CN101213454A - 用于癌症风险评估的膜联蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少一种膜联蛋白治疗癌症，特别是治疗泌尿生殖道和/或肠道癌症的用途，本发明还涉及诊断癌症，特别是诊断泌尿生殖道和/或肠道癌症的方法，和/或区别癌性和非癌性组织的方法。

Description

用于癌症风险评估的膜联蛋白
本发明涉及对癌症，特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症的治疗和/或诊断。
癌症是西方社会人类死亡最主要的原因，其通常与其诊断困难相关。
例如，前列腺癌是男性癌症死亡的最主要原因，但是其是难于诊断的异质性(heterogeneous)疾病。预测个体肿瘤的发展过程几乎是不可能的。目前，诊断用的前列腺癌标志物基本都基于前列腺癌特异性抗原(PSA)的不同亚型(isoform)，总体而言，在假阴性和假阳性方面都不令人满意(1-4)。近来，已提出了来自体液或前列腺组织的多种替代性分子标志物(5-11)。至少三个不同的前列腺癌亚类已被鉴定出来，它们似乎与肿瘤级别、复发率和转移相关(12)。仅仅是脂肪酸合酶单独就对前列腺癌定义了截然不同的分子标记(13)。然而，人们仍急切需要更精细、更可靠的治疗和诊断参数，用于根据病程发展风险来表征患者，以开发出新的合适的多模式(multimodel)治疗策略，用于改善个体癌症控制(14-16)。
有鉴于此，在第一个方面，已通过使用至少一种膜联蛋白(annexin)(优选地，膜联蛋白A3)来治疗癌症(特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症，优选前列腺癌)，解决了本发明所提出的问题。
此外，本发明包括至少一种膜联蛋白(优选地，膜联蛋白A3)用于制备治疗癌症(特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症，优选前列腺癌)的药物的用途。在优选的实施方式中，癌症治疗通过提高至少一种膜联蛋白的体内丰度来进行，特别是通过提高至少一种细胞外膜联蛋白的体内丰度来进行。
有鉴于此，在另一方面，通过下述方法解决了本发明提出的问题，所述方法用于诊断癌症，特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症，和/或用于区分癌性和非癌性组织，所述方法包括以下单独步骤：
-测定至少一种膜联蛋白的细胞内丰度，和/或
-测定至少一种膜联蛋白的细胞外丰度，
特别是使用尿样或其组分来进行。
在优选的实施方式中，本发明的方法包括以下单独步骤：
-测定至少一种膜联蛋白的细胞内丰度，和
-测定至少一种膜联蛋白的细胞外丰度，
特别是使用尿样或其组分来进行。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法包括以下单独步骤：
-测定至少一种膜联蛋白的细胞内丰度，和
-测定至少一种所述膜联蛋白的细胞外丰度，
特别是使用尿样或其组分来进行。
测定至少一种膜联蛋白的细胞内和细胞外丰度之后，可以确定细胞外丰度相对细胞内丰度的比例或者反过来的比例。优选地，确定细胞外丰度相对细胞内丰度的比例。获得的比例是针对癌症和/或用于区分癌性和非癌性组织的有利诊断参数。
根据本发明，术语“细胞外”应当被理解为包括细胞质膜的外表面在内的细胞外空间。
根据本发明，术语“非癌性组织”包括健康组织和发病组织，特别是良性前列腺增生、慢性前列腺炎、Crohn病、溃疡性结肠炎、易发炎组织和纤维化，特别是次级纤维化。
根据本发明，术语“丰度”应当被理解为蛋白质分别的细胞内和/或细胞外水平和浓度。
根据本发明，术语“膜联蛋白”和“蛋白”通常包含其亚型、突变体、截短版本和翻译后修饰形式。翻译后修饰形式尤其可以包括可通过蛋白水解加工获得的蛋白质性(proteinaceous)形式。
根据本发明，术语“治疗(treatment)”等同于“治疗法(therapy)”，由此包括治疗与癌症相关的问题。
在优选实施方式的情况下，膜联蛋白至少是由膜联蛋白A1、膜联蛋白A2、膜联蛋白A3、膜联蛋白A4、膜联蛋白A5、膜联蛋白A6、膜联蛋白A7、膜联蛋白A8和膜联蛋白A10构成的组的成员，并且其中，优选地，将至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种其它蛋白的丰度一起测定。关于所述其它蛋白，参考下文中的描述。
在另一实施方式中，将至少一种膜联蛋白的丰度与小分子或核酸标志物的丰度一起测定。
膜联蛋白是钙结合蛋白，其被认为能影响多种细胞内和细胞外功能，包括膜运输、淋巴细胞迁移、细胞能动性、钙流动和信号转导。它们高度丰富，带负电荷的膜脂的钙依赖型体积掩饰(bulk masking)可能对膜联蛋白的功能来说是重要的(17)。
在以前的蛋白质组学研究中比较了来自31名前列腺癌患者的良性和肿瘤组织之间的蛋白丰度差异，发明人将膜联蛋白A3鉴定为肿瘤中丰度差异更为多样化的，其可能代表着针对前列腺癌多种亚型的诊断标志物。膜联蛋白A3是膜联蛋白家族中相对少见的成员，其在所有31名患者中被平均上调了2.4倍(1.1和5.4倍之间，95％置信度；P＝0.045)。在聚类(cluster)研究暗示的22名患者的试验性子聚类中，膜联蛋白A3被平均上调了4.4倍(2.2和9.1倍之间，95％置信度；P＝0.008)，这暗示在某些类型的肿瘤中，膜联蛋白A3丰度可能涉及癌性表型。进一步的细节参见专利申请PCT/EP2005/001567，其整体并入本文。
有人报道，若干种膜联蛋白相关于前列腺癌被下调，包括膜联蛋白A1、膜联蛋白A2、膜联蛋白A4、膜联蛋白A7和膜联蛋白A10(6)。Alaiya et a.(18)还报道了恶性和良性前列腺组织之间的一些差异(膜联蛋白A3)值。近来，膜联蛋白A3已被证实在培养的肝细胞中对于DNA复制来说是必要的(19)，并且看起来在较之肝实质细胞具有更高的生长潜力和增殖速率的小肝细胞中表达更高(20)。发明人的结果暗示，通常为该家族稀有成员的膜联蛋白A3因此可能为某些患者的癌症治疗提供生物标志物或靶或治疗原则。
膜联蛋白是细胞质性的，但是也在细胞外被发现，虽然它们缺乏分泌引导序列。例如，Carlsson et al.(24)将膜联蛋白A3鉴定为男性不育中涉及的抗精子抗体的抗原。Oh et al.(25)发现，膜联蛋白A1暴露于实体肺部肿瘤邻近的上皮表面，在动物实验中，施予针对该蛋白的放射标记抗体导致肿瘤消退。事实上，膜联蛋白A5迁移到细胞表面与凋亡相关(26)，也称为Lipocortin1的膜联蛋白A1则作为抗炎性剂以高丰度从嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞释放到细胞外空间。事实上，膜联蛋白A1可能是糖皮质激素抗炎性作用的主要介体(27，28)。
还没有关于膜联蛋白分泌机制的报道将分泌(尤其是膜联蛋白A3的细胞排出，胞外体(exosome)途径)与对前列腺免疫监视(surveillance)的调控改变结合起来。胞外体是直径30至100nm的膜囊泡，它们在体外是由不同来源的活细胞产生并分泌的，并被认为涉及肿瘤抗原向抗原呈递细胞的转移，还涉及对特异免疫应答的刺激(21)。膜联蛋白家族成员，包括膜联蛋白A3和膜联蛋白A8，在胞外体中被普遍发现(21-23)。
Hegmann et al.(29)已假定，胞外体涉及不存在细胞坏死时热休克蛋白向细胞外环境的释放。胞外体的腔环境可能允许对提议的体内膜联蛋白钙离子通道来说必需的低pH值，由于与细胞存活不相容，这个观点已被争论过(17)。事实上，生理性膜联蛋白离子通道的被报道例子发生于造骨细胞骨形成中涉及的基质囊泡中，以及软骨细胞的终末分化和死亡中(30)，这是正常细胞存活的两种非典型情况。根据发明人，膜联蛋白离子通道可能涉及胞外体囊泡的渗透性破裂(与细胞质膜分泌性融合之前的多囊泡性囊泡中，或者细胞外)，由此调节肿瘤或其它组织的细胞外环境，例如，骨质疏松症的情况下的骨。
Bondanza et al.(31)近来报道，受辐射的肿瘤细胞被巨噬细胞高效吞噬，但是当细胞表面磷脂酰丝氨酸被膜联蛋白A5掩饰时，巨噬细胞途径减弱，并且强的CD8+树突状细胞依赖性免疫应答被激发。参照上文所述，膜联蛋白A1是抗炎性调节子，其能降低嗜中性粒细胞募集，由此减弱组织炎症。其结合嗜中性粒细胞和巨噬细胞上特异的细胞外ALX(脂氧素A)受体，由此能调节巨噬细胞的吞噬作用(27，28)。在组织内的作用位点，膜联蛋白A1及其N末端肽(Ac2-26)促进了凋亡嗜中性细胞的吞噬作用，由此降低了炎症水平以及通过抗炎细胞因子(例如TGF(转化生长因子)-β1)的免疫应答(28)，以及，由此，Th1(T-协助细胞1)和Th2(T-协助细胞2)T细胞的抗原诱导的T细胞增殖也被肽Ac2-26抑制(32)。膜联蛋白A3在肿瘤中的改变可能通过改变细胞外膜联蛋白池的性质和/或浓度，以及由此通过调节巨噬细胞/粒细胞主导的应答和/或体液应答之间的相互作用，而影响到对前列腺组织的免疫监视。
根据本发明的一种实施方式，将至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种另外的膜联蛋白(优选地，膜联蛋白A1、膜联蛋白A2、膜联蛋白A3、膜联蛋白A4、膜联蛋白A5、膜联蛋白A6、膜联蛋白A7、膜联蛋白A8和膜联蛋白A10构成的组的膜联蛋白)的丰度一起测定。
