TWI664289B - 針對細胞內抗原之單域抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種不使用外源性靶向序列或化學組合物而治療病症或疾病之組合物及方法。本發明係有關針對細胞內造成病症或疾病的成分之單域抗體(sdAbs)、蛋白質及包括該單域抗體之多肽。本發明亦包含編碼該單域抗體、蛋白質及多肽之核酸，以及包括該單域抗體之組合物。本發明包含該等核酸、單域抗體及編碼該單域抗體之核酸在預防性、治療性或診斷性目的上之用途。

Description

針對細胞內抗原之單域抗體 【相關申請案之交叉參考】

本申請案主張2014年10月23日提出之美國臨時專利申請案第62/067,908號、2015年4月16日提出之美國臨時專利申請案第62/148,656號、2015年7月2日提出之美國臨時專利申請案第62/188,353號以及2015年8月27日提出之美國臨時專利申請案第62/210,795號之權益，其內容全文係以引用方式併入本文中。

本發明係有關一種針對細胞內抗原之單域抗體。

在習知抗體或抗體片段的使用上，使用單域抗體(sdAbs)做為單抗原結合蛋白或做為較大蛋白質或多肽中的抗原結合域可提供許多優點。sdAbs的優點包含：僅需一個單一結構域來高親合力地及高選擇性地結合一抗原；可由單一個基因表現sdAbs且不需要轉譯後修飾；sdAbs對於熱、pH、蛋白水解酶及其他變性劑或變性條件具有高穩定性；sdAbs的製備便宜；且sdAbs可接近習知抗體無法接近的目標及表位。

有許多由異常的細胞內或穿膜成分(諸如核苷酸及蛋白質)所引起的疾病或病症，諸如癌症。可利用將該等異常成分消除以預防或治療疾病或病症。有許多藥物化合物可用於治療，但該等化合物可能是無效的、無法遞送的或對未受影響的細胞有毒性。

其他的治療方法包含使用含有一外源性靶向序列的治療性蛋白質或試劑，使得治療性試劑可以在細胞膜中被受體識別，從而使治療性試劑可穿過細胞膜並進入細胞。一旦治療劑在細胞內，該治療性試劑可以與目標成分交互作用以治療疾病。然而，使用外源性靶向序列可能會限 制被治療性試劑靶向的細胞類型，且增加製造該治療性試劑的成本。

出於上述原因，需要有不依賴於為了進入細胞之外源性靶向序列或化學組合物、且能有效地僅靶定體內受影響的細胞之組合物及方法來治療或預防疾病。

本發明係有關單域抗體(sdAbs)以及包括該單域抗體之蛋白質或多肽。該單域抗體係針對會導致病症或疾病的細胞內成分。本發明亦包含編碼該單域抗體、蛋白質及多肽之核酸，以及包括該單域抗體的組合物。本發明包含為預防、治療或診斷目的之該組合物、單域抗體、蛋白質或多肽的用途。本發明亦包含用於本發明的單域抗體之單株抗體的用途。

本發明之一實施例係為一種針對一細胞內成分之單域抗體。該細胞內成分係可為(例如)蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、TNF-α及KRAS。

在另一實施例中，本發明係針對一種抗STAT3的單域抗體。可選擇地，該抗STAT3的單域抗體係包括如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明係針對一種包括一編碼抗STAT的單域抗體之胺基酸序列的經分離多肽，諸如(例如)SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之多肽。

又在另一實施例中，本發明係針對一種宿主細胞，且該宿主細胞係表現該單域抗體的胺基酸序列，諸如(例如)SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列。

本發明之一實施例係為一種包括一單域抗體或一多肽，以及一藥學上可接受之載體的醫藥組合物。可選擇地，該單域抗體包括有一包括如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的抗STAT3的單域抗體，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明之另一實施例係為一種用以診斷在一個體中之一由STAT3介導的病症之方法，該方法包括下列步驟：a)以該單域抗體或一多肽接觸一生物樣本；b)判定該生物樣本中的STAT3數量；以及c)將步驟(b)中所判定的數量與一標準量進行比較，在數量上的差異指示該病症的存在。

本發明之另一實施例係為一種預防或治療疾病或病症、或預防由STAT3介導的疾病復發、或供使用於癌症的治療、或由異常細胞增生所引起的疾病之方法，該方法包括對一個體施予其所需之一抗STAT3的單域抗體或一多肽。可選擇地，該單域抗體包括有一包括如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的抗STAT3的單域抗體，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明之一實施例係為一種抗TNF-α的單域抗體。可選擇地，該抗TNF-α的單域抗體包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列。本發明亦包括一種包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明之另一實施例係為一種表現如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的宿主細胞。

在另一實施例中，本發明亦為一種包括一單域抗體或一多肽以及一藥學上可接受之載體的醫藥組合物。可選擇地，該單域抗體包括有一包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的抗TNF-α的單域抗體，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明之另一實施例係為一種用以診斷在一個體中之一由TNF-α介導的病症之方法，該方法包括下列步驟：a)以一單域抗體或一多肽接觸一生物樣本；b)判定該生物樣本中的TNF-α數量；以及c)將步驟(b)中所判定的數量與一標準量進行比較，在數量上的差異指示該病症的存在。

在一實施例中，本發明係描述一種預防或治療疾病或病症 或由TNF-α介導的疾病或病症復發、或供使用於癌症的治療、或由異常細胞增生所引起的疾病之方法，該方法包括對一哺乳動物施予其所需之一抗TNF-α的單域抗體或一多肽。可選擇地，該抗TNF-α的單域抗體包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列，且該多肽包括經分離多肽，該經分離多肽包括如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列。

本發明之一實施例係為一種抗KRAS的單域抗體。可選擇地，該抗KRAS的單域抗體包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列。在一態樣中，本發明包括一經分離多肽，其中該經分離多肽包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列。在一態樣中，本發明包括一表現如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的宿主細胞。

本發明之另一實施例係為一種包括一單域抗體或一多肽，以及一藥學上可接受之載體的醫藥組合物。可選擇地，該單域抗體包括有一包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的抗KRAS的單域抗體，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明之另一實施例係為一種用以診斷在一個體中之一由KRAS介導的病症之方法，該方法包括下列步驟：a)以一單域抗體或一多肽接觸一生物樣本；b)判定該生物樣本中的KRAS數量；以及c)將步驟(b)中所判定的數量與一標準量進行比較，在數量上的差異指示該病症的存在。可選擇地，該單域抗體包括有一包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的抗KRAS的單域抗體，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的經分離多肽。

本發明亦包括一種使用一抗KRAS的單域抗體治療疾病的方法，該方法包括對一個體施予其所需之一有效量的抗KRAS的單域抗體。

在一實施例中，本發明係描述一種預防或治療疾病或病症、或一由KRAS介導的疾病或病症的復發、或供使用於癌症的治療、或由異常細胞增生所引起的疾病之方法，該方法包括對一哺乳動物施予其所需之一抗KRAS的單域抗體或一多肽。可選擇地，該抗KRAS的單域抗體 包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列，且該多肽包括有一包括如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的經分離多肽。

在一實施例中，本發明係描述一種施予本發明之單域抗體的方法，該方法包括靜脈內投藥、肌肉內投藥、口服投藥、直腸投藥、眼內投藥、經腸投藥、非經腸投藥、皮下投藥、經皮投藥、以眼藥水投藥、以鼻噴劑投藥、藉由吸入法或噴霧法投藥、局部投藥及以一可植入式藥物投藥。

在另一實施例中，本發明係描述一種使用本發明之單域抗體與一或多個化合物結合而治療一疾病、預防一疾病或預防一疾病的復發之方法。可選擇地，該一或多個化合物係為一轉錄抑制劑。

在另一實施例中，本發明係描述一種測量一單域抗體的數量之方法，該方法包括下列步驟：a)產生一針對該單域抗體之一或多個結構域的小鼠單株抗體；b)執行一定量免疫測定以判定在一個體中該單域抗體的數量；以及c)定量該個體中該單域抗體的數量。

參考以下描述、所附申請專利範圍及附圖，本發明的這些及其他特徵、態樣與優點將變得更加容易理解，其中：第1圖係為VHH13抗STAT3單域抗體表現載體pTT21-stt VHH13之示意圖；第2圖係為VHH14抗STAT3單域抗體表現載體pTT21-stt VHH13之示意圖；第3圖係描繪使用抗STAT3細菌型VHH13 STAT3(SEQ ID NO：3)及抗STAT3細菌型VHH14 STAT3(SEQ ID NO：4)之免疫沉澱測定結果；第4圖係描繪使用抗STAT3細菌型VHH13 STAT3(SEQ ID NO：3)之免疫沉澱測定結果；第5圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231異種移植模式中以0.5mg/kg/天的劑量給藥之生長抑制情形； 第6圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231異種移植模式中在1mg/kg每天兩次至2mg/kg每天兩次或2mg/kg/天的給藥範圍中之生長抑制情形；第7圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231異種移植模式中以5mg/kg/每天兩次的劑量給藥之生長抑制情形；第8圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在DU145異種移植模式中以5mg/kg/每天兩次的劑量給藥之生長抑制情形；第9圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在PANC-1異種移植模式中以5mg/kg/每天兩次的劑量給藥之生長抑制情形；第10圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MCF-7異種移植模式中以1mg/kg/每天三次的劑量給藥之生長抑制情形；第11圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在BT-474異種移植模式中以1mg/kg/每天三次的劑量給藥之生長抑制情形；第12圖係顯示TNF-α在U937細胞中的細胞毒性情形；第13圖係顯示星形孢菌素在U937細胞中的細胞毒性情形；以及第14圖係顯示TNF-α的細胞毒性係受到抗TNF-α細菌型VHH(SEQ ID NO：45,46及47)單域抗體抑制的情形。

如本文中所用，下列術語及其變體具有下文中給出的含義，除非使用這類術語的上下文明確指出其有不同的含義。

本文中使用的術語「一(a)」、「一個(an)」與「該(the)」以及相似的指代應被解釋為涵蓋單數及複數，除非它們在上下文中用於指示其他含義。

術語「抗原決定子」是指在抗原上被抗原結合分子(諸如本發明的單域抗體或多肽)、更特別是被該抗原結合分子之抗原結合位點所辨識的表位。術語「抗原決定子」及「表位」亦可交換地使用。對於特定 的抗原決定子、表位、抗原或蛋白質係可以結合、具有親合力及/或具有特異性的胺基酸序列係被認為是「抗(against)」或「針對(directed against)」該抗原決定子、表位、抗原或蛋白質。

如本文中所用，術語「包括(comprise)」和該術語的變化形(諸如"comprising"及"comprises”)並非意欲排除其他附加物、成分、整體或者步驟。

可以預期到本文中所述之該等單域抗體、多肽及蛋白質可包含所謂的「保守」胺基酸取代，其通常可以描述為其中的胺基酸殘基被具有相似化學結構的另一胺基酸殘基取代，且對該多肽的功能、活性或其他生物特性幾乎沒有或基本上沒有影響之胺基酸取代。保守胺基酸取代是本技術領域中眾所周知的。保守取代即為下列群組(a)-(e)內的一個胺基酸被同群組內的另一胺基酸所取代：(a)小的脂肪族、非極性或弱極性的殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(b)極性、帶負電荷的殘基及其(不帶電荷的)醯胺：Asp、Asn、Glu及和Gln；(c)極性、帶正電荷的殘基：His、Arg及Lys；(d)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；以及(e)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。其他的保守取代包含：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg、取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu、取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met、取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；及/或Phe取代成Val、取代成Ile或取代成Leu。

