CN115215939A - 一种融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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杨杰
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Sun Yat Sen University
Sun Yat Sen University Cancer Center
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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种融合蛋白及其制备方法与应用。该融合蛋白包含与KRas蛋白特异性结合的多肽、肿瘤细胞特异性穿膜肽以及溶酶体识别肽。本发明首次针对“不可成药”蛋白设计构建了具有肿瘤靶向性和穿透性以及蛋白特异性降解的融合蛋白，为抗癌靶向药的开发提供了新的思路；该融合蛋白不同于现有技术一个分子只能靶向一种目标蛋白，其能够同时诱导野生型和突变型KRas蛋白的降解；同时，该融合蛋白能够通过诱导KRas降解而提高KRas突变型肿瘤对肿瘤靶向药物的敏感性，从而扩大现有抗癌靶向药物的适用范围，在肿瘤临床治疗中具有重要意义。

Description

一种融合蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
KRas作为GTP蛋白酶超家族的一员，在多个肿瘤发生发展如增殖、转移、血管生成等过程中均起到重要的促进作用，是众所周知的促癌因子。研究表明，多种类型癌症中均存在KRas突变，其中肠癌细胞中KRas突变的比例高达37.9％。常见的KRas突变主要发生在2号外显子中12、13、61和146等密码子上，其中发生在第12和13位点的突变占总突变数量的90％。高突变率导致了KRas下游多个肿瘤恶化信号通路的持续激活，这些活化的生理过程能够减弱甚至抵消KRas上游信号分子如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的作用效果，造成肠癌细胞对目前多种一线抗癌靶向药的天然耐受。
在生命科学和基础医学中，减弱蛋白质的激活或表达水平是进行蛋白质功能研究和靶向药物设计的重要策略。目前对蛋白质活性的抑制主要是针对目标蛋白质的活性位点进行小分子抑制剂的开发，然而研究表明包括KRas蛋白在内，85％的蛋白质是“不可成药蛋白”，这类蛋白质因为结构松散易变、细胞内部其它小分子竞争结合能力强、活性位点容易发生突变等原因使得很难对其进行抑制剂的开发。另外使用抗体对目标蛋白质的活性位点进行阻断性覆盖也是抑制蛋白质活性的方法，但是常规抗体分子量较大、进入细胞膜困难、以及需要针对目标蛋白质特定片段进行抗体筛选等特征限制了抗体的使用，导致目前仅有几个膜蛋白能够通过该方法进行活性抑制。
除了激活水平，对蛋白质表达水平的抑制也是减弱蛋白质功能的重要手段。以Crispr为代表的DNA编辑技术和以siRNA为代表的RNA干扰技术能够分别在DNA和RNA水平降低目标基因的表达，从而减弱编码蛋白质在细胞中的含量，继而抑制蛋白质的功能。目前DNA编辑和RNA干扰已经在生命科学的基础研究中得到了广泛的使用，部分研究人员也探索了这两种技术在临床治疗中的应用。然而实际应用中发现DNA编辑和RNA干扰均存在脱靶效应，且作用时间较长使细胞极易产生代偿效应，给基础研究造成了困扰；另外严格的作用条件也限制了这两种技术的临床使用，导致至今没有基于DNA编辑和RNA干扰的药物被批准用于疾病的临床治疗。
除DNA和RNA水平外，在蛋白质水平降低蛋白质在细胞中的积累也是减弱蛋白质表达的重要策略，其中蛋白质降解是减少其在细胞中积累的重要方法。活细胞中蛋白质降解是一个快速有序的生理过程，主要发生在蛋白酶体和溶酶体两种细胞器中。当前对蛋白质靶向降解的研究主要集中在蛋白酶体途径，通过引诱泛素连接酶(E3)与目的蛋白结合，继而将泛素分子转移到蛋白质上并被蛋白酶体识别和降解。主流的蛋白质靶向降解技术是通过构建嵌合分子将目标蛋白和E3连接酶连接在一起，进而促进目标蛋白的降解，典型代表技术为PROTAC(蛋白降解靶向嵌合体)。PROTAC嵌合分子由三部分构成：目标蛋白质配体、E3连接酶配体、以及将两者共价连接的中间片段，其中目标蛋白质配体负责识别并结合目标蛋白质，E3配体负责结合E3连接酶。根据公开报道，目前已有多种蛋白质能够通过PROTAC技术被迅速降解。其中，使用KRas G12C配体MRTX849构建的PROTAC能够有效诱导G12C突变的KRas蛋白降解。然而G12C突变只占KRas突变的一小部分(以肠癌为例，只有6.8％为G12C突变)，其他突变类型均无有效配体使用，因此并没有从本质上解决“不可成药蛋白”的抑制问题。此外，KRas配体特异性无法保证，存在错误结合蛋白的可能；嵌合分子的合成也较为复杂，无法进行大规模的生产，因此至今未能进入商业化生产和应用。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种融合蛋白。
本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的融合蛋白的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第二方面的核酸分子的载体。
本发明第四方面的目的，在于提供一种包含本发明第三方面的载体的宿主细胞。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的融合蛋白的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的融合蛋白在制备产品中的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的融合蛋白的产品。
本发明第八方面的目的，在于提供一种药物。
本发明第九方面的目的，在于提供一种联合用药物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种融合蛋白，包含与KRas蛋白特异性结合的多肽、肿瘤细胞特异性穿膜肽以及溶酶体识别肽。
优选地，所述与KRas蛋白特异性结合的多肽为抗KRas蛋白纳米抗体。
进一步优选地，所述抗KRas蛋白纳米抗体的氨基酸序列为：
a)
DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSTYPTGWFRQAPGKEREFVARINLSGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGGGSTTWAGGIPTNFDYWGQGTQVTVSSGR(SEQ ID NO.1)；或
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
优选地，所述肿瘤包括结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌。
优选地，所述肿瘤细胞特异性穿膜肽为神经节苷脂结合肽。
进一步优选地，所述神经节苷脂结合肽的氨基酸序列为：
a)RAGLQFPVGRLLRRLLR(SEQ ID NO.2)；或
b)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
优选地，所述溶酶体识别肽的氨基酸序列为：
a)KFERQKILDQRFFE(SEQ ID NO.3)；或
b)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为：
a)RAGLQFPVGRLLRRLLRDVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSTYPTGWFRQAPGKEREFVARINLSGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGGGSTTWAGGIPTNFDYWGQGTQVTVSSGRKFERQKILDQRFFE(SEQ ID NO.4)；或
b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一方面的融合蛋白的核酸分子。
本发明的第三个方面，提供一种载体，包含本发明第二方面的核酸分子。
本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，包含本发明第三方面的载体。
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
本发明的第五个方面，提供本发明的第一方面的融合蛋白的制备方法，培养本发明的第四方面的宿主细胞，得到融合蛋白。
本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的融合蛋白在制备产品中的应用。
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)降解KRas蛋白的制剂；
(2)抗肿瘤的药物；
(3)提高KRas突变型肿瘤对肿瘤靶向药物的敏感性的药物。
优选地，(1)中所述KRas蛋白包括野生型KRas蛋白和突变型KRas蛋白。
优选地，所述突变型KRas蛋白包括在G12、G13、S17、P34、A59、Q61和A146的一个或多个氨基酸位置处的突变的KRas蛋白。
优选地，(2)中所述肿瘤为KRas相关的肿瘤；进一步为结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌中的至少一种。
优选地，(3)中所述KRas突变型肿瘤为突变型KRas蛋白相关的肿瘤。
优选地，所述突变型KRas蛋白包括在G12、G13、S17、P34、A59、Q61和A146的一个或多个氨基酸位置处的突变的KRas蛋白。
优选地，所述肿瘤靶向药物为人表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物。
本发明的第七个方面，提供一种产品，包含本发明第一方面的融合蛋白。
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)降解KRas蛋白的制剂；
(2)抗肿瘤的药物；
(3)提高KRas突变型肿瘤对肿瘤靶向药物的敏感性的药物。
优选地，(1)中所述KRas蛋白包括野生型KRas蛋白和突变型KRas蛋白。
优选地，所述突变型KRas蛋白包括在G12、G13、S17、P34、A59、Q61和A146的一个或多个氨基酸位置处的突变的KRas蛋白。
优选地，(2)中所述肿瘤为KRas相关的肿瘤；进一步为结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌中的至少一种。
优选地，(3)中所述KRas突变型肿瘤为突变型KRas蛋白相关的肿瘤。
优选地，所述突变型KRas蛋白包括在G12、G13、S17、P34、A59、Q61和A146的一个或多个氨基酸位置处的突变的KRas蛋白。
优选地，所述肿瘤靶向药物为表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物；进一步为吉非替尼。
本发明的第八个方面，提供一种药物，包含本发明第一方面的融合蛋白及药学上可接受的辅料。
本发明的第九个方面，提供一种联合用药物，包含本发明第一方面的融合蛋白和本发明第八方面的药物中的至少一种，以及肿瘤靶向药物。
优选地，所述肿瘤靶向药物为表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物；进一步为吉非替尼。
本发明的有益效果是：
本发明首次针对“不可成药”蛋白设计构建了具有肿瘤靶向性和穿透性以及蛋白特异性降解的融合蛋白，为抗癌靶向药的开发提供了新的思路；该融合蛋白不同于现有技术一个分子只能靶向一种目标蛋白，其能够同时诱导野生型和突变型KRas蛋白的降解；同时，该融合蛋白能够通过诱导KRas降解而提高KRas突变型肿瘤对肿瘤靶向药物的敏感性，从而扩大现有抗癌靶向药物的适用范围，在肿瘤临床治疗中具有重要意义。
相较于嵌合分子诱导的靶蛋白降解技术，本发明提供的融合蛋白合成简单、原核或真核表达使生产方便、作用效率高，更易于大规模生产和商业化应用。
附图说明
图1是免疫羊驼及靶蛋白纳米抗体筛选的流程图。