在本发明的又一种实施方式的情况下，将至少一种膜联蛋白的丰度与下述组的至少另一种蛋白的丰度一起测定，所述组由血清淀粉状蛋白P、异肽酶T、肌肉类型的脂肪酸结合蛋白、半乳糖凝集素1、热休克蛋白90、Bip(人类蛋白质：P11021-78kDa的葡萄糖调节蛋白前体，GRP78，免疫球蛋白重链结合蛋白，内质网腔Ca2+结合蛋白grp78)、蛋白质二硫键异构酶、表皮类型的脂肪酸结合蛋白、烯酰基辅酶A水合酶和核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)构成。
此外，可以将至少一种膜联蛋白的丰度与下述组的至少另一种蛋白的丰度一起测定，所述组由14-3-3家族、蛋白酶体(特别是前体和/或macropain)、活化因子亚基2、细胞角蛋白家族、KNP-Iα蛋白(NCBI编号BAA85554.1GI：7768772)和KNP-Iβ蛋白(NCBI编号BAA21139.1GI：2250701)构成。
在一些情况下，对于诊断而言传统肿瘤标志物的诊断价值是有局限的。例如，高或极低的血清前列腺抗原(PSA)值为前列腺癌提供了合理可靠的诊断参数。但是，在2至10ng/ml之间，尤其是4至10ng/ml，特别是2至6ng/ml之间的手术前PSA值在诊断可靠性的方面极端没用，特别是在预测放射性前列腺切除术后的术后治愈率方面。
因此，在本发明的一种特别优选的实施方式中，将至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种血液或血清标志物(特别是Kallikrein蛋白酶家族的至少一个成员，优选地，前列腺特异性抗原(PSA))的丰度一起测定。多种形式的PSA丰度，特别是总PSA(tPSA)的丰度、游离PSA(fPSA)的相对或绝对丰度和复合PSA(cPSA)的相对或绝对丰度可与膜联蛋白A3的丰度一起测定。Kallikrein蛋白酶家族的其它成员也可用于该方面，这也在实施方式的范围内。这些蛋白质相互之间的丰度也可用来与测量或计算得到的一种或多种膜联蛋白参数组合，用于本发明的诊断目的。可使用的膜联蛋白参数明显不局限于本文公开的以阐述方式使用的那些。
在又一种优选的实施方式的情况下，将至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种上皮细胞标志物(特别是前列腺特异性膜抗原(PSMA))一起测定。
根据本发明的一种尤其优选的实施方式，使用膜联蛋白A3和/或膜联蛋白A8，优选膜联蛋白A3。
根据本发明，待治疗和/或待诊断的癌症可来自泌尿生殖道和/或肠道。优选地，癌症选自前列腺癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、子宫癌或结肠癌构成的组。优选地，待诊断的癌症是前列腺癌和/或结肠癌。就前列腺癌而言，本发明的方法优选能够对前列腺癌组织样品、良性前列腺增生(BPH)组织样品、慢性前列腺炎组织样品、患纤维化的组织样品和健康的组织样品加以区分。
对于肠道癌症，特别是结肠癌，本发明的方法优选能够对癌症组织样品和受炎症性肠病，特别是受Crohns病和/或溃疡性结肠炎影响的组织样品加以区分。
根据本发明的又一种实施方式，有可能治疗和/或诊断癌症亚型。此外，可通过本发明治疗和/或诊断不同的癌症阶段。还可以通过本发明来监测非癌性组织向癌性组织的转化。
在本发明的又一种优选实施方式的情况下，在测定至少一种膜联蛋白的丰度之前，对排泄样品或其组分，尤其是尿液的，特别是exprimate尿进行分离工艺，以产生细胞沉淀团(pellet)和上清液。优选地，分离工艺通过离心进行，尤其是通过低速离心将细胞从液体培养基中分离(例如，200×g，5分钟，4℃)，这对于本领域专家来说是显而易见的。显然，任何合适的离心方案，包括在不同条件下连续离心，或者离心与其它方法的组合都可用于将可溶的或与胞外体结合的膜联蛋白与细胞内膜联蛋白分离，以用于测量。也可使用将可溶的或与胞外体结合的膜联蛋白与细胞内膜联蛋白分离的其它方法，或者其组合，这对于本领域专家来说是显而易见的(例如，磁珠、过滤、色谱等)。
根据本发明的又一种实施方式，细胞沉淀团被用来测定至少一种膜联蛋白(优选膜联蛋白A3)的细胞内丰度。
如上文中已提到的，膜联蛋白复杂地参与成骨细胞病(osteoblastosis)和骨质溶解。膜联蛋白被暗示涉及骨的矿物质化过程。这是值得注意的，因为前列腺癌的转移展示出高频率成骨细胞性骨损伤，这在癌症中并不常见。大多数癌症转移的特征在于破骨细胞的溶骨(骨溶解)活性，而前列腺转移则既展示出破骨细胞活性又展示出矿物质沉积性成骨活性。
生理矿物质化是高度复杂并且受调控的过程。骨矿物质化由被称为基质囊泡的小囊泡起始，所述囊泡是从正矿物质化的骨骼细胞的质膜释放的。最初的矿物化阶段在基质囊泡内形成。由于这些是膜封闭的，因此需要通道蛋白用于矿物质离子进入。膜联蛋白形成Ca2+进入基质囊泡的通道，使得磷酸钙矿物质化得以起始。一旦囊泡内晶体达到一定尺寸，它们就会使得膜破裂。这进而与炎症相关(炎症是癌症和膜联蛋白生物学的共同特征)，并且还涉及骨和免疫系统之间的相互影响。因此，根据一种特别优选的实施方式，本发明的方法可用于诊断和/或治疗骨质疏松症。在本发明方法的一种特别的实施方式中，尤其是通过本领域技术人员已知的方法，测定体液、身体分泌物、组织样品、细胞群或细胞中的膜联蛋白丰度，优选膜联蛋白A3和/或膜联蛋白A8的丰度，以诊断和/或治疗骨质疏松症。此类治疗可包括应用能影响膜联蛋白丰度、亚细胞/细胞外定位、翻译后修饰或活性的物质。在该方面，活性尤其包括离子通道活性，其可被适当增加或降低。可用于治疗骨质疏松症的物质明确包括膜联蛋白A3，其截短形式或突变体形式，或抗体或其它亲和试剂，特别是本领域已知的那些。所述物质还可包括核酸或化学相关物质，例如肽核酸(pNA)，其还可用小干扰RNA(siRNA)，特别是本领域已知的那些。
图3、图4和图5分别展示了对来自被诊断患有癌症、良性前列腺增生(BPH)或具有被诊断为与癌症无关的病症的对照患者的exprimate按摩得到的前列腺尿细胞沉淀团的蛋白质分析例子。图3至图5中每张图的上图展示了被膜联蛋白A3增强的蛋白质印迹化学发光(ECL)信号，下图展示了用Ponceau S染色的全部上样的蛋白质信号(“蛋白质”)。每块凝胶都含有分子量梯度标记(M)以及作为阳性对照(+C)的7.5μg总细胞蛋白裂解物(来自前列腺肿瘤，其中含有膜联蛋白A3)的双份重复。通过相对于重复的各阳性对照的平均值归一化，来对不同凝胶上来自样品的膜联蛋白A3信号加以比较。本发明人在初步研究中发现，癌症患者的exprimate尿样的沉淀团所具有的膜联蛋白A3比良性前列腺增生(BPH)患者或者健康对照患者都要少得多(图6)。例如，以PR-26CA中膜联蛋白A3信号(丰度)的量的0.2倍作为参考值，癌症患者中仅5/30(5∶25)份exprimate尿样超过了0.2倍这个参考值，而BPH患者的exprimate尿样中23/30(23∶7)，健康对照患者的exprimate尿样中18/30(18∶12)都超过了该参考值。这些结果显示，平均而言，较之来自BPH患者或健康对照患者的exprimate尿样而言，来自癌症患者的exprimate尿样的这些细胞沉淀团含有较少的膜联蛋白A3。
根据本发明的又一实施方式，来自对尿样(特别是exprimate尿样)及其组分进行的分离工艺的上清液被用于测定至少一种膜联蛋白(优选地，膜联蛋白A3)的细胞外丰度。
特别优选使用上清液用于诊断癌症(特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症)和/或用于区分癌性组织和非癌性组织。
在本发明的又一优选实施方式的情况下，在测定至少一种膜联蛋白(优选膜联蛋白A3)的丰度之前，向尿样或其组分中加入阳离子螯合剂，尤其是Ca2+-螯合剂，特别是EDTA和/或EGTA。在一种优选的实施方式中，在对样品或其组分进行分离工艺之前加入阳离子螯合剂。
优选地，对至少一种细胞外膜联蛋白(尤其是膜联蛋白A3)丰度的测定在经过阳离子螯合剂处理(特别是经EDTA和/或EGTA处理)的上清液中进行，并用于与缺乏阳离子螯合剂(特别是EDTA和/或EGTA)的上清液比较。优选地，从同样的尿样(特别是exprimate尿样)或其组分获得上清液。
前列腺癌发展期间，特别是膜联蛋白A3从细胞内向细胞外的转移受到不同影响，基于该理由，本发明包括下述测定：测定膜联蛋白A3的细胞内/细胞外定位是否有与癌症相关的任何不同。在本文上文中已提及，细胞外环境应当被理解为包括细胞质膜外表面在内的细胞外空间。临床前列腺按摩后获得的exprimate尿含有从前列腺流出的细胞。与胞外体中细胞外膜联蛋白A3的可能性一样，游离膜联蛋白A3能与带负电荷基团(例如细胞表面上的磷脂)以钙依赖性方式结合。可通过向培养基中添加EDTA/EGTA以螯合钙，将后一种膜联蛋白A3组分从细胞表面释放进上清液。
