pacijenti tretirani u odnosu na malignosti koji su u riziku od ponovne pojave imaće korist od tretmana sa anti-STAT3 sdAb. Na osnovu porodične medicinske istorije i HLA-tipa, neki pojedinci će biti u povećanom riziku od nekih tipova autoimunih bolesti i mogu imati korist od tretmana sa sdAbs da bi se smanjio rizik razvoja te autoimune bolesti. Rizik od kancera dojke može biti smanjen sa primenom anti-STAT3 lekova kao što su GLG-302, kao što je pokazano u skorijoj NCI studiji.
[0081] Dodatno inhibiciji STAT3, anti-STAT3 sdAb može takođe inhibirati STAT1, STAT2, STAT4, STAT5a, STAT5b, i STAT6 usled visokog stepena homologije između ovih molekula.
1
[0082] Rekombinantni humani STAT3 protein je korišćen za proizvodnju anti-STAT sdAbs koji su usmereni protiv ili koji se mogu vezati za epitop STAT3. Da bi se stvorilo anti-STAT3 sdAbs, rekombinantni humani STAT3 pune dužine (Gen ID: 6774) je eksprimiran sa bakulovirusom u Sf9 ćelijama insekata. Anti-STAT sdAbs su klonirane u vektore koji se mogu eksprimirati i u bakterijskim i sisarskim ćelijama, kao što je prikazano na Slikama 1 i 2.
[0083] Anti-STAT3 sdAb pronalaska može se koristiti za targetiranje STAT3 i svih drugih STAT molekula unutar ćelije da bi se inhibirao rast ćelija, kao što je, na primer, supresija rasta ćelija kancera. Dodatno, anti-STAT3 sdAb može inhibirati rast ćelije u drugim proliferativnim bolestima kao što su psorijaza i makularna degeneracija preko VEGF.
[0084] Bez ograničavanja na određeni mehanizam dejstva, smatra se da anti-STAT3 sdAb može eliminisati imunu supresiju indukovanu kancerom smanjivanjem nivoa STAT3 u antigen prikazujućim ćelijama kao što su, na primer, dendritske ćelije domaćina. STAT3 inhibicija promoviše anti-kancer odgovor od strane pacijentovog urođenog i stečenog imunog sistema (tj., dendritske ćelije, makrofage, neutrofili, T ćelije, NK ćelije, i B ćelije).
[0085] Upotrebom postupaka koji su dobro poznati u tehnici, dobijeno je nekoliko anti-STAT sdAbs i podvrgnuto je skriningu u odnosu na sposobnost da suprimiraju rast ćelije kancera i indukuju apoptozu u ćelijskim linijama kancera, kao što je opisano u nastavku. Testirani su citotoksičnost i anti-proliferativna dejstva anti-STAT3 sdAbs. Dodatno, tolerancija anti-STAT3 sdAbs je testirana in vitro i in vivo. Proizvodnja mišjeg monoklonskog antitela usmerenih protiv jednog ili više domena anti-STAT sdAbs je opisana u nastavku.
[0086] Aminokiselinska sekvenca jednog anti-STAT3 sdAb, nazvana VHH13 (SEQ ID NO.
3), je prikazana u nastavku:
Tri CDR su podvučena.
[0087] Aminokiselinska sekvenca drugog anti-STAT3 sdAb, nazvanog VHH14 (SEQ ID NO.
4), je prikazana ispod:
[0088] Ponovo, tri CDRs su podvučena. Proteinske sekvence drugih anti-STAT3 sdAbs koji su dobijeni su kao što sledi:
1
STAT3_10 (SEQ ID NO.5):
STAT3_34 (SEQ ID NO.6):
STAT3_19 (SEQ ID NO.7):
STAT3_14 (SEQ ID NO.8):
STAT3_35 (SEQ ID NO.9):
STAT3_9 (SEQ ID NO.10):
STAT3_30 (SEQ ID NO.11):
STAT3_23 (SEQ ID NO.12):
STAT3_24 (SEQ ID NO.13):
1
STAT3_36 (SEQ ID NO.14):
STAT3_12 (SEQ ID NO.15):
STAT3_16 (SEQ ID NO.16):
STAT3_11 (SEQ ID NO.17):
STAT3_20 (SEQ ID NO.18):
STAT3_2 (SEQ ID NO.19):
STAT3_15 (SEQ ID NO.20):
STAT3_6 (SEQ ID NO.21):
2
STAT3_33 (SEQ ID NO.22):
STAT3_17 (SEQ ID NO.23):
STAT3_25 (SEQ ID NO.24):
STAT3_32 (SEQ ID NO.25):
STAT3_13 (SEQ ID NO.26):
STAT3_39 (SEQ ID NO.27):
STAT3_4 (SEQ ID NO.28):
STAT3_29 (SEQ ID NO.29):
[0089] Odgovarajuće anti-STAT3 DNK sekvence su kao što sledi:
�
[0090] Dodatno, predmetni pronalazak sadrži jedno ili više mišjih moonklonskih antitela koja su usmerena protiv jednog ili više domena anti-STAT3 sdAb pronalaska. Mišje monoklonsko antitelo može se stvoriti postupcima koji su poznati stručnjacima, na primer, mišje monoklonsko antitelo može se proizvesti od strane mišjeg hibridoma. Mišje monoklonsko antitelo može se koristiti u dijagnostičkim analizama, na primer, antitelo može biti korišćeno u imunoanalizi kao što je ELISA da bi merila količina anti-STAT3 sdAb prisutnog u serumu pacijenta. Treba shvatiti da postupak nije ograničen na anti-STAT3 sdAbs, i može se koristiti da se proizvede mišje antitelo usmereno protiv bilo kog sdAbs predmetnog pronalaska.
[0091] TNF-alfa gen kodira multifunkcionalni proinflamatorni citokin koji pripada superfamiliji faktora nekroze tumora (TNF). Ovaj citokin uglavnom izlučuju makrofage. Citokin je uključen u regulaciju širokog spektra bioloških procesa uključujući regulaciju rasta, diferencijaciju, inflamaciju, replikaciju virusa, genezu tumora, i autoimune bolesti; i u virusnim, bakterijskim, gljivičnim, i parazitskim infekcijama. Osim indukcije hemoragične nekroze tumora, pronađeno je da je TNF uključen u genezu tumora, metastaziranje tumora, replikaciju virusa, septički šok, groznicu, inflamaciju, kaheksiju, i autoimune bolesti uključujući Crohn bolest, i reumatoidni artritis kao i bolest graft-protiv-domaćina.
[0092] Predmetni pronalazak obezbeđuje sdAbs, proteine, i polipeptide koji su usmereni protiv TNF-alfa, naročito protiv humanog TNF-alfa unutar ćelije ili ćelijske membrane, tako da sprečava sekreciju TNF-alfa od strane ćelija.
[0093] Predviđeno je da se anti-TNF-alfa sdAbs i polipeptidi prema pronalasku za prevenciju i/ili tretman bolesti ili poremećaja povezani sa i/ili posredovani sa TNF-alfa, kao što su inflamacija, reumatoidni artritis, Crohn bolest, ulcerativni kolitis, inflamatorni sindrom creva, multipla skleroza, Addison bolest, autoimuni hepatitis, autoimuni parotitis, dijabetes tipa 1, epididimitis, glomerulonefritis, Graves bolest, Guillain-Barre sindrom, Hashimoto bolest, hemolitička anemija, sistemski eritemski lupus, neplodnost kod muškarca, multipla skleroza, miastenija gravis, pemfigus, psorijaza, reumatična groznica, reumatoidni artritis, sarkoidoza, skleroderma, Sjogren sindrom, spondiloartropatije, tiroiditis, vaskulitis, i gubitak težine usled kancera i kaheksije.
[0094] TNF-alfa postoji u različitim oblicima; postoje monomerni i multimerni oblici, uključujući trimerni oblik. Unutar je obima pronalaska da se sdAbs, proteini i polipeptidi pronalaska vezuju za TNF-alfa u svom različitom obliku, tj., monomernim ili multimernim oblicima. Stoga, kada su sdAbs, proteini i polipeptidi pronalaska usmereni protiv TNF-alfa, podrazumeva se da ovo takođe sadrži sdAbs, proteine i polipeptide usmerene protiv TNF-alfa u njegovom trimernom obliku.
[0095] Poznato je da prenos signala sa TNF uključuje unakrsno vezivanje TNF receptora sa trimerom TNF molekula, koji sadrži tri receptorska mesta za vezivanje (videti, na primer, Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489).
[0096] Rekombinantni TNF-alfa protein je korišćen da bi se genrisao sdAbs koji je usmeren protiv ili koji se može vezivati za epitop TNF-alfa. Da bi se stvorio anti-TNF-alfa sdAbs, rekombinantni humani TNF-alfa pune dužine (Gen ID: 7124) je eksprimiran u Escherichia coli i korišćem kao target antigen.
[0097] Trideset pet sdAbs protiv TNF-alfa proteina je dobijeno. Ova anti-TNF-alfa antitela su podeljena u tri grupe na osnovu homologije sekvence.
[0098] Aminokiselinska sekvenca prvog anti-TNF-alfa sdAb, nazvana TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO.45) sdAb, je prikazana ispod:
Tri CDR su podvučena.
[0099] Aminokiselinska sekvenca drugog anti-TNF-alfa sdAb, nazvana TNF-alfa VHH69 (SEQ ID NO.46) sdAb, je prikazana u ispod:
Tri CDR su podvučena.