如本文中所用之術語「結構域」通常指抗體鏈的球狀區域，特別是指重鏈抗體的球狀區域，或指基本上由這類球狀區域組成的多肽。

單域結構的胺基酸序列與結構一般係由四個構架區(或稱「FR」)所組成，該等構架區分別稱為「構架區1」或「FR1」；「構架區2」或「FR2」；「構架區3」或「FR3」；及「構架區4」或「FR4」。該等構架區 間雜有三個「互補決定區」(或稱「CDR」)，其分別稱為「互補決定區1」(或稱「CDR1」)；「互補決定區2」(或稱「CDR2」)；及「互補決定區3」(或稱「CDR3」)。

如本文中所用，術語「人類化單域抗體」係表示一個單域抗體之天然存在的VHH序列的胺基酸序列中已有一或多個胺基酸殘基，被來自於人類的習知四鏈抗體的VH結構域中之對應位置處存在的一或多個胺基酸殘基所取代。這可由本領域中所熟知的方法進行。該等單域抗體的構架區係可被人類變異構架區所取代。

如本文中所用，「經分離」核酸或胺基酸係已與其通常相關聯的至少一種其他成分分離，諸如其來源或培養基、另一核酸、另一蛋白質/多肽、另一生物成分或大分子或污染物、雜質或次要組分。

術語「哺乳動物」定義為一屬於哺乳動物網之個體，包括(但不限於)人、家畜及農場動物，及動物園、體育及寵物動物，諸如牛、馬、羊、狗及貓。

如本文中所用，「藥學上可接受之載體」係意欲包含任何及所有與藥物施用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌及抗真菌劑、等滲透壓及吸收延遲劑等。適宜的載體係描述在最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences，其為本技術領域中的標準參考文獻。這類載體或稀釋劑之較佳實例包含(但不限於)水、鹽水、生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋葡萄糖溶液、PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)及5%的人類血清白蛋白。也可使用脂質體、陽離子脂質及非水性媒劑(諸如非揮發性油)。用於藥學活性物質之這類介質及試劑在本技術領域中是眾所周知的。除非到任何習用介質或試劑與如上述所定義之治療性試劑不相容的程度，可預期其使用在本發明的組合物中。

「定量免疫測定」係指任何藉由使用一抗體測量存在於一樣本中的抗原數量之手段。用以執行定量免疫測定的方法包含：酵素連接免疫吸附測定(ELISA)、特異性分析物標記及再捕獲法(SALRA)、液相色層分析、質譜分析、螢光活化細胞分選及其組合。

術語「溶液」係指一包括溶劑及溶質的組合物，且其包含真溶液和懸浮液。溶液的實例包含括溶解在一液體中的固體、液體或氣體以及懸浮在一液體中的顆粒或微胞。

術語“特異性”是指特定的抗原結合分子或抗原結合蛋白分子可以結合的不同類型的抗原或抗原決定子的數目。一抗原結合蛋白的特異性可以依據親合力及/或結合性來判定。親合力係由抗原與抗原結合蛋白的解離平衡常數(KD)所表示，其為抗原決定子和該抗原結合蛋白上抗原結合位點之間的結合強度的量度：KD值越小，抗原決定子和抗原結合分子之間的結合強度越強(或者，親合力亦可以表示為親合常數(Ka)，其為1/KD)。本領域技術人員應該清楚，親合力可以取決於感興趣的特定抗原來判定。結合性係為抗原結合分子及該抗原之間的結合強度的量度。結合性係與抗原決定子及其在抗原結合分子上的抗原結合位點之間的親合力以及在該抗原結合分子上存在的相關結合位點的數目有關。抗原結合蛋白與抗原或抗原決定子的特異性結合可由任何已知方法來判定，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)及/或競爭結合測定，諸如放射性免疫測定(RIA)、酵素免疫測定(EIA)及夾心式(sandwich)競爭測定。

如本文中所用，術語「重組」係指使用用於產生本發明的單域抗體之基因工程方法(例如，選殖，及擴增)。

術語「單域抗體」、「sdAb」或「VHH」通常可定義為一包括由四個間雜有三個互補決定區的構架區所組成的胺基酸序列之多肽或蛋白質。其係以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4表示。本發明之sdAb亦包含一包括該sdAb胺基酸序列之多肽或蛋白質。

術語「合成的」係指藉由活體外化學或酵素合成。

如本文中所用之術語「目標」係指任何被該sdAb所辨識之成分、抗原或官能基。術語「細胞內目標」係指任何存在於細胞內的成分、抗原或官能基。術語「穿膜目標」係指任何位於細胞膜內的成分、抗原或官能基。

如本文中所用之語「治療性組合物」係表示一意欲具有治 療效果之物質，諸如醫藥組合物、基因物質、生物製劑及其它物質。基因物質包含意欲具有直接或間接的基因治療效果的物質，諸如基因載體、基因調控因子、基因結構因子、DNA、RNA等。生物製劑包含該等為生命物質或衍生自生命物質且意欲有治療效果的物質。

如本文中所用，詞語「治療有效用量」及「預防有效用量」係指在一疾病或該疾病之明顯症狀的治療、預防或管理上提供治療益處的用量。在治療、治愈、減輕、緩解、改變、矯正、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或患病傾向之目的上，該治療有效用量可治療一疾病或病症、一疾病的症狀或一患病傾向。治療有效的特定用量係可為一般開業醫生所容易判定，且可視本領域中已知的因素而改變，諸如(例如)疾病類型、病患病史及年齡、疾病的階段及其它治療性試劑的施用。

如本文中所用，存在於天然存在重鏈抗體中的可變區也將被稱為「VHH結構域」，以便將它們與存在於習知4鏈抗體中的重鏈可變結構域(稱為「VH結構域」)，及存在於習知4鏈抗體中的輕鏈可變結構域(稱為「VL結構域」)相區分。「VHH」與「單域抗體(sdAb)」在本文中係可互換使用。單域抗體或多肽的胺基酸殘基編號係根據Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」，US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，出版號91)提供之用於VH結構域之通用編號來編號。根據此編號方式，單域抗體的FR1包括位置1-30的胺基酸殘基，單域抗體的CDR1包括位置31-36的胺基酸殘基，單域抗體的FR2包括位置36-49的胺基酸殘基，單域抗體的CDR2包括位置50-65的胺基酸殘基，單域抗體的FR3包括位置66-94的胺基酸殘基，單域抗體的CDR3包括位置95-102的胺基酸殘基，而單域抗體的FR4包括位置103-113的胺基酸殘基。

本發明係有關一種針對細胞內成分之單域抗體，也有關包括該等單域抗體之蛋白質及多肽以及編碼該等蛋白質與多肽之核苷酸。本發明亦可有關針對細胞內、穿透細胞及細胞外之目標或抗原的單域抗體。本發明亦包含編碼該等單域抗體、蛋白質及多肽的核酸，以及包括該單域抗體的組合物。本發明包含該等用於預防性、治療性或診斷性目的之組合 物、單域抗體、蛋白質或多肽之使用。

單域抗體具有許多獨特的結構特徵與功能特性，其使得單域抗體非常有利於用作為功能性抗原結合結構域或蛋白質。單域抗體在功能上係結合至不存在於輕鏈可變結構域中的抗原，且可以作用為一個單一的、相對小的功能性抗原結合結構單元、結構域或蛋白質。這將單域抗體與習用抗體的結構域區分開來，後者本身並不作用為抗原結合蛋白或結構域，但需要與習用抗體片段(諸如Fab片段或ScFv片段)結合以結合抗原。

單域抗體可使用本技術領域中所熟知的方法來取得。例如，一用於取得單域抗體的方法包含(a)以一或多個抗原對一駱駝科動物進行免疫接種、(b)自經免疫接種的駱駝科動物分離周邊淋巴細胞，取得總RNA及合成對應的cDNA、(c)構築一編碼VHH結構域之cDNA片段的基因庫、(d)使用PCR方法將步驟(c)中所獲得之該等編碼VHH結構域的cDNA轉錄成mRNA，將該mRNA轉換成核醣體表現型式，並由核醣體的表現選擇VHH結構域、以及(e)在一適宜的載體中表現該VHH結構域，並且，選擇性地純化所表現的VHH結構域。

另一種取得本發明之單域抗體的方法係藉由使用核酸合成技術來製備一編碼單域抗體的核酸，接著在體內或在體外表現該核酸。此外，本發明之單域抗體、多肽及蛋白質可使用用於製備蛋白質、多肽或其他胺基酸序列之合成或半合成技術來製備。

本發明之該等單域抗體通常將結合至該目標所有天然存在的或合成的類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段，或至少結合至該目標之如下彼等類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段：含有一或多個在野生型目標中本發明該等單域抗體所結合之抗原決定子或表位基本上相同之抗原決定子或表位。本發明之該等單域抗體係可以與本發明該等單域抗體結合至野生型目標之親合力與特異性相同(或較高或較低)之親合力與專一性來結合至這類類似物、變異體、突變體、對偶基因、部分及片段。在本發明之範疇內亦可預期到本發明之該等單域抗體係結合至該目標的某些類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段而不結合其 餘者。此外，本發明之單域抗體可經人類化，且可為單價或多價，及/或多特異性。另外，本發明之該等單域抗體可結合至磷酸化形式的目標蛋白質以及非磷酸化形式的目標蛋白質。單域抗體可連接其他諸如白蛋白或其他大分子的分子。

此外，多價的單域抗體係屬於本發明之範圍內，也就是說，該單域抗體可具有二或多個針對該目標之二或多個不同表位的蛋白質或多肽。在這樣的多價單域抗體中，該蛋白質或多肽可(例如)針對相同的表位，實質上相等的表位，或不同的表位。該等不同的表位可位於相同的目標上，或其可在二或多個不同的目標上。

亦可預期到本發明之該一或多個單域抗體的序列可與一或多個連接子序列連接或接合。該連接子係可為(例如)一含有絲胺酸、甘胺酸及丙胺酸組合之蛋白質序列。

使用本發明單域抗體之部分、片段、類似物、突變體、變體、對偶基因及/或衍生物係亦屬於本發明之範圍，只要它們是適用於所述的用途。

由於本發明之該等單域抗體主要係用於治療及/或診斷的用途，其係針對哺乳動物，較佳地係以人做為目標。然而，本文中所述之該等單域抗體有可能與來自其他物種的目標交叉反應，例如與來自一或多個其它靈長類物種或其它動物(例如，小鼠、大鼠、兔、豬或狗)的目標交叉反應，尤其在與該等目標相關疾病有關之疾病及病症動物模型中。

在另一態樣中，本發明係有關一種編碼本發明之單域抗體的核酸。這類核酸係可(例如)呈一基因構築體形式。

在另一態樣中，本發明係有關一種表現或能夠表現本發明之單域抗體，及/或含有編碼本發明之單域抗體的核酸之宿主或宿主細胞。該等單域抗體的序列可用以插入任何生物體的基因體中而產生一基因改良生物體。其實例包含(但不限於)植物、細菌、病毒及動物。