在双盲四中心研究中进行的进一步调查表明，沉淀团总膜联蛋白A3相对上清液的比例能诊断出非癌症患者组中标记为纤维化的病例。纤维化与良性过程相关，表明非癌症。对总共103个非癌症病例而言，关于“pu.anx.tot.ratio”，AUROC为0.7072。该比例的相关性为负，由此上清液中增加的总膜联蛋白A3的量对于分选进该组来说是关键的。这对于癌症病例来说也是合理的，上清液中减少的膜联蛋白A3被观察到(见下文)。
通过沉淀团/上清液中膜联蛋白A3的比例对非癌症患者(BPH、慢性前列腺炎、纤维化、PIN1-3)的进一步描述是本发明的一个重要方面，以在癌症对非癌症的诊断决定之外还随后进行依次的和/或多参数步骤的数据分析。
此外，发明人针对单独的、独立系列的患者测定了上清液和细胞沉淀团中的膜联蛋白3的丰度，并对exprimate尿样的细胞沉淀团和上清液中相对膜联蛋白A3丰度进行了比较。针对该不同患者群体，发明人再次发现，来自癌症患者的exprimate尿样沉淀团中的膜联蛋白A3的丰度要低于来自BPH患者或健康患者的exprimate尿样沉淀团中膜联蛋白A3的丰度。在上清液方面，在用EDTA处理过的癌症患者exprimate尿样上清液中，来自这些患者的膜联蛋白A3丰度比用EDTA处理过的BPH患者或健康患者的exprimate尿样上清液中的丰度要高。exprimate尿的细胞外(EDTA处理过的上清液)和细胞内(1000×g细胞团)组分的各比例给出了更加清晰的图象，如图7所示。总体考虑，这些数据表明了大约或低于10％的假阳性率，此外，上清液(膜联蛋白A3-S)对沉淀团(膜联蛋白A3-P)中膜联蛋白A3表达的比例使得能对癌症、VPH、对照加以区分，如表1所示：基本上，膜联蛋白A3-S在癌症和BPH中高，在对照中低，而膜联蛋白A3-P在BPH和对照中高，在癌症中低；由此癌症为高S(或S/P)低P；BPH为高S(或S/P)高P；对照为低S(S/P)和高P；各比例(S/P)较之沉淀团单独时给出了最为清楚的图象(图7)。对于蛋白丰度的额外校正进一步改善了图象。
根据本发明的又一实施方式，通过免疫组织化学方法，特别是使用组织样品，例如组织切片来测定至少一种膜联蛋白的丰度，优选地，膜联蛋白A3。
本发明还包括至少一种抗膜联蛋白抗体(特别是抗膜联蛋白A3抗体)用于诊断癌症(特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症)和/或用于区分癌性和非癌性组织的用途。在一种优选的实施方式中，用抗膜联蛋白抗体对组织样品(特别是组织切片)进行病理组织-诊断染色。可以通过活检或完全组织切割获得样品。特别地，在切除(protectomy)之后，从前列腺活检或前列腺组织获得待通过抗膜联蛋白抗体染色的组织样品。
获得含有针对膜联蛋白A3的抗体的多克隆兔血清，将其用于通过免疫组织化学在前列腺组织中对膜联蛋白A3加以定位。因为膜联蛋白家族有大量成员，发明人在免疫组织化学之前通过蛋白质印迹分析了抗膜联蛋白A3多克隆抗体的特异性。通过对前列腺良性和癌症组织细胞裂解物进行蛋白质印迹获得的信号的绝大部分都来自膜联蛋白A3(图1)。对于更高分子量的蛋白，观察到了信号的较小丰度，这被推定为膜联蛋白A6。在同样的条件下使用大约120ng重组的60kDA GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-膜联蛋白A3，该抗体产生了强且清楚的条带。基于来自活检的2D凝胶的放射活性值、来自活检和exprimate尿的1D和2D蛋白质染色以及1D和2D凝胶蛋白印迹，完全定量导致将exprimate尿样蛋白浓度检测限确定为0.02至＞15ng/ml的范围。该检测限略低于但接近0.01ng/ml。就蛋白质含量而言，范围为从0.001至超过0.3ng/μg总蛋白。
因此，该抗体在免疫组织化学里主要识别膜联蛋白A3是可能的，如图2所示，其中相对应的膜联蛋白A3信号在健康前列腺中局限于上皮细胞，但在肿瘤中还出现于癌性细胞。早期癌症中，间质细胞展示出了增强的染色。在前列腺癌和BPH组织中膜联蛋白A3存在差异的机制原理试验性地表明：较之对照而言，存在从更局部的、细胞内的总体较低的表达向细胞外的、总体较高的表达的转变。
膜联蛋白A3染色分布暗示了胞质和膜定位(图2)，虽然癌症病例中单个细胞中染色的总体水平看起来比良性组织的要低(图2)，但在同样的癌症组织中膜联蛋白A3的总体水平却更高(例如图1)，这可通过下述理由来解释：在癌性组织中存在更多的含有膜联蛋白A3的细胞，和/或在癌性组织中存在更多的细胞外膜联蛋白A3。
在广泛的研究(四中心、双盲)中，观察到：在患有癌症的患者的exprimate尿上清液中膜联蛋白A3水平降低，该研究考虑并首次测量了250名患者exprimate尿上清液和沉淀团中膜联蛋白总量，并且还对嗜中性粒细胞对膜联蛋白A3信号的可能贡献进行了定量(通过对嗜中性粒细胞标志物NGAL进行平行定量来实现)。总体而言，该结果表明，在具有纤维化/EPH的非癌症患者的exprimate尿中观察到了比癌症患者更高水平的膜联蛋白A3，但是，在非exprimate常规尿中，这些水平显著降低至可以忽略。因此，我们推断，在exprimate尿中测量的膜联蛋白A3主要来自前列腺，并且作为前列腺按摩过程的后果释放进尿。上文已显示：膜联蛋白A3主要在健康前列腺的导管上皮细胞中表达。为单独区分癌症和非癌症，本发明的数据表明，上清液中膜联蛋白A3的量具有最大诊断价值(对于初始PSA值在4-10之间的前列腺癌患者的exprimate尿的上清液中总的膜联蛋白A3以及每μg蛋白中的膜联蛋白A3的组合读数而言，AUROC值为0.78-0.82)。在更高NGAL值的情况下观察到了沉淀团-膜联蛋白A3的波动；由此对于沉淀团膜联蛋白A3而言相应的AUROC值在0.55至0.65的范围内)。
还已知，在患有癌症的前列腺中，仅一小部分上皮导管细胞是癌性的，因此，根据逻辑推理，测量得到的、细胞外膜联蛋白A3丰度的差异应当不显著。但是，在癌症患者的exprimate尿中，观察到了相对于非癌性患者而言相当大并且显著的平均膜联蛋白A3丰度降低。为何出现这种情况无法从原理上解释，因为根据直觉上的传统观点，非癌性上皮细胞应当持续分泌膜联蛋白A3。可能是，癌症的存在导致分泌反式作用物质(例如细胞因子)，所述反式作用物质影响膜联蛋白A3从具有癌性损伤的前列腺中的大量上皮细胞分泌。这种反式作用因子是来自癌性细胞本身还是来自其它细胞尚不清楚。有大量文献表明：反式作用因子影响癌性细胞及其间叶(mesenchymal)/间质环境，反之亦然。无论何种机制使然，这种经验性的观察虽不明确，但是却令人吃惊地清楚表明，exprimate尿中膜联蛋白A3的较低水平提供了针对患者前列腺中有肿瘤细胞的可能性的预测手段。exprimate尿中膜联蛋白A3水平的诊断用途可与其它诊断参数(例如前列腺特异性抗原(PSA))组合，如实施例所示。这些结果还表明，膜联蛋白A3蛋白的存在与健康表型相关。因此，可以通过提高细胞外膜联蛋白A3的水平，将膜联蛋白A3蛋白应用于治疗手段中，以治疗癌症。
观察到的结果的机制尚在研究中，它们可能反映了完全健康的前列腺上皮细胞向非癌性阶段(纤维化/BPH)的某种类型的转变，这与膜联蛋白A3在exprimate尿的沉淀团和上清液中升高的水平相关，总膜联蛋白A3的上述比例(p/s)具有最高诊断价值。在癌症中，与癌症患者exprimate尿上清液中膜联蛋白A3的量减少有着明显且令人吃惊的关系；沉淀团膜联蛋白A3的量看起来是有NGAL阳性白细胞/嗜中性粒细胞的污染贡献。
因此，最好测量沉淀团和上清液中的膜联蛋白A3水平。蛋白质水平上的这种信息并不能通过基因组的方法获得，例如，如美国专利申请US2003/0108963A1简单提及但并未证实的。
总而言之，膜联蛋白A3显示为-在健康组织中主要是细胞内染色，在早期癌性组织中为上皮外分布：而晚期癌症则显示为癌症细胞中膜联蛋白A3染色显著降低。
根据本发明的又一实施方式，从尿，特别是从exprimate尿(前列腺按摩之后回收的，特别是直肠手指插入后)中获得尿样或其组分。
在本发明的又一实施方式中，对尿样或其组分加以纯化，特别是使其不含嗜中性粒细胞、单核细胞或外周血单核细胞(PMBC)，尤其是通过磁珠来纯化。优选地，使用晨尿样品或其组分。
根据本发明的一种实施方式，在粪便或肠道上皮细胞中测量膜联蛋白水平。此外，膜联蛋白水平可用于在粪便的任何组分或制备物(任何可能是产生胞外体的上皮表面)中治疗和/或诊断胃肠道上皮癌症。膜联蛋白水平还可用于治疗和/或诊断结直肠癌症。根据一种优选的实施方式，本发明的方法可与对嗜中性粒细胞，特别是钙卫蛋白(calprotectin)和/或与嗜中性粒细胞白明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的测定组合，以区分炎症(Crohn病或溃疡性结肠炎)和癌症。
至少一种膜联蛋白，优选地，膜联蛋白A3和/或膜联蛋白A8，特别是膜联蛋白A3可用作本说明书公开的疾病的(特别而言，针对前列腺癌、结直肠癌和/或骨质疏松症，优选针对其亚型的)诊断标志物和/或治疗靶标，这也在本发明的范围内。
根据本发明，可对癌症，特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症加以治疗。这优选通过提高至少一种膜联蛋白(例如，至少一种细胞外膜联蛋白)的体内丰度来实现。