[0100] Aminokiselinska sekvenca trećeg anti-TNF-alfa sdAb, nazvana TNF-alfa VHH62 (SEQ ID NO.47) sdAb, je prikazana ispod:
2
[0101] Tri CDR su podvučena. Druga anti-TNF-alfa sdAbs koja su pronađena uključuju sekvence u nastavku, ponovo sa CDR podvučenim:
TNF_2 (SEQ ID NO.48):
TNF_46 (SEQ ID NO.49):
TNF_71 (SEQ ID NO.50):
TNF_21 (SEQ ID NO.51):
TNF_38 (SEQ ID NO.52):
TNF_18 (SEQ ID NO.53):
TNF_37 (SEQ ID NO.54):
2
TNF_66 (SEQ ID NO.55):
TNF_68 (SEQ ID NO.56):
TNF_78 (SEQ ID NO.57):
TNF_67 (SEQ ID NO.58):
TNF_6 (SEQ ID NO.59):
TNF_7 (SEQ ID NO.60):
TNF_13 (SEQ ID NO.61):
TNF_60 (SEQ ID NO.62):
2
TNF_69 (SEQ ID NO.64):
TNF_76 (SEQ ID NO.65):
TNF_62 (SEQ ID NO.66):
TNF_43 (SEQ ID NO.67):
TNF 15 (SEQ ID NO.68):
TNF_17 (SEQ ID NO.70):
2
TNF_63 (SEQ ID NO.71):
TNF_20 (SEQ ID NO.72):
TNF_58 (SEQ ID NO.73):
TNF_27 (SEQ ID NO.74):
TNF_28 (SEQ ID NO.75):
TNF_4 (SEQ ID NO.76):
TNF_14 (SEQ ID NO.77):
TNF_3 (SEQ ID NO.78):
2
TNF_1 (SEQ ID NO.79):
TNF_22 (SEQ ID NO.81):
[0102] In vitro inhibicija rasta nekoliko TNF-alfa sdAbs je testirana, kao što je opisano u nastavku. Dodatno, predmetni pronalazak sadrži jedno ili više mišjih monoklonskih antitela koja su usmerena protiv jednog ili više domena anti-TNF-alfa sdAb pronalaska. Mišje monoklonsko antitelo može se stvoriti postupcima koji su poznati stručnjaku, kao što je prethodno opisano. Mišje monoklonsko antitelo se može koristiti u dijagnostičkim analizama, kao što su, na primer, imunoanaliza kao što je ELISA da bi se merila količina anti-TNF-alfa sdAb prisutna u serumu pacijenta.
[0103] RAF proteini su familija serin/treonin-specifičnih kinaza koje služe kao centralni intermedijer u prenošenju ekstracelularnih signala u mitogen-aktiviranu protein kinaza kaskadu, koja kontroliše rast ćelije, diferencijaciju i preživljavanje. BRAF je član RAF familije koji je aktiviran članovima Ras familije nakon stimulacije indukovane faktorom rasta. Aktivni Ras može indukovati heterodimerizaciju cRaf i BRAF i ovo može objasniti uočenu kooperativnost cRaf i BRaf u ćelijama koje odgovaraju na signale faktora rasta. Aktivirajuće mutacije u BRAF genu su prisutne u velikom procentu humanih malignih melanoma i u delu kancera debelog creva. Velika većina ovih mutacija rezultuje u izmeni valina u glutaminsku kiselinu na ostatku 599 unutar aktivacionog segmenta BRAF.
[0104] Anti-BRAF sdAbs su razvijeni za targeting divljeg tipa i mutiranog BRAF da bi se poremetila njegova uloga u malignim ćelijama kao što su, na primer, ćelije uključene u knacer debelog creva i druge malignitete.
[0105] Korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici, rekombinantni humani BRAF protein je korišćen za stvaranje sdAbs koji su usmereni protiv ili se mogu vezati za epitop BRAF.
[0106] Dodatno, predmetni pronalazak sadrži jedno ili više mišjih monoklonskih antitela koja su usmerena protiv jednog ili više domena anti-BRAF sdAb pronalaska. Mišje monoklonsko antitelo se može stvoriti postupcima koji su poznati stručnjaku. Mišje monoklonsko antitelo se može koristiti u dijagnostičkim analizama, na primer, antitelo se može koristiti u imunoanalizi kao što je ELISA da bi se merila količina anti-BRAF sdAb prisutna u serumu pacijenta.
PRIMERI
PRIMER 1: ANTI-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO.3) SDAB VEZUJE STAT3
[0107] U ovom primeru, afinitet dva VHH targeta protiv STAT3 je meren korišćenjem Octet zasnovane analize vezivanja bez obeležavanja. Anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb, anti-KRAS (negativna kontrola) i GST-STAT3 (16kDa monovalentni antigen, Creative BioMart #STAT3-1476H) su korišćeni kao antigen probe u ovom testu. GST-STAT3 protein je uhvaćen na 20mg/ml u PBS korišćenjem aminopropilsilan (APS) biosenzora potapanja i čitanja, specifično namenjenih hidrofobnom proteinu. Probe su zatim potopljene u bunarčiće sa GST-STAT3 proteinom, anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb ili anti-KRAS na koncentraciji kao što je naznačeno. Merena je stopa asocijacije (on stopa) antigena. Senzori su ugašeni sa 1% BSA u vodi. Probe su potpoljene u pufer za analizu (PBS) i merena je stopa disocijacije rate (off stopa).
[0108] Afinitet, predstavljen sa konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antigenvezujućim proteinom (KD) je determinisana iz dobijene konstante afiniteta (KA), i KDkorišćenjem 1:1 analize globalnog fitovanja Fortebio softvera kao što je prikazano u nastavku u Tabeli 1. Afinitet je određen sa prosečnom vrednošću KD vrednosti za krive sa R2 vrednostima >0.95. 250 nM anti-STAT3 VHH13 tačka podataka je izostavljena jer je predstavljala ekstremnu vrednost. Određeno je da je anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) sdAb afinitet bio 1.16 x 10-7. Afinitet anti-KRAS VHH nije određen.
1
TABELA 1
Analiza lokalne aproksimacije, istaknute vrednosti korišćene za određivanje afiniteta od 1.16 k 10<-7>
PRIMER 2: STUDIJE IMUNOPRECIPITACIJE
[0109] Specifičnost STAT3 sdAbs je analizirana kod humanih ćelija kancera dojke. U ovom primeru, MDA-MB-231 humane ćelije kancera dojke su uzgajane od 50% do 70%
2
konfluenca. Ćelije su zatim disruptovane u sveže pripremljenom ledenom puferu za lizu (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 0.1% NP-40, 10% glicerol, 1 mM natrijum vanadat, 1 mM natrijum fluorid, 1 mM ditiotreitol, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 10 µg/mL aprotinin, 10 µg/mL leupeptin) 45 minuta na ledu. Lizati su zatim centrifugirani, supernatant je sakupljen, i određena je koncentracija proteina korišćenjem modifikovanog Lowry postupka (Bio Rad, Hercules, CA). Ukupni protein (1 mg) je inkubiran sa 1.5 mg Dynabeads (Invitrogen) sa sdAbs protiv STAT3, pozitivnom kontrolom (STAT3, cat#SC-482, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), ili negativnom kontrolom (STAT-1, cat# 9172, Cell Signaling, Danvers, MA) 1 č na 4 °C. Kuglice su zatim isprane. Nakon finalnog ispiranja, dodatno je 60 µl pufera za lizu, i rezultujući supernatant je podvrgnut Western blot analizi. Ukratko, uzorci su razdvojeni na 10% pliakrilamidnim gelovima i preneti na nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane, zatim inkubirane sa odgovarajućim primarnim i sekundarnim antitelima. Anti-STAT3 antitelo, korišćeno kao pozitivna kontrola, bilo je od Cell Signaling (Cat# 4904, Danvers, MA). Reakcija hemiluminescencije je izvedena korišćenjem ECL sistema od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
[0110] Kao što je ilulstrovano na Slici 3, endogeni STAT3 je imunoprecipitirao sa svim testiranim sdAbs testiranim sa različim količinama. M je Marker staza koja je sadržala marker, staza 1 sadržala je STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) proizveden i izolovan iz sisarskih ćelija, staza 2 sadržala je STAT3 VHH14 (SEQ ID NO:4) proizveden i izolovan iz sisarskih ćelija, staza 3 sadržala je STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) proizveden i izolovan iz bakterijskih ćelija, staza 4 sadržala je STAT3 VHH14 (SEQ ID NO:4) proizveden i izolovan iz sisarskih ćelija, staza 5 bilo je pozitivno STAT3 antitelo, staza 6, koristila je STAT-1 kao negativnu kontrolu, nije pokazivala traku.
PRIMER 3: ANTI-STAT3 BAKTERIJSKI VHH13 VEZUJE SE SA VELIKIM AFINITETOM ZA ĆELIJSKE LINIJE KOJE SADRŽE KONSTITUTIVNO AKTIVIRANI STAT3
[0111] Specifičnost bakterijskog anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) korišćenjem konstitutivno aktiviranog STAT3 kod humanih (PANC-1 i DU145) i mišjih (4T1) ćelijskih linija je analizirana. Komercijalne HeLa ćelije su takođe tretirane sa interferonom gama (INFΓ) da bi se indukovao fosforilisani STAT3. The PC-3 STAT3 nulta ćelijska linija je korišćena kao negativna kontrola.
[0112] Ćelije su uzgajane od 50% do 70% konfluence, zatim disruptovane u sveže pripremljenom ledenom puferu kao što je prethodno opisano 45 minuta na ledu. Lizati su zatim centrifugirani, supernatant sakupljen, i koncentracija proteina je određena kao što je prethodno opisano. Ukupni protein (1 mg) je inkubiran sa 1.5 mg Dynabeads (Invitrogen) koje sadrže bakterijski anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) ili negativnu kontrolu (KRAS, Creative Biolabs, Shirley, NY) 1 čas na 4°C. Kuglice su zatim isprane. Nakon finalnog ispiranja, dodato je 60 µl pufera za lizu, i rezultujući supernatant je podvrgnut Western Blot analizi kao što je opisano u Primeru 2.
[0113] Kao što je ilustrovano na Slici 4, endogeni STAT3 je imunoprecipitiran sa bakterijskim VHH13 STAT3 (SEQ ID NO:3) u konstitutivno aktiviranim STAT3 ćelijskim linijama: PANC-1 (staza 1), DU145 (staza 2), i 4T1 (staza 4). Dodatno, bakterijski VHH13 STAT3 (SEQ ID NO:3) vezivao se za fosfo-STAT3 u HeLa lizatu (staza 3). Nisu uočene trake za PANC-1 KRAS, staza 3, i ni za PC-3 (negativnu kontrolu), staza 6.