图2是羊驼外周血淋巴细胞总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果图：其中，M表示Marker。
图3是不同量的oligo dT Primer和random 6-mer的cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果图：其中，M表示Marker。
图4是不同cDNA模板量的琼脂糖凝胶电泳结果图：其中，M表示Marker。
图5是菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。
图6是KRas蛋白降解系统(TKD)分子的构建示意图和诱导靶蛋白降解的过程示意图。
图7是TKD和TKDm的纯化效果图。
图8是TKD分子、TKDm分子和KRas蛋白在体外结合水平结果图：其中，A是TKD分子和KRas蛋白在体外结合水平结果图；B是TKDm和KRas蛋白在体外结合水平结果图；****表示与NC1相比，P<0.0001；ns表示与NC1相比，无显著差异。
图9是TKD分子、TKDm分子和KRas蛋白进行SPR结合能力实验的结果图：其中，A是TKD分子和KRas蛋白进行SPR结合能力实验的结果图；B是TKDm分子和KRas蛋白进行SPR结合能力实验的结果图。
图10是TKD分子、TKDm分子和KRas蛋白在细胞内的结合水平结果图：其中，A是TKD分子、TKDm分子和KRas蛋白在HT29(KRas wt)细胞内的结合水平结果图；B是TKD分子、TKDm分子和KRas蛋白在HCT116(KRas G13D)细胞内的结合水平结果图。
图11是不同浓度的TKD分子、TKDm分子降解KRas蛋白的结果图。
图12是不同浓度的TKD分子在不同时间降解KRas蛋白的结果图。
图13是不同浓度的TKD分子对不同位点突变的KRas蛋白的降解效果图。
图14是TKD分子与不同细胞处理后的流式细胞术结果图：其中，A是TKD分子与正常肠上皮细胞FHC处理后的流式细胞术结果图；B是TKD分子与HT29细胞处理后的流式细胞术结果图；C是TKD分子与HCT116细胞处理后的流式细胞术结果图。
图15是TKD分子在KRas野生型细胞HT29和KRas突变型HCT116细胞来源的肿瘤中的聚集图。
图16是TMD分子、TKDm分子对肠癌的抑制结果图：其中，A是不同浓度的TMD分子、TKDm分子对HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)的抑制结果图；B是不同浓度的TMD分子、TKDm分子对HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)的克隆生长的抑制结果图：**表示P<0.01；***表示P<0.001；ns表示无显著差异。
图17是TKD分子对肿瘤生长的影响图：其中，A是TKD分子对KRas野生型(HT29)肠癌生长的影响的直观图；B是TKD分子对KRas突变型(HCT116)肠癌生长的影响的直观图；C是TKD分子对KRas野生型(HT29)肠癌生长的影响的统计结果图；D是TKD分子对KRas突变型(HCT116)肠癌生长的影响的统计结果图：****表示P<0.0001；**表示P<0.01；*表示P<0.05。
图18是TKD分子对小鼠机体的影响图：其中，A是TKD分子对小鼠体重的影响图；B是TKD分子对小鼠肺、肝、脾、肾的影响图。
图19是TKD分子在体内滞留时间的结果图。
图20是gefitinib对结直肠癌细胞HCT116和HT29的细胞活率的影响图：****表示P<0.0001；***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05；ns表示无显著差异。
图21是gefitinib对结直肠癌细胞HCT116、HT29和正常肠上皮细胞FHC的克隆生长的影响的直观图。
图22是gefitinib对KRas野生型(HT29)肠癌和KRas突变型(HCT116)肠癌的影响图：其中，A是gefitinib对KRas野生型(HT29)肠癌和KRas突变型(HCT116)肠癌的影响的直观图；B是gefitinib对KRas野生型(HT29)肠癌和KRas突变型(HCT116)肠癌的影响的统计结果图：其中，**表示P<0.01；ns表示无显著差异。
图23是gefitinib对KRas野生型细胞HT29和KRas突变型细胞HCT116的信号通路Raf/ERK/c-myc的影响图。
图24是TMD分子、TKDm分子对KRas野生型细胞HT29和KRas突变型细胞HCT116中EGFR下游信号通路KRas/Raf/ERK/c-myc的影响图。
图25是TMD分子、TKDm分子与gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)和HCT116(KRasG13D)的生长的影响图：其中，A是TMD分子与gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)的生长的影响图；B是TMD分子与gefitinib联合使用对HCT116(KRas G13D)的生长的影响图；C是TKDm分子与gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)的生长的影响图；D是TKDm分子与gefitinib联合使用对HCT116(KRas G13D)的生长的影响图：其中，*表示P<0.05；**表示P<0.01；ns表示无显著差异。
图26是TMD分子、TKDm分子与gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)和HCT116(KRasG13D)的克隆生长的影响图：其中，A是TMD分子、TKDm分子与gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)的克隆生长的影响图；B是TMD分子、TKDm分子与gefitinib联合使用对HCT116(KRas G13D)的克隆生长的影响图。
图27是TKD和gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)来源肿瘤和HCT116(KRasG13D)来源肿瘤的影响图：其中，A是TKD和gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)来源肿瘤的影响的直观图；B是TKD和gefitinib联合使用对HCT116(KRas G13D)来源肿瘤的影响的直观图；C是TKD和gefitinib联合使用对HT29(KRas wt)来源肿瘤的影响的统计结果图；D是TKD和gefitinib联合使用对HCT116(KRas G13D)来源肿瘤的影响的统计结果图：****表示P<0.0001；***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05；ns表示无显著差异。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 KRas蛋白降解系统TKD的构建及其效果验证
本实例以设计构建的纳米抗体介导的KRas蛋白靶向降解系统TKD进行快速、高效的降低肠癌细胞中野生型或突变型KRas表达为例，展示并证实本发明的技术方案的可行性以及优势。KRas蛋白在维持肠癌细胞生长过程中起到重要作用，因此针对KRas设计有效的抑制性药物对肠癌的临床治疗具有重要意义。然而，KRas作为“不可成药蛋白”的一员，至今尚没有能够用于临床治疗的KRas靶向药。
一、融合蛋白TKD分子的制备
(一)TKD分子工具的设计和构建
1.KRas纳米抗体VHH序列筛选
本实施例前期使用高纯度KRas蛋白(氨基酸序列为：MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM，SEQ ID NO.7)反复免疫羊驼4次后(使用5mg纯化的靶蛋白(KRas)分四次对羊驼进行免疫，每次免疫用时15天)，提取免疫后羊驼白细胞，分离mRNA构建抗体基因噬菌体展示文库，通过噬菌体筛选和ELISA检测，经测序确定目标抗体VHH序列，最终获得了高亲和力的KRas蛋白纳米抗体VHH序列(KRas纳米抗体VHH序列筛选流程如图1所示)。具体流程如下：
1.1RNA提取和反转录
1.1.1RNA提取：
(1)将用Trizol保存的羊驼外周血淋巴细胞转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿混匀；
(2)室温静置5分钟后，4℃、12000g离心15分钟；
(3)将离心后的上清液转移到新的离心管；
(4)新离心管中加入等量体积的异丙醇,颠倒混匀；
(5)室温静置10分钟后,4℃、12000g离心10分钟,去上清；
(6)加入75％乙醇清洗沉淀，4℃、7500g离心5分钟后室温晾干沉淀,并溶解到DEPC处理水中，溶解后合并所有样品，即为提取得到的总RNA(凝胶电泳结果如图2所示)。
1.1.2反转录cDNA：
(1)使用Takara反转录试剂盒对得到的总RNA进行反转录：将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的总RNA作为模板反转录成cDNA，分别保存到2个离心管中。
1.2PCR扩增
1.2.1第一轮PCR扩增：
(1)以cDNA为模板进行第一轮PCR反应，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行PCR扩增，为了确定最佳模板使用量，分别使用2μL，3μL，5μL的oligo dT Primer和random6-mer的cDNA作为模板，PCR反应体系如下：cDNA 2/3/5μL(浓度为800ng/uL)；CALL 001/CALL 002(深圳康体生命)2μL/2μL；dNTP Mix 4μL；10×ExTaq Buffer 5μL；HS Ex Taq0.25μL；ddH2O至50μL；PCR反应体系如下：98℃3min；94℃50s，55℃30s，72℃40s+2s/cycle，23cycles；72℃5min；4℃∞；
(2)反应结束后，取20μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(不同cDNA模板量的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示)，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将所有cDNA按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应；
(3)将所有PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带；
(4)将所有纯化回收产物收集中至一个离心管中，即为第一轮PCR扩增产物，-20℃保存。
1.2.2第二轮PCR扩增
(1)将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.1μL、0.25μL、0.5μL、1μL、2μL作为模板，PCR反应体系如下：cDNA 0.1/0.25/0.5/1/2μL(浓度为800ng/μL)；VHH-for/VHH-back(深圳康体生命)2μL/2μL；dNTP Mix 4μL；10×ExTaq Buffer 5μL；HS Ex Taq0.25μL；ddH2O至50μL；PCR反应体系如下：98℃3min；94℃50s，55℃30s，72℃40s，11cycles；72℃5min；4℃∞；
(2)反应结束后，取20μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(不同cDNA模板量的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示)，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮PCR扩增产物的1/3体积共192个反应按照此模板量并使用1.2.2.(1)将所有回收产物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μL用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存相同条件进行PCR反应后使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化；