此外，本发明使得能对癌症，特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症进行诊断，和/或允许区分癌性和非癌性组织。这具体是通过分别测定膜联蛋白的细胞内外丰度比以及细胞外内丰度比来实现，如果合适的话，这可与其它蛋白质相应比例的测定组合。优选地，对癌症的诊断和/或对癌性和非癌性组织的区别基于至少一种膜联蛋白的细胞外丰度。测得的蛋白质比例和丰度分别揭示了癌性和非癌性组织之间的差异，由此允许对患者作出分析。因此，膜联蛋白，特别是膜联蛋白A3是可靠的诊断标志物，其甚至可以完全取代传统用于癌症诊断的肿瘤标志物。
为对本发明进行更为详细的描述，现在将参考附表和附图：
表1：
样品号     癌症40     BPH40     对照40    假阴性(120中的％)    假阳性(120中的％)
ANXA3-P(40中的％)生物标志物下生物标志物上 8416 2377 4060 6 13.3
ANXA3-S(40中的％)生物标志物下生物标志物上 595 2080 919
ANXA3-S/ANXA3-P之比以及分选癌症BPH 926 1280 36 1.5 7.5
对照     2     8     91
表1：对诊断结果的概括，癌症患者exprimate尿样沉淀团中膜联蛋白A3的丰度(膜联蛋白A3-P)低，而在BPH患者和健康患者exprimate尿样相应的沉淀团中则较高。对于exprimate尿样上清液中膜联蛋白A3的丰度(膜联蛋白A3-S)而言，存在不同的情况：对健康患者来说它们较低，而对于癌症和BPH患者来说则较高。组合起来的读数能以表的靠下部分所示的数量正确分选出三种情况。更多细节参见上文的详细说明。
表2
名称 说明
P_ug_tot 沉淀团：总蛋白质含量(μg)
U_ug_tot 上清液*：总蛋白质含量(μg)
P_ANX_ug 沉淀团：每μg蛋白的膜联蛋白信号水平
P_ANX_tot 沉淀团：每份患者总样品的膜联蛋白信号水平
U_ANX_ug 上清液：每μg蛋白的膜联蛋白信号水平
U_ANX_tot 上清液：每份患者总样品的膜联蛋白信号水平
PU_ANX_ug 沉淀团+上清液：每μg蛋白的膜联蛋白信号水平
PU_ANX_tot 沉淀团+上清液：每份患者总样品的膜联蛋白信号水平
PU_ANX_ug_ratio 沉淀团/上清液之比：每μg蛋白的膜联蛋白信号水平
PU_ANX_tot_ratio 沉淀团/上清液之比：每份患者总样品的膜联蛋白信号水平
P_NGAL_ug 沉淀团：每μg蛋白的NGAL信号水平
P_NGAL_tot 沉淀团：每份患者总样品的NGAL信号水平
U_NGAL_ug 上清液：每μg蛋白的NGAL信号水平
U_NGAL_tot 上清液：每份患者总样品的NGAL信号水平
PU_NGAL_ug 沉淀团+上清液：每μg蛋白的NGAL信号水平
PU_NGAL_tot 沉淀团+上清液：每份患者总样品的NGAL信号水平
PU_NGAL_ug_ratio 沉淀团/上清液之比：每μg蛋白的NGAL信号水平
PU_NGAL_tot_ratio 沉淀团/上清液之比：每份患者总样品的NGAL信号水平
P_ANX_NGAL_ug_ratio 沉淀团：每μg蛋白的膜联蛋白/NGAL之比
U_ANX_NGAL_ug_ratio 上清液：每μg蛋白的膜联蛋白/NGAL之比
PU_ANX_NGAL_ug_ratio 沉淀团+上清液：每μg蛋白的膜联蛋白/NGAL之比
(“U”＝“上清液”)
表2.从exprimate尿上清液和沉淀团组分测量的蛋白参数
表3：
变量 说明
P.ug.tot 沉淀团：总蛋白质量(μg)
U.ug.tot 上清液：总蛋白质量(μg)
P.ANX.ug 沉淀团：每μg蛋白的膜联蛋白水平
P.ANX.tot 沉淀团：每份总样品的膜联蛋白水平
U.ANX.ug 上清液：每μg蛋白的膜联蛋白水平
U.ANX.tot 上清液：每份总样品的膜联蛋白水平
PU.ANX.ug 上清液+沉淀团：每μg蛋白的膜联蛋白水平
PU.ANX.tot 上清液+沉淀团：每份总样品的膜联蛋白水平
PU.ANX.ug.ratio 沉淀团/上清液之比：每μg蛋白的膜联蛋白水平
PU.ANX.tot.Ratio 沉淀团/上清液之比：每份总样品的膜联蛋白水平
psa.ini 血液PSA水平
Perc.free.psa 百分比游离PSA
表3：对实施例4中所用缩写和变量的说明。
表4：
 试验  AUROC  患者
 anx.comb.var  0.78  112
 comb.var.anx.psa 1  0.76  112
 u.anx.tot  0.76  112
 pu.anx.tot  0.75  112
 u.anx.ug  0.74  112
 perc.free.psa  0.72  103
 psa.ini  O.57  109
表4：针对给出的变量参数的ROC曲线分析结果(描述见表3)，这是在根据4-10ng/mL之间的PSA值分组的患者上进行的。试验参数、得到的AUROC值以及每项分析包括的患者数被列为表格。
表5：
试验  AUROC  患者
 comb.var.anx.psa 2  0.79  109
 comb.var.anx.psa 1  0.77  109
 pu.anx.tot  0.73  109
 anx.comb.var  0.71  109
 u.anx.tot  0.71  109
 pu.anx.ug  0.71  109
 u.anx.  0.71  109
 p.anx.tot  0.69  109
 psa.ini  0.69  109
 perc.free.psa  0.69  109
表5：针对给出的变量参数的ROC曲线分析结果(描述见表3)，这是在根据2-6ng/mL之间的PSA值分组的患者上进行的。试验参数、得到的AUROC值以及每项分析包括的患者数被列为表格。
表6：
试验  AUROC  患者
 comb.var.anx.psa 1  0.75  226
 comb.var.anx.psa 2  0.73  244
 perc.free.psa  0.70  227
 psa.ini  0.68  239
 anx.comb.var  0.67  244
 pu.anx.tot  0.66  245
表6：针对给出的变量参数的ROC曲线分析结果(描述见表3)，这是在所有患者(包括所有PSA值)上进行的。试验参数、得到的AUROC值以及每项分析包括的患者数被列为表格。
表7：
判断标准     敏感性(95％c.I.)     特异性(95％C.I.)     +LR     -LR     +PV   -PV
  ＞＝-3.5155＞-3.5155＞-2.6907＞-2.5444＞-2.0663＞-1.9579＞-1.9096＞-1.6827＞-1.6673＞-1.5429＞-1.4419＞-1.3903＞-1.273＞-1.2619＞-1.1825＞-1.1791＞-1.0689＞-1.0621＞-1.0192＞-1.0041＞-0.9502＞-0.8458＞-0.8339＞-0.8285＞-0.8253＞-0.8237＞-0.8044＞-0.7935＞-0.7836＞-0.7431＞-0.7371＞-0.6841＞-0.6759     100.0(93.7-100.0)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)98.2(90.6-99.7)96.5(87.9-99.5)96.5(87.9-99.5)94.7(85.4-98.8)94.7(85.4-98.8)94.7(85.4-98.8)93.0(83.0-98.0)93.0(83.0-98.0)91.2(80.7-97.1)91.2(80.7-97.1)91.2(80.7-97.1)91.2(80.7-97.1)91.2(80.7-97.1)89.5(78.5-96.0)89.5(78.5-96.0)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)87.7(76.3-94.9)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)     0.0(0.0-6.9)0.0(0.0-6.9)1.9(0.3-10.3)3.8(0.6-13.2)5.8(1.3-16.0)7.7(2.2-18.6)9.6(3.2-21.0)11.5(4.4-23.5)13.5(5.6-25.8)13.5(5.6-25.8)15.4(6.9-28.1)15.4(6.9-28.1)17.3(8.3-30.3)19.2(9.6-32.5)19.2(9.6-32.5)21.2(11.1-14.7)21.2(11.1-34.7)23.1(12.5-36.8)25.0(14.0-38.9)26.9(15.6-41.0)28.8(17.1-43.1)28.8(17.1-43.1)30.8(18.7-45.1)30.8(18.7-45.1)32.7(20.3-47.1)34.6(22.0-49.1 )36.5(23.6-51.0)38.5(25.3-53.0)40.4(27.0-54.9)42.3(28.7-56.8)42.3(28.7-56.8)44.2(30.5-58.7)46.2(32.2-50.5)     1.000.981.001.021.041.061.091.111.141.121.141.121.151.171.151.181.161.191.221.251.281.261.291.271.301.341.381.431.471.521.491.541.60 0.910.460.300.230.180.150.130.260.230.340.300.270.360.330.410.380.350.330.300.360.340.400.380.350.340.320.300.290.330.320.30     52.351.952.352.853.353.854.454.955.455.055.655.155.756.255.856.455.956.557.157.858.458.058.658.158.859.560.261.061.762.562.062.863.6 0.050.066.775.080.083.385.787.577.880.072.775.076.971.473.368.770.672.273.775.071.472.769.670.872.073.174.175.075.973.374.275.0