本發明更有關一種用於製備或產生該等單域抗體、編碼該等單域抗體的核酸、表現或能夠表現這類單域抗體的宿主細胞、含有本發 明該等單域抗體的產物及組合物之方法。

本發明更有關一種在本文中所述之單域抗體、編碼該單域抗體的核酸、宿主細胞、產物及組合物之應用及用途。這類產物或組合物係可為(例如)一用於治療或預防一疾病的醫藥組合物，或一用於診斷用途之產物或組合物。單域抗體可使用在ELISA測定及質譜分析測定中以測量該等單域抗體的血清及組織數量。

在另一態樣中，編碼本發明之一或多個單域抗體的核酸係可插入一生物體的基因體中以治療或預防疾病。

本發明大致上係有關單域抗體，以及包括或主要由一或多個這類單域抗體所組成而可用於預防性、治療性及/或診斷性目的之蛋白質或多肽。

於本發明中所詳述之該等方法單域及組合物係可用以施予一治療有效用量以治療本文中所述之疾病，且其可以本文中所述或其他已知之任何劑量及/或配方來使用，以及以本文中所述或其他本領域技術人員所知之任何給藥方式來使用。

一般認為該等單域抗體(尤其是本發明之抗STAT3的VHH、抗KRAS的VHH及抗TNF-α的VHH)係可用於治療或預防惡性疾病，該等惡性疾病包含(但不限於)：多發性骨髓瘤、白血病(HTLV-1依存性、紅血球性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、及大顆粒淋巴球性白血病(LGL)、淋巴瘤(EBV相關/伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、蕈樣肉芽腫淋巴瘤，皮膚T細胞淋巴瘤，非何傑金氏(non-Hodgkins)淋巴瘤(NHL)，間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、乳癌、三陰性乳癌、頭頸部癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤骨肉瘤、卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤、尤文氏(Ewing’s)肉瘤、肝癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、星狀細胞瘤、大腸直腸癌、威爾姆氏斯瘤(Wilm’s tumor)、腎癌、膀胱癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、食道癌、皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌、以及任何轉移性癌症。該等單域抗體可使用在癌症病患中以助於預防或減少因癌症所造成的體重減輕或惡病體質。

該等單域抗體(尤其是本發明之抗STAT3的VHH及抗TNF-α的VHH)係可用於治療及預防非惡性疾病，諸如(但不限於)：自體免疫疾病(例如，類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、細菌介導的結腸炎、哮喘、硬皮病、紅斑性狼瘡、腦脊髓炎、動脈炎、血管炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、葡萄膜視網膜炎、多發性硬化症)、多囊性腎病變、皮膚疾病(例如，牛皮癬、斑禿、異位性皮膚炎、瘢痕瘤/肥厚性瘢痕、脂肪瘤、Padget氏病及日光性角化病)、移植(例如，實體器官、骨髓、手、臉、四肢、任何身體部分)、與癌症及老化相關之肌肉營養不良及肌肉萎縮、子宮內膜異位症、黃斑部退化、視網膜變性、中風、癲癇、創傷性腦傷及脊髓損傷、高血壓、心臟肥大、阿滋海默症、肺動脈高血壓、第2型糖尿病及僵直性背椎炎。此外，抗STAT3的VHH係可靶定孤兒疾病(orphan diseases)。這些罕見孤兒癌症的實例包含(但不限於)：三陰性乳癌、胰腺癌、AML(急性骨髓性白血病)、頭頸部癌、多發性骨髓瘤及化療抗性癌症。

病毒感染可以通過在受感染的細胞中靶向細胞內的病毒蛋白而進行治療。病毒蛋白，諸如HIV逆轉錄酶，可以阻斷病毒的生命週期。本發明之單域抗體也可以靶定細胞內的病毒蛋白(諸如Ebola VP24)，從而阻斷埃博拉病毒(Ebola)關閉宿主的抗病毒免疫反應之能力。本發明之單域抗體係可用以於細胞內分子過度表現時靶定疾病，亨丁頓舞蹈症係可用單域抗體來治療。

本發明之單域抗體可與一或多個化合物一起使用。例如，本發明之單域抗體可與JAK/STAT抑制劑一起使用，該等抑制劑諸如(例如)薑黃素(Curcumin)、白藜蘆醇(Resveratrol)、葫蘆素(Cucurbitacin)A,B,E,I,Q、黃酮吡醇Flavopiridol、去氧四角黴素(Deoxytetrangomycin)、環戊烯酮(Cyclopentenone)衍生物、N-酰基高丝氨酸內酯(N-Acylhomoserine Lactone)、靛玉紅(Indirubin)衍生物、甲異靛(Meisoindigo)、酪胺酸磷酸化抑制劑(Tyrphostins)、含白金之化合物(例如，IS3-295)、擬肽物(Peptidomimetics)、反意寡核苷酸、S3I-201、磷酸酪胺酸三肽(phosphotyrosin tripeptide)衍生物、 HIV蛋白水解酶抑制劑(例如，nelfinavir、indinavir、saquinavir及ritornavir)、JSI-124、XpYL、Ac-pYLPQTV-NH2、ISS 610、CJ-1383、嘧啶甲胺(pyrimethamine)、二甲雙胍(Metformin)、阿替莫德(Atiprimod)、S3I-M2001、STX-0119；N-[2-(1,3,4-惡二唑基)]-4喹啉甲酰胺(N-[2-(1,3,4-oxadiazolyl)]-4 quinolinecarboxamide)衍生物、S3I-1757、LY5；5,8-二側氧基-6(吡啶-3-基氨基))-5,8,-二氫-荼-1-磺醯胺(5,8-dioxo-6(pyridin-3-ylamino)-5,8,-dihydro-naphthalene-1-sulfonamide)、withacinstin、Stattic、STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、SF-1066、SF-1087、17o、隱丹參酮(Cryptotanshinone)、FLL32、FLL62、C188-9、BP-1108及BP-1075、肉盤菌內酯(Galiellalactone)、JQ1,5,15 DPP、WP1066、耐克螺(Niclosamide)、SD1008、硝呋齊特(Nifuroxazide)、隱丹參酮(Cryptotanshinone)、BBI醌以及Ruxolitnib磷酸鹽)。該等化合物中之一或多者係可增加治療反應並增強本發明之單域抗體的功效。本發明之單域抗體的功效可藉由與肽、擬肽、及其它藥物(諸如，例如(但不限於)希美替定(cimetidine)、阿托伐他汀(atorvastatin)、塞內昔布(celecoxib)、二甲雙胍及希美替定)結合而增加。此外，對於放射治療，抗STAT3的單域抗體係可將放射抗性的癌症轉換成放射敏感性的癌症。

亦可預期到本發明該等單域抗體中之一或多者係可結合一起，或本發明該等單域抗體可與其他單域抗體結合。

可預期到本發明該等單域抗體可不借助於在單域抗體上的額外靶定蛋白質序列，且可不借助於導引單域抗體結合至細胞表面受體及穿過細胞膜的外源性化合物，而穿過細胞膜進入細胞。

於穿過細胞膜之後，這些單域抗體可靶定穿膜或細胞內的分子或抗原。這些細胞內或穿膜的目標係可為(例如)蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸、突變蛋白質、病毒蛋白及傳染性蛋白顆粒。該等單域抗體的目標可作用為酵素、細胞結構蛋白、細胞膜分子的胞內部分、胞器膜內的分子、任何類型的RNA分子、DNA或染色體的任何區域、甲基化或未甲基化的核酸、細胞合成機制內的部分組裝分子、第二信使分子以及細 胞信息機制內的分子。該等目標可包含於細胞質、細胞核、胞器及細胞膜中的所有分子。預定分泌或放置在細胞膜中的分子係可在離開細胞之前於細胞質內被靶定。

該等單域抗體的目標可以在人、動物、植物、真菌、寄生蟲、原生動物、細菌、病毒、傳染性蛋白顆粒、原核細胞及真核細胞之中。可被本發明該等單域抗體靶定的細胞間及細胞內信息分子及蛋白質群的一些實例如下：致癌基因產物、內泌素、細胞介素、生長因子、神經傳導物質、激酶(包含酪胺酸激酶、絲胺酸激酶及蘇胺酸激酶)、磷酸酶、泛素、環核苷酸、環化酶(腺嘌呤基及甲脒基)、G蛋白、磷酸二酯酶、GTP酶超家族、免疫球蛋白(抗體、Fab片段、結合蛋白、單域抗體)、免疫球蛋白超家族、肌醇磷酸脂、類固醇受體、調鈣蛋白、CD群組(例如，CD4、CD8、CD28等)、轉錄因子、TGF-β、TNF-α及TNF-β、TNF配位體家族、凹槽受體信息分子、刺蝟受體信息分子、Wnt受體信息分子、類鐸受體信息分子、凋亡蛋白酶、肌動蛋白、肌球蛋白、肌肉生長抑制素、12-脂氧化酶、15-脂氧化酶、脂氧化酶超家族、逆轉錄酶、病毒及其蛋白質、澱粉樣蛋白、膠原蛋白、耦合G蛋白的受體、經突變的一般蛋白質、傳染性蛋白顆粒、Ras、Raf、Myc、Src、BCR/ABL、MEK、Erk、Mos、Tpl2、MLK3、TAK、DLK、MKK、p38、MAPK、MEKK、ASK、SAPK、JNK、BMK、MAP、JAK、PI3K、環氧化酵素、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、Myc、p53、NRAS、KRAS、HRAS及趨化介素。

KRAS是一個來自於哺乳類ras基因家族之Kirsten ras致癌基因同源物。KRAS係編碼一為小型GTPase(鳥嘌呤核苷三磷酸酶)超家族的一員之蛋白質。該蛋白質係與多種惡性腫瘤關聯密切，包含肺腺癌、黏液腺瘤、胰腺及結腸直腸癌性導管癌。在正常情況下，Ras家族成員係於一以次細胞膜隔室化為基礎的信息系統中影響細胞生長及分化事件。然而，致癌的Ras可以解除對於細胞增生與細胞凋亡二者的控制過程之控制。

抗KRAS的單域抗體係經開發以靶定野生型及突變型的KRAS，以破壞其在惡性細胞中的角色，該等惡性細胞諸如(例如)涉及結 腸直腸癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、白血病以及其他轉移性惡性腫瘤之細胞。在不受限於特定的機制下，可認為該抗KRAS的單域抗體結合KRAS並阻斷KRAS基因在惡性細胞中的下游信息傳導。此外，該抗KRAS的單域抗體可成功治療對於抗EGFR生物製劑(例如，西妥昔單抗(cetuximab)及盤尼圖單抗(panitumumab))有抗藥性的惡性腫瘤。

藉由使用本領域中所熟知的方法，使用重組人類突變型KRAS(G12D)蛋白質來產生針對或可以結合至KRAS或突變型KRAS(G12D)或其他KRAS突變體之表位的單域抗體。此外，可針對其他KRAS突變體產生單域抗體。為產生該抗KRAS單域抗體，重組的全長人類KRAS(Gene ID：3845)係於大腸桿菌中表現。

多個單域抗體係經取得並進行篩選。一抗KRAS的單域抗體之DNA序列(命名為KRAS_13(SEQ ID NO：1))係顯示如下：

該抗KRAS的單域抗體KRAS_13之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)係顯示如下(該等CDR係加下劃線)：