(3)将所有回收产物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μL用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。
1.3酶切和连接
1.3.1载体与PCR产物酶切：
(1)使用pComb3XSS作为噬菌体质粒载体，用Spe I、Sac I分别酶切20μgpComb3XSS载体和10μg第二轮PCR扩增产物，37℃孵育4h；
(2)使用DNA回收纯化试剂盒对pComb3XSS载体和第二轮PCR扩增产物进行纯化，4℃保存。
1.3.2连接
(1)载体和片段进行连接，连接反应体系如下：酶切后的PCR产物1.6μg；酶切后的载体(pComb3XSS)4μg；T4连接酶30μL；10×T4 reaction Buffer 200μL；ddH2O至2000μL；
(2)将连接反应体系4℃过夜(约16h)孵育；
(3)使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液，检测回收产物的浓度，4℃保存。
1.4细菌文库和噬菌体文库构建
1.4.1验证连接产物转化率
(1)取一支50μL的TG1感受态细胞在冰上放置5-10min融化；
(2)加入100ng连接产物，转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数(1800V，1mm)，电击转化；
(3)电转完成后立即加入37℃预热好的SOC培养液1mL，混匀后37℃，200rpm摇菌复苏1h；
(4)从1mL复苏后的菌液中取100μL进行10倍梯度稀释并涂板，根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目，即为连接产物的转化效率；
(5)同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落PCR，PCR反应体系如下：菌液2μL(OD600＝49.15)；VHH-for/VHH-back(深圳康体生命)2μL/2μL；dNTP Mix 4μL；10×ExTaq Buffer5μL；HS Ex Taq 0.25μL；ddH2O至50μL；PCR反应体系如下：98℃3min；94℃50s，55℃30s，72℃40s，11cycles；72℃5min；4℃∞；PCR产物有在600bp左右的单一条带认为是阳性克隆(菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示)，由此估算单克隆阳性率。
1.4.2细菌文库构建
(1)按上述方法使用20管感受态进行电转反应；
(2)37℃复苏1h后从中取100μL进行10倍梯度稀释后涂板，37℃过夜培养；
(3)收集剩下所有菌液并均匀涂布到6个245mm方形培养板(2×YT培养基含有100μg/mL Amp(氨苄青霉素)中,37℃培养过夜；
(4)根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；
(5)同时从梯度稀释板中随机挑选60个单克隆进行菌落PCR，PCR反应体系如下：菌液2μL(OD600＝49.15)；VHH-for/VHH-back(深圳康体生命)2μL/2μL；dNTP Mix 4μL；10×ExTaq Buffer 5μL；HS Ex Taq 0.25μL；ddH2O至50μL；PCR反应体系如下：98℃3min；94℃50s，55℃30s，72℃40s，11cycles；72℃5min；4℃∞；验证细菌文库的克隆阳性率；
(6)将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2×YT液体培养基刮下，置于50mL离心管，测量其OD600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
1.4.3噬箘体文库制备
(1)根据细菌文库的OD600计算在100mL2×YT液体培养基需要加入的细菌文库体积，根据计算结果接种细菌文库到100mL 2×YT液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，37℃，250rpm培养直至OD600为0.5-0.55；
(2)根据辅助噬菌体M13K07效价，按照1：20(细菌个数：噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃，250rpm孵育30min；
(3)加入终浓度为50μg/mL的Kana(卡那霉素)，30℃，250rpm过夜培养；
(4)将过夜培养的菌液4℃、4000rpm离心10min，然后将离心后的上清液转移到新的50mL离心管中；
(5)加入1/4的预冷20％PEG/2.5M NaCl储存液，混合均匀，冰上静置孵育30min；
(6)4℃、4000rpm离心20min后，弃上清，倒置控干2min；
(7)加入1mLPBS重悬至新的离心管，4℃、12000rpm离心20min；
(8)离心后转移上清至新的离心管中，再次加入1/4体积的预冷20％PEG/2.5MNaCl储存液，混合均匀，冰上孵育10min；
(9)4℃、12000rpm，10min离心，弃上清，用1mLPBS重悬后，12000rpm离心2min，转移上清至新的离心管，-80℃保存，即为纯化后的噬菌体文库。
(10)取制备好的噬菌体文库10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共12个梯度，即将噬菌体文库取10μL稀释到100μL，再从中取10μL稀释到100μL，依次类推，共稀释12个梯度至10-12，振荡混匀。
(11)在每个稀释离心管中加入90μL TG1菌液，混匀后37℃孵育30min；
(12)从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中，37℃过夜培养；
(13)统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照下面公式计算噬菌体文库效价：噬菌体文库效价＝相应稀释倍数上单菌落个数×稀释倍数×400。
2免疫筛选
2.1第一轮筛选
2.1.1从-80℃冰箱中取出筛选抗原KRas蛋白，冰上放置解冻；
2.1.2将筛选抗原包被免疫管(50μg/管，包被液为CBS缓冲液，pH9.6，2mL/管)，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被BSA作对照；
2.1.3将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2ml PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
2.1.4加入2mL封闭液(3％BSA)溶液，室温旋转封闭2h；
2.1.5将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入2mL PBST缓冲液(1×PBS加0.1％Tween20，下同)室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
2.1.6弃掉免疫管中的清洗液，加入1mL PBS，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库32μL作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育1h：
Figure BDA0003019389960000081
其中，V为加入的噬菌体体积(单位μL)，Tlibrary为噬菌体效价；
2.1.7将免疫管内液体弃掉，加入2mL PBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min；
2.1.8将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1mL 0.25mg/mL Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；
2.1.9加入10μL10％AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟)终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
2.2第一轮噬菌体洗脱液效价检测
2.2.1将-80℃冰箱保存的TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL 2×YT培养基，37℃过夜培养；
2.2.2取过夜培养菌液500μL转接到含5mL 2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55；
2.2.3取第一轮噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将第一轮噬菌体洗脱液取10μL稀释至100μL，再从中取10μL稀释至100μL，依次类推，共稀释12个梯度至10-12，振荡混匀；
2.2.4在每个稀释离心管中加入90μL的TG1菌液，混匀后37℃孵育30min；
2.2.5从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中，37℃倒置过夜培养；
2.2.6统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：
T(pfu/ml)＝N×D×400
其中，T为噬菌体效价(单位pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数上单菌落个数。
2.3第一轮噬菌体洗脱液的扩增
2.3.1预先将-80℃冰箱保存的TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL 2×YT培养基，37℃过夜培养；
2.3.2取过夜培养菌液500μl转接到含5mL 2×YT液体培养基中，37℃、250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55；
2.3.3加入500μL第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至OD600为0.5-0.55的菌液中(剩余的洗脱液4℃保存)；
2.3.4 37℃、250rpm继续培养30min；
2.3.5将全部菌液均匀涂布到含有100μg/mL Amp的2％琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃过夜培养；
2.3.6取过夜培养的方形板，在培养板表面加入6mL 2×YT液体培养基(含100μg/mL Amp)，用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15mL离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液OD600值，即为洗脱液细菌文库OD600值，加入终浓度为20％的甘油，即为第一轮细菌文库。
2.3.7将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至100ml 2×YT液体培养基中(含100μg/mL Amp)，以使初始OD600为0.1：
Figure BDA0003019389960000091
其中，V为转接菌液的体积(单位μL)，OD600为构建的洗脱液细菌文库的OD600；
2.3.8 37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55；
2.3.9按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：
Figure BDA0003019389960000092