    判断标准     敏感性(95％C.I.)     特异性(95％ C.I.)     +LR     -LR     +PV     -PV
    ＞-0.6297＞-0.6205＞-0.6095＞-0.5341＞-0.5077＞-0.503＞-0.4942＞-0.4548＞-0.4346＞-0.4211＞-0.3763＞-0.201＞-0.1764＞-0.1476＞-0.1049＞-0.0809＞-0.0773＞-0.0323＞-0.0007＞0.007＞0.0841＞0.085＞0.1274＞0.1395＞0.1475＞0.1672＞0.1764＞0.1803＞0.1808＞0.2017＞0.2682＞0.2761＞0.3249＞0.3445＞0.4091＞0.476＞0.4824＞0.4969＞0.5666＞0.6639＞0.683＞0.6877＞0.6934＞0.7038*＞0.7226＞0.8531＞0.8868     86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)86.0(74.2-93.7)84.2(72.1-92.5)82.5(70.1-91.2)80.7(68.1-89.9)78.9(66.1-88.6)78.9(66.1-88.6)78.9(66.1-88.6)78.9(66.1-88.6)77.2(64.2-87.2)75.4(62.2-85.9)75.4(62.2-85.9)73.7(60.3-84.5)71.9(58.5-83.0)71.9(58.5-83.0)70.2(56.6-81.6)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)68.4(54.8-80.1)66.7(52.9-78.6 )64.9(51.1-77.1)63.2(49.3-75.5)63.2(49.3-75.5)61.4(47.6-74.0)59.6(45.8-72.4)57.9(44.1-70.9)57.9(44.1-70.9)57.9(44.1-70.9)57.9(44.1-70.9)57.9(44.1-70.9)57.9(44.1-70.9)56.1(42.4-69.3)56.1(42.4-69.3)54.4(40.7-67.6)54.4(40.7-67.6)52.6(39.0-66.0)50.9(37.3- 64.4)49.1(35.6-62.7)     48.1(34.0-62.4)50.0(35.8-64.2)51.9(37.6-66.0)53.8(39.5-67.8)55.8(41.3-69.5)57.7(43.2-71.3)59.6(45.1-73.0)59.6(45.1-73.0)59.6(45.1-73.0)59.6(45.1-73.0)59.6(45.1-73.0)61.5(47.0-74.7)63.5(49.0-76.4)65.4(50.9-78.0)65.4(50.9-78.0)65.4(50.9-78.0)67.3(52.9-79.7)67.3(52.9-79.7)67.3(52.9-79.7)69.2(54.9-81.3)69.2(54.9-81.3)69.2(54.9-81.3)71.2(56.9-82.9)73.1(59.0-84.4)75.0(61.1-86.0)76.9(63.2-87.5)78.8(65.3-88.9)80.8(67.5-90.4)80.8(67.5-90.4)80.8(67.5-90.4)80.8(67.5-90.4)82.7(69.7-91.7)82.7(69.7-91.7)82.7(69.7-91.7)82.7(69.7-91.7)84.6(71.9-93.1)86.5(74.2-94.4)88.5(76.5-95.6)90.4(79.0-56.8)92.3(81.4-57.8)92.3(81.4-97.8)94.2(84.0-98.7)94.2(84.0-98.7)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)     1.661.721.791.861.942.032.132.092.042.001.952.052.162.282.232.182.112.252.202.342.282.222.372.542.742.963.233.563.473.383.283.653.553.453.353.764.305.026.027.537.309.739.4314.1413.6813.2312.77     0.290.280.270.260.250.240.240.260.290.320.350.340.330.320.350.380.360.390.420.410.430.460.440.430.420.410.400.390.410.430.460.450.470.490.510.500.490.480.470.460.480.470.480.470.490.510.53     64.565.366.267.168.169.070.069.669.168.768.269.270.371.471.070.571.771.270.771.971.470.972.273.675.076.578.079.679.278.778.380.079.579.178.680.582.584.686.889.288.991.491.293.993.893.593.3     75.876.577.177.878.478.979.577.575.673.872.172.773.373.972.370.871.470.068.669.267.966.767.367.968.469.069.570.068.967.766.767.266.265.264.264.765.265.766.266.765.866.265.365.864.964.163.3
    判断标准     敏感性(95％ C.I.)     特异性(95％ C.I.)     +LR     -LR     +PV   -PV
    ＞0.9511＞0.9527＞1.0734＞1.116＞1.1278＞1.1707＞1.1763＞1.2415＞1.267＞1.3195＞1.3976＞1.4368＞1.4579＞1.4781＞1.6158＞1.6423＞1.6559＞1.7477＞1.7524＞1.7628＞1.8054＞1.8153＞1.8787＞2.1994＞2.4311＞2.472＞2.5544＞2.5595＞2.8088＞3.6467     47.4(34.0-61.0)45.6(3.4-59.3)43.9(30.-57.6)42.1(29.1-55.9)40.4(27.6-54.2)38.6(26.0-52.4)36.8(24.5-50.7)35.1(22.9-48.9)33.3(21.4-47.1)31.6(19.9-45.2)29.8(18.4-43.4)28.1(17.0-41.5)26.3(15.5-39.7)24.6(14.1-37.8)22.8(12.8-35.8)21.1(11.4-33.9)19.3(10.1-31.9)17.5(8.8-29.9)17.5(8.8-29.9)17.5(8.8-29.9)15.8(7.5-27.9)14.0(6.3-25.8)12.3(5.1-23.7)10.5(4.0-21.5 )8.8(2.9-19.3)7.0(2.0-17.0)5.3(1.2-14.6)3.5(0.5-12.1)1.8(0.3-9.4)0.0(0.0-6.3)     96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)96.2(86.8-99.4)98.1(89.7-99.7)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)100.0(93.1-100.0)     12.3211.8611.4010.9510.4910.049.589.128.678.217.757.306.846.395.935.475.024.569.12     0.550.570.580.600.620.640.660.680.690.710.730.750.770.780.800.820.840.860.840.820.840.860.880.890.910.930.950.960.981.00     93.192.992.692.392.091.791.390.990.590.089.588.988.287.586.785.784.683.390.9100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0   62.561.761.060.259.558.858.157.556.856.255.654.954.353.853.252.652.151.552.052.552.051.551.050.550.049.549.148.648.147.7