PRIMER 4: STUDIJE CITOTOKSIČNOSTI ANTI-STAT3 SDABS U MDA-MB-231 ĆELIJSKIM LINIJAMA KANCERA
[0114] U ovom primeru, anti-proliferativni efekti anti-STAT3 sdAbs su analizirani korišćenjem humane linije ćelija kancera dojke MDA-MB-231. Za eksperimente, MDA-MB-231 ćelije su uzgajane do dostizanja konfluence od 90%. U to vreme, ćelije su isprane, tripsinizovane i izbrojane korišćenjem Coulter Counter (Beckman, Brea, CA). Studije proliferacije su izvedene korišćenjem analize sa 3-[4,5-dimetiltiaolil]-2,5-difeniltetrazolijum bromidom (MTT). Za ovo, ćelije su zasejane u ploču sa 96 bunarčića sa gustinom od 5 x 10<3>po bunarčiću kao što je naznačeno od strane proizvođača (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Ćelijama je dozvoljeno da se pričvrste 24 časa i zatim su dodata sdAbs na odgovarajućim koncentracijama (tj., 0, 0.5, 1.0, 10.0, ili 100 µg/ml). Ćelije su izbrojane na dan 3. Za 5-dnevno tretirane ćelije, dodavan je svež medijum koji sadrži sdAbs na dan 3. Na završni dan, dodato je 10 µl MTT reagensa (0.5 mg/mL) u svaki bunarčić kao što je naznačeno od strane proizvođača. Nakon perioda inkubacije od 4 časa, 100 µl rastvora za poboljšanje rastvaranja je dodato i ploča je stavljena u inkubator preko noći. Sve ploče su očitane na 570 nm talasnim dužinama korišćenjem Biotek čitača ploča (Winooski, VT).
[0115] Svi podaci su analizirani korišćenjem GraphPad InStat 3 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Grupe tretmana su poređene sa kontrolnom grupom sa vehikulumom korišćenjem
4
jednofaktorske ANOVA. Ukoliko je uočena značajana razlika (p <0.05), izveden je Tukey-Kramer test višestrukih poređenja.
[0116] Na osnovu MTT eksperimenta, pronađeno je da je bakterijski VHH13 anti-STAT3 (SEQ ID NO.3) sdAb efikasan u inhibiciji rasta ćelija na dane 3 i 5 nakon tretmana, kao što je prikazano u Tabelama 2-5 u nastavku.
TABELA 2
TABELA 3
TABELA 4
Tabela 5
PRIMER 5: STUDIJE CITOTOKSIČNOSTI ANTI-STAT3 SDABS KOD HUMANIH ĆELIJSKIH LINIJA KANCERA DOJKE (MDA-MB-231) I KANCERA PANKREASA (PANC-1)
[0117] U ovom primeru, anti-proliferativni efekti anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) i VHH14 (SEQ ID NO. 4) sdAbs su analizirani korišćenjem humane ćelijske linije kancera dojke MDA-MB-231 i humane ćelijske linije kancera pankreasa PANC-1. Za eksperimente, MDA-MB-231 i PANC-1 ćelije su uzgajane do 90% konfluence. U to vreme, ćelije su isprane, tripsinizovane i izbrojane korišćenjem Coulter Counter (Beckman, Brea, CA). Studije proliferacije su izvedene korišćenjem MTT analize opisane prethodno. Za 5-dnevno tretirane ćelije, ponovo je dodat svež medijum koji sadrži anti-STAT3 sdAbs na dan 3.
[0118] Svi podaci su analizirani korišćenjem GraphPad InStat 3. Grupe tretmana su poređene sa kontrolnom grupom sa vehikulumom korišćenjem jednofaktorske ANOVA. Ukoliko je uočena značajna razlika (p <0.05), izveden je Tukey-Kramer test višestrukih poređenja.
[0119] Na osnovu MTT eksperimenta, pronađeno je da i VHH13 (SEQ ID NO. 3) i VHH14 (SEQ ID NO. 4) inhibiraju rast ćelija kod oba tipa ćelija kancera MDA-MB-231 i PANC-1, kao što je prikazano na Tabelama 6-13 u nastavku.
TABELA 6
TABELA 7
TABELA 8
TABELA 9
4
TABELA 10
TABELA 11
TABELA 12
4
TABELA 13
PRIMER 6: ANTI-PROLIFERATIVNA DEJSTVA STAT3 SDABS u HUMANIM ĆELIJSKIM LINIJAMA KANCERA DOJKE I KANCERA PROSTATE
[0120] Anti-proliferativni efekti STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) sdAb analizirani su kod humane ćelijske linije kancera dojke MDA-MB-231 i humane ćelijske linije kancera pankreasa DU145. Za eksperimente, ćelije kancera su uzgajane do postizanja 90% konfluence. U to vreme, ćelije su isprane, tripsinizovane, i izbrojane korišćenjem Coulter Counter (Beckman, Brea, CA). Studije proliferacije su urađene korišćenjem MTT analize kao što je prethodno opisano.
[0121] Anti-proliferativne osobine anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO. 3) sdAb na MDA-MB-231 ćelije su upoređene sa njegovim dejstvom na DU145 ćelije. Kao što je prikazano na Tabeli 14, MDA-MB-231 ćelije tretirane sa anti-STAT3 (SEQ ID NO:3) sdAbs prikazale su prosečnu inhibiciju rasta od 29.6 i 91.2 na 50.0 i 100 µg/ml, respektivno. Kod DU145 ćelija, uočena je slična inhibicija rasta (31.2 i 92.1% za 50.0 i 100 µg/ml, respektivno) kao što je dato u Tabeli 15.
TABELA 14
4
TABELA 15
PRIMER 7: ANTI-PROLIFERATIVNI EFEKTI STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) SDABS HUMANE ĆELIJSKE LINIJE KANCERA
[0122] Da bi se testirali anti-proliferativni efekti STAT3 VHH13 (SEQ ID NO. 3) sdAbs korišćenjem humanih ćelijskih linija: MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, BT474, i DU145 kao što je prikazano na Tabeli 16.
[0123] Sve humane ćelijske linije kancera su dobijene od American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ćelijske linije su održavane i kultivisane u RPMI 1640 medijumu (MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, BT474) ili MEM-E (DU145) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM L-glutamina i 1% rastvora antibiotika-antimikotika (10 units/mL penicilin, 10 µg/mL streptomicin i 25 µg/mL amfotericin B). Ćelije su držane na 37°C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2. Zalihe ćelijske kulture su dobijene od Life Technologies, Inc., (Grand Island, NY). MTT reagens je kupljen od Sigma Aldrich (St. Louis, MO).
[0124] Za eksperimente, ćelije kancera su uzgajane do dostizanja 90% konfluence. U to vreme, ćelije su isprane, tripsinizovane i izbrojane korišćenjem Coulter Counter (Beckman, Brea, CA). Studije proliferacije su izvedene korišćenjem MTT analize kao što je prethodno opisano.
[0125] Anti-proliferativne osobine anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAbs su procenjivane na pet kancerskih ćelija dojke koij predstavljaju različite klasifikacije (Tabela
4
34). Kao što je prikazano na Tabeli 17, sve ćelijske linije na 72 časa nakon tretmana pokazale su značajnu inhibiciju rasta. Najveća inhibicija rasta je uočena na 100 i 200 µg/ml dozi za sve ćelijske linije. Polu maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za rast u ćelijskim linijama bile su: 10.1 ± 2.4, 12.36 ± 1.5, 14.8 ± 1.6, i 25.2 ± 14.7 za MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, i BT474 ćelijske linije, respektivno. Ovi podaci sugerišu da trostruko negativne ćelijske linije kancera dojke zahtevaju najnižu koncentraciju VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAbs da bi se postigla IC50u poređenju sa estrogen/progesteron pozitivnim ćelijskim linijama (tj., MCF-7) ili HER2 amplifikovanim ćelijskim linijama (tj., BT474).
TABELA 16
TABELA 17
4
4
[0126] Dejstva anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je takođe procenjena u humanoj ćelijskoj liniji kancera prostate DU145, kao što je prikazano na Tabeli 18. Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb pokazao je inhibiciju rasta zavisnu od doze kod svih testiranih ćelijskih linija kancera.
4
TABELA 18
PRIMER 8: NAKSIMALNA TOLERISANA DOZA ANTI-STAT3 BAKTERIJSKOG VHH13 (SEQ ID NO:3) KOD BALB/C MIŠEVAS
[0127] U ovom primeru, tolerancija anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je testirana u test životinjama korišćenjem humane ćelijske linije kancera dojke MDA-MB-231. Za eksperiment, ukupno 9 BALB/C golih ženki miševa (6 do 7 nedelja starih) podeljenoje u tri grupe prema telesnoj težini. (Tabela 19) Miševi (n=3) su primili ili vehikulum (PBS) ili anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb na 250 ili 500 mg/kg body težine/dan tokom pet dana. Tokom ove studije, mortalitet/morbiditet je izvođen dva puta dnveno. Telesne težine su zabeležene na dane 1, 4, i 6 studije kao i na dan završetka studije (Dan 13). Toksičnost je procenjena na osnovu merenja telesne težine i ponašanja miševa u poređenju sa kontrolnim miševima sa vehikulumom. Nakon završetka faze tretmana, životinje su praćene dodatnuo nedelju dana da bi se zabeležile bilo koje abnoramlnosti u telesnoj težini i/ili opštem zdravstvenom stanju nakon tretmana.
TABELA 19
[0128] Kao što je ilustrovano na Tabeli 20, nije bilo značajne razlike u telesnim težinama između grupa, i anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb nije bio povezan sa bilo kakvom smrti povezanom sa lekom na bilo kom doznom nivou. Dodatno, promene u ponašanju nisu uočene kod životinja tretiranih sa anti-STAT3 bakterijskim VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u poređenju sa kontrolnim miševima.
TABELA 20
1
PRIMER 9: AKTIVNOST BAKTERIJSKOG ANTI-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO:3) KOD KSENOGRAFTA GOLIH BALB/C MIŠEVA I HUMANIH ĆELIJA KANCERA DOJKE I KANCERA PANKREASA
[0129] U ovom primeru, aktivnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je procenjena kod miševa korišćenjem humane ćelijske linije kancera dojke MDA-MB-231. Ukratko, aktivnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je procenjena korišćenjem: MDA-MB-231 ksenograft modela humanog kancera dojke i ksenograft modela PANC-1 humanog kancera pankreasa. Raspored doziranja bio je sledeći: Grupa 1 (n=6; PBS; IP) dnevno 14 dana [QDx14]; i Grupa 2 (n-12; 500 mg/kg bw; IP), svaki dan 14 dana [QDx14]. Period posmatranja od 5 dana pratio je primenu leka.
[0130] Humane ćelijske linije kancera dojke (MDA-MB-231 i PANC-1) dobijene su od American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). MDA-MB-231 ćelije su uzgajane u MEM (Life Technologies, Grand Island, NY) sa dodatkom 10% FBS (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA) i Penicilin-Streptomicin-Glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY). PANC-1 ćelije su uzgajane u RPMI 1640 medijumu (Life Technologies, Grand Island, NY) sa dodatkom 10% FBS i Penicilin-Streptomicin-Glutamin. Sve ćelije su uzgajane u prisustvu 5% CO2na 37°C u inkubatoru.