此外，本發明係包括一或多個針對本發明之抗KRAS單株抗體之一或多個結構域的小鼠單株抗體。小鼠單株抗體可藉由本領域技術人員已知的方法產生，例如，該小鼠單株抗體可藉由小鼠融合瘤而產生。該小鼠單株抗體可使用在診斷測定中，例如，該抗體可使用在一諸如ELISA或質譜分析測定之免疫測定中，以便測量該抗KRAS單株抗體存在於病患血清中的數量。該KRAS(G12D)單域抗體對於PANC-1人類胰腺癌細胞的 細胞毒性係經測試，如下所述。

STAT3係為信息傳導與轉錄活化因子(STAT)家族的一員，其蛋白質帶有信息傳導及轉錄活化功能。STAT3在酪胺酸及/或絲胺酸磷酸化期間係廣泛地表現且變為活化的，而做為一個因應各種細胞介素及生長因子(諸如EGF、IL-6、PDGF、IL-2及G-CSF)的DNA結合蛋白。STAT3磷蛋白係與STAT家族其餘成員一起形成同質二聚體及異二聚體並易位至細胞核以便調節各種基因的轉錄，且因此在許多細胞過程(諸如細胞生長、細胞凋亡、血管生成、逃避免疫及細胞生存)中扮演關鍵角色。

抗STAT3的單域抗體可給予病患或其他生物體以治療由STAT3所引起的疾病，以及預防疾病的發生或疾病的復發。例如，已經歷器官移植及骨髓移植的病患因其服用的免疫抑制藥物而對皮膚性SCCA及BCCA有較高的風險。抗STAT3的單域抗體可減少或消除此風險。經治療惡性腫瘤而處於復發風險下的病患將可從使用抗STAT3單域抗體的治療中獲益。基於家族病史及HLA類型，一些個體對於某些類型的自體免疫疾病將面臨更大的風險，而其可從使用單域抗體的治療中獲益以降低形成自體免疫疾病的風險。乳腺癌的風險可隨著施予抗STAT3的藥物(諸如在最近的NCI研究中所顯示的GLG-302)而降低。

除了抑制STAT3之外，該抗STAT3的單域抗體亦可抑制STAT1、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5及STAT6，因為這些分子之間的同源性程度高。

重組的人類STAT3蛋白質係用以產生針對或能夠結合至STAT3表位的抗STAT單域抗體。為產生該抗STAT3的單域抗體，重組的全長人類STAT3(Gene ID：6774)係在Sf9昆蟲細胞中藉由桿狀病毒而表現。該等抗STAT的單域抗體係選殖至皆可在細菌及哺乳類動物細胞中表現的載體之中，如第1及2圖所示。

本發明之抗STAT3單域抗體可用以在細胞內靶定STAT3及所有其他STAT分子，以便抑制細胞生長，諸如(例如)抑制癌細胞生長。此外，該抗STAT3單域抗體可在其他增生性疾病(諸如牛皮癬及經由VEGF 導致的黃斑部退化)中抑制細胞生長。

在不受限於特定的作用機制下，可認為該抗STAT3的單域抗體可藉由減少抗原呈現細胞(諸如，(例如)宿主樹突細胞)中的STAT3數量而消除癌症所誘發的免疫抑制。，STAT3的抑制促使了憑藉病患先天及適應性免疫系統(即，樹突細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、T細胞、NK細胞及B細胞)的抗癌反應。

藉由使用本技術領域中所熟知的方法，多個單域抗體係經取得並篩選其在癌細胞株中抑制癌細胞生長與誘發細胞凋亡的能力，如下所述。該抗STAT3單域抗體之細胞毒性及抗增生活性係經測試。此外，抗STAT3單域抗體的容許度係在活體內及活體外測試。另外，針對該抗STAT單域抗體中之一或多個結構域的小鼠單株抗體的產生係描述如下。

一抗STAT3單域抗體的胺基酸序列(命名為VHH13(SEQ ID NO.3))係顯示如下： 該三個CDR係加下劃線。

一第二抗STAT3單域抗體的胺基酸序列(命名為VHH14(SEQ ID NO.4))係顯示如下：

同樣地，該三個CDR係加下劃線。其他所取得的抗STAT3單域抗體的蛋白質序列如下：

STAT3_10(SEQ ID NO.5)：

STAT3_34(SEQ ID NO.6)：

STAT3_19(SEQ ID NO.7)：

STAT3_14(SEQ ID NO.8)：

STAT3_35(SEQ ID NO.9)：

STAT3_9(SEQ ID NO.10)：

STAT3_30(SEQ ID NO.11)：

STAT3_23(SEQ ID NO.12)：

STAT3_24(SEQ ID NO.13)：

STAT3_36(SEQ ID NO.14)：

STAT3_12(SEQ ID NO.15)：

STAT3_16(SEQ ID NO.16)：

STAT3_11(SEQ ID NO.17)：

STAT3_20(SEQ ID NO.18)：

STAT3_2(SEQ ID NO.19)：

STAT3_15(SEQ ID NO.20)：

STAT3_6(SEQ ID NO.21)：

STAT3_33(SEQ ID NO.22)：

STAT3_17(SEQ ID NO.23)：

STAT3_25(SEQ ID NO.24)：

STAT3_32(SEQ ID NO.25)：

STAT3_13(SEQ ID NO.26)：

STAT3_39(SEQ ID NO.27)：

STAT3_4(SEQ ID NO.28)：

STAT3_29(SEQ ID NO.29)：

對應的抗STAT3 DNA序列如下：

Stat3_VHH-10(SEQ ID NO.30)：

Stat3_VHH-14(SEQ ID NO.31)：

Stat3_VHH-12(SEQ ID NO.32)：

Stat3_VHH-13(SEQ ID NO.33)：

Stat3_VHH-20(SEQ ID NO.34)：

Stat3_VHH-23(SEQ ID NO.35)：

Stat3_VHH-24(SEQ ID NO.36)：

Stat3_VHH-25(SEQ ID NO.37)：

Stat3_VHH-19(SEQ ID NO.38)：

Stat3_VHH-32(SEQ ID NO.39)：

Stat3_VHH-33(SEQ ID NO.40)：

Stat3_VHH-36(SEQ ID NO.41)：

Stat3_VHH-11(SEQ ID NO.42)：

Stat3_VHH-6(SEQ ID NO.43)：

Stat3_VHH-1(SEQ ID NO.44)：

此外，本發明包括一或多個針對本發明之抗STAT3單域抗體之一或多個結構域的小鼠單株抗體。該小鼠單域抗體係可由本領域技術人員已知的方法而產生，例如，該小鼠單株抗體可藉由小鼠融合瘤而產生。該小鼠單株抗體可使用在診斷測定中，例如，該抗體可使用在一諸如ELISA之免疫測定中，以便測量該抗STAT3單株抗體存在於病患血清中的數量。應理解，該方法並不限於抗STAT3單域抗體，且可用以產生一針對本發明 該等單域抗體中之任一者的小鼠抗體。

該TNF-α基因係編碼一屬於腫瘤壞死因子(TNF)超家族之多功能性類前發炎細胞介素。此細胞介素主要是由巨噬細胞所分泌。該細胞介素涉及廣泛的生物過程調控，包含生長調控、分化、發炎、病毒複製、腫瘤形成、及自體免疫疾病；以及病毒、細菌、真菌及寄生蟲的感染在內。除誘發腫瘤的出血性壞死之外，TNF被發現係涉及腫瘤形成、腫瘤轉移、病毒複製、敗血性休克、發燒、發炎、惡病體質及自體免疫疾病(包含克羅恩氏病及類風濕性關節炎)，以及移植體對宿主反應疾病。

本發明係提供針對TNF-α，尤其是針對細胞內或細胞膜內的人類TNF-α之單域抗體、蛋白質及多肽，從而預防TNF-α由細胞分泌。

可以預期到本發明之該等抗TNF-α的單域抗體及多肽係可用於與TNF-α相關及/或其所介導之疾病及病症的預防及/或治療，該等疾病及病症諸如發炎、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸症候群、多發性硬化症、阿狄森氏病(Addison's disease)、自體免疫性肝炎、自體免疫性腮腺炎、第1型糖尿病、附睾九炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯病(Graves' disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、男性不孕症、多發性硬化症、重症肌無力症、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮病、修格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊椎關節病、甲狀腺炎、血管炎及因癌症和惡病體質引起的體重減輕。

TNF-α係以不同的形式存在，有單體及多聚體形式，包含三聚體形式。本發明之該等單域抗體、蛋白質及多肽結合至以不同形式(即，單體及多聚體)呈現的TNF-α係屬於本發明之範圍內。因此，當本發明之該等單域抗體、蛋白質及多肽係與TNF-α有關時，應理解到此亦包括該等單域抗體、蛋白質及多肽係針對呈三聚體形式的TNF-α。

已知透過TNF所調控的信息傳導係涉及由TNF分子三聚體形成的TNF受體的交聯，其中該TNF分子三聚體含有三個受體結合位(參(例如)Peppel et al.,J.Exp.Med.,174(1991),1483-1489)。

重組人類TNF-α蛋白質係用以產生針對或可以結合至TNF-α之表位的單域抗體。為產生該抗TNF-α單域抗體，重組的全長人類TNF-α(Gene ID：7124)係於大腸桿菌中表現。

三十五個針對該TNF-α蛋白質的單域抗體係經取得。這些抗TNF-α的抗體係可基於基於序列同源性分為三組。

該第一個抗TNF-α的單域抗體的胺基酸序列(命名為TNF-α VHH66(SEQ ID NO.45)單域抗體)係顯示如下： 該三個CDR係加下劃線。

該第二個抗TNF-α的單域抗體的胺基酸序列(命名為TNF-α VHH69(SEQ ID NO.46)單域抗體)係顯示如下： 該三個CDR係加下劃線。

該第三個抗TNF-α的單域抗體的胺基酸序列(命名為TNF-α VHH62(SEQ ID NO.47)單域抗體)係顯示如下：

該三個CDR係加下劃線。其他所發現到的抗TNF-α的單域抗體係包含以下序列，該等CDR同樣加下劃線：

TNF_2(SEQ ID NO.48)：

TNF_46(SEQ ID NO.49)：

TNF_71(SEQ ID NO.50)：

TNF_21(SEQ ID NO.51)：

TNF_38(SEQ ID NO.52)：

TNF_18(SEQ ID NO.53)：

TNF_37(SEQ ID NO.54)：

TNF_66(SEQ ID NO.55)：

TNF_68(SEQ ID NO.56)：

TNF_78(SEQ ID NO.57)：

TNF_67(SEQ ID NO.58)：

TNF_6(SEQ ID NO.59)：

TNF_7(SEQ ID NO.60)：

TNF_13(SEQ ID NO.61)：

TNF_60(SEQ ID NO.62)：

TNF_73(SEQ ID NO.63)：

TNF_69(SEQ ID NO.64)：

TNF_76(SEQ ID NO.65)：

TNF_62(SEQ ID NO.66)：

TNF_43(SEQ ID NO.67)：

TNF_15(SEQ ID NO.68)：

TNF_11(SEQ ID NO.69)：

TNF_17(SEQ ID NO.70)：

TNF_63(SEQ ID NO.71)：

TNF_20(SEQ ID NO.72)：

TNF_58(SEQ ID NO.73)：

TNF_27(SEQ ID NO.74)：

TNF_28(SEQ ID NO.75)：

TNF_4(SEQ ID NO.76)：

TNF_14(SEQ ID NO.77)：

TNF_3(SEQ ID NO.78)：

TNF_1(SEQ ID NO.79)：

TNF_45(SEQ ID NO.80)：

TNF_22(SEQ ID NO.81)：

多個TNF-α單域抗體在體外的生長抑制係經測試，如下所述。此外，本發明包括一或多個針對本發明之抗TNF-α單域抗體之一或多個結構域的小鼠單株抗體。該小鼠單域抗體係可由本領域技術人員已知的方法而產生，例如，該小鼠單株抗體可藉由小鼠融合瘤而產生。該小鼠單株抗體可使用在診斷測定中，例如，該抗體可使用在一諸如ELISA之免疫測定中，以便測量該抗TNF-α單株抗體存在於病患血清中的數量。