Sens.＝敏感性
Spec.＝敏感性特异性
+LR＝阳性似然比例
-LR＝阴性似然比例
+PV＝阳性预测(predictive)值
-PV＝阴性预测值
表7：对应于图9的ROC曲线的数据。表8和9描述了最大似然估值模型。
表8：
参数  DF 估计  误差(标准) 卡方(Wald)  Pr＞ChiSq
截距  1 -2.3860  1.7461  1.8673  0.1718
Log  PUANX tot  1 -0.4747  0.1394  11.5908  0.0007
Log PSAini  1 3.2942  1.0198  10.4343  0.0012
表8：针对logit模型的简明(condensed)SAS输出，其产生了comb.var.anx.psa2：对最大似然估计的分析。
表9：
影响  估计(点)  置信度 极限
log PU ANX tot  0.622  0.473 0.818
log PSA ini  26.956  3.652 198.934
表9：针对logit模型的简明SAS输出，其产生了comb.var.anx.psa2：优势比估计。
图1：通过蛋白质印迹对抗膜联蛋白A3兔多克隆抗血清的分析。(A)1-D SDS凝胶的蛋白质印迹。泳道1：Magic Mark(Invitrogen)分子量标记，每泳道3μg，其给出了120、100、80、60、50、40、30和20kDa的质量。重复的泳道含有从患者29的癌症(泳道2-4)和良性(泳道5-7)前列腺提取的15μg全组织蛋白。使用抗膜联蛋白3多克隆血清(1∶20,000)孵育滤器。泳道1-7展示出来自整个滤器的信号的假彩色图像。框中的插入部分(泳道1’和2’)展示了泳道1和2的单色图案。示出了膜联蛋白A3以及接着的膜联蛋白A6条带的位置。(B)对来自患者29的癌症样品的蛋白质100μg提取物进行的2D-PAGE蛋白质印迹以假彩色显示了与多克隆血清具有交叉反应性的蛋白质分布。通过MALDI-TOF PMF验证了三个最强(红色)的膜联蛋白A3点的身份(数据未示出)，其中最强的对应于我们蛋白质组分析中检测到的蛋白质点。
图2：
对膜联蛋白3的免疫组织化学分析：在A)良性前列腺组织的上皮细胞中发现了抗膜联蛋白A3多克隆血清(1∶100稀释)的膜联蛋白A3免疫反应性。在B)cribbriform前列腺上皮内肿瘤(PIN)和C)癌症组织中，对上皮细胞和癌细胞加以染色。还观察到了升高水平的扩散的上皮外定位。棕色表示膜联蛋白A3特异性过氧化物酶染色。蓝色代表用Gill苏木精溶液(Sigma)进行的组织复染。
图3：
对从癌症患者前列腺按摩之后获得的尿的exprimate沉淀团中的膜联蛋白A3的蛋白质印迹定量。上图展示了印迹蛋白质的化学发光膜联蛋白A3信号。下图展示了用Ponceau S(“蛋白质”)染色的上样蛋白质。每块凝胶都含有分子量梯度标记以及作为阳性对照的双份7.5μg总细胞蛋白裂解物(来自前列腺肿瘤，其中含有膜联蛋白A3)(+C)。
图4：
对BPH患者前列腺按摩之后获得的尿的exprimate沉淀团中的膜联蛋白A3的蛋白质印迹定量。其它细节遵循图3。
图5：
对非癌症对照患者前列腺按摩之后获得的尿的exprimate沉淀团中的膜联蛋白A3的蛋白质印迹定量。其它细节遵循图3。
图6：
如图3至图5所示的、来自前列腺按摩后患者尿的细胞沉淀团的标准化膜联蛋白A3信号。来自不同凝胶的膜联蛋白A3值被标准化为7.5μg总细胞蛋白裂解物(来自前列腺肿瘤，PR-26CA，含有膜联蛋白A3，作为图3至图5中每一幅的阳性对照)的任意单位。
图7：
前列腺按摩后(另外的患者材料，不包含在图6中)，患者exprimate尿样的经EDTA处理后的上清液和细胞沉淀团的膜联蛋白A3含量之比，a.u.是任意单位。
图8：
ROC曲线-两步程序1：
″Use U_ANX_tot if 2.5≤PSA_ini≤12，most obvious decision otherwise”
图例：
变量(VARIABLE)＝IF(PSA_ini＜2.5；100000；IF(PSA_ini＜＝12；u_anx_tot；0))
twostepvar1
分类变量(CLASSIFICATION VARIABLE)：PCa
阳性组：PCa＝1
样本大小＝137
阴性组：PCa＝0
样本大小＝101
发病率(％)＝57.6
ROC曲线下的面积＝0.740
标准差＝0.033
95％置信区间＝0.679至0.794
P(面积＝0.5)＜0.0001
图9：
ROC曲线-T comb.var anx.psa2：
≡-2.386+3.294 log(1+PSA_ini)-0.475log(1+PU_ANX tot)
图例：
选择：AND(PSA_ini＞＝2；PSA_ini＜＝6)
分类变量PCa
阳性组：PCa＝1，样本大小＝57
阴性组：PCa＝0，样本大小＝52
发病率(％)＝52.3
ROC曲线下面积＝0.791
标准差＝0.043
95％置信区间0.703至0.863
P(面积＝0.5)＜0.0001
实施例
虽然将参照实施例对本发明进行更详细的描述，但是本发明并不会以任何方式受限于这些实施例。
实施例1
对前列腺按摩后的尿进行处理：
在对血液前列腺特异性抗原(PSA)丰度的筛选显示了升高的癌症风险后，从经历临床检查的患者获得前列腺按摩exprimate尿。将通过直肠手指插入进行剧烈前列腺按摩之后获得的47ml尿加入预先冷却至0℃的3ml 0.5M EDTA，pH8，立即冷却至0℃。如果尿体积小于47ml，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液补足体积。在0℃，于3000rpm下对冷却的样品进行30分钟离心，以产生细胞沉淀团。移出1ml上清液小份试样，冷冻于液氮中，贮藏于-80℃直到使用。将细胞沉淀团温和地重悬于2ml冰冷的PBS中，转移至冰上的Eppendorf管，接着于4℃在12000rpm离心5分钟。移出上清液，沉淀被冷冻于液氮中，贮藏于-80℃直到使用。
实施例2：
蛋白质印迹分析：
按照厂商说明书，使用BioRad-Mini凝胶装置和带有1mm间隔和15个孔的12％T聚丙烯酰胺凝胶，来制备用于蛋白质印迹分析的SDS-PAGE凝胶。抗膜联蛋白A3(膜联蛋白A3)与下文所述的抗体相同。1∶20,000稀释。重组GST-膜联蛋白A3购自Abnova Corporation(#ABV0040710002；Lot：T04G01-ANNEXINA3，0.05μg/μl，61kDa)。使用ECL检测方法(Peerce)和基于DIANA III CCD照相机的化学发光检测器(Raytest，Straubenhardt，德国)，用山羊抗兔IgG(Sigma A 3937，lot#121K9151)来观察抗体结合。针对通过重组细菌表达的膜联蛋白A3的兔多克隆血清展示出了对于膜联蛋白A3的主要特异性，以及针对膜联蛋白A6的一些交叉反应性。
实施例3：
免疫组织化学：
按照标准的马辣根过氧化物酶免疫组织化学方案，使用ZymedPicTure PLUS试剂盒(Broad Spectrum，DAB，Zymed，South SanFransisco，CA)，使用多克隆抗膜联蛋白A3血清，用5μm石蜡组织切片来进行免疫组织化学分析。在免疫染色后，用Gill苏木精溶液(Sigma)进行复染。
实施例：使用250名患者的exprimate尿进行临床研究
在针对存在前列腺癌(PCa)被诊断为阳性或阴性的临床患者exprimate尿中测定膜联蛋白A3水平。检测多种额外参数，例如血液中的前列腺特异性抗原(PSA)水平以及下文列出的其它变量。
按照实施例1所述来收集样品，但是不向尿中加入EDTA。在前列腺按摩后，收集全部exprimate尿体积并进行记录。立即在尿的小份试样上进行Combur-10-Test(Roche Diagnostics Cat.No.11 203 479)，以记录比重、pH、白细胞数和亚硝酸盐、蛋白质、葡萄糖、酮、尿胆素原(urobilinogen)、胆红素和红细胞的水平。然后在室温下以1000×g对尿进行15分钟离心。分开操作该上清液的细胞沉淀团和上清液。在去除最后的痕量上清液后，将沉淀团重新悬浮于1ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水，冷冻于液氮中或者冰冻CO2上。2×1.8ml的单独小份试样和大至2×50ml的上清液被类似地冷冻。