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值；
2.3.10 37℃、250rpm继续培养30min；
2.3.11分别加入终浓度为50μg/mL Kana，30℃、250rpm过夜培养。
2.4第一轮噬菌体纯化
2.4.1将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中4000rpm，4℃离心10min；
2.4.2将离心后的上清液转移至新的50mL离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min；
2.4.3 4000rpm、4℃离心20min，弃上清，并在纸上倒置2min；
2.4.4加入1mL PBS重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5mL离心管，13000rpm、4℃离心20min；
2.4.5将离心后的上清转移至新的1.5mL离心管，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min；
2.4.6 13000rpm、4℃离心10min，弃上清，加入1mL PBS重悬沉淀；
2.4.7 13000rpm、4℃离心2min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库，100μL/管分装，长期-80℃保存，短期(1-2周)可于-20℃放置保存；
2.4.8第一轮筛选噬菌体子文库效价检测，方法同2.2。
2.5第二轮筛选
筛选方法同2.1，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库0.25mL，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液。
2.6第二轮噬菌体洗脱液效价检测
方法同2.2。
2.7第二轮洗脱液的扩增、纯化
方法同2.3-2.4，得到第二轮筛选噬菌体子文库。
2.8第二轮筛选噬菌体子文库效价检测，
方法同2.2。
2.9第三轮筛选
筛选方法同2.1，输入噬菌体为第二轮筛选得到噬菌体子文库0.25mL，作为第三轮筛选输入噬菌体文库，得到第三轮筛选噬菌体洗脱液。
2.10第三轮噬菌体洗脱液效价检测
方法同2.2。
2.11单克隆ELISA检测
2.11.1预先将-80℃冰箱保存的TG1菌株在2×YT固体培养基)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL 2×YT培养基，37℃过夜培养；
2.11.2取过夜培养菌液500μL转接到含5mL 2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55；
2.11.3取第三轮筛选后噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将噬菌体文库取10μL稀释至100μL，再从中取10μL稀释至100μL，依次类推，共稀释12个梯度，振荡混匀；
2.11.4每个稀释离心管中加入90μLOD600值为0.5-0.55的菌液，混合均匀；
2.11.5 37℃，250rpm继续培养30min；
2.11.6将菌液均匀涂布到含有100μg/mL Amp的2×YT固体培养基平板，37℃过夜培养；
2.11.7从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(P1-P2)中，每孔加入200μL2×YT培养基(含有100μg/mL Amp)，37℃过夜静置培养；
2.11.8取过夜培养的菌液2μL转接至每孔200μL 2×YT液体培养基(含有100μg/mLAmp)的新96孔细胞培养板中，37℃静置培养3h，将转接前过夜培养的菌液4℃保存；
2.11.9按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数＝1：20：
Figure BDA0003019389960000101
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位ml)，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价；
2.11.10 37℃孵育30min，加入终浓度为50μg/mL的Kana，30℃静置过夜培养；
2.11.11将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用；
2.11.12将筛选抗原包被酶标板(1ng/μL，包被液为pH9.6的CBS，100μL/孔)，同时平行包被BSA作对照，4℃包被过夜；
2.11.13将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200μLPBS缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；
2.11.14每孔加入200μL封闭液(3％BSA)封闭酶标板，室温封闭1h；
2.11.15弃封闭液，每孔加入200μLPBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；
2.11.16每孔加入120μl 3％BSA后再加入80μL步骤2.11.11中离心后的上清液，室温孵育2h；
2.11.17弃掉酶标板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min；
2.11.18每孔加入M13Bacteriophage Antibody(HRP)，Mouse Mab，1:40000稀释于封闭液中，100μL/孔，室温孵育1h；
2.11.19弃掉ELISA板内液体，每孔加入200μl PBST缓冲液洗涤3次，每次10min；
2.11.20每孔加入100μl TMB单组份显色液，避光显色2-3min，每孔加入100μL 1MHCl终止，用酶标仪读取OD450nm值，记录并保存。
2.12阳性克隆ELISA二次验证
为了排除假阳性结果，将初步认定为阳性克隆进行ELISA二次验证，方法同2.11。
2.13阳性克隆测序
根据ELISA检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆
从单克隆ELISA检测(2.11.7)板中取阳性克隆菌液5μL接种至1mL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp)，37℃、250rpm培养直至OD600至0.8-1.0(约6-8h)，取0.5mL菌液测序，其余菌液4℃保存。
2.14序列分析
经测序的序列使用GENtle软件进行序列比对分析，并使用GENtle软件将抗体序列翻译成氨基酸，氨基酸序列为DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSTYPTGWFRQAPGKEREFVARINLSGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGGGSTTWAGGIPTNFDYWGQGTQVTVSSGR(SEQ ID NO.1)。
3.构建TKD表达载体
合成含有BR2、纳米抗体(VHH)和CTM等分子元件的DNA序列并克隆到原核表达载体pET28a(质粒由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成构建)。将合成的TKD-pET28a质粒转化至E.coli BL(Rosetta)感受态细胞，经卡纳抗性平板筛选阳性重组子，对其进行菌落PCR验证及DNA测序验证，经NCBI Blast比对分析测序结果。质粒置于-20℃长期保存，将测序正确的菌株加入15％甘油保存于-80℃。TKD分子的对照分子中CTM片段的精氨酸位点进行人为突变为丙氨酸(Q-A)，使之不能被溶酶体识别，命名为TKDm，以同样的方法获得TKDm表达菌株(质粒由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成构建)，15％甘油保存于-80℃。载体pET28a带有6*His标签，可用于His蛋白的表达纯化。TKD分子的构建示意图和降解过程示意图如图6所示。
(二)TKD系统的表达纯化
1.TKD和TKDm均采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，分别使用不同的IPTG浓度、作用温度和作用时间进行诱导表达条件的摸索。随后使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝实验确定最佳表达条件。本实施例中将测序正确TKD和对照组TKDm菌液接种于含有卡那抗性(50ng/μL)的TB培养基中，37℃振荡培养过夜。次日将活化的菌种按1:100比例将菌液分别接入新鲜培养基扩大培养，在37℃以220rpm振荡培养至OD600＝0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG终浓度为0.5mM，同样的条件继续诱导表达4h左右收集菌体，5000rpm于4℃离心30min，1×PBS缓冲液重悬菌体并再次离心收集菌体。将收集到的菌体再次用1×PBS缓冲液重悬至10％的菌液，用于液氮和37℃反复冻融3次，然后冰浴超声30min(5s开，5s关)至菌液完全破碎(或者直接使用高压破碎仪，700～900Pa，4℃破碎8min)。在破碎完全的菌液中加入尿素至终浓度为8M，室温孵育30min以上，菌液变得澄清透亮。于4℃以10000rpm离心1h，弃沉淀，0.22mm孔径滤膜过滤上清，上清用于后续的纯化。
2.TKD分子的变性纯化和复性：将上述得到的上清与Ni-NTA琼脂糖凝胶重悬后4℃孵育2h(按照5g的菌体：1mL 50％Ni-NTA琼脂糖凝胶进行孵育)。Ni-NTA琼脂糖凝胶在孵育过程中颜色由蓝色变为棕色，1000g，4℃离心1min，取20uL上清用于后续纯化效果验证，弃去大部分上清仅保留少许用于重悬Ni-NTA琼脂糖凝胶，上柱，用含有50mM咪唑，8M尿素的1×PBS缓冲液洗涤3次，每次2倍柱体积。收集最后一次洗涤液20uL。接着用含有300mM咪唑，8M尿素的1xPBS缓冲液进行洗脱，若Ni-NTA琼脂糖凝胶重新变为蓝色，则说明基本洗脱完全。取20uL洗脱液留样，将纯化过程中留取的样品用12％SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效率。检测洗脱的蛋白变性溶液的浓度，用含有8M尿素的1×PBS缓冲液调整蛋白浓度为1mg/mL左右，加入5％甘油，混合后进行梯度冷冻透析。透析液浓度为分别含有4M，2M,0M尿素的1×PBS缓冲液，蛋白变性溶液与透析液比例1:10，每个梯度在-10℃透12h。透析后的蛋白溶液使用10000g离心力离心10min，上清用3KD超滤管(Millipore,货号：UFC900396)进行融合蛋白浓缩，4500g离心，4℃超滤至500μL，之后使用1×PBS冲洗浓缩液三次，并重复离心三次。获得的浓缩蛋白使用BCA蛋白浓度检测试剂盒(Thermo Fisher，货号：23227)测得浓度并放置在-80℃保存。
TKD和TKDm的纯化效果如图7所示，纯度均达到了90％以上，可以用于接下来的实验验证。TKD分子的氨基酸序列为：
Figure BDA0003019389960000121
Figure BDA0003019389960000122
Figure BDA0003019389960000123
(SEQID NO.4)(其中，单下划线为癌细胞特异性穿膜肽BR2的氨基酸序列，SEQ ID NO.2；双下划线为溶酶体识别肽CTM的氨基酸序列，SEQ ID NO.3)。TKDm分子的氨基酸序列为：
Figure BDA0003019389960000124
Figure BDA0003019389960000125
(SEQ ID NO.5)(其中，单下划线为癌细胞特异性穿膜肽BR2的氨基酸序列，SEQ ID NO.2；双下划线为不能被溶酶体识别的CTMmt的氨基酸序列，SEQ IDNO.6)。
二、TKD识别并结合野生型和突变型KRas蛋白的效果验证