[0131] Atimusni goli-Foxnlnu mužjaci miševa starosti 4 do 5 nedelja kupljeni su od Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Životinje su bile u karantinu nedelju dana i smeštene u kaveze sa 5 miševa, sa 12-č ciklusom svetlo-tama, i relativnom vlažnošću od 50%. Voda i hrana su dati životinjama ad libitum. Sve životinje su bile smeštene u uslovima bez patogena i eksperimenti su izvedeni u skladu sa IIT Research Institute Animal Use i Care Committee. Za MDA-MB-231 ksenograft studiju, ćelije (4 x 10<6>) u 100- µL finalne zapremine MEM medijuma je injektirano potkožno u desni bok miševa. Za PANC-1 ksenograft studiju, ćelije (5 x 10<6>) u 100- µL finalne zapremine RPMI medijuma injektirano je potkožno u desni bok miševa. Merenje tumora za oba modela započeto je čim su tumori bili palpabilni. Nakon toga, tumori su mereni dva puta nedeljno. Životinje su randomizovane kada su tumori dostigli raspon od 75 do 175 mm<3>, kontrola (n = 6) i tretman (n=12) grupe su randomizovane korišćenjem algoritma stratifikovanog uzorkovanja. Tretman (anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb) ili vehikulum (PBS) je započet na dan nakon randomizacije. Tretman je bio dobro tolerisan i nije bio povezan sa smrtima izazvanim lekom. Nije uočen nikakav značajan gubitak telesne težine.
2
[0132] Za MDA-MB-231 ksenograft studiju, randomizaciona srednja vrednost (± SE) veličine tumora bila je: 103.01 ± 11.89 i 102. 61 ± 9.60 za kontrolnu i grupu tretmana respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) pri randomizaciji: 32.08 ± 0.76 i 30.27 0.75 za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. Tabela 21 prikazuje srednje vrednosti telesne težine (± SE) za celu studiju.
TABELA 21
[0133] Na dan 14 doziranja, srednja vrednost veličine tumora (± SE) za kontrolu je bila 179.11 ± 19.39 nasuprot 118.86 ± 15.94 za grupu tretmana. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku je bila: 31.98 ± 0.71 i 30.55 ± 0.74 za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. Tabela 22 rezimira zapremine tumora (± SE) za celu studiju. % srednje vrednosti inhibicije rasta tumora u gupi tretmana bio je 33.64%. Vremena udvostručavanja tumora bila su kao što sledi:
Grupa 1: 44.27 dana; i Grupa 2: 61.06 dana. Slika 5 ilustruje inhibiciju rasta sa anti-STAT3 bakterijskim VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u modelu ksenografta MDA-MB-231. Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb pokazao je značajnu inhibiciju rasta (p= 0.047). Stoga, anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb ima hemoteraputsku aktivnost u model sistemu MDA-MB-231 humanog kancera dojke.
TABELA 22
Merenja pojedinačnih tumora (mm<3>) za ksenograft model MDA-MB-231 Životinja Dan Dan Da Grupa Dan 6 Dan 9 Dan 16
# 1 12 20
1 1 117.43 141.72 135.00 139.31 127.93 133.19
[0134] Za PANC-1 ksenograft studiju, randomizaciona srednja vrednost (+SE) veličina tumora bila je 107.01 ± 4.54 za kontrolnu i 110.58 ± 6.18 u grupi tretmana. Srednja vrednost telesne težine (± SE) pri randomizaciji bila je: 29.0 ± 0.81 i 28.5 ± 0.70 za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku bila je: 31.2 ± 0.99 i 30.1 ± 0.75 za Grupu 1 i Grupa 2, respektivno. Tabela 23 rezimira srednju vrednost telesne težine (± SE) za celu studiju. Na dan 14 doziranja, srednja vrednost veličine tumora (± SE) za kontrolnu 287.30 ± 33.94 nasuprot 318.74 29.76 za grupu tretmana. Tabela 24 rezimira zapremine tumora (± SE) za celu studiju.
4
TABELA 23
[0135] Vremena udvostručavanja bila su kao što sledi: Grupa 1: 22.44 dana; i Grupa 23.02 dana. Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb prikazala je značajnu inhibiciju rasta u model sistemu PANC-1 humanog kancera pankreasa.
TABELA 24
PRIMER 10: MDA-MB-231 KSENOGRAFT STUDIJA
[0136] U ovom primeru, dodatno je procenjena efikasnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u humanom ksenograft modelu MDA-MB-231 dojke. Dozni raporedi su bili sledeći: Grupa 1 (n=4; PBS; IP) dva puta dnevno 14 dana [BIDx14]; Grupa 2 (n=4; 1 mg/kg bw; IP), dva puta dnevno 14 dana [BIDx14]; Grupa 3 (n=4; 2 mg/kg bw; IP) dva puta dnevno 14 dana [BIDx14]; i Grupa 4 (n=4; 2 mg/kg bw; IP) jednom dnevno 14 dana [QDx14]. Period posmatranja od 7 dana je usledio nakon primene.
[0137] Humane ćelijske linije kancera dojke MDA-MB-231 i atimusne gole-Foxn1nu ženke miševa su opisani prethodno.
[0138] MDA-MB-231 ćelije na gustini od 5x10<6>su potkožno injektirane u desni bok miševa u finalnoj zapremini od 100-mL u MEM medijumu. Merenja tumora su inicirana čim su tumori postali palpabilni. Nakon toga, tumori su mereni dva puta nedeljno. Životinje su randomizovane kada su tumori dostigli veličinu u opsegu od 55 do 150 mm<3>korišćenjem algoritma stratifikovanog randomizovanog uzorkovanja. Tretman (anti-STAT3 bakterijskim VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb) ili vehikulumom (PBS) je iniciran dan nakon randomizacije.
[0139] Srednje vrednosti randomizacije (±SE) veličine tumora su bile: 92.08 ± 13.24, 82.38 ± 5.17, 77.47 ± 7.17, i 104.71 ± 14.64 za Grupe 1, 2, 3, i 4 respektivno. Kao što je prikazano na Tabeli 25, srednje vrednosti telesne težine (± SE) pri randomiozaciji su bile: 23.65 ± 0.72, 23.45 ± 0.66, 23.10 ± 0.20, i 22.45 ± 1.25 za Grupe 1, 2, 3, i 4, respektivno.
[0140] Kao što je prikazano na Tabeli 26, na dan 14 doziranja, srednja veličina tumora (± SE) za kontrolnu grupu bila je 221.51 ± 57.32 nasuprot 67.12 ± 10.66, 58.27 ± 22.54, i 131.44 ± 22.86, za grupu tretmana 2, 3, i 4, respektivno. U vreme završetka (dan 42) srednja veličina tumora (± S.E.) bila je: 255.42 ± 65.46, 55.98 ± 6.94, 41.15 ± 13.21, i 145.51 ± 52.32, za grupe 1, 2, 3, i 4, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku su bile: 24.80 ± 0.49, 23.25 ± 1.20, 24.00 ± 0.32, i 23.2 ± 1.46 za Grupe 1, 2, 3, i 4, respektivno. Maksimalni % srednje vrednosti neto gubitka težine (dan) bio je: 0.7 (36), 1.5 (23), 1.8 (36), i 2.2 (29) za Grupe 1, 2, 3, i 4, respektivno.
[0141] Takođe kao što je prikazano na Tabeli 26, srednja vrednost inhibicije rasta u grupama tretmana bila je 78.3, 75.2, i 55.9, za Grupe 2, 3, i 4, respektivno. Vreme dupliranja tumora je bilo: Grupa 1: 20.56 dana; Grupa 2: 34.54 dana; Grupa 3: 30.07 dana; i Grupa 4: 27.17 dana. Postojao je odloženi rast od 13.99, 9.52, i 6.61 dana za Grupe 2, 3 i 4, respektivno. % tretman/kontrola vrednosti za grupe tretmana bili su: Grupa 2: -33.75 (staza tumora); Grupa 3: -54.4 (regresija tumora); i Grupa 4: 10.28 (inhibicija tumora). Slika 6 ilustruje inhibiciju rasta sa anti-STAT3 bakterijskim VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u modelu ksenografta MDA-MB-231.
[0142] Primena anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je povezana sa značajnim stepenom inhibicije rasta u Grupi 2 (p=0.02) [1 mg/kg; BID X 14] i Grupa 3 (p= 0.02) [2 mg/kg; BID x 14]. Dodatno, tri od četiri tumora pokazali su značajnu regresiju. Na osnovu ovih podataka, zaključeno je da anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb ima hemoterapeutsko dejstvo u MDA-MB-231 humanom model sisitemu kancera dojke.
TABELA 25
TABELA 26
PRIMER 11: EFIKASNOST ANTI-STAT3 BAKTERIJSKOG VHH13 (SEQ ID NO:3) SDAB NA KSENOGRAFT MODELIMA TRI HUMANA KANCERA
[0143] U ovom primeru, efikasnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je procenjivana kod ksenograft modela MDAMB-231 humane dojke, PANC-1 pankreasa, i DU145 kancera prostate.
1
[0144] Atimusni goli-Foxn1nu miševi, ćelijske linije MDA-MB-231 ćelije kancera dojke, PANC-1 kancera pankreasa i DU145 kancera prostate su opisani prethodno. Telesna težina miševa bila je u opsegu od 17 do 19 g (34 ženke) i 21 do 23 g (16 mužjaka) na dan 1 studije.
[0145] Ćelije u ranim pasažima (4 do 10) su korišćene za implantaciu u miševe i sakupljene su tokom log faze rasta. MDA-MB-231 (53106), DU145 (53106), i PANC-1 (1.5 x106) su potkožno injektirane u desni bok miševa u finalnoj zapremini od 100-mL medijuma. Merenja tumora su započeta čim su tumori bili palpabilni. Nakon toga, tumori su mereni dva puta nedeljno.
[0146] Životinje su randomizovane korišćenjem algoritma za stratifikovano randomizovano uzorkovanje kada su tumori dostigli opseg veličine od: 74-120 mm<3>(MDA-MB-231), 89-146 mm<3>(DU145), ili 60-160 mm<3>(PANC-1). Tretman (koji sadrži anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb i ovde označen kao SBT-100) ili vehikulum (PBS) je iniciran dan nakon randomizacije, označen kao dan 1.