解冻冷冻的蛋白样品，加入1/100体积的2％脱氧胆酸盐，接着进行震荡，然后加入1/10体积的三氯乙酸，震荡，在0℃孵育10分钟。这之后是在4℃于10000×g离心15分钟以沉淀蛋白质。取出上清液，通过剧烈震荡沉淀团，用冰冷的80％丙酮对沉淀团进行三次洗涤，以完全除去残余的TCA，在每次洗涤后之后是按照前文所述于10000×g重新离心。最后一次离心之后，取出上清液，令沉淀团空气干燥2分钟，注意不要使得沉淀团完全脱水。将沉淀团重新悬浮于煮沸的XT样品缓冲液(1×XT-缓冲液：141mM Tris-Base；106mM Tris-HCl；2％SDS；BPB；pH大约8.5；50mM DTT；35％甘油)中。
按照厂商说明书，通过将给定体积的每种样品上样至一维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶(Criterion XT-precast凝胶：BioradCat#345-0119，lot#CX070706B2)(其含有校正量的来自全肝细胞裂解物的大鼠蛋白质的一系列稀释液)，以及在BioRad Criterion电泳设备上进行电泳，来估计每份样品的蛋白浓度。根据厂商说明书，使用SyproRuby对凝胶进行染色。简言之，在含有50％甲醇、7％乙酸的水性溶液中对凝胶固定2×30分钟，接着在Sypro Ruby溶液(Molecular Probes，#S12001)中染色过夜。在10％甲醇、7％乙酸中对凝胶洗30分钟，然后再在水中洗2×5分钟。用基于Diana III CCD的数字成像仪(RaytestIsotopenmessgerte GmbH，Streaubenhard，德国：Sypro Filter，605nm)对用Sypro Ruby染色蛋白质进行定量。
在标准蛋白质和患者尿样之间比较Sypro Ruby染色的凝胶泳道的蛋白质染色强度。对于上清液而言，使用整条泳道来进行测定。对于尿沉淀团样品而言，仅考虑主要的尿调素(uromodulin)条带下的泳道面积，产生“经尿调素校正的蛋白浓度”。
通过将标准化的蛋白量上样至上文描述过的SDS-PAGE凝胶，来定量膜联蛋白A3和嗜中性粒细胞白明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL，SWISSPROT编号P80188，嗜中性粒细胞标志物)的水平，由此每块凝胶含有三条重复的2μg经标准化的蛋白质提取物(来自PC3人前列腺癌细胞系)泳道，其含有方便的参考量的膜联蛋白A3和NGAL。按照标准方法，将来自这些凝胶的蛋白质转印到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，在15V恒定电压和3mA/cm2的限度下运行1.5小时。
通过在含有5％重新溶解的干燥奶粉的TBS(175mM NaCl、3.5mMKCl、20mM Tris，pH7.4)中轻柔振荡下孵育2小时，封闭转印膜上非特异性蛋白结合位点。加入特异于膜联蛋白A3(1∶20000稀释，多克隆兔抗人膜联蛋白A3)或NGAL(1∶500稀释，抗人Lipocalin，多克隆的，来自山羊，R&D Systems，Nr.AF1757，lot JBH025051)的一抗。在室温下温育2小时后，移除缓冲液，用TBS洗三次，每次10分钟，然后与合适的针对兔IgG(山羊抗兔IgG，用人IgG和小鼠IgG预吸收过，与马辣根过氧化物酶偶联。Santa Cruz，#sc-2054，lot#G2005.1∶5000稀释)或山羊IgG(抗山羊IgG，来自兔，用人IgG和小鼠IgG预吸收过，与马辣根过氧化物酶偶联。Santa Cruz，#sc-2922，lot#C1405.1∶5000稀释)的各自的二抗孵育。在加入Super Signal West Dura，Pierce(0.1ml/cm2)后测量增强的化学发光(ECL)。
将NGAL或膜联蛋白A3信号的值标准化至每块凝胶上的三条参考PC3泳道中的每一条的平均信号，将经标准化的膜联蛋白A3或NGAL值进行统计分析。从这些值计算相对于绝对样品体积而言的两种蛋白水平，并标准化至蛋白浓度。分别针对沉淀团和上清液计算这些值，以及针对沉淀团/上清液之比来计算。表2概括了与癌症相关并且与PSA值相比较的参数。
在标准的直肠指检(digital rectal examination，DRE)期间，记录的临床参数包括血液PSA值、游离的总PSA水平以及复合PSA水平以及对前列腺组织活检的组织学评估，这些是在取得exprimate尿之后获得的。在高水平的血清PSA和DRE表明了前列腺切除术的必要性的情况下，在该材料上进行组织学评估，而无须生物活检。
上述数据参数被包括于统计学分析中，该分析还包括医院记录的临床数据。从所有患者获得前列腺活检或前列腺切除物，临床医师基于对所述组织的组织学检查进行PCa阳性或阴性的诊断。血液PSA水平也是根据标准临床操作获得的。美国食品与药品管理局(FDA)已批准将PSA试验用于在年龄50岁及以上的男性中进行的前列腺癌筛查。4至10ng/mL(纳克每毫升)之间的PSA水平被认为是可疑的，应当之后进行直肠超声显像，并且，如果有所指示的话，进行活检。PSA在假阳性和假阴性方面都是易错的。在具有4.0ng/mL或更少的PSA水平的男性中通过活检发现前列腺癌(包括高级别的癌症)的现象并不少见，尽管这样的PSA水平通常被认为在正常范围内。
数据组由来自250名患者的组合数据文件构成。最初的PSA值在250患者的243名中都是可获得的，但7名患者缺少该数据。此外，这7名患者中的2名以及另外5名患者缺少活检组织学结果(是否为前列腺癌症)。因此，本文给出的所有结果仅使用了PCa状态已知的243名患者的数据：140名患者具有阳性PCa诊断，而103名具有阴性PCa诊断。在图8和9中，使用针对所有ROC曲线而非PSA的相反数(inversevalue)给出了使用临床结果产生的接收者工作特征(ROC)曲线，即，观察到ROC曲线下的面积与癌症患者中较高的PSA值相关，并且与针对癌症患者测量的较低的平均膜联蛋白A3信号相关。
针对PSA的ROC曲线下面积(AUROC)为0.684，这与0.5的AUROC显著不同，但是人为地略高是由于进入诊所的患者招募所致(对于本领域每位专家来说这是已知的)。但是我们确实注意到，我们的患者群体具有不寻常高比例的癌症患者(57％)，因为一些患者是在其它中心提供了高PSA读数后被我们的试验诊所检查的。针对测量的基于个体膜联蛋白A3的变量的AUROC值在同样的范围内(最大为PU_ANX-tot，AUROC 0.666；数据未示出)，并且也显著不同于0.5。因此，考虑到PSA值的整个范围，还可使用膜联蛋白A3完全代替PSA，因为在PSA的关键的灰色区域(2-6ng/ml和4-10ng/ml)，膜联蛋白3具有相当大的优势(见表4-6中的ROC曲线0.78和0.791)，在可接受的敏感性下具有高特异性，并且展示出相似的总体表现。
在我们的患者选择中没有针对膜联蛋白A3的预选择，在膜联蛋白A3值和PSA值之间也没有关联，这表明膜联蛋白A3表达/分泌和PSA进入血流是通过不同的机制调控的。我们没有观察到PSA或膜联蛋白A3水平与患者年龄之间的联系。我们推测，可能是高比例的癌症阳性患者(其中一些是基于在其它中心测量到的可疑的高PSA值而被预选出来的)扰乱了随着年龄增加而预计的更高PSA水平丰度。但是，因为膜联蛋白A3没有被预选过，因此我们推断，其水平可能并非年龄相关的。
我们对最初PSA值在2ng/mL至6ng/mL区间内的患者亚群体的统计分析投入了特别的关注。针对测量到的个体参数的所有七个AUROC值与0.5显著不同，虽然仅有57名PCa患者和52名非PCa患者达到了定义该亚群的PSA判断标准。与总体结果相反，PSA_ini的AUROC不再是最大的一个，而是低于基于膜联蛋白A3变量的六个AUROC值中的五个(P_ANX_ug是唯一例外)。最高的AUROC值，0.735是PU_ANX_tot获得的。
除了2ng/mL-6ng/mL的PSA范围之外，2.5mg/mL-12ng/mL也是被特别关注的：在该亚群中，PSA_ini自身表现很差(AUROC 0.580)，而U_ANX-tot表现最好(AUROC 0.693)。因此，该PSA范围看起来适于评估下述两步程序(通过方法性阐述示出)的特征：
在第一步中，根据其最初的PSA值将患者分入三组之一：
PSA_ini＜2.5->低PCa风险，
PSA_ini＞12->高PCa风险，
PSA_ini在[2.5，12]->应用基于U_ANX_tot的试验作为第二步，确定是否要进行侵入性诊断程序。
(在图8的标题中前两种情况被称为“最明显的决定”)。
然后通过下述定义，将该两步程序包括进单个变量，此处称为twostepvarl
twostepvarl : = 100000 , if PSA _ ini < 2.5 U _ ANX _ tot , if PSA _ ini &Element; [ 2.5,12 ] 0 , if PSA _ ini > 12 .