RAF蛋白質係為絲胺酸/蘇胺酸特異性激酶，其可在傳送細胞外信息至該促分裂原活化蛋白激酶級聯反應而控制細胞生長、分化及生存的過程之中充當一中心中間產物。BRAF係為RAF家族的一員，其係在 生長因子誘發的刺激下藉由Ras家族的成員而活化。活性的Ras可誘發cRaf及BRAF的異二聚體化，且此可解釋在細胞中對應於生長因子信息所觀察到cRaf及BRAF的協同作用。在BRAF基因中的活化突變係存在於很大比例的人類惡性黑色素瘤以及一定比例的結腸癌之中。這些突變中的絕大多數導致了BRAF的活化區段內的殘基599位置處的纈胺酸轉變成麩胺酸(glutamic acid)。

抗BRAF的單域抗體係經開發以靶定野生型及突變型BRAF，以破壞其在惡性細胞中的角色，該等惡性細胞諸如(例如)涉及結腸直腸癌及其他惡性腫瘤之細胞。

藉由使用本領域中所熟知的方法，使用重組人類BRAF蛋白質來產生針對或可以結合至BRAF之表位的單域抗體。

此外，本發明係包括一或多個針對本發明之抗BRAF單株抗體之一或多個結構域的小鼠單株抗體。小鼠單株抗體可藉由本領域技術人員已知的方法產生，例如，該小鼠單株抗體可藉由小鼠融合瘤而產生。該小鼠單株抗體可使用在診斷測定中，例如，該抗體可使用在一諸如ELISA或質譜分析測定之免疫測定中，以便測量該抗BRAF單株抗體存在於病患血清中的數量。

實例 實例1：抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)對於STAT3具有結合親合力

在此實例中，二個靶定STAT3的VHH之親合力係使用基於Octet分析的無標記結合測定法來測量。在此測定中係使用抗STAT3的VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體、抗KRAS(陰性對照組)及抗GST-STAT3(16kDa單價抗原，Creative BioMart #STAT3-1476H)做為抗原探針。此GST-STAT3蛋白質係以在PBS中20μg/ml的濃度使用胺基丙基三乙氧矽烷(aminopropylsilane,APS)浸漬讀數生物感測器(特別是為疏水性蛋白質所準備)進行捕捉。該等探針係接著下沉到具有在所示濃度下的GST-STAT3蛋白質、抗STAT3的VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體或抗KRAS之孔槽內。該抗原的締合速率(on rate)係經測量。該等感測器接著以在水中的1% BSA 進行淬滅。該等探針係浸入測定緩衝液(PBS)中並測量解離速率(off rate)。

由一抗原與一抗原結合蛋白的解離平衡常數(KD)所表示之親合力係由所取得的親合力常數(KA)與KD使用1：1比例的整體擬合分析Fortebio軟體進行判定，如以下表1中所示。親合力係藉由計算R2值>0.95之曲線的KD數值的平均值而判定。250nM的抗STAT3 VHH13資料點係因其為一離群值而被省略。該抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)單域抗體的親合力係經判定為1.16 x 10^-7。抗KRAS VHH的親合力係無法判定。這很可能是因為該抗體在低濃度時的非特異性結合。

實例2：免疫沉澱研究

STAT3單域抗體的特異性係在人類乳癌細胞中分析。在此實例中，MDA-MB-231人類乳癌細胞係生長至50%至70%的匯聚度。該等細胞係接著以新鮮製備的冰冷溶解緩衝液(20mM HEPES、pH 7.9、400mM NaCl、0.1% NP-40、10%甘油、1mM釩化鈉、1mM氟化鈉、1mM二硫蘇糖醇、1mM苯基甲基磺醯氟、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮抑酶肽)在冰上崩解45分鐘。接著對溶胞產物進行離心、收集上清液並使用改良型Lowry法(Bio Rad公司，Hercules,CA)測定蛋白質濃度。全蛋白(1mg)係與1.5mg之含有抗STAT3的單域抗體、陽性對照組(STAT-3,cat#SC-482,Santa Cruz Biotechnology公司，Dallas,TX)或陰性對照組(STAT-1,cat# 9172,Cell Signaling公司，Danvers,MA)之珠粒(Dynabeads,Invitrogen公司)在4℃下一起培養一小時。接著清洗珠粒。在最終的清洗之後加入60μl的溶解緩衝液，且所產生的上清液係進行西方墨點法分析。簡而言之，該等樣本係在10%的聚丙烯醯胺凝膠上被分離且被移轉至硝化纖維膜。該硝化纖維膜係經阻斷並接著以合適的一級與二級抗體進行培養。用作陽性對照組的抗STAT3抗體係得自Cell Signaling公司(Cat# 4904,Danvers,MA)。化學螢光反應係使用得自Santa Cruz Biotechnology公司(Dallas,TX)的ECL系統進行。

如第3圖所示，內源性STAT3係與所有不同數量下測試之單域抗體進行免疫沉澱。M係為含有標記物之標記物泳道，泳道1係含有自哺乳動物細胞所產生及分離之STAT3 VHH13(SEQ ID NO：3)，泳道2係含有自哺乳動物細胞所產生及分離之STAT3 VHH14(SEQ ID NO：4)，泳道3係含有自細菌動物細胞所產生及分離之STAT3 VHH13(SEQ ID NO：3)，泳道4係包含自哺乳動物細胞所產生及分離之STAT3 VHH14(SEQ ID NO：4)，泳道5係為陽性STAT-3抗體，而使用STAT-1作為陰性對照組的泳道6未顯示出染色帶。

實例3：抗STAT3的細菌VHH13係以高親合力結合至含有在組成上被活化的STAT3之細胞株

細菌型抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO：3)之特異性係使用人類(PANC-1及DU145)及鼠科動物(4T1)細胞株中之在組成上被活化的STAT3來測定。商業性HeLa細胞亦經以干擾素-γ(IFN-γ)處理以便誘發磷酸化的STAT3。不具有STAT3的PC-3細胞株係做為陰性對照組使用。

該等細胞係生長至50%至70%的匯聚度，接著以新鮮製備的冰冷溶解緩衝液(20mM HEPES、pH 7.9、400mM NaCl、0.1% NP-40、10%甘油、1mM釩化鈉、1mM氟化鈉、1mM二硫蘇糖醇、1mM苯基甲基磺醯氟、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮抑酶肽)在冰上崩解45分鐘。接著對溶胞產物進行離心、收集上清液並使用改良型Lowry法(Bio Rad公司， Hercules,CA)測定蛋白質濃度。全蛋白(1mg)係與1.5mg之含有之珠粒(Dynabeads,Invitrogen公司)，細菌型抗STAT-3 VHH(SEQ ID NO：3)或陰性對照組(KRAS,Creative Biolabs公司，Shirley,NY)在4℃下一起培養一小時。接著清洗珠粒。在最終的清洗之後加入60μl的溶解緩衝液，且所產生的上清液係進行西方墨點法分析(如實例2所述)。

如第4圖所示，內源性STAT-3係使用含有在組成上被活化的STAT3的細胞株中之細菌型VHH13 STAT3(SEQ ID NO：3)進行免疫沉澱：PANC-1(泳道1),DU145(泳道2)及4T1(泳道4)。再者，細菌型VHH13 STAT3(SEQ ID NO：3)係結合至HeLa細胞溶質中的磷酸化STAT3(泳道3)。在PANC-1與KRAS之泳道3，以及PC-3(陰性對照組)之泳道6中並未記錄到染色帶。

實例4：在MDA-MB-231癌細胞株中之抗STAT3單域抗體的細胞毒性研究

在此實例中，抗STAT3單域抗體的抗增生效果係使用人類乳癌細胞株MDA-MB-231進行測定。對於這些試驗，MDA-MB-231細胞係生長至其達到90%的匯聚度。此時，細胞係經沖洗、胰蛋白處理並使用庫爾特粒子計數儀(Coulter Counter,Beckman公司，Brea,CA)進行計數。該增生研究係使用溴化3-[4,5-二甲噻唑]-2,5-二苯四銼(3-[4,5-dimethylthiaolyl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)測定法來進行。為此，係將細胞以每孔5 x 10³個細胞的密度播種在96孔的孔盤中，如製造商(Roche Diagnostics Corporation公司，Indianapolis,IN)所指示。讓細胞黏附在孔盤上24小時，接著以合適的濃度(即，0、0.5、1.0、10.0或100μg/ml)加入該等單域抗體。該等細胞係在第3天進行計數。對於進行5天處理的細胞，係在第3天更換含有該等單域抗體的新鮮培養液。結束時，將10μl的MTT試劑(0.5mg/mL)加入至每一個孔中，如製造商所指示。在進行四小時的培養時間之後，加入100μl的增溶溶液並將該孔盤放置在培養箱中隔夜培養。所有的孔盤係使用Biotek孔盤讀取儀(Winooski,VT)在570nm的波長下讀取吸光值。

所有的資料係使用軟體GraphPad InStat 3(GraphPad Software有限公司，La Jolla,CA)進行分析。實驗群組係使用單因子變異數分析(One-way ANOVA)與載劑對照組進行比較。若觀察到顯著性的差異(p<0.05)，則進行Tukey-Kramer多重比較測試。

根據該MTT試驗，發現到該細菌型VHH13抗STAT3(SEQ ID NO.3)單域抗體在進行處理後皆可在第3天及第5天有效抑制細胞生長，如以下表2-5中所示。

實例5：在人類乳腺(MDA-MB-231)及胰臟(PANC-1)癌細胞株中之抗STAT3單域抗體的細胞毒性研究

在此實例中，抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)與VHH14 (SEQ ID NO.4)單域抗體的抗增生效果係使用人類乳癌細胞株MDA-MB-231及人類胰臟癌細胞株(PANC-1)進行測定。對於這些試驗，MDA-MB-231及PANC-1細胞係生長至其達到90%的匯聚度。此時，細胞係經沖洗、胰蛋白處理並使用庫爾特粒子計數儀(Beckman公司，Brea,CA)進行計數。對於進行5天處理的細胞，係在第3天更換含有該等抗STAT3單域抗體的新鮮培養液。

所有的資料係使用軟體GraphPad InStat 3進行分析。實驗群組係使用單因子變異數分析(One-way ANOVA)與載劑對照組進行比較。若觀察到顯著性的差異(p<0.05)，則進行Tukey-Kramer多重比較測試。

根據該MTT試驗，發現到該VHH13(SEQ ID NO.3)與該VHH14(SEQ ID NO.4)單域抗體二者皆可抑制MDA-MB-231及PANC-1癌細胞中的細胞生長，如以下表6-13中所示。