本实施例首先验证TKD分子与KRas蛋白的结合能力。体外使用纯化TKD分子和KRas蛋白(KRas蛋白的纯化过程与“TKD系统的表达纯化”过程一致)进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)以及表面等离子共振(Surface PlasmonResonance,SPR)结合能力实验。在细胞内主要采用免疫共沉淀(Co-IP)实验验证TKD分子和KRas蛋白在细胞内的结合水平。
1.ELISA验证TKD分子和KRas蛋白在体外结合水平
酶联免疫吸附测定(ELASA)是在免疫酶技术的基础上发展的免疫测定技术，也可用来检测蛋白之间的相互作用。
(1)设置对照组，包括空白对照(NC1)、TKD+IgG对照(NC2)、IgG+KRas对照(NC3)，对照组各成分的使用浓度和体积与实验组保持一致；实验组包括TKD、TKDm，分别验证与KRas蛋白的相互作用。
(2)包被：ELISA包被液(购自NeoBioscience，货号：NBC01)分别将TKD和TKDm稀释到浓度为1ng/μL，每个96孔ELISA板的孔中加入100μL包被液，4℃包被过夜。
(3)封闭：使用磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS配方：4g NaCl，0.1g KCl，1.815g十二水合磷酸氢二钠，0.12g磷酸氢二钾，溶解在400mL的超纯水中，定容至500mL使用)清洗ELISA板1次5分钟；每孔加入300μL5％(w/v)牛血清白蛋白；37℃封闭2小时。
(4)加入纯化的蛋白质KRas：分别将6.25、12.5、25、50、100μg纯化蛋白预先混匀稀释在200μLPBS中，依次往孔内加入稀释后的KRas蛋白，室温慢摇5小时；之后按照上述清洗方法清洗ELISA板5次，每次5分钟。
(5)加入anti-KRas(货号：05-516，购自Abcam)抗体：按照1:2000比例，将1μg抗体在2000μL5％BSA中稀释，得到抗体稀释液，每孔加入100μL抗体稀释液，室温孵育2小时或者4℃孵育过夜。
(6)清洗掉多余抗体：清洗方法如上，清洗5次，每次5分钟。
(7)孵育二抗：将带有辣根过氧化酶的二抗山羊抗鼠IgG HRP(货号：ab6721，购自Abcam)按照质量体积比1:2000，也即将1μg抗体稀释到2000μL的5％BSA中，得到抗体稀释液，每孔加入100μL抗体稀释液进行孵育。
(8)显色：每孔加入100μL ELISA显色液TMB(购自NeoBioscience，货号：TMS.12)，37℃放置1分钟，立即用50μL终止液(购自NeoBioscience，货号：EST001)终止显色。
(9)读取数值：待显色稳定后使用分光光度计进行双波长测定，按OD450-OD630计算得到每个孔的吸光度值，进而分析药物作用效果。实验结果如图8所示，与对照组相比，TKD和对照分子TKDm均能与KRas蛋白存在较强的相互作用。
2.体外使用纯化的TKD分子和KRas蛋白进行SPR结合能力实验。SPR实验利用的机型为BiacoreT200，具体操作流程详见《BiacoreT200检测蛋白与蛋白结合操作指南》，本实例要点如下：
(1)配体偶联，首先根据以下公式计算目标偶联量：
Figure BDA0003019389960000126
其中，Rmax为芯片表面最大结合量，在蛋白测试中通常代入100RU；本实施例选用了偶联TKD分子(17kD，analyte MW),流过蛋白KRas(23kD，ligand MW)；Sm为化学计量比，未知时选1；RL为配体偶联水平，实验时实际偶联量为1.5倍的RL；所以经计算，RL为74RU，TKD分子的目标偶联量为110RU。
(2)配体的预富集，TKD分子分别用醋酸钠pH5.0、4.5、4.0分别稀释到10ug/mL(至少10倍稀释比)，各准备100uL，通过预富集实验，确定pH5.0为最佳偶联条件。故用pH5.0的醋酸钠将10μg/mL，200uL进行正式的偶联操作。
(3)配体偶联:
a.打开BiacoreT200 Control Software，点击File下面的Open/New wizardtemplate，选择immobilization；对话框中，在Chiptype中选CM5，在Flowcell spercycle选1；勾选Flow cell2，method选用amine氨基偶联，ligand输入配体名称，该实验选用aimforimmobilized level，target level输入计算出的110RU；在Flow path中选择Flowpath2(如芯片2通道已用，可选择4通道)；接着按Next，勾选prime，选择实验温度，一般默认25℃。
b.在左侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack1，系统会自动排好样品放置位置(可以通过鼠标拖拽重新安排)；根据样品架位置表，准备足够体积的样品(如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去)；100μL的EDC放入R1D3，100μL的NHS放入R1D4，空管放入R1D5，140μL乙醇胺放入R1D6，166μL10μg/mL配体蛋白放入R1D1；盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱；点击Next，弹出Prepare Run Protocol对话框，确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求，点击start。
(4)样品检测过程：
a.在Kinetics/Affinity界面中，将Flowpath点为2-1或4-3，Chiptype选择CM5；在Setup界面里，Startup底下的Solution一栏中填写HBS-EP，并将Numberofcycles改为3；在Kinetics/Affinity-injectionParameter界面下：在Sample一栏中Contacttime为120s，Flowrate为30μL/min，Dissociationtime为120s，再生条件为Glycine2.0，再生时间30s；
b.Kinetics/Affinity-Sample界面中，填写分析物信息：Sampleid填写样品名称，MW(Da)填写分子量，第一个Concentration为摩尔浓度将其调为μM，第二个为质量浓度，摩尔浓度填完后质量浓度会自动计算(每个样品请选择一个浓度进行重复进样，样品浓度由低到高填写)；
c.在Kinetics/Affinity-SystemPreparations界面下，直接点Next进入RackPosition界面，将ReagentRack改为SampleandReagentRack1，点开Menu后选AutomaticPositioning；将Pooling一栏全部改为Yes，VialSize根据需求进行调整，1.5mLEP管请选择medium；根据样品所在位置进行样品准备和放置；KRas蛋白用运行缓冲液HBS-EP进行倍比稀释；点Next后，对方法进行保存，再对数据路径进行保存，仪器便会开始自动运行。
结果如图9所示，SPR检测结果证明在体外TKD与对照分子TKDm与KRas蛋白的结合能力均较强，其中TKD与KRas蛋白结合达到了抗原-抗体结合(nM)级别。
3.验证TKD分子和KRas蛋白在细胞内的结合水平。
免疫共沉淀实验(Co-IP)是检验蛋白质细胞内相互作用重要手段，为了进一步研究验证TKD分子降解靶蛋白的机制和效果，本实施例进行免疫共沉淀实验(Co-IP)对TKD的作用进行进一步研究。Co-IP具体操作步骤如下：
(1)提前将100万个结肠癌HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)细胞(来自美国模式培养物集存库(ATCC)(货号：HTB-38，CCL-247))铺在细胞培养皿中，并分别加入TKD及其对照分子TKDm使终浓度为20μg/mL，该实验在终浓度为10μM的溶酶体抑制剂Lys05的持续存在下进行。
(2)37℃环境下培养处理细胞24小时，之后用PBS清洗细胞两次，每个培养皿加1mL0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔2mL完全培养液终止消化，300g转速常温离心3分钟，收集细胞并用5mL PBS重悬，重复离心1次。
(3)将清洗好的结肠癌细胞收集到1.5mL的EP管中。加入配置好的裂解液，此裂解液为含有1％PMSF、1％PI和磷酸酶抑制剂的western及IP裂解液(货号：P0013，购自碧云天生物技术公司)，冰上裂解，每5min上下颠倒几次，轻柔的，不能涡旋，裂解30min后，12000rpm、4℃离心30min。
(4)取上清至新EP管，使用BCA法测蛋白浓度，随后每组取1mg蛋白质进行Co-IP反应；每组加入ProteinA/G agarose 30μL和鼠IgG(货号：10284-1-AP；购自Proteintech)1μg，4℃旋转孵育1小时；随后4℃，2500rpm离心5min，取上清蛋白样至新EP管中；此步骤为去除样品中能与下一步实验中His-tag抗体(货号：66005-1-Ig；购自：Proteintech)孵育时非特异性结合的蛋白质。
(5)将第(4)步中得到的上清蛋白样分成均三组：IgG组、实验组和Input组：IgG组中加入2μg鼠IgG抗体，实验组中的蛋白样中加入2μg His-tag抗体，Input组不作处理，4℃旋转孵育16～18h。
(6)IgG组、实验组样品中各加入30μL ProteinA/G agarose beads，4℃旋转孵育4h。
(7)IgG组、实验组样品2500rpm离心5分钟，去除上清；用western及IP裂解液洗轻柔润洗beads，之后2500rpm离心5分钟，重复三次；去除上清液，每组加入30μL SDS裂解液(货号：P0013G；购自：碧云天生物技术公司)，同时Input组中也取30μL蛋白样品；涡旋震荡一分钟，开水煮10min；离心，收集上清于新的1.5mLEP管中。
(8)使用BCA法测蛋白浓度，并各取每组30μg蛋白进行SDS变性凝胶电泳，转印并用5％脱脂牛奶封闭1h后，加入KRas(货号：12063-1-AP；购自：Proteintech)一抗，4℃摇晃过夜，去抗体，用TBST洗膜3次，每次10min；随后使用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗室温摇晃孵育1h，TBST洗膜3遍，10min每次，ELC发光试剂盒暗室中发光显影。
结果如图10所示，通过免疫共沉淀(Co-IP)实验表明：TKD分子能够穿过细胞膜并无差别的结合胞内野生型和突变型KRas蛋白。
三、验证靶向KRas的TKD分子对野生型和突变型KRas蛋白的降解效果。
本实施例验证了TKD分子降解野生型和突变型KRas蛋白的过程是时间依赖和浓度依赖的。主要是通过蛋白质免疫印迹(western blot,WB)的方法检测TKD分子降解KRas的效果，具体步骤如下：
1.TKD以及TKDm分子降解KRas蛋白的浓度依赖性。
(1)细胞来源和培养：人结肠癌细胞HT29(KRas wt)、人结肠癌细胞HCT116(KRasG13D)来自美国模式培养物集存库(ATCC)(货号：HTB-38，CCL-247)，HT29和HCT116细胞均培养在1640培养基中，加含10％胎牛血清(Invitrogen)；培养条件为5％CO2，37℃。
(2)将结肠癌细胞HCT116、HT29分别铺在六孔板中，每孔50万细胞；各分为两组，实验组中分别往培养孔中加入TKD使终浓度依次为0、0.01、0.1、1、10、20μg/mL(0浓度用等体积的PBS代替)，对照组中用TKDm代替TKD作相同处理；每个孔加入DMEM完全培养液2000μL，混匀培养液，37℃培养处理细胞24小时。
(3)PBS清洗细胞两次，每个孔加0.5mL0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔1mL完全培养液终止消化，细胞悬液收集到1.5mLEP管中，300g转速常温离心3分钟，收集细胞并用1mLPBS重悬，重复离心1次。
(4)去除上清，每组加入裂解液100μL(货号：P0013G；购自碧云天生物技术公司)。冰上裂解，每5min涡旋震荡一次，裂解30min后，12000rpm4℃离心30min，收集上清于新的1.5mLEP管中。