低的U_ANX_tot值表明前列腺癌风险增加，而高的该值表明较低的风险。100000这个值被选用来确保其应当始终高于实际测得的最大U_ANX_tot值。在图8中可以看到twostepvarl的表现。(针对低于2.5和超过12的PSA_ini值，恒定的twostepvarl使得ROC曲线以可注意到的直线片断开始和结束)。0.740的AUROC当然与0.5非常不同。此外，强调了与传统PSA试验的比较：例如，“PSA_ini＞4”的判断标准在该分析数据组中导致80.3％的敏感性以及49.5％的特异性。而使用“twostepvarl＜450”的判断标准获得了同样的敏感性-80.3％，但是却获得的了57.4％的特异性。
图8的例子证实了分步AUROC值的原理，其依赖于取决于PSA水平的不同的测量(PSA或膜联蛋白A3值)。对专家而言显而易见的是：这些原理与表4-6中列出的若干结果中所用的相同，并提供了更高的AUROC值。通过对具有中间PSA值的患者考虑基于膜联蛋白A3的多个变量，进一步证实了膜联蛋白A3变量在具有中间水平的血清PSA的患者中预测癌症的优秀表现。
根据上面阐述的方法和策略，对表3-6中展示的参数进行ROC曲线分析。
除了这些变量之外，使用通过逻辑回归分析产生的下述参数进行ROC曲线分析。
anx.comb.var基于按照下述关系用组合的U_ANX_ug和U_ANX_tot作为变量进行的逻辑回归分析。
≡4.463+2.906log(1+U_ANX_ug)-0.790log(1+U_ANX_tot)
comb.var.anx.psal基于按照下述关系用组合的PSA_ini和U_ANX0_tot作为变量进行的逻辑回归分析。
≡0.254+1.046log(1+PSA_ini)-0.342log(1+PU_ANX_tot)
comb.var.anx.psa2基于按照下述关系用组合的PSA_ini和PU_ANX_tot作为变量进行的逻辑回归分析。
≡-2.386+3.294log(1+PSA_ini)-0.475log(1+PU_ANX_tot)
虽然极高或极低的PSA值提供了对癌症/非癌症状况相对可靠的的判定，但是表4-6的结果清楚表明，基于膜联蛋白A3的参数的多种组合在用于PSA的中间值时要比PSA表现更好。因此，对exprimate尿上清液或沉淀团中膜联蛋白A3水平(包括上清液与沉淀团之比)的测量提供了改善的诊断可靠性。
为证实这些结果的用途，在图9和表7中详细展示了针对comb.var.anx.psa2的ROC曲线。该ROC曲线仅基于具有2ng/mL至6ng/mL之间的PSA值的患者，并且给出了非常显著的AUROC值-0.791，尽管只使用了该范围中的109名患者用于研究。此外，该ROC曲线展示出敏感性(真阳性部分)相对特异性(真阴性部分)的非常陡峭的上升，这对于预测值来说相当有利。例如，在54％的敏感性水平时，特异性为96％(图9，表7)。针对anx.comb.var的ROC曲线类似，对于4ng/mL至10ng/mL之间的PSA而言，敏感性为38％，特异性为91％(AUROC 0.78)。本文公开的数据令人信服地证实，膜联蛋白A3是用于前列腺癌的新的有效的标志物，其在PSA值最不可靠的那些患者中尤其有效。
总而言之，双盲、多中心的第三种复杂研究显示，最可靠的和统计学上显著的诊断读数是前列腺按摩后exprimate尿上清液中膜联蛋白A3的量，该exprimate尿上清液是在适合于可能的前列腺癌患者的标准临床程序(DRE)期间用标准低速离心获得的。这是非常有用的，因为这允许直接进行基于ELISA的试验或者基于抗体的其它试验，而无需先溶解沉淀的样品(存在去垢剂、盐、化学物质等干扰的危险)。上清液中这种膜联蛋白A3的量与癌症反相关，在非癌症中，膜联蛋白A3的量较高，有些迹象表明，对非癌症病例的额外及随后的分析可以进一步提高总体诊断价值。
结果完全与前两项研究一致，前两项规模更小，并且在某些方面，对于样品收集和样品控制并不完全。第一项研究仅包括了沉淀团(图6)，但是我们发现了对于癌症患者而言的反相关性。在该研究中包括了一组健康志愿者，他们并非用于进行随后研究的病例。在第二项研究期间，考虑到了上清液-膜联蛋白A3和沉淀团膜联蛋白A3(虽然采用了太小的样品数，无法获得统计学上显著的解决方案)，其呈现这样的趋势：较之BPH和其它非癌症患者，癌症患者中上清液与沉淀团之比更高。这与第一项和第三项研究完全一致，因为很明显地，癌症患者中低沉淀团膜联蛋白A3的量组合具有稍高的膜联蛋白A3的量给出较大的比例(图7)。在非癌症患者中(例如BPH、纤维化和其它)，显然，总体上大得多的沉淀团和上清液中膜联蛋白的量组合起来，给出了较低的总体比例。上清液中膜联蛋白A3信号的可靠性提供了实验上和临床上有利且容易的诊断读数。

Claims (22)

1.至少一种膜联蛋白，优选膜联蛋白A3在治疗癌症，特别是在治疗泌尿生殖道和/或肠道癌症中的用途。
2.诊断癌症，特别是泌尿生殖道和/或肠道癌症，和/或区分癌性和非癌性组织的方法，所述方法包括如下独立步骤：
-测定至少一种细胞内膜联蛋白的丰度，和/或
-测定至少一种细胞外膜联蛋白的丰度，
尤其是使用尿样或其组分来进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述膜联蛋白至少是由膜联蛋白A1、膜联蛋白A2、膜联蛋白A3、膜联蛋白A4、膜联蛋白A5、膜联蛋白A6、膜联蛋白A7、膜联蛋白A8和膜联蛋白A10构成的组的成员，并且其中优选将所述至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种其它蛋白的丰度一起测定。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，将所述至少一种膜联蛋白的丰度与至少另一种膜联蛋白的丰度一起测定。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，将所述至少一种膜联蛋白的丰度与下述组的至少另一种蛋白的丰度一起测定，所述组由血清淀粉状蛋白P、异肽酶T、肌肉类型的脂肪酸结合蛋白、半乳糖凝集素1、热休克蛋白90、Bip、蛋白质二硫键异构酶、表皮类型的脂肪酸结合蛋白、烯酰基辅酶A水合酶和核仁磷酸蛋白构成。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，将所述至少一种膜联蛋白的丰度与下述组的至少另一种蛋白的丰度一起测定，所述组由14-3-3家族、蛋白酶体、活化因子亚基2、细胞角蛋白家族、KNP-Iα蛋白和KNP-Iβ蛋白构成。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，将所述至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种血液或血清标志物，特别是Kallikrein蛋白