實例6：在人類乳癌及人類前列腺癌細胞株中之STAT3單域抗體的抗增生作用

STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)單域抗體的抗增生功效係在人類乳癌細胞株MDA-MB-231及人類前列腺癌細胞株DU145中測定。對於這些試驗，癌細胞係生長至其達到90%的匯聚度。此時，細胞係經沖洗、胰蛋白處理並使用庫爾特粒子計數儀(Beckman公司，Brea,CA)進行計數。該增生研究係使用上述之MTT測定法完成。

抗STAT3細菌型VHH13(SEQ ID NO.3)單域抗體對於MDA-MB-231細胞的抗增生特性係與其對於DU145細胞的作用進行比較。如表14所示，以抗STAT-3(SEQ ID NO：3)單域抗體處理的MDA-MB-231細胞顯示了在50.0及100μg/ml的條件下分別有29.6及91.2%的平均生長抑制。在DU145細胞中，可看到近似的生長抑制情形(在50.0及100μg/ml的條件下分別有31.2及92.1%的抑制)，如表15中所述。

實例7：STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)單域抗體對人類癌細胞株的抗增生作用

為測試STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)單域抗體的抗增生功效，係使用下列人類癌細胞株進行測試：MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474及DU145，如表16中所示。

所有的人類癌細胞係得自American Type Culture Collection公司(Manassas,VA)。細胞株係維持並培養在含有10%胎牛血清、2mM左旋麩醯胺酸(L-glutamine)及1%抗菌抗黴菌溶液(10units/mL青黴素、10μg/mL鏈黴素及25μg/mL雙性黴素B)的RPMI 1640培養液(用於MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474)或MEM-E(用於DU145)之中。細胞係於一含有5% CO₂的潮濕空氣中保持在37℃。細胞培養物料係得自Life Technologies有限公司(Grand Island,NY)。MTT試劑係購自 Sigma Aldrich公司(St.Louis,MO)。

對於這些試驗，癌細胞係生長至其達到90%的匯聚度。此時，細胞係經沖洗、胰蛋白處理並使用庫爾特粒子計數儀(Beckman公司，Brea,CA)進行計數。該增生研究係使用上述之MTT測定法進行。

抗STAT3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的抗增生特性係於代表不同分類的五個乳癌細胞中評估(表34)。如表17中所示，進行處理72小時之後的所有細胞株顯示了顯著的生長抑制。在所有的細胞株中最大的生長抑制係在100及200μg/ml的劑量下記錄到。對於該等經測試細胞株的生長，半衰最大抑制濃度(IC₅₀)分別為：10.1±2.4(MDA-MB-231細胞株)、12.36±1.5(MDA-MB-468細胞株)、14.8±1.6(MCF-7細胞株)及25.2±14.7(BT474細胞株)。這些資料教示了當該三陰性乳癌細胞株與表現有雌激素/孕酮的細胞株(即，MCF-7)或經擴增HER2的細胞株(即，BT474)相比時，其需要最低的VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體濃度來達到IC₅₀。

抗STAT-3細菌型VHH 13(SEQ ID NO：3)單域抗體的作用係亦在人類前列腺癌細胞株DU145中進行評估，如表18中所示。該抗STAT-3細菌型VHH 13(SEQ ID NO：3)單域抗體在所有經測試癌細胞中顯示了劑量依存性的生長抑制情形。

實例8：細菌型VHH13在BALB/C小鼠中之最大耐受劑量

在此實例中，抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的容許度係使用人類乳癌細胞株MDA-MB-231在實驗動物中進行測定。對於此試驗，共有9隻BALB/C裸鼠(6至7周齡)係根據體重被分成三個群組。(表19)該等裸鼠(n=3)係接受載劑(PBS)或者以250或500μg/kg體重/天的劑量接受抗STAT-3細菌型VHH 13(SEQ ID NO：3)單域抗體進行5天的處理。於研究期間，每兩天執行死亡率/發病率檢查。體重係於研究的第1、4及6天以及研究結束當天(第13天)進行記錄。毒性係藉由與載劑對照組的裸鼠比較體重量測及小鼠行為來評估。當完成處理階段，該等動物接著進行額外一星期的量測以在經過處理之後記錄任何在體重及/或總體健康上的異常。

如表20中所示，在該等群組之間並沒有顯著的體重差異，且抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在任一劑量程度上係未與任何藥物有關的死亡相關聯。另外，與對照組裸鼠相比，在以抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體處理的動物中並未觀察到行為的改變。

實例9：細菌型抗STAT3 VHH13在BALB/C裸鼠異種移植及人類乳癌與人類胰臟癌細胞中的活性

在此實例中，抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的活性係在小鼠中使用人類乳癌細胞株MDA-MB-231進行評估。簡而言之，抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的活性係使用下列模式進行評估：MDA-MB-231人類乳癌異種移植模式及PANC-1人類胰臟癌異種移植模式。給藥時程如下：群組1(n=6；PBS；IP)每天給藥共給14天[QDx14]；以及群組2(n-12；500μg/kg bw；IP)，每天給藥共給14天[QDx14]。在施予藥物後進行5天的觀察期。

人類乳癌細胞株(MDA-MB-231及PANC-1)係得自American Type Culture Collection(ATCC)公司(Manassas,VA)。MDA-MB-231細胞係生長在補充有10% FBS(Atlanta Biologicals公司，Flowery Branch,GA)及青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Life Technologies公司，Grand Island,NY)的MEM(Life Technologies公司，Grand Island,NY)之中。PANC-1細胞係供養在補充有10% FBS及青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸的RPMI 1640培養液(Life Technologies公司，Grand Island,NY)之中。所有細胞係在37℃下於含有5% CO₂的培養箱中生長。

4至5周齡的無胸腺裸-Foxnl^nu雄性小鼠係購自Harlan Laboratories公司(Indianapolis,IN)。動物係隔離一週且以每籠五隻小鼠的方式圈養在12小時光暗週期及相對濕度為50%的環境中。飲用水及飲食係以自由採食方式供應給動物。所有動物係在無病菌的條件下圈養，且按照IIT Research Institute動物使用與照護委員會規定進行實驗。對於MDA-MB-231異種移植的研究，在100-μL最終體積之MEM培養液中的細胞(4 x 10⁶)係皮下注射至小鼠的右側腹。對於PANC-1異種移植的研究，在100-μL最終體積之RPMI培養液中的細胞(5 x 10⁶)係皮下注射至小鼠的右側腹。一旦可觸知腫瘤，即開始對該二模式進行腫瘤的量測。此後，腫瘤係每週測量兩次。當腫瘤達到75至175mm³的範圍大小時對動物進行隨機選擇，且使用分層隨機抽樣法而隨機選擇一對照組(n=6)及一治療組(n=12)。治療劑(抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體)或載劑(PBS)係於隨機選擇後的第二天開始進行。治療的耐受性良好且未與藥物有關的死亡相關聯。未記錄到顯著的體重減輕。

對於MDA-MB-231異種移植的研究，隨機選擇下之對照組及治療組的平均腫瘤大小(±SE)係分別為：103.01±11.89及102.61±9.60。隨機選擇下之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：32.08±0.76及30.27+0.75。表21顯示了整個研究的平均體重(±SE)。

在給藥的第16天，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為179.11±19.39，而治療組的則為118.86±15.94。在實驗終止時群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：31.98±0.71及30.55±0.74。表22概述了整個研究的腫瘤體積(±SE)。在治療組中的平均腫瘤生長抑制%係為33.64%。腫瘤倍增時間如下：群組1：44.27天；及群組2：61.06天。第5圖係說明抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231異種移植模式中的生長抑制情形。抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體顯示了顯著的生長抑制效果(p=0.047)。因此，抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231人類乳癌模式系統中具有化學治療活性。

對於PANC-1異種移植的研究，隨機選擇之對照組中的平均腫瘤大小(±SE)為107.01±4.54，而治療組則為110.58±6.18。隨機選擇下之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：29.0±0.81及28.5±0.70。表21顯示了整個研究的平均體重(±SE)。在實驗終止時之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：31.2±0.99及30.1±0.75。表23概述了整個研究的平均體重(±SE)。在給藥的第14天，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為287.30±33.94，而治療組的則為318.74+29.76。表24概述了整個研究的腫瘤體積(±SE)。

腫瘤倍增時間如下：群組1為22.44天；而群組2為23.02天。抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體顯示了其在PANC-1人類胰臟癌模式系統中沒有顯著的生長抑制效果。

實例10：MDA-MB-231異種移植研究

在此實例中，其係進一步評估抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231人類乳癌異種移植模式。其給藥時程如下：群組1(n=4；PBS；IP)每天兩次共給14天[BIDx14]；群組2(n=4；1mg/kg bw；IP)每天兩次共給14天[BIDx14]；群組3(n=4；2mg/kg bw；IP)每天兩次共給14天[BIDx14]；以及群組4(n=4；2mg/kg bw；IP)每天一次共給14天[QDx14]。在給藥後進行7天的觀察期。

人類乳癌細胞株MDA-MB-231及無胸腺裸-Foxnl^nu雌性小鼠係如上所述。

密度為5×10⁶的MDA-MB-231細胞係以在MEM培養液中 100-μL的最終體積皮下注射至小鼠的右側腹。一旦可觸知腫瘤，即開始進行腫瘤的量測。此後，腫瘤係每週測量兩次。當腫瘤達到55至150mm³的範圍大小時，即使用分層隨機抽樣法來隨機選擇動物。治療劑(抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體)或載劑(PBS)係於隨機選擇後的第二天開始進行。

隨機選擇之平均腫瘤大小(±SE)分別為：92.08±13.24(群組1)、82.38±5.17(群組2)、77.47±7.17(群組3)、以及104.71±14.64(群組4)。如表25中所示，在隨機選擇下之平均體重(±SE)分別為：23.65±0.72(群組1)、23.45±0.66(群組2)、23.10±0.20(群組3)、以及22.45±1.25(群組4)。

如表26中所示，在給藥的第14天，對照組的平均腫瘤大小(±SE)係為221.51±57.32，而治療組2、3、4的平均腫瘤大小分別為67.12±10.66、58.27±22.54及131.44±22.86。在實驗終止時(第42天)群組1、2、3、4的平均腫瘤大小(±S.E.)分別係為：255.42±65.46、55.98±6.94、41.15±13.21以及145.51±52.32。在實驗終止時群組1、2、3、4的平均體重(±SE)分別係為：24.80±0.49、23.25±1.20、24.00±0.32以及23.2±1.46。群組1、2、3、4的最大平均淨體重減輕%分別為：0.7(36)、1.5(23)、1.8(36)以及2.2(29)。

亦如表26中所示，在治療組中群組2、3、4的平均生長抑制分別為：78.3、75.2及55.9。其腫瘤倍增時間為：群組1：20.56天；群組2：34.54天；群組3：30.07天；以及群組4：27.17天。群組2、3、4分別有13.99、9.52及6.61 days的生長延遲情形。治療組的治療/控制值比率為：群組2：-33.75(腫瘤停滯)；群組3：-54.4(腫瘤消退)；以及群組4：10.28(腫瘤抑制)。第6圖係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231異種移植模式中的生長抑制情形。

抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的投藥係與群組2中的顯著生長抑制情形(p=0.02)[1mg/kg；BID X 14]以及群組2中的顯著生長抑制情形(p=0.02)[2mg/kg；BID x 14]相關聯。再者，四分之三 的腫瘤顯示出顯著的消退。基於這些資料，可以得到抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在MDA-MB-231人類乳癌模式系統中具有化學治療活性的結論。

實例11：抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體對於三種人類癌症異種移植模式之功效

在此實例中，其係於MDA-MB-231人類乳癌異種移植模式、PANC-1胰臟異種移植模式及DU145前列腺異種移植模式中評估抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的功效。

無胸腺裸Foxnl^nu小鼠、MDA-MB-231乳癌細胞、PANC-1胰臟癌細胞株及DU145前列腺癌細胞株係如上所述。在研究的第一天，該等小鼠的體重範圍係自17至19克(34隻雌性小鼠)以及21至23克(16隻雄性小鼠)。

早期代數(4至10代)中的細胞係使用來植入到小鼠內並在對數期生長期間收取細胞。MDA-MB-231(5×10⁶)、DU145(5×10⁶)及PANC-1(1.5 x10⁶)係以在培養液中100-μL的最終體積皮下注射至小鼠的右側腹。一旦可觸知腫瘤，即開始進行腫瘤的量測。此後，每周兩次對腫瘤 進行測量。

當腫瘤達到74-120mm³(MDA-MB-231)、89-146mm³(DU145)或60-160mm³(PANC-1)的範圍大小時，使用分層隨機抽樣法隨機選擇該等動物。治療劑(含有抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體且在本文中稱為SBT-100)或載劑(PBS)係於隨機選擇後的第二天(稱為第1天)開始進行。

抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體係經補充以做為一濃度為0.651mg/ml的預配置溶液，且其係儲存在-20℃下直至準備使用。該儲備溶液係稀釋到pH 7.6的無菌PBS中以在10mL/kg的給藥體積中提供5mg/kg。使用的溶液係每7天進行製備，等分至7個小管中並儲存在4℃。在每一個處理天數中，只有需用到的小管回復至室溫。所有剩餘的單域抗體材料係保持在4℃以做為下一個劑量之需求使用。在第8天，所有剩餘的單域抗體材料係經丟棄並製備新鮮的批次。

每個腫瘤模式中的二個小鼠群組(控制試劑及SBT-100)係根據表27中所示之實驗規程進行給藥。給藥時程如下：群組1(n=4；PBS)每天兩次共給14天[BIDx14]；群組2(n=4；SBT-100,5mg/kg bw)每天兩次共給14天[BIDx14]。該載體(PBS pH 7.6)及SBT100皆經腹膜內(i.p.)以6小時的間隔每天給藥三次共14天。根據個別動物的體重進行給藥。在投藥之後進行7天的復原期。

Study Log研究導向動物研究管理軟體(Study Log Study Director Animal Study Management Software,San Francisco,CA)係用來對該等動物進行隨機選擇、收集資料(例如，給藥、體重、腫瘤量測、臨床觀察)及進行資料分析。

在MDA-MB-231腫瘤異種移植模式中，其係於接種後的第23天隨機選擇動物，且群組1及群組2之平均腫瘤大小(±SE)係分別為：77.98±21.58及84.71±5.56。隨機選擇下之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：20.04±0.62及23.7±1.84。表28概述了整個研究的平均體重(±SE)。在給藥(Dosing)的最後一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為168.28±51.57，而經SBT-100處理的小鼠之平均腫瘤大小(±SE)為83.81±22.65。表29概述了整個研究的腫瘤體積(±SE)。在實驗終止時(第28天)群組1及群組2的平均腫瘤大小(±SE)係分別為：70.49±112.35及91.72±33.17。在實驗終止時群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：25.36±1.07及24.25±1.68。在研究結束時，經SBT-100處理的群組中之平均腫瘤生長抑制為85.8%(p=0.006)。第7圖說明了平均腫瘤體積。群組1及群組2之腫瘤倍增時間係分別為25.78天與111.6天。群組2之治療/控制%為13.35(腫瘤抑制)。

在DU145腫瘤異種移植模式中，其係於接種後的第17天隨機選擇動物，且群組1及群組2之平均腫瘤大小(±SE)係分別為：111.87±20.53及111.23±25.16。隨機選擇下之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：29.10±1.94及30.68±1.56。表30概述了整個研究的平均體重(±SE)。在給藥的最後一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為621.81±276.25，而經SBT-100處理的小鼠之平均腫瘤大小(±SE)為364.14±51.64。表31概述了整個研究的腫瘤體積(±SE)。在實驗終止時(第28天)群組1及群組2的平均腫瘤大小(±SE)係分別為：819.42±351.88及601.83±131.51。在實驗終止時群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：29.20±2.33及29.60±1.04。在研究結束時，經SBT-100處理的群組中之平均腫瘤生長抑制為26.6%(p=0.29)。第8圖說明了平均腫瘤體積。群組1及群組2之腫瘤倍增時間係分別為14.57天與18.19天。群組2之治療/控制%為74.8。

在PANC-1腫瘤異種移植模式中，其係於接種後的第22天隨機選擇動物，且群組1及群組2之平均腫瘤大小(±SE)係分別為：78.74±40.21及93.84±36.31。隨機選擇下之群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：22.50±1.47及24.23±1.63。表32概述了整個研究的平均體重(±SE)。在給藥的最後一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為204.95±178.90，而經SBT-100處理的小鼠之平均腫瘤大小(±SE)為159.03±28.01。表33概述了整個研究的腫瘤體積(±SE)。在實驗終止時(第28天)群組1及群組2的平均腫瘤大小(±SE)係分別為：284.77±288.88及203.02±30.34。在實驗終止時群組1及群組2的平均體重(±SE)係分別為：27.38±1.07及26.23±1.19。在研究結束時，經SBT-100處理的群組中之平均腫瘤生長抑制為41.78%(p=0.35)。第9圖說明了平均腫瘤體積。群組1及群組2之腫瘤倍增時間係分別為18.51天與35.70天。群組2之治療/控制%為52.79。

實例12：抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在ER+/PR+(MCF-7)人類乳房腫瘤異種移植模式中之功效

此實例係顯示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在裸鼠中之MCF-7人類乳房腫瘤異種移植模式中的功效。

雌性無胸腺裸鼠(Crl：NU(Ncr)-Foxnl ^nu ,Charles River公司)在研究的第1天係為12周齡大且具有23.0至30.1克的體重(BW)範圍。該等動物以上述方式餵食及圈養。

MCF-7人類乳房惡性腫瘤細胞係以上述方式取得及培養，且供小鼠異種移植使用。在移植腫瘤細胞的三天之前，係使用滅菌穿刺套管在每隻實驗動物的肩胛間皮下植入雌激素顆粒(0.36mg雌二醇、釋放60天型、Innovative Research of America公司，Sarasota,FL)。

使用於移植的腫瘤細胞係在對數期生長期間收取，並以1 x 10⁸細胞/mL的濃度將細胞再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)之中。於移植當日，每隻實驗鼠係以皮下移植方式在其右側腹接收1 x 10⁷個MCF-7細胞(0.1mL的細胞懸浮液)，並於平均大小接近100-150mm³的目標範圍時監控腫瘤的生長。在21天之後(指定為研究的第1天)，將動物分成兩組，每個群組由四隻帶有個別腫瘤體積範圍在108至144mm³且群組平均腫瘤體積為117至123mm³的小鼠所組成。

抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體係以一在1mL的分裝液中濃度為0.41867mg/mL之預配置且準備好給藥的溶液來提供，且儲存在-20℃直到需要時。該0.41867mg/mL的溶液係在23.88mL/kg的給藥體積中提供1mg/kg的劑量。在治療的每一天中，只有需用到的抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體小管解凍到室溫。所有剩餘的給藥懸浮液係保持在4℃以做為下一個劑量之需求使用。

二個無胸腺裸鼠群組係根據表34中所示之實驗規程進行給藥。所有載體(對照組)及抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的劑量係經腹膜內(i.p.)以6小時的間隔每天給藥三次共14天，其中第1天給予兩個劑量，而第15天早上給予一個劑量(tid x 14，第1天兩個劑量)。載體及抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的給藥體積為每20克體重給0.478mL(23.88mL/kg)並與每一個別動物的體重成比例給藥。群 組1接受該載劑並做為腫瘤植入及進展的基準群組並做為對照組。群組2係經給予1mg/kg的抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體。

腫瘤係每週測量兩次，且每一動物於其腫瘤達到預定終點體積(1000mm³)或在研究結束時(第39天)係處以安樂死，無論哪一時間先到。當腫瘤達到終點體積時，該動物係記錄為因腫瘤擴展(TP)而處以安樂死，並記錄安樂死日期。每一小鼠到達終點的時間(TTE)係由下列方程式計算： 其中TTE係以天數表示，終點體積係以mm³表示，b為截距，而m為由一對數轉換之腫瘤生長資料組的線性迴歸所獲得的線段斜率。該資料組係由超過該使用於分析中之終點體積的第一觀測資料以及接近達到此終點體積之前的三個觀測資料所組成。經計算的TTE通常小於TP日期(即動物因腫瘤尺寸而處以安樂死的日子)。未達到終點體積的動物係被配給一個與研究的最後一天(D39)相等的TTE值。任何歸類為已因治療相關(TR)原因而死亡的動物係被配給一個與死亡日相等的TTE值。任何歸類為已因非治療相關(NTR)原因而死亡的動物係被排除在TTE的計算之外。

治療功效係由腫瘤生長延遲(TGD)情形來判定，其定義為一治療組與對照組相比時在天數上的中位數TTE增加：TGD=T-C相對於對照組之中位數TTE的增加比率為

其中：T=一治療組的中位數TTE，且C=所指定對照組的中位數TTE。

在每一群組中的治療功效係可由該中位數腫瘤體積MTV(n)所表示，其定義為在研究的最後一天(D39)之腫瘤尚未達到終點體積的若干剩餘動物(n)中的中位數腫瘤體積。

治療功效亦可由研究期間所觀察到的消退反應發生率與幅度來判定。治療可能造成動物中的腫瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反應中，在研究過程期間三次連續量測中的腫瘤體積為50%或小於其D1體積，且這三次量測中之一或多者中的腫瘤體積係等於或大於13.5mm³。在CR反應中，在研究過程期間三次連續量測中的腫瘤體積係小於13.5mm³。任何在研究結束時有CR反應的動物係另外歸類為無腫瘤倖存者(TFS)。

動物在前五天係每天進行秤重，接著在研究的其餘天數中每週秤重兩次。小鼠係經常被觀察其健康及任何不利於治療之相關TR副作用的明顯跡象，並記錄值得注意的臨床觀察。個體的體重減輕係按照實驗規程進行監控，且任何在一次量測中有體重減輕超過30%、或在三次量測中超過25%的情形之動物係因健康因素而處以安樂死並視為TR死亡。若群組平均體重恢復，可重新開始在該群組中給藥，但以較低的劑量或較不頻繁的給藥實驗規程進行。可接受的毒性之定義為在研究期間群組平均體重減輕係低於20%且在十隻受治療動物之中不超過有一TR死亡例(或低於10%)。任何造成更大毒性的給藥方案係被認為是超過耐受劑量(MTD)。若一死亡例是可由臨床症狀及/或屍體剖檢證明而歸因於治療的副作用，其係被歸類為TR，或者，若因為是在給藥期期間或在最後一個劑量的14天內之未知原因，其亦可被歸類為TR。若有證據顯示一死亡例係與腫瘤模式有關而不是與治療相關，其係被歸類為NTR。NTR死亡係進一步分類為NTRa (由於意外或人為失誤)、NTRm(由於經屍體剖檢確認之隨浸潤或轉移發生之腫瘤浸染)以及NTRu(由於未知原因)。