[0147] Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je nabavljen kao preformulisani rastvor na koncentraciji od 0.651 mg/ml i uskaldišten je na -20°C dok nije bio spreman za upotrebu. Stok rastvor je razblažen u sterilnom PBS pH 7.6 da bi se obezbedila 5 mg/kg u zapremini doze od 10 mL/kg. Radni rastvor je pripreman svakih 7 dana, alikvotiran u sedam vijalica i uskladišten na 4°C. Na svaki dan tretmana, sada je potrebna vijalica stavljena na sobnu temepraturu. Sav preostali sdAb materijal je zadržan na 4°C potreban za sledeću dozu. Na dan 8, bilo koji sdAb materijal je odbačen i pripremljena je sveža serija.
[0148] Dve grupe (kontrola i SBT-100) miša po modelu tumora su dozirane prema protokolu prikazanom na Tabeli 27. Dozni rasporedi bili su kao što sledi: Grupa 1 (n=4; PBS) dva puta dnevno 14 dana [BIDx14]; Grupa 2 (n=4; SBT-100, 5 mg/kg bw), dva puta dnevno 14 dana [BIDx14]. I vehikulum (PBS pH 7.6) i SBT100 su primenjeni intraperitonealno (i.p.) dva puta na dan, sa šest sati razlike između četrnaest dana. Doziranje je izvedeno u skladu sa pojedinačnim težinama životinja. Period oporavka od 7 dana usledio je nakon primene.
TABELA 27
Eksperimentalni dizajn studije ksenografta
2
[0149] Study Log Study Director Animal Study Management Software (San Francisco, CA) je korišćen za randomizovanje žvotinja, sakupljanje podataka (npr., doziranje, telesne težine, merenja tumora, klinička posmatranja), i izvođenje analize podataka.
[0150] Kod MDA-MB-231 tumor ksenograft modela, životinje su randomizovane na dan 23 nakon inokulacije sa srednjom vrednošću (±SE) veličina tumora od: 77.98 ± 21.58 i 84.71 ± 5.56 za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) pri randomizaciji bila je: 20.04 ± 0.62 i 23.7 ± 1.84 za Grupe 1 i 2, respektivno. Tabela 28 rezimira srednju vrednost telesne težine (± SE) za celu studiju. Na zadnji dan doziranja (Dan 14), srednja vrednost veličine tumora (±SE) za kontrolnu grupu bila je 168.28 ± 51.57 nasuprot 83.81 ± 22.65 za SBT-100 tretirane miševe. Tabela 29 rezimira zapremine tumora (± SE) za celu studiju. U vreme završetka (dan 28) srednja vrednost veličine tumora (± S.E.) bila je: 270.49 ± 112.35 i 91.72 ± 33.17, za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku bila je: 25.36 ± 1.07 i 24.25 ± 1.68 za Grupe 1 i 2, respektivno. Na kraju studije, srednja vrednost inhibicije rasta tumora u SBT-100 tretiranoj grupi bila je 85.8% (p= 0.006). Slika 7 ilustruje srednju vrednost zapremine tumora. Vreme dupliranja tumora bilo je 25.78 dana nasuprot 111.6 dana za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. % tretman/kontrola za Grupu 2 bila je 13.35 (inhibicije tumora).
TABELA 28
Srednja vrednost težine tela za miševe u MDA-MB-231
TABELA 29
Zapremine tumora za MDA-MB-231
4
[0151] U DU145 tumor ksenograft modelu, životinje su randomizovane na dan 17 nakon inokulacije sa srednjom vrednošću (±SE) veličine tumora od: 111.87 ± 20.53 i 111.23 ± 25.16 za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) pri randomizaciji je bila: 29.10 ± 1.94 i 30.68 ± 1.56 za Grupe 1 i 2, respektivno. Tabela 30 rezimira srednju vrednost telesne težine (± SE) za celu studiju. Na poslednji dan doziranja (Dan 14), srednja vrednost veličine tumora (±SE) za kontrolnu grupu bila je 621.81 ± 276.25 nasuprot 364.14 ± 51.64 za SBT-100 tretirane miševe. Tabela 31 rezimira zapremine tumora (± SE) za celu studiju. U vreme završetka (dan 28) srednja vrednost veličine tumora (± S.E.) bila je: 819.42 ± 351.88 i 601.83 ± 131.51, za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku bila je: 29.20 ± 2.33 i 29.60 ± 1.04 za Grupe 1 i 2, respektivno. Na kraju studije, the srednja vrednost inhibicije rasta tumora u SBT-100 tretiranoj grupi bila je 26.6% (p= 0.29).
Slika 8 ilustruje srednju vrednost zapremine tumora. Vremena dupliranja tumora bila su 14.57 dana nasuprot 18.19 dana za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. % tretman/kontrola za Grupu 2 bio je 74.8.
TABELA 30
Srednja vrednost težine tela za miševe u DU145
TABELA 31
Zapremine tumora za DU145
[0152] U PANC-1 tumor ksenograft modelu, životinje su randomizovane na dan 22 nakon inokulacije sa srednjom vrednošću (±SE) veličina tumora od: 78.74 ± 40.21 i 93.84 ± 36.31 za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) pri randomizaciji bila je: 22.50 ± 1.47 i 24.23 ± 1.63 za Grupe 1 i 2, respektivno. Tabela 32 rezimira srednju vrednost telesne težine (± SE) za celu studiju. Na poslednji dan doziranja (Dan 14), srednja vrednost veličine tumora (±SE) za kontrolnu grupu bila je 204.95 ± 178.90 nasuprot 159.03 ± 28.01 za SBT-100 tretirane miševe. Tabela 33 rezimira zapremine tumora (± SE) za celu studiju. U vreme završetka (dan 28) srednja vrednost veličine tumora (± S.E.) bila je: 284.77 ± 288.88 i 203.02 ± 30.34, za Grupe 1 i 2, respektivno. Srednja vrednost telesne težine (± SE) na završetku bila je: 27.38 ± 1.07 i 26.23 ± 1.19 za Grupe 1 i 2, respektivno. Na kraju studije, srednja vrednost inhibicije rasta tumora u SBT-100 tretiranoj grupi bila je 41.78% (p= 0.35).
Slika 9 ilustruje srednju vrednost zapremine tumora. Vremena dupliranja tumora su bila 18.51 dana nasuprot 35.70 dana za Grupu 1 i Grupu 2, respektivno. % tretman/kontrola za Grupu 2 bio je 52.79.
TABELA 32
Srednja vrednost težine tela za miševe za PANC-1
TABELA 33
Zapremine tumora za PANC-1
PRIMER 12: EFIKASNOST ANTI-STAT3 BAKTERIJSKOG VHH13 (SEQ ID NO:3) SDAB U KSENOGRAFT MODEL ER+/PR+ (MCF-7) HUMANOG TUMORA DOJKE
[0153] Ovaj primer pokazuje efikasnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u ksenograft model MCF-7 humanog tumora dojke kod golih miševa.
[0154] Ženke atimusnih golih miševa (Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu, Charles River) bile su stare dvanaest nedelja sa telesnom težinom (BW) u opsegu od 23.0 do 30.1 g na dan 1 studije. Životinje su hranjene i smeštene kao što je prethodno opisano.
[0155] MCF-7 ćelije humanog karcinoma dojke dobijene su i kultivisane kao što je prethodno opisano, i korišćene za mišji ksenograft. Tri dana pre implantacije ćelije tumora, kuglice estrogena (0.36 mg estradiol, 60-dnevno oslobađanje, Innovative Research of America, Sarasota, FL) su implantirane potkožno između skapule svake test životinje korišćenjem sterilizovanog trokara.
[0156] Ćelije tumora korišćene za implantaciju su sakupljene tokom log faze rasta i resuspendovane u fosfatno puferovanom slanom rastvoru (PBS) na koncentraciji od 1 x 10<8>ćelija/mL. Na dan implantacije, svaki test miš je primio 1 x 10<7>MCF-7 ćelija (0.1 mL ćelijske suspenzije) implantiranih potkožno u desni bok i rast tumora je praćen kao srednja vrednost veličine koja se približava ciljanom opsegu od 100-150 mm<3>. Dvadesetjedan dan kasnije, označen kao dan 1 studije, životinje su sortirane u dve grupe pri čemu se svaka sastojala od četiri miša sa pojedinačnim zapreminama tumora u opsegu od 108 do 144 mm<3>i grupna srednja vrednost veličine tumora od 117 do 123 mm<3>.
[0157] Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je obezbeđen kao preformulisani rastvor spreman za doziranje na koncentraciji od 0.41867 mg/mL u 1 mL alikvotama i smeštena na -20 °C do potrebe. 0.41867 mg/mL rastvora obezbedilo je 1 mg/kg dozu u doznoj zapremini od 23.88 mL/kg. Na svaki dan tretmana, samo potrebne vijalice anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb su odmrznute do sobne temperature. Sve preostale dozne suspenzije su zadržane na 4 °C kao potrebne za sledeću dozu.
[0158] Dve grupe atimusnih golih miševa su dozirane prema protokolu prikazanom u Tabeli 34. Sve doze vehikuluma (kontrola) i anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb su primenjene intraperitonealno (i.p.) tri puta dnevno, u razmaku od šest časova četrnaest dana, sa dve doze isporučene na dan 1 i jednom dozom isporučenom ujutru dana 15 (tid x 14, prvi dan 2 doze). Dozna zapremina za vehikulum i anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb bila je 0.478 mL na 20 grama telesne težine (23.88 mL/kg) i skalirana je prema telesnoj težini svake pojedinačne životinje. Grupa 1 je primila vehikulum i služila je kao benčmark grupa za graftovanje i progresiju tumora, kao i kontrola. Grupi 2 je dat anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb sa 1 mg/kg.
TABELA 34
[0159] Tumori su mereni dva puta nedeljno, i svaka životinja je eutanazirana kada je njena neoplazma dostigla prethodno određenu krajnju tačku zapremine (1000 mm<3>) ili na kraju studije, dan 39, šta god da je bilo prvo. Kada je tumor dostigao krajnju zapreminu, životinja je dokumentovana kao eutanazirana zbog progresije tumora (TP), sa datumom eutanazije. Vreme do krajnje tačke (TTE) za svakog miša je izračunato sledećom jednačinom:
log 10 (krajnjazapremina)- b
TTE =
m
gde je TTE izražen u danima, krajnja zapremina je izražena u mm<3>, b je intercept, i m je nagib linije dobijene linearnom regresijom log-transformisanog seta podataka za rast tumora. Set podataka se sastoji od prvog uočavanja koje premašuje krajnju zapreminu korišćenu u anlaizi i tri uzastopne opservacije koje neposredno prethode dostizanju ove krajnje zapremine. Izračunata TTE je obično manja od TP datuma, dan na koji je životinja eutanazirana zbog veličine tumora. Životinjama koje nisu dostigle krajnju zapreminu dodeljena je TTE vrednost jednaka poslednjem danu danu studije (D39). Bilo kojoj životinji klasifikovanoj kao uginuloj od uzroka povezanih sa tretmanom (TR) je dodeljena TTE vrednost jednaka danu smrti. Bilo kojoj životinji koja je klasifikovana od uzroka koji nisu povezani sa tretmanom (NTR) isključena je iz TTE izračunavanja.