(5)使用BCA法测蛋白浓度，并各取每组30μg蛋白进行SDS变性凝胶电泳，转印并用5％脱脂牛奶封闭1h后，按照1：2000比例稀释加入KRas(来源：Proteintech；货号:12063-1-AP)、β-tublin(来源：Proteintech；货号:10094-1-AP)一抗，4℃摇晃过夜，去抗体，用TBST洗膜3次，10min每次；用相应的HRP标记的兔二抗(来源：全式金公司；货号：HS101-01)1:3000稀释并室温摇晃孵育1h，TBST洗膜3遍，10min每次；ELC发光试剂盒暗室中发光显影；所有一抗浓度均为1:2000(1μg蛋白质稀释在2000μL一抗稀释液中)。
结果如图11所示，TKD能够引起肠癌细胞中野生型和突变型KRas蛋白表达水平的降解，且降解程度随着浓度的增加而提高，不能被溶酶体识别的对照分子TKDm则不能起到相似的作用；说明了TKD分子能够诱导细胞内部蛋白进行溶酶体介导的蛋白质降解。
2.TKD以及TKDm分子给药时间对降解KRas的影响。
(1)图11显示，当TKD浓度为10ug/mL、20ug/mL时降解KRas效果明显；因此我们设置了时间点1、2、6、12、24h来持续检测当TKD分子浓度为0、10、20μg/mL时，KRas的降解效果。
(2)按照上述浓度依赖性检测中的操作过程收集不同时间点处理后的细胞，并及时进行裂解，BCA测定蛋白浓度各取30μg蛋白保存于-20℃冰箱备用。
(3)将收集到蛋白样品进行Western blot实验。
结果如图12所示，TKD能够快速降解KRas，且该降解过程在一定范围内呈时间依赖性。
3.TKD分子能够降解多种突变的KRas蛋白。
我们随后分别使用多个含有常见KRas位点突变的癌细胞对TKD分子的作用效果进行了验证，本实施例使用的细胞系分别为SW1116(KRas G12D)、SW480(KRas G12V)、H358(KRas G12C)，均来源于ATCC，货号分别为:CCL-233,CCL-228,CRL-5807；各细胞的处理过程与上述给药时间对降解KRas的影响保持一致，收集的蛋白质样品进行Western blot实验验证TKD分子对KRas蛋白的降解效果。
结果如图13所示，TKD分子能够诱导不同突变状态的KRas蛋白的降解，降解效果较为显著；表明TKD分子能够无差别的降解不同突变状态的靶蛋白，比传统小分子靶向药物具有更广的适用范围和更好的作用效果。
四、TKD肿瘤细胞靶向性验证
使用荧光染料Cy5标记TKD分子形成TKD-Cy5共价耦合物，随后使用该耦合分子分别处理正常肠上皮细胞和肠癌细胞，利用流式细胞仪检测TKD分子在各种类细胞中的富集程度，同时使用小鼠进行体内肿瘤靶向性评估，证明TKD分子的肿瘤细胞靶向性。
1.水溶性Cy5 NHSester标记TKD分子
(1)Cy5 NHS 1.0mg溶解于400μL DMSO后，加入到盛有1.0mg的400μL TKD蛋白溶液的玻璃瓶中。
(2)加入15μL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。
(3)用HPLC纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25cm×10mm)，每次上样注入2×400μL，30分钟梯度洗脱；从0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液到MeCN(乙腈)∶H2O(0.1％TFA)＝70∶30，流速4mL/min。
(4)收集目标色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
(5)将TKD-Cy5分子稀释成60μM，产品保存在PBS溶液中，-20℃避光储存。
2.流式细胞术验证TKD分子的肿瘤细胞靶向性
(1)肠癌细胞系HCT116细胞和HT29细胞，以及正常肠上皮细胞FHC(购自ATCC，货号：CRL-1831)按每孔4×105个的密度接种于6孔板中，培养过夜后，用相应药物处理细胞；分别设置实验组和对照组，实验组用60nM的TKD-Cy5耦合分子处理，对照组用相应浓度的Cy5单分子处理；对照组和实验组均同时加入终浓度为10μM的溶酶体抑制剂Lys 05，各孔中培养液的终体积为1mL；37℃，5％CO2条件下避光孵育1h。
(2)胰酶消化收集细胞，1500rpm离心5min，去除上清并用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将清洗好的细胞重悬于0.2mL PBS中，用锡箔纸包住，随后在流式细胞仪上分析(公司：BECKMAN COULTER；型号：Cytoflex)，使用的荧光通道为APC-A。
结果如图14所示，流式细胞仪分析表明，TKD分子能够特异性识别并穿过细胞膜进入肠癌细胞，而无法进入正常肠上皮细胞中，表明TKD分子具有较强的肿瘤靶向性。
3.小鼠体内实验证明TKD分子在体内有肿瘤靶向性
(1)购买4-5周龄雌性Balb/c裸鼠10只(广东省实验动物中心)，随后分别在小鼠左右两侧皮下注射HT29(左)和HCT116(右)细胞各50万个，一周后，将小鼠分为两组，每组5只，分别为实验组和对照组。小鼠饲养和实验均在中山大学实验动物中心进行，所有操作均符合中山大学实验动物管理办法，并服从动物伦理规则。
(2)使用上述构建的TKD-Cy5分子和Cy5单分子以60μM浓度、100μL体积经尾静脉注射进入小鼠体内，其中TKD-Cy5注射组为实验组，Cy5单分子注射组为对照组。
(3)尾静脉注射完成2.5小时后，小鼠使用异氟烷进行气体麻醉，并使用IVISLumina(PerkinElmer)进行Cy5成像检测，检测荧光形式为fluorescence。
(4)实验结果如图15所示，与Cy5单分子对照组相比，TKD-Cy5能够在KRas野生型细胞HT29和KRas突变型HCT116细胞来源的肿瘤中聚集，而除了与对照组一样因体内代谢产生的膀胱滞留外，不会靶向小鼠其他组织器官。以上结果表明：TKD具有良好的肿瘤靶向性。
五、TKD抑制肠癌细胞增殖的作用验证
通过细胞增殖CCK-8实验，克隆形成实验和小鼠体内成瘤实验证明TKD分子能够抑制肠癌增殖。
1.CCK-8实验
CCK-8是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏、无放射性的比色检测法，主要试剂WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成橙黄色甲臜染料能够溶解在培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量呈正比。
(1)分别取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和HT29，以0.25％胰酶消化、计数、接种于96孔培养板，每种细胞分6组，每组4个副孔，每孔加入100μL的细胞悬液，浓度为1×104个/mL,同时，将96孔细胞培养板四周加入100μL磷酸盐缓冲液(PBS)防止细胞培养液挥发，37℃，5％CO2培养箱，培养24h使其贴壁。
(2)经PBS漂洗3次后，更换含不同浓度的TKD和TKDm(0、10、20μg/mL)的培养基继续培养24h，弃培养液，PBS洗3次，均匀加入100μL CCK-8稀释液(CCK-8：培养基＝1:10)，置于37℃，5％CO2孵育2h后，应用酶联免疫检测仪，在450nm波长处测得相应OD值。
(3)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)，P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图16中A所示，细胞增殖CCK-8实验表明：TKD能显著抑制HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)生长，而TKDm则不能取得相同效果，表明TKD是通过溶酶体介导的KRas蛋白降解抑制了肠癌细胞的增殖，而不是通过纳米抗体对KRas蛋白活性的阻断作用。
2.细胞克隆形成实验
(1)将对数生长期的结肠癌细胞HT29、HCT116经胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔500个细胞均匀接种于12孔板内，每种细胞分6组，每组3个副孔，37℃，5％CO2培养箱，培养24h使其贴壁。
(2)各组细胞经各自实验处理，即含不同浓度的TKD和TKDm(0、10、20μg/mL)的培养基继续培养，每日观察细胞生长情况，每隔1-2天进行一次细胞换液，直至光镜下看到细胞克隆(50个以上细胞为一个克隆)时终止培养。
(3)各组弃上清后，PBS缓冲液洗涤两次，空气干燥；每孔加适量甲醇固定液进行细胞固定15min，用PBS液洗净孔内残余固定液，空气干燥；每孔加适量结晶紫染色液进行细胞染色15min；用PBS液洗净孔内残留染液，空气干燥，倒置显微镜下对各组复孔中所见细胞克隆进行计数并计算克隆数。
(4)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)，P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图16中B所示，克隆形成实验在细胞水平表明：TKD分子能显著抑制KRas野生型和突变型(G13D)肠癌细胞克隆的生长。
以上CCK-8和克隆形成实验均证明，与对照组TKDm相比，TKD能够显著抑制KRas野生型和突变型肠癌细胞增殖，表明纳米抗体介导的KRas降解系统TKD是通过溶酶体途径降解目标蛋白的，对肠癌的治疗具有重要价值。
3.体内成瘤实验
(1)本实验使用小鼠为Balb/c裸鼠，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心，实验小鼠分为3组，每组5只，分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、TKD-25mg/kg组、TKD-50mg/kg组。
(2)使用胰酶消化处于对数期的HT29和HCT116细胞，使用完全培养液终止消化后进行细胞计数，经计数，分别取750万个HT29和HCT116细胞，并使用PBS洗涤两次，每次洗涤完成后均使用300g离心力离心5分钟，收集细胞。
(3)配置细胞稀释缓冲液重悬细胞，缓冲液成分为PBS:基质胶(康宁公司)＝1：1，随后分别使用1.5毫升缓冲液重悬HT29和HCT116细胞，置于冰上备用。
(4)进行皮下成瘤实验：对每只小鼠通过腹腔注射150μL三溴乙醇进行麻醉，随后分别在小鼠背部左右两侧皮下注射HT29和HCT116细胞悬液100μL(50万个)，其中HT29细胞位于左侧，HCT116细胞位于右侧。
(5)小鼠饲养一周后开始进行给药实验：给药方式为腹腔注射，其中PBS对照组注射PBS，TKD-25mg/kg组注射TKD浓度为25mg/kg，TKD-50mg/kg组注射TKD浓度为50mg/kg，给药体积均为150μL，给药频率为每三天固定时间给药一次，持续给药7次。
(6)给药结束后，对每只小鼠注射三溴乙醇150μL，随后脱颈处死，分别收取小鼠左右两侧肿瘤并进行称重统计肿瘤重量。实验结果如图17所示，与PBS对照组相比，TKD给药组能显著抑制KRas野生型(HT29)和突变型(HCT116)肠癌的生长，且用药浓度大的TKD-50mg/kg组比低浓度的25mg/kg组效果更好；表明TKD在体内也能够有效抑制肿瘤生长。
六、TKD分子的毒副作用验证
(1)本实验使用小鼠为Balb/c裸鼠，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心；实验小鼠分为3组，每组5只，分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、TKD-25mg/kg组、TKD-50mg/kg组。
(2)通过小鼠腹腔注射进行PBS和TKD溶液给药，每次给药体积均为150μL，TKD分别按照25mg/kg和50mg/kg给药；每隔3天固定时间给药一次，同时观察并记录小鼠身体状态、精神状态和体重变化。
(3)持续给药7次(3周)后停止给药，对小鼠实施安乐死(颈椎脱臼)，分别取小鼠主要器官肺、肝、脾、肾等进行苏木素-尹红(HE)染色并进行病理组织学分析，评估TKD对机体的毒副作用，本研究所有动物实验均在中山大学动物伦理相关规定内进行。