Windows介面之軟體Prism 6.07(GraphPad)係用來進行圖形分析。因樣本大小少而未進行統計分析。

一散佈圖係經建構以按照群組顯示個別小鼠的TTE值；此圖表顯示了被排除在其他所有圖式之外的NTR死亡。個別的動物、群組中位數及平均腫瘤體積係標示於圖表上以做為時間的函數。當一動物因腫瘤大小或TR死亡而退出研究，其最後記錄到的腫瘤體積係經列入且其資料係用來計算隨後的時間點的中位數體積。Kaplan-Meier圖係經建構以顯示每個群組餘留在研究中的動物比例與時間。腫瘤生長曲線係於相同群組中發生二個TR死亡例之後截斷。在研究過程中之群組平均體重變化係自第1天以百分比變化(±SEM)而繪示。腫瘤生長及體重變化曲線係於群組中一半以上的可評估小鼠退出研究之後截斷。第10圖係說明該研究中的平均腫瘤體積。

表35係提供該等小鼠之平均體重減輕、TR及NTR死亡數。臨床症狀係於觀察到時進行記錄，如表36-38中所示。在研究期間未有TR死亡發生。在各群組中的動物體重減輕情形係易變且劇烈的，且由雌激素的影響所引起。包含體重減輕、增大的子宮角及膀胱晶體的臨床觀察發現皆存在於該等群組內，且其亦可歸因於雌激素的影響。雌激素的毒性在每一群組中造成二個非治療相關的死亡例。在該研究中所評估的治療係可接受容忍的。

因為對照組以及治療組中四分之二的小鼠係死於雌激素毒性，無法判定統計上的結論。藉由可得到的資料，當與對照組相比時，治療組中的中位數腫瘤生長及平均腫瘤體積均減少。此差異係存在於治療14天的期間，但也存在於研究的第25天。對照組係耗費25天來達到1000mm³的腫瘤體積，而治療組耗費36天來達到1000mm³的腫瘤體積。這教示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在體內延緩了MCF-7腫瘤的生長。在整個研究中該對照組及該治療組二者均維持相似的體重。這教示抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在體重減輕方面並未造成毒性。

實例13：在異種移植小鼠中使用抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體治療人類HER2+(BT474)乳癌

在此實例中，抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的功效係在小鼠CB.17 SCID之BT474人類乳房腫瘤異種移植中進行判定。

兩組8-12周齡之在右側腹含有1mm³ BT474腫瘤片段的異種移植之CB.17 SCID小鼠係根據表39中所示的實驗規程於腫瘤達到100-150mm³的平均大小時進行治療。所有的載劑(PBS對照試劑)及抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體(在表39中係以SB-01顯示)的劑量係經腹腔內(i.p.)以6小時的間隔每天給藥三次共14天，且在第1天給予兩個劑量(tid x 14，第一天兩個劑量)。載體及抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體的給藥體積為每20克體重給0.478mL(23.88mL/kg)並與每一個別動物的體重成比例給藥。群組1接受該載劑並做為腫瘤植入及進展的基準群組並做為對照組。群組2係經給予1mg/kg的抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體。

在研究的前14天期間，治療組係接收anti-STAT3 B VHH13且該對照組僅接收載劑。如表40中所示，在此期間中，治療組在整個研究中係維持並增加體重，而對照組在整個研究中係有較輕的體重。這教示該治療組在體重減輕方便並未從抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體經歷到毒性。該二群組的平均腫瘤體積及中位數腫瘤體積均相似，且在研究的第15天完全相同。在研究的第59天，該等群組皆達到700立方公分的腫瘤體積。這教示該抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體在與對照組相比時，其在體內並不降低BT474腫瘤的生長。第11圖係說明群組的平均腫瘤體積。

#-對照組

實例14：關於抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體之小鼠單株抗體的產生

在此實例中，小鼠單株抗體係經產生以用於本發明之單域抗體。所使用的動物為8至10周齡的BALB/c雌性小鼠。其使用了一水溶性佐劑(CBL)。所使用的HAT及HT係得自Sigma-Aldrich公司。

抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體係用於免疫接種三隻小鼠及製造融合瘤細胞株。該等小鼠進行三次免疫接種且每一次係以水溶性佐劑進行。在其中一小鼠中，血清效價達到1/51200。該小鼠係被犧牲且融合瘤細胞株係藉由融合脾細胞與骨髓瘤細胞株Sp2/0而製成。

經融合的細胞係以限數稀釋法播種在96孔的孔盤內。經融合的細胞係在有HAT的存在下進行培養，且對651個殖株進行殖株。在該651個殖株中係辨識到有27個陽性殖株可特異性地結合至抗STAT-3細菌型VHH13(SEQ ID NO：3)單域抗體抗原。

實例15：KRAS(G12D)單域抗體對於PANC-1人類胰臟癌細胞的細胞毒性

此實例係使用人類胰臟癌細胞株PANC-1來展示抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO：2)單域抗體之抗增生功效。對於這些實驗，PANC-1細胞係生長至其達到90%的匯聚度。此時，係使用上述之MTT測定法進行增生研究。

進行處理3天之後，抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO：2)單域抗體對於PANC-1細胞之抗增生特性係在表41中顯示。以抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO：2)單域抗體處理的PANC-1細胞顯示了在50.0及100μg/ml的條件下分別有19.9及37.7的平均生長抑制情形。

因此，抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO：2)單域抗體顯示了在人類胰臟癌細胞PANC-1中的劑量依存性生長抑制情形。

實例16：通過TNF-α單域抗體的體外生長抑制

此實例係展示判定TNF-α濃度及評估TNF-α的抑制作用之建立方法。用來顯示在U937人類肺淋巴母細胞中可測得的活性調控之所需TNF-α濃度係藉由對所含ATP進行定量來評估，且其使用Promega's Cell Titer-GJo® Luminescent Cell Viability測定組來預示代謝活性細胞的存在。

U937細胞係以每孔90μL的總體積播種在一透明聚苯乙烯製的96孔微培養孔盤(Corning® Costar® 96孔平底孔盤，Cat.#3997)中。於在37℃下且含有5% CO₂及95%空氣的加濕培養箱中培養24小時之後，以雙重複方式在每一孔內加入5μL的20倍連續稀釋TNF-α生長培養液(10pt劑量反應，最高濃度為20ng/mL)。此外，以雙重複方式在每一孔內5μL的20倍連續稀釋星形孢菌素生長培養液(濃度為1nM)。

在有測試試劑的存在下培養24小時之後，用來顯示在U937細胞株中可測得的TNF-α活性調控之所需化合物濃度係藉由對所含ATP進行定量來評估，且其使用Promega's Cell Titer-GJo® Luminescent Cell Viability測定組來預示代謝活性細胞的存在。細胞生長比率係相對於該等未經處理的對照組的孔來計算。所有的測試係以雙重複的方式在每一濃度程度下進行。

該等測試試劑的EC₅₀係使用軟體Prism 6.05藉由使用下列四參數邏輯方程式曲線擬合資料而評估： 其中「Top」為對照組吸光值的最大比率，「Bottom」為對照組吸光值在最高試劑濃度下的最大比率，「Y」為對照組吸光值，「X」為試劑濃度，「IC₅₀」為與對照組細胞相比時抑制細胞生長50%的試劑濃度，而「n」為該曲線的斜率。

第12及13圖展示了TNF-α對U937細胞是有細胞毒性的。TNF-α對於U937細胞的IC₅₀為95.10pg/ml。TNF-α的曲線顯示出劑量滴定型致死效果。

第14圖係展示TNF-α對U937細胞的細胞毒性係受到三種不同的抗TNF-α VHH抑制。當抗TNF-α VHH62(SEQ ID NO：47)單域抗體、抗TNF-α VHH 66(SEQ ID NO：45)單域抗體及抗TNF-α VHH69(SEQ ID NO：46)單域抗體係與一定量的TNF-α一起培養時，在EC₅₀時，這三種抗TNF-α VHH均抑制了TNF-α的U937細胞致死作用。抗TNF-α VHH62(SEQ ID NO：47)單域抗體的IC₅₀約為713.6ug/ml。抗TNF-α VHH69(SEQ ID NO：46)單域抗體的IC₅₀約為208.055ug/ml。在約1X10^-2ug/ml至1X10²ug/ml的抗TNF-α VHH66(SEQ ID NO：45)單域抗體濃度下，抗TNF-α VHH66(SEQ ID NO：45)單域抗體的IC₅₀係因其完全抑制了TNF-α的細胞毒性而無法判定。在這抗TNF-α VHH66(SEQ ID NO：45)單域抗體濃度範圍中，U937細胞生長的情形增加，因而完全抑制了TNF-α的活性。

儘管已經參考某些較佳實施例對本發明進行了相當詳細的討論，但也可以有其他的實施方式。本方法公開的步驟(例如)並非是限制性的，且其並非意欲指明每一個步驟對於該方法都一定是必要的，而是其僅僅是例示性的步驟。因此，所附申請專利範圍的範疇不應該限制於本公開內容所含之實施例的描述。本文所有引用的參考文獻之全文係以引用方式併入本文中。

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<213> 駱駝科動物

<400> 37

<210> 38

<211> 378

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 38

<210> 39

<211> 381

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 39

<210> 40

<211> 381

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 40

<210> 41

<211> 378

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 41

<210> 42

<211> 378

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 42

<210> 43

<211> 378

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 43

<210> 44

<211> 378

<212> DNA

<213> 駱駝科動物

<400> 44

<210> 45

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 45

<210> 46

<211> 124

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 46

<210> 47

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 47

<210> 48

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 48

<210> 49

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<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 49

<210> 50

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 50

<210> 51

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 51

<210> 52

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 52

<210> 53

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 53

<210> 54

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 54

<210> 55

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 55

<210> 56

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 56

<210> 57

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<213> 駱駝科動物

<400> 57

<210> 58

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 58

<210> 59

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 59

<210> 60

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 60

<210> 61

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 61

<210> 62

<211> 123

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 62

<210> 63

<211> 125

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 63

<210> 64

<211> 124

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 64

<210> 65

<211> 128

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 65

<210> 66

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 66

<210> 67

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<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 67

<210> 68

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 68

<210> 69

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 69

<210> 70

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 70

<210> 71

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 71

<210> 72

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<213> 駱駝科動物

<400> 72

<210> 73

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 73

<210> 74

<211> 129

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<213> 駱駝科動物

<400> 74

<210> 75

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 75

<210> 76

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<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 76

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<213> 駱駝科動物

<400> 77

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<213> 駱駝科動物

<400> 78

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<213> 駱駝科動物

<400> 79

<210> 80

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<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 80

<210> 81

<211> 129

<212> PRT

<213> 駱駝科動物

<400> 81

Claims (2)

1. 一種抗STAT3的單域抗體，其中該抗STAT3的單域抗體包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。
2. 一種經分離多肽，其中該經分離多肽包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。