[0160] Efikasnost tretmana je određena iz odlaganja rasta tumora (TGD), koje je definisano kao povećanje u medijani TTE, u danima, za grupu tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom:
Procenat povećanja medijane TTE, u odnosu na kontrolnu grupu, je
gde:
T = medijana TTE za grupu tretmana, i
C = medijana TTE za naznačenu kontrolnu grupu.
1
[0161] Efikasnost tretmana u svakoj grupi može biti naznačena medijanom zapremine tumora, MTV(n), koja je definisana kao medijana zapremine tumora na poslednji dan studije (D39) u broju preostalih životinja (n) čiji tumori nisu dostigli krajnju zapreminu.
[0162] Efikasnost tretmana može takođe biti određena iz incidence i veličine regresionih odgovora uočenih tokom studije. Tretman može izazvati delimičnu regresiju (PR) ili kompletnu regresiju (CR) tumora u životinji. Kod PR odgovora, zapremina tumora bila je 50% ili manja od njegove D1 zapremine u tri uzastopna merenja tokom trajanja studije, i jednaka ili veća od 13.5 mm<3>za jedno ili više od ova tri merenja. Kod CR odgovora, zapremina tumora je bila manja od 13.5 mm<3>u tri uzastopna merenja tokom trajanja studije. Bilo koja životinja sa CR odgovorom na kraju studije bila je dodatno klasifikovana kao preživela bez tumora (TFS).
[0163] Životinje su merene dnevno prvih pet dana, zatim dva puta nedeljno u preostalom delu studije. Miševi su posmatrani često u odnosu na zdravstveno stanje i očigledne znake bilo kojih štetnih efekata povezanih sa tretmanom TR, i značajne kliničke opservacije su zabeležene. Pojedinačni gubitak težine je praćen po protokolu, i bilo koja životinja sa gubitkom težine preko 30% za jedno merenje, ili preko 25% za tri merenja, eutanazirana je u odnosu na TR smrt. Ukoliko se grupna srednja vrednost telesne težine oporavila, doziranje se može nastaviti u toj grupi, ali na nižoj dozi ili manje učestalom doznom rasporedu. Prihvatljiva toksičnost je definisana kao grupna srednja vrednost gubitka BW manje od 20% tokom studije i ne više od jedne TR smrti među deset tretiranih životinja, ili 10%. Bilo koji dozni režim koji rezultuje u većoj toksičnosti se smatra iznad masimalne tolerisane doze (MTD). Smrt se klasifikovala kao TR ukoliko se mogla povezati sa sporednim efektima tretmana što se uočava na osnovu kliničkih znaka i/ili nekropsije, ili može takođe biti klasifikovana kao TR ukoliko je usled nepoznatih uzorka tokom perioda doziranja ili u okviru 14 dana od poslednje doze. Smrt je klasifikovana kao NTR ukoliko su postojali dokazi da je smrt povezana sa tumor modelom, pre nego da je povezana sa tretmanom. NTR smrti su dodatno kategorizovane kao NTRa (usled slučajnosti ili ljudske greške), NTRm (usled diseminacije tumora invazijom ili metastaziranjem što je potvrđeno nekropsijom), i NTRu (usled nepoznatih uzroka).
[0164] Prism 6.07 (GraphPad) za Windows je korišćen za grafičke analize. Statistika nije rađena usled male veličine uzorka.
[0165] Scatter plot je konstruisan da bi pokazao TTE vrednosti za pojedinačne miševe, po grupi; ovaj plot prikazuje NTR smrti, koje su isključene iz svih drugih slika. Pojedinačna
2
životinja, grupna medijana i srednja vrednost zapremine tumora plotovane su u funkciji vremena. Kada je životinja izašla iz studije usled veličine tumora ili TR smrti, njena zabeležena krajnja zapremina je uključena sa podacima korišćenim za izračunavanje medijane zapremine u sledećim vremenskim tačkama. Kaplan-Meier plot je konstruisan da bi se pokazao procenat životinja u svakoj grupi koje ostaju u studiji nasuprot vremenu. Krive rasta tumora su skraćene nakon dve TR smrti koje su se desile u istoj grupi. Grupna srednja vrednost BW promene tokom studije je grafički prikazana kao procenat promene, ± SEM, od dana 1. Rast tumora i krive promene BW su skraćene nakon što je više od polovine procenjivanih miševa u grupi izašlo iz studije. Slika 10 ilustruje srednju vrednost zapremine tumora u studiji.
[0166] Tabela 35 obezbeđuje srednju vrednost gubitka BW, TR i NTR smrti za miševe. Klinički znaci su zabeleženi po uočavanju, kao što je prikazano na Tabelama 36-38. TR smrti nisu se dogodile tokom studije. Gubici težine bili su varijabilni, teški z ajednu životinju u svakoj grupi, i rezultovali su od efekata estrogena. Kliničke opservacije uključujući gubitak težine, uvećane rogove uterusa, i kristale u mokraćnoj bešici bile su prisutne u obe grupe i takođe su se mogle pripisati efektima estrogena. Toksičnost estrogena rezultovala je u dve smrti nepovezane sa tretmanom u svakoj grupi. Tretman procenjen u studiji bio je prihvatljivo tolerisan.
TABELA 35
Rezime odgovora
t) 36(A na ELteži B A
T sna Tele
na) uži -da, Lirin - š ( ora
tum njeereM
37 A EL B A
T
) V
(T a or
tum
ina em prZa38 A L E B A
T
[0167] Kako su dva od četiri miša u kontrolnoj grupi i takođe u grupi tretmana uginula usled tokičnosti estrogena, nije se mogao odrediti statistički zaključak. Sa raspoloživim podacima, medijana rasta tumora i srednja vrednost zapremine tumora su smanjene u grupi tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom. Ova razlika je bila prisutna tokom 14 dana tretmana ali takođe na dan 25 studije. Bilo je potrebno 25 dana kontrolnoj grupi da bi dostigla zapreminu tumora od 1000 mm<3>, dok je kontrolnoj grupi trebalo 36 dana da dostigne zapreminu tumora od 1000 mm<3>. Ovo sugeriše da anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb usporava rast MCF-7 tumora in vivo. Tokom studije i kontrolna grupa i grupa tretmana održavala je slične težine. Ovo sugeriše da anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb nije izazvao toksičnost usled gubitka težine.
PRIMER 13: TRETMAN HUMANOG HER2+ (BT474) KANCERA DOJKE SA ANTI-STAT3 BAKTERIJSKIM VHH13 (SEQ ID NO:3) SDAB U KSENOGRAFT MIŠEVIMA
[0168] U ovom primeru, efikasnost anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je određena u ksenograftu BT474 humanog kancera dojke u CB.17 SCID miševima.
[0169] Dve grupe od 8-12 nedelja starih CB.17 SCID miševa koji sadrže ksenografte od 1 mm<3>fragmenata BT474 tumora u njihovom boku su tretirani prema protokolu prikazanu na Tabeli 39 kada su tumori dostigli prosečnu veličinu od 100-150 mm<3>. Sve doze vehikuluma (PBS kontrola) i anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb (prikazanog na Tabeli 39 kao SB-01) su primenjene intraperitonealno (i.p.) tri puta na dan, u razmaku od šest sati četrnaest dana, sa dve doze isporučene na dan 1 (tid x 14, prvi dan 2 doze). Zapremina doziranja za vehikulum i anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb bila je 0.478 mL na 20 grama telesne težine (23.88 mL/kg) i skalirana je u odnosu na telesnu težinu svake pojedinačne životinje. Grupa 1 je primila vehikulum i služila je kao benčmark grupa za graftovanje i progresiju tumora, kao i kontrola. Grupi 2 je dat anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb na 1 mg/kg.
TABELA 39
Protokol studije
[0170] Tokom prvih 14 dana studije, grupa tretmana je primila anti-STAT3 B VHH13 i kontrolna grupa je primila samo vehikulum. Kao što je prikazano na Tabeli 40, tokom ovog vremena, grupa tretmana je održala i dobijala na težini tokom studije dok je kontrolna grupa imala manje težine tokom studije. Ovo sugeriše da grupa tretmana nije iskusila toksičnost od anti-STAT3 bakterijskog VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb u odnosu na gubitak težine. Srednja vrednost zapremine tumora i medijane zapremine tumora u obe grupe bile su slične, i identične na dan 15 studije. Na dan 59 studije, obe grupe su dostigle zapreminu tumora od 700 kubnih mm<3>. Ovo sugeriše da anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb nije smanjio rast BT474 tumora in vivo u poređenju sa kontrolnom grupom. Slika 11 ilustruje grupnu srednju vrednost zapremine tumora.
40 A L E B A
T
PRIMER 14: PROIZVODNJA MIŠJEG MONOKLONSKOG ANTITELA USMERENOG PROTIV ANTI-STAT3 BAKTERIJSKOG VHH13 (SEQ ID NO:3) SDAB
[0171] U ovom primeru, mišja monoklonska antitela su generisana protiv sdAb pronalaska. Korišćene životinje bile su BALB/c ženke miševa, 8-10 nedelja. Korišćen je ađuvant rastvorljiv u vodi (CBL). Korišćeni HAT i HT bili su od Sigma-Aldrich.
[0172] Anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb je korišćen za imunizaciju tri miša i stvaranje ćelijskih linija hibridoma. Miševi su imunizovani svaki tri puta sa ađuvantom rastvorljivim u vodi. Kod jednog miša, titar seruma je dostigao 1/51200. Miš je žrtvovan i ćelijske linije hibridoma su stvorene fuzijom ćelija slezine sa mijeloma ćelijskom linijom Sp2/0.
[0173] Fuzionisane ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarčića sa ograničenim razblaženjem. Fuzionisane ćelije su kultivisane u prisustvu HAT, i 651 pojedinačni klon je testiran. Od 651 pojedinačnih klonova, 27 pozitivnih klonova je identifikovano koji se specifično vezuju za anti-STAT3 bakterijski VHH13 (SEQ ID NO:3) sdAb antigen.