实验结果如图18所示，与对照PBS给药组相比，两个TKD给药组小鼠均未出现明显的体重变化，病理组织分析表明TKD分子未对小鼠肺、肝、脾、肾等重要器官造成损伤。以上数据均证明TKD分子对机体的毒副作用较小，具有重要的临床应用价值。
七、TKD分子体内滞留时间验证
(1)本实验使用小鼠为Balb/c裸鼠，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心；实验小鼠分为3组，每组5只，分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、TKD-25mg/kg组、TKD-50mg/kg组。
(2)通过小鼠腹腔注射进行PBS和TKD溶液给药，每次给药体积均为150μL，TKD分别按照25mg/kg和50mg/kg给药一次。
(3)给药3天后对小鼠实施安乐死(颈椎脱臼)，抽取小鼠心脏新鲜血液并离心取血清，使用BCA法测血清蛋白浓度(步骤如前述)，随后分别取血清蛋白20μg进行WB实验(实验过程如前述)，并进行血清全蛋白跑胶和考马斯亮蓝染色。
(4)实验结果如图19所示，给药三天后，高浓度TKD给药组仍能被检测到(50mg/kg)，表明明TKD分子在体内的半衰期较长，具有重要的临床应用价值。
实施例2TKD逆转肠癌细胞Gefitinib耐药的效果验证
“实施例1”中阐述了TKD的设计思路，验证了TKD在诱导野生型和突变型KRas蛋白降解中的作用，并对其肿瘤靶向性和抑制肠癌增殖的效果进行了深入验证。由于KRas蛋白是EGFR下游信号通路中的重要效应分子，KRas的突变常常导致肠癌细胞对EGFR靶向药如gefitinib的临床耐药。因此本实施例采用TKD诱导KRas蛋白降解的方式降低了肠癌细胞中KRas的表达水平，并评估了该作用方式对肠癌细胞恢复gefitinib敏感性的效果。
一、KRas突变引起肠癌细胞gefitinib(吉非替尼)耐药的效果验证
EGFR主要通过激活两条信号通路促进肿瘤发生和发展，分别为EGFR/KRas/Raf/ERK和EGFR/PI3K/AKT，其中KRas的突变通常会导致KRas/Raf/ERK信号通路的持续激活，因此会抵消甚至减弱EGFR靶向药的作用效果。本实施例以EGFR靶向药gefitinib为例，以KRas野生型细胞HT29(KRas wt)和KRas突变型细胞HCT116(KRas G13D)为对象首先探究了KRas突变对肠癌细胞耐药性的影响。
1.cck-8实验证明KRas突变型细胞HCT116(KRas G13D)具有gefitinib耐药性
(1)分别取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和HT29以及作为对照的正常肠上皮细胞FHC，以0.25％胰酶消化、计数、接种于96孔培养板，每种细胞分6组，每组4个副孔，每孔加入100μL的细胞悬液，浓度为1×104个/ml，同时，将96孔细胞培养板四周加入100μL磷酸盐缓冲液(PBS)防止细胞培养液挥发，37℃，5％CO2培养箱，培养24小时使其贴壁。
(2)经PBS漂洗3次后，更换含不同浓度的gefitinib(0μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM)的培养基继续培养24小时(0μM浓度用等体积的二甲基亚砜DMSO代替)，弃培养液，PBS洗3次，均匀加入100μL CCK-8稀释液(CCK-8：培养基＝1:10)，置于37℃，5％CO2孵育2h后，应用酶联免疫检测仪，在450nm波长处测得相应OD值。
(3)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)。P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图20所示，细胞增殖CCK-8实验证实gefitinib能显著抑制HT29(KRas wt)生长，但不能抑制HCT116(KRas G13D)生长。
2.克隆形成实验证明KRas突变型细胞HCT116(KRas G13D)具有gefitinib耐药性
(1)将对数生长期的结肠癌细胞HT29(KRas wt)、HCT116(KRas G13D)和正常肠上皮细胞FHC经胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔500个细胞均匀接种于12孔板内，每种细胞分6组，每组3个副孔，37℃，5％CO2培养箱，培养24h使其贴壁。
(2)各组细胞经各自实验处理，即含不同浓度的gefitinib(0μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM)的培养基继续培养，每日观察细胞生长情况，每隔1-2天进行一次细胞换液，直至光镜下看到细胞克隆(50个以上细胞为一个克隆)时终止培养。
(3)各组弃上清后，PBS缓冲液洗涤两次，空气干燥；每孔加适量甲醇固定液进行细胞固定15min，用PBS液洗净孔内残余固定液，空气干燥；每孔加适量结晶紫染色液进行细胞染色15min；用PBS液洗净孔内残留染液，空气干燥，倒置显微镜下对各组复孔中所见细胞克隆进行计数并计算克隆数。
(4)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)，P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图21所示，克隆形成实验在细胞水平验证了gefitinib能显著抑制KRas野生型细胞HT29(KRas wt)的生长，对KRas突变型细胞HCT116(KRas G13D)的生长无显著作用。
3.体内成瘤实验证明KRas突变型细胞HCT116(KRas G13D)具有gefitinib耐药性
(1)本实验使用小鼠为Balb/c裸鼠，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心，实验小鼠分为2组，每组5只，分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和gefitinib组。
(2)使用胰酶消化处于对数期的HT29和HCT116细胞，使用完全培养液终止消化后进行细胞计数，经计数，分别取500万个HT29和HCT116细胞，并使用PBS洗涤两次，每次洗涤完成后均使用300g离心力离心5分钟，收集细胞。
(3)配置细胞稀释缓冲液重悬细胞，缓冲液成分为PBS:基质胶(康宁公司)＝1：1，随后分别使用1毫升缓冲液重悬HT29和HCT116细胞，置于冰上备用。
(4)进行皮下成瘤实验：对每只小鼠通过腹腔注射150μL三溴乙醇进行麻醉，随后分别在小鼠背部左右两侧皮下注射HT29和HCT116细胞悬液100μL(50万个)，其中HT29细胞位于左侧，HCT116细胞位于右侧。
(5)小鼠饲养一周后开始进行给药实验：给药方式为灌胃给药，其中PBS对照组注射PBS，gefitinib组注射gefitinib浓度为50mg/kg，给药体积均为150μL，给药频率为每三天固定时间给药一次，持续给药7次。
(6)给药结束后，对每只小鼠注射三溴乙醇150μL，随后脱颈处死，分别收取小鼠左右两侧肿瘤并进行称重统计肿瘤重量，实验结果如图22所示，与PBS对照组相比，gefitinib给药组能显著抑制KRas野生型(HT29)肠癌的生长，但对KRas突变型(HCT116)肠癌的生长无作用。
4.Gefitinib不能抑制KRas突变细胞中EGFR下游信号通路KRas/Raf/ERK/c-myc的激活。
(1)将结肠癌细胞HCT116(KRas G13D)和HT29(KRas wt)分别铺在六孔板中，每孔50万细胞，各分为两组，实验组中分别往培养孔中加入Gefitinib使终浓度依次为0μM和4μM(0浓度用等体积的二甲基亚砜DMSO代替)，每个孔加入DMEM完全培养液2000μL，混匀培养液，37℃培养处理细胞24小时，选用4μM浓度是因为该浓度下gefitinib不会对正常细胞产生毒副作用。
(2)PBS清洗细胞两次，每个孔加0.5mL 0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔1mL完全培养液终止消化，细胞悬液收集到1.5mL EP管中，300g转速常温离心3分钟，收集细胞并用1mL PBS重悬，重复离心1次。
(3)去除上清，每组加入裂解液100μL(货号：P0013G；购自碧云天生物技术公司)，冰上裂解，每5min涡旋震荡一次，裂解30min后，12000rpm 4℃离心30min，收集上清于新的1.5mL EP管中。
(4)使用BCA法测蛋白浓度，并各取每组20μg蛋白进行SDS变性凝胶电泳，转印并用5％脱脂牛奶封闭1小时后，分别按照1：2000比例稀释加入β-tublin(来源：Proteintech；货号:10094-1-AP)、ERK(来源：GST；货号:4695s)、pEKR(来源：GST；货号:8544S)、Raf(来源：GST；货号:53745s)、pRaf(来源：GST；货号:9427s)、c-myc(来源：GST；货号:9402s)一抗，4℃摇晃过夜，去抗体，用TBST洗膜3次，10min每次。用相应的HRP标记的鼠或兔二抗(来源：全式金公司；货号：HS101-01和HS201-01)1:3000稀释并室温摇晃孵育1h，TBST洗膜3遍，10min每次，ELC发光试剂盒暗室中发光显影，所有一抗浓度均为1:2000(1μg蛋白质稀释在2000μL一抗稀释液中)。
(5)结果如图23所示，gefitinib能够显著抑制KRas野生型细胞HT29中信号通路Raf/ERK/c-myc的激活，而不能抑制KRas突变型细胞HCT116中该信号通路的激活。
以上cck-8实验、克隆形成实验，小鼠体内实验和WB实验均证明KRas突变的肠癌细胞对gefitinib具有耐药性。
二、TKD诱导的KRas降解能够抑制EGFR下游KRas/Raf/ERK/c-myc信号通路的激活
(1)将结肠癌细胞HCT116、HT29分别铺在六孔板中，每孔50万细胞，各分为两组，实验组中分别往培养孔中分别加入TKD使终其浓度依次为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL(0浓度用等体积的PBS代替)，对照组中用TKDm代替TKD作相同处理，每个孔加入DMEM完全培养液2000μL，混匀培养液，37℃培养处理细胞24小时。
(2)PBS清洗细胞两次，每个孔加0.5mL0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔1mL完全培养液终止消化，细胞悬液收集到1.5mLEP管中，300g转速常温离心3分钟，收集细胞并用1mLPBS重悬，重复离心1次。
(3)去除上清，每组加入裂解液100μL(货号：P0013G；购自碧云天生物技术公司)。冰上裂解，每5min涡旋震荡一次，裂解30min后，12000rpm4℃离心30min。收集上清于新的1.5mLEP管中。
(4)使用BCA法测蛋白浓度，并各取每组20μg蛋白进行SDS变性凝胶电泳，转印并用5％脱脂牛奶封闭1小时后，分别按照1：2000比例稀释加入KRas(来源：Proteintech；货号:12063-1-AP)、β-tublin(来源：Proteintech；货号:10094-1-AP)、ERK(来源：GST；货号:4695s)、pEKR(来源：GST；货号:8544S)、Raf(来源：GST；货号:53745s)、pRaf(来源：GST；货号:9427s)、c-myc(来源：GST；货号:9402s)一抗，4℃摇晃过夜，去抗体，用TBST洗膜3次，10min每次，用相应的HRP标记的鼠或兔二抗(来源：全式金公司；货号：HS101-01和HS201-01)1:3000稀释并室温摇晃孵育1h，TBST洗膜3遍，10min每次，ELC发光试剂盒暗室中发光显影，所有一抗浓度均为1:2000(1μg蛋白质稀释在2000μL一抗稀释液中)。
(6)结果如图24所示，与对照组TKDm相比，TKD能够显著抑制KRas野生型细胞HT29和KRas突变型细胞HCT116中EGFR下游信号通路KRas/Raf/ERK/c-myc的激活。
三、TKD与gefitinib(吉非替尼)联合用药增强gefitinib的作用效果
1.cck-8实验证明TKD能够增强gefitinib的作用效果