PRIMER 15: CITOTOKSIČNOST KRAS (G12D) ANTITELA SA JEDNIM DOMENOM NA PANC-1 HUMANE ĆELIJE KANCERA PANKREASA
[0174] Ovaj primer demonstrira anti-proliferativne efekte anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) sdAb kirišćenjem PANC-1 ćelijske linije humanog kancera pankreasa. Za eksperimente, PANC-1 ćelije su uzgajane do dostizanja konflence od 90%. U to vreme, studije proliferacije su izvedene korišćenjem MTT analilze kao što je prethodno opisano.
[0175] Anti-proliferativne osobine anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) sdAB na PANC-1 ćelije tri dana posle tretmana su prikazane na Tabeli 41. PANC-1 ćelije tretirane sa anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) sdAb pokazale su srednju vrednost inhibicije rasta od of 19.9 i 37.7 na 50.0 i 100 μg/ml, respektivno.
TABELA 41
[0176] Stoga, anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO:2) sdAb pokazale su dozno zavisnu inhibiciju rasta kod PANC-1 ćelija humanog kancera pankreasa.
PRIMER 16: IN VITRO INHIBICIJA RASTA SA TNF-ALFA SDAB
[0177] Ovaj primer demonstrira postupak razvijen za određivanje TNF-alfa koncentracije i procenu inhibicije TNF-alfa funkcije. Koncentracija TNF-alfa neophodna da se prikaže merljiva modulacija aktivnosti kod U937 humane limfoblastne ćelijske linije pluća procenjena je kvantifikacijom prisutnog ATP, koji signalizuje prisustvo metabolički aktivnih ćelija korišćenjem Promega Cell Titer-GJo® Luminescent Cell Viability analize.
[0178] U937 ćelije su zasejane na providnu polistirensku ploču sa 96 bunarčića (Corning® Costar® 96-well flat bottom plate, Cat. #3997) u ukupnoj zapremini od 90 μL/bunarčić. Nakon 24 časa inkubacije u humidifikovanom inkubatoru na 37°C sa 5% CO2i 95% vazduha, 5 μL 20X, serijski razblaženog TNF-alfa u medijumu za rast je dodato u svaki bunarčić u duplikatu (10 pt odgovor na dozu, najviša koncentracija 20 ng/mL). Dodatno, 5 μL 20X, razblaženog staurosporina je dodato u medijum za rast u svaki bunarčić u duplikatu (koncentracija 1 nM).
[0179] Nakon 24 časa kulture u prisustvu test agenasa, koncentracija jedinjenja neophodnog da pokaže merljivu modulaciju TNF-alfa aktivnosti u U937 ćelijskoj liniji kao što je procenjeno kvantifikacijom prisutnog ATP. Procenat rasta ćelija je izračunat u odnosu na netretirane kontrolne bunarčiće. Svi testovi su izvedeni u duplikatu na svakom nivou koncentracije.
[0180] EC50vrednost za test agense je procenjena korišćenjem Prism 6.05 fitovanjem krive podataka korišćenjem sledeće četvoro parametarske logističke jednačine:
1
gde Gornji je maksimalni % apsorbance kontrole, Donji je minimalni % absorbance kontrole na najvišoj koncentraciji agensa, Y je % absorbance kontrole, X je koncentracija agensa, IC50je koncentracija agensa koja inhibira ćelijski rast sa 50% u poređenju sa kontrolnim ćelijama, i n je nagib krive.
[0181] Slike 12 i 13 demonstriraju da je TNF-alfa citotoksičan za U937 cells. IC50za TNF-alfa protiv U937 je 95.10 pg/ml. TNF-alfa kriva pokazuje efekat ubijanja u odnosu na titar doze.
[0182] Slika 14 demonstrira da je TNF-alfa citotoksičnost za U937 inhibirana sa tri različita anti-TNFalfa VHH. Kada su anti-TNF-alfa VHH62 (SEQ ID NO:47) sdAb, anti-TNF-alfa VHH 66 (SEQ ID NO:45) sdAb, i anti-TNF-alfa VHH69 (SEQ ID NO:46) sdAb inkubirani sa konstantnom dozom TNF-alfa, na EC50, sva tri anti-TNF-alfa VHH inhibiraju ubijanje U937 sa TNF-alfa. IC50anti-TNF-alfa VHH62 (SEQ ID NO:47) sdAb je približno 713.6 ug/ml. IC50anti-TNF-alfa VHH69 (SEQ ID NO:46) sdAb bila je veća od 208.055 ug/ml. IC50anti-TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO:45) sdAb nije se mogla odrediti usled toga što je kompletno inhibirala citotokičnost TNF-alfa iz koncentracija od oko 1X10<2>ug/ml do 1 X 10<2>ug/ml anti-TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO:45) sdAb. U ovom opsegu koncentracije anti-TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO:45) sdAb, postojipovećanje rasta U937 ćelija, i stoga kompletna inhibicija TNF-alfa aktivnosti.
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Izolovani polipeptid, naznačen time što izolovani polipeptid sadrži anti-KRAS antitelo sa jednim domenom (sdAb) koje sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2.
2. Izolovani polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je polipeptid anti-KRAS antitelo sa jednim domenom (sdAb), pri čemu anti-KRAS sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2.
3. sdAb prema patentnom zahtevu 2, za upotrebu kao lek.
4. sdAb za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je subjekat sisar; poželjno čovek.
5. sdAb za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, naznačeno time što se sdAb primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja, poželjno pri čemu su jedno ili više jedinjenja transkripcioni inhibitor.
6. sdAb za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 5, naznačeno time što lek je za intravensku primenu, intramuskularnu primenu, oralnu primenu, rektalnu primenu, enteralnu primenu, parenteralnu primenu, intraokularnu primenu, subkutanu primenu, transdermalnu primenu, primenu kao kapi za oči, primenu kao nazalni sprej, primenu inhalacijom ili nebulizacijom, topikalnu primenu i primenu kao implantabilni lek.
7. Postupak za merenje nivoa sdAb prema patentnom zahtevu 2 u uzorku od subjekta, naznačen time što postupak sadrži korake:
a) generisanja mišjeg monoklonskog antitela usmerenog protiv jednog ili više domena polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2;
b) izvođenja kvantitativne imunološke analize na uzorku od subjekta, pri čemu kvantitativna imunološka analiza može izborno da sadrži enzimsku imunoanalizu (ELISA), specifični test obeležavanja analita i test ponovnog hvatanja (SALRA), tečnu hromatografiju, masenu spektrometriju, fluorescencijom-aktivirano sortiranje ćelija ili njihovu kombinaciju, sa mišjim monoklonskim antitelom i uzorkom za određivanje količine sdAb u subjektu; i
c) kvantitativno određivanje količine sdAb u subjektu.
1 4
RS20211519A 2014-10-23 2015-10-23 Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena RS62694B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462067908P 2014-10-23 2014-10-23
US201562148656P 2015-04-16 2015-04-16
US201562188353P 2015-07-02 2015-07-02
US201562210795P 2015-08-27 2015-08-27
EP19165430.0A EP3590962B1 (en) 2014-10-23 2015-10-23 Single domain antibodies directed against intracellular antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62694B1 true RS62694B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=55761757

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190750A RS59063B1 (sr) 2014-10-23 2015-10-23 Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena
RS20211519A RS62694B1 (sr) 2014-10-23 2015-10-23 Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190750A RS59063B1 (sr) 2014-10-23 2015-10-23 Antitela sa jednim domenom usmerena protiv intracelularnih antigena

Country Status (24)

Country Link
US (4) US9546211B2 (sr)
EP (3) EP3590962B1 (sr)
JP (5) JP2017538671A (sr)
KR (4) KR102207381B1 (sr)
CN (2) CN106852148B (sr)
AU (4) AU2015335600B2 (sr)
BR (4) BR122020006914B8 (sr)
CA (3) CA3052777C (sr)
CY (2) CY1122035T1 (sr)
DK (2) DK3590962T3 (sr)
ES (2) ES2900253T3 (sr)
HR (2) HRP20191056T1 (sr)
HU (2) HUE057605T2 (sr)
IL (2) IL289769B2 (sr)
LT (2) LT3590962T (sr)
MX (2) MX379450B (sr)
PL (2) PL3590962T3 (sr)
PT (2) PT3590962T (sr)
RS (2) RS59063B1 (sr)
RU (1) RU2017116710A (sr)
SI (2) SI3590962T1 (sr)
SM (2) SMT201900413T1 (sr)
TW (1) TWI664289B (sr)
WO (1) WO2016065323A2 (sr)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
US20180072815A1 (en) 2014-10-23 2018-03-15 Singh Biotechnology, Llc Single Domain Antibodies Directed Against Intracellular Antigens
HUE057605T2 (hu) * 2014-10-23 2022-06-28 Singh Molecular Medicine Llc Intracelluláris antigének ellen irányuló egydoménes antitestek
CN107427577A (zh) 2015-03-31 2017-12-01 韦斯夸尔德有限公司 具有蛋白酶可切割接头的肽构建体
CN107454905B (zh) 2015-03-31 2023-04-28 索里索制药公司 多肽
WO2016156468A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptides
CN109562137A (zh) 2015-09-01 2019-04-02 第波生物公司 用于治疗与异常炎性反应有关的病况的方法和组合物
TWI746473B (zh) 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
CN108603037B (zh) * 2015-12-10 2020-11-17 希望之城 细胞穿透花青偶联抗体
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
AU2018273914A1 (en) 2017-05-24 2019-11-14 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
TW201922780A (zh) 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
KR20190076354A (ko) * 2017-12-22 2019-07-02 주식회사 로피바이오 세포 내 침투능을 갖는 항 stat3 이중특이 항체를 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물
CN111699002B (zh) 2017-12-22 2024-06-28 罗菲佰欧株式会社 抗stat3双特异性抗体及包含其的药学组合物
WO2019213481A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory disease or disorder
AU2019307959B2 (en) 2018-07-20 2025-09-25 Momenta Pharmaceuticals, Inc. FcRn antibody compositions
KR102101561B1 (ko) * 2018-07-25 2020-04-20 가톨릭대학교 산학협력단 신생혈관 표적용 조영제 조성물 및 이의 제조방법
TW202110885A (zh) 2019-05-20 2021-03-16 美商潘迪恩治療公司 靶向ＭＡｄＣＡＭ之免疫耐受性
MX2021015761A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptidos.
MX2021015762A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Composiciones.