(1)分别取对数生长期的结直肠癌细胞HCT116和HT29，以0.25％胰酶消化、计数、接种于96孔培养板，每种细胞分6组，每组4个副孔，每孔加入100μL的细胞悬液，浓度为1×104个/mL，同时，将96孔细胞培养板四周加入100μL磷酸盐缓冲液(PBS)防止细胞培养液挥发，37℃，5％CO2培养箱，培养24小时使其贴壁。
(2)经PBS漂洗3次后，分别加入含有TKD和TKDm(终浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，以及gefitinib的培养基继续培养24小时(0μM浓度用等体积的二甲基亚砜DMSO代替)，弃培养液，PBS洗3次，均匀加入100μL CCK-8稀释液(CCK-8：培养基＝1:10)，置于37℃，5％CO2孵育2h后，应用酶联免疫检测仪，在450nm波长处测得相应OD值。本次实验为较好验证TKD对恢复肠癌细胞gefitinib敏感性的效果，均使用了较低浓度的gefitinib处理，其中KRas野生型细胞HT29的处理浓度为2μM，KRas突变型细胞HCT116的处理浓度为4μM。
(3)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)，P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图25所示，细胞增殖CCK-8实验证实TKD和gefitinib联合使用能显著抑制HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)生长，且作用效果好于任何一种药物单独的作用效果。
2.克隆形成实验证明TKD能够增强gefitinib的作用效果
(1)将对数生长期的结肠癌细胞HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)经胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔500个细胞均匀接种于12孔板内，每种细胞分6组，每组3个副孔，37℃，5％CO2培养箱，培养24h使其贴壁。
(2)经PBS漂洗3次后，分别加入含有TKD和TKDm(终浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，以及gefitinib的培养基继续培养24小时(0μM浓度用等体积的二甲基亚砜DMSO代替)。每日观察细胞生长情况，每隔1-2天进行一次细胞换液。直至光镜下看到细胞克隆(50个以上细胞为一个克隆)时终止培养。本次实验为较好验证TKD对恢复肠癌细胞gefitinib敏感性的效果，均使用了较低浓度的gefitinib处理，其中KRas野生型细胞HT29的处理浓度为2μM，KRas突变型细胞HCT116的处理浓度为4μM。
(3)各组弃上清后，PBS缓冲液洗涤两次，空气干燥；每孔加适量甲醇固定液进行细胞固定15min，用PBS液洗净孔内残余固定液，空气干燥；每孔加适量结晶紫染色液进行细胞染色15min；用PBS液洗净孔内残留染液，空气干燥，倒置显微镜下对各组复孔中所见细胞克隆进行计数并计算克隆数。
(4)用GraphPad Prism8软件进行统计分析，多组均数比较用单因素方差分析(Oneway anova)，P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图26所示，克隆形成实验证实TKD和gefitinib联合使用能显著抑制HT29(KRas wt)和HCT116(KRas G13D)生长，且作用效果好于任何一种药物单独的作用效果。
3.体内成瘤实验证明TKD能够增强gefitinib的作用效果
(1)本实验使用小鼠为Balb/c裸鼠，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心，实验小鼠分为4组，每组5只，分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组，gefitinib组(25mg/kg)，TKD组(25mg/kg)，gefitinib(25mg/kg)和TKD(25mg/kg)联合用药组，为更好的展示TKD与gefitinib联合使用效果，本次实验均使用较低浓度TKD和gefitinib处理小鼠。
(2)使用胰酶消化处于对数期的HT29和HCT116细胞，使用完全培养液终止消化后进行细胞计数。经计数，分别取1000万个HT29和HCT116细胞，并使用PBS洗涤两次，每次洗涤完成后均使用300g离心力离心5分钟，收集细胞。
(3)配置细胞稀释缓冲液重悬细胞，缓冲液成分为PBS:基质胶(康宁公司)＝1：1。随后分别使用1毫升缓冲液重悬HT29和HCT116细胞，置于冰上备用。
(4)进行皮下成瘤实验：对每只小鼠通过腹腔注射150μL三溴乙醇进行麻醉，随后分别在小鼠背部左右两侧皮下注射HT29和HCT116细胞悬液100μL(50万个)，其中HT29细胞位于左侧，HCT116细胞位于右侧。
(5)小鼠饲养一周后开始进行给药实验：其中PBS和gefitinib给药方式为注射灌胃给药，TKD给药方式为腹腔注射给药，给药体积均为150μL。给药频率为每三天固定时间给药一次，持续给药7次。
(6)给药结束后，对每只小鼠注射三溴乙醇150μL，随后脱颈处死，分别收取小鼠左右两侧肿瘤并进行称重统计肿瘤重量，实验结果如图27所示，TKD和gefitinib联合给药组能显著抑制KRas野生型(HT29)和KRas突变型(HCT116)肠癌的生长，且抑制效果优于PBS对照组和两个药物单独使用组。
以上数据表明，TKD和gefitinib联合使用能够在细胞水平和动物水平显著抑制KRas野生型和突变型肠癌细胞的增殖，且作用效果能比两者单独使用时效果更好。尤其在gefitinib耐药的KRas突变细胞中，两者联合使用能够显著增强肠癌细胞对gefitinib的作用效果，因此证明TKD能够通过靶向降解KRas而使对EGFR靶向药耐药的癌细胞重新恢复敏感性，这将对扩大现有抗癌靶向药的使用范围产生重大意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120> 一种融合蛋白及其制备方法与应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Pro Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asn Leu Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Thr Thr Trp Ala Gly Gly Ile Pro Thr Asn Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg
115 120 125
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Lys Phe Glu Arg Gln Lys Ile Leu Asp Gln Arg Phe Phe Glu
1 5 10
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr
35 40 45
Tyr Pro Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
50 55 60
Val Ala Arg Ile Asn Leu Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
85 90 95
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Gly Gly Gly Ser Thr Thr Trp Ala Gly Gly Ile Pro Thr Asn Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg Lys
130 135 140
Phe Glu Arg Gln Lys Ile Leu Asp Gln Arg Phe Phe Glu
145 150 155
<210> 5
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr
35 40 45
Tyr Pro Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
50 55 60
Val Ala Arg Ile Asn Leu Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
85 90 95
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Gly Gly Gly Ser Thr Thr Trp Ala Gly Gly Ile Pro Thr Asn Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg Lys
130 135 140
Phe Glu Arg Ala Lys Ile Leu Asp Ala Arg Phe Phe Glu
145 150 155
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Lys Phe Glu Arg Ala Lys Ile Leu Asp Ala Arg Phe Phe Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185

Claims (10)

1.一种融合蛋白，包含：与KRas蛋白特异性结合的多肽、肿瘤细胞特异性穿膜肽以及溶酶体识别肽；
优选地，所述与KRas蛋白特异性结合的多肽为抗KRas蛋白纳米抗体；
优选地，所述抗KRas蛋白纳米抗体的氨基酸序列为：
a)DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSTYPTGWFRQAPGKEREFVARINLSGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGGGSTTWAGGIPTNFDYWGQGTQVTVSSGR(SEQ ID NO.1)；或
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述肿瘤细胞特异性穿膜肽为神经节苷脂结合肽；
优选地，所述神经节苷脂结合肽的氨基酸序列为：
a)RAGLQFPVGRLLRRLLR(SEQ ID NO.2)；或
b)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述溶酶体识别肽的氨基酸序列为：
a)KFERQKILDQRFFE(SEQ ID NO.3)；或
b)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
4.编码权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。
5.一种载体，包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，包含权利要求5所述的载体。
7.权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：培养权利要求6所述的宿主细胞，得到。
8.权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白在制备产品中的应用；
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)降解KRas蛋白的制剂；
(2)抗肿瘤的药物；
(3)提高KRas突变型肿瘤对肿瘤靶向药物的敏感性的药物。
9.一种药物，包含权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白及药学上可接受的辅料。
10.一种联合用药物，包含权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白和权利要求9所述的药物中的至少一种，以及肿瘤靶向药物。
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