AU2020296979A1 (en) 2019-06-21 2022-02-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
CN110357965A (zh) * 2019-06-24 2019-10-22 浙江大学 一种突变型kras特异性抗体及其制备方法
WO2021168079A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector
CN115485289A (zh) 2020-03-11 2022-12-16 宾夕法尼亚大学董事会 使用工程化的病毒颗粒进行基因递送的方法和组合物
US10980756B1 (en) 2020-03-16 2021-04-20 First Wave Bio, Inc. Methods of treatment
CN115215939B (zh) 2021-04-14 2025-09-23 中山大学 一种融合蛋白及其制备方法与应用
EP4366772A4 (en) * 2021-07-07 2025-05-21 Singh Biotechnology, LLC SUPPRESSION OF UVEITIS BY SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES
EP4392459A4 (en) * 2021-08-27 2026-03-18 Singh Biotechnology Llc SINGLE-DOMAIN THERAPEUTIC ANTIBODY
CA3239267A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Ronnie M. RUSSELL Pseudotyped viral particles, compositions comprising the same, and uses thereof
WO2024003873A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio Single variable domain antibodies against tumor necrosis factor-alpha
AU2023314605A1 (en) 2022-07-25 2025-01-09 Interius Biotherapeutics, Inc. Mutated polypeptides, compositions comprising the same, and uses thereof
IL322228A (en) 2023-02-04 2025-09-01 Momenta Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for treating hemolytic disease of the fetus and newborn
WO2025004683A1 (ja) * 2023-06-30 2025-01-02 国立大学法人大阪大学 がん検査方法及びがん治療剤
WO2025027511A1 (en) 2023-07-30 2025-02-06 Janssen Biotech, Inc. Molecules that bind to mutant calreticulin and uses thereof
TW202527982A (zh) 2023-09-11 2025-07-16 美商默門塔醫藥公司 Fcrn抗體之醫藥組成物
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
TW202540161A (zh) 2023-11-21 2025-10-16 美商健生生物科技公司 治療骨髓增生性腫瘤之方法
WO2025163617A1 (en) 2024-02-04 2025-08-07 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating sjögren's disease
WO2025186787A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia
WO2025257810A1 (en) * 2024-06-14 2025-12-18 Singh Biotechnology, Llc Suppression of neurodegenerative diseases by single domain antibody

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
ATE348175T1 (de) * 1992-07-17 2007-01-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Method eder intrazellularen bindung von zielgerichteten molekülen
FR2706486B1 (fr) * 1993-06-16 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques.
AU6234700A (en) 1999-07-27 2001-02-13 Abgenix, Inc. Methods and compositions for inhibiting polypeptide accumulation associated with neurological disorders
US6277974B1 (en) * 1999-12-14 2001-08-21 Cogent Neuroscience, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating conditions, disorders, or diseases involving cell death
DE10019157A1 (de) 2000-04-18 2001-11-15 Stefan Duebel Verfahren zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen
US7943129B2 (en) 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US20040052762A1 (en) 2001-09-10 2004-03-18 Hua Yu Stat3 agonists and antagonists and therapeutic uses thereof
CA2433227A1 (en) * 2000-12-29 2002-08-01 Bio-Technology General, Inc. Specific human antibodies for selective cancer therapy
AU2003219277A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-29 Medical Research Council Intracellular antibodies
GB0226727D0 (en) * 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intrabodies
DK1578446T3 (en) * 2002-11-07 2015-06-29 Immunogen Inc ANTI-CD33 ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR TREATING ACUTE MYELOID LEUKEMIA BY USING IT
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
EP1558647B1 (en) 2002-11-08 2015-06-10 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
GB0226729D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intracellular antibodies
US7638122B2 (en) 2003-03-07 2009-12-29 University Of South Florida Stat3 antagonists and their use as vaccines against cancer
WO2005052002A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
RU2464276C2 (ru) 2005-05-18 2012-10-20 Аблинкс Н.В. Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
WO2008070363A2 (en) 2006-10-31 2008-06-12 Domantis Limited Intrabodies
CA2588106A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-18 Nrc - Institute For Biological Sciences Single-domain antibodies and heavy chain antibody against egfr and uses thereof
EP2008666A1 (en) 2007-06-29 2008-12-31 Institut Pasteur Use of VHH antibodies for the preparation of peptide vectors for delivering a substance of interest and their applications
US20110195509A1 (en) 2007-09-06 2011-08-11 Drew Pardoll Treatment of th17-mediated autoimmune disease via inhibition of stat 3
CN102137658A (zh) * 2008-06-30 2011-07-27 斯兰斯德有限公司 局部递送药物的方法、组合物和系统
EP2143735A1 (en) 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
US20100092470A1 (en) * 2008-09-22 2010-04-15 Icb International, Inc. Antibodies, analogs and uses thereof
WO2011051327A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Small antibody-like single chain proteins
WO2011163423A2 (en) 2010-06-22 2011-12-29 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for cell permeable stat3 inhibitor
US9879093B2 (en) * 2011-12-20 2018-01-30 Adaerata, Limited Partnershp Single domain antibodies as inhibitors of PCSK9
CN104755621A (zh) * 2012-10-31 2015-07-01 埃西斯药品公司 癌症治疗
EP2970392B1 (en) * 2013-03-15 2019-07-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized sos1 peptides
WO2014153495A2 (en) * 2013-03-22 2014-09-25 University Of Hawaii Novel stat3 inhibitors
CN103368197B (zh) 2013-07-15 2015-11-25 国家电网公司 模块化多电平换流器的阀基控制设备和方法
JP6736464B2 (ja) 2013-08-29 2020-08-05 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 細胞透過性コンジュゲート及びその使用の方法
EP2873680A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligopeptide and methods for producing conjugates thereof
EP2899208A1 (en) 2014-01-28 2015-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Camelid single-domain antibody directed against phosphorylated tau proteins and methods for producing conjugates thereof
HUE057605T2 (hu) 2014-10-23 2022-06-28 Singh Molecular Medicine Llc Intracelluláris antigének ellen irányuló egydoménes antitestek

Also Published As

Publication number Publication date
PT3209685T (pt) 2019-06-27
US20160115248A1 (en) 2016-04-28
CA2962275A1 (en) 2016-04-28
ES2900253T3 (es) 2022-03-16
EP3590962B1 (en) 2021-09-29
CY1122035T1 (el) 2020-10-14
EP3209685B1 (en) 2019-04-24
BR122020006918B8 (pt) 2023-01-31
IL250961B (en) 2022-02-01
JP2022037002A (ja) 2022-03-08
LT3209685T (lt) 2019-08-26
PT3590962T (pt) 2021-12-15
KR101831123B1 (ko) 2018-02-22
EP3209685A4 (en) 2018-01-24
EP3209685A2 (en) 2017-08-30
AU2015335600A1 (en) 2017-03-16
SI3209685T1 (sl) 2019-10-30
IL289769B2 (en) 2024-05-01
BR112017008165B8 (pt) 2023-01-31
CA3114318A1 (en) 2016-04-28
JP2020015732A (ja) 2020-01-30
CN106852148A (zh) 2017-06-13
JP2017538671A (ja) 2017-12-28
BR122020006914B1 (pt) 2022-03-22
CA3052777A1 (en) 2016-04-28
DK3590962T3 (da) 2021-12-13
JP2021165278A (ja) 2021-10-14
KR102207382B1 (ko) 2021-01-27
JP2019142885A (ja) 2019-08-29
HRP20211889T1 (hr) 2022-03-04
JP6670963B2 (ja) 2020-03-25
MX2017003268A (es) 2017-08-02
US9663570B2 (en) 2017-05-30
BR112017008165B1 (pt) 2020-04-22
KR102207381B1 (ko) 2021-01-27
SMT201900413T1 (it) 2019-09-09
CN111848793A (zh) 2020-10-30
HUE047601T2 (hu) 2020-05-28
MX379450B (es) 2025-03-11
BR122020006914B8 (pt) 2023-01-31
MX2021001098A (es) 2021-03-31
KR20170070002A (ko) 2017-06-21
JP6928773B2 (ja) 2021-09-01
ES2731876T3 (es) 2019-11-19
SMT202100695T1 (it) 2022-01-10
CN111848793B (zh) 2023-08-18
LT3590962T (lt) 2021-12-27
BR122020006918B1 (pt) 2022-03-15
CN106852148B (zh) 2020-07-31
JP6986180B2 (ja) 2021-12-22
AU2015335600B2 (en) 2019-04-04
US20160115226A1 (en) 2016-04-28
US20160115244A1 (en) 2016-04-28
CA2962275C (en) 2019-11-05
US20160115247A1 (en) 2016-04-28
DK3209685T3 (da) 2019-07-29
US9695234B2 (en) 2017-07-04
EP4006052A1 (en) 2022-06-01
RS59063B1 (sr) 2019-08-30
JP7195400B2 (ja) 2022-12-23
AU2021200416A1 (en) 2021-02-25
KR102023289B1 (ko) 2019-09-19
CY1124867T1 (el) 2022-11-25
KR20180021205A (ko) 2018-02-28
KR20190107199A (ko) 2019-09-18
CA3052777C (en) 2021-06-01
BR122020006907B8 (pt) 2023-01-31
KR20190108646A (ko) 2019-09-24
AU2019204614A1 (en) 2019-07-18
US9546211B2 (en) 2017-01-17
IL289769B1 (en) 2024-01-01
IL289769A (en) 2022-03-01
TW201615834A (zh) 2016-05-01
PL3209685T3 (pl) 2020-01-31
AU2021200416B2 (en) 2022-06-09
IL250961A0 (en) 2017-04-30
PL3590962T3 (pl) 2022-01-31
TWI664289B (zh) 2019-07-01
HRP20191056T1 (hr) 2019-09-20
BR112017008165A2 (pt) 2018-03-06
HUE057605T2 (hu) 2022-06-28
RU2017116710A (ru) 2018-11-23
BR122020006907B1 (pt) 2022-03-22
WO2016065323A3 (en) 2016-06-16
AU2022204167A1 (en) 2022-06-30
EP3590962A1 (en) 2020-01-08
SI3590962T1 (sl) 2022-02-28
WO2016065323A2 (en) 2016-04-28
AU2019204614B2 (en) 2020-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7195400B2 (ja) 細胞内抗原に対して指向された単一ドメイン抗体
RU2810002C2 (ru) Однодоменные антитела, направленные против внутриклеточных антигенов
US9850321B2 (en) Single domain antibodies directed against intracellular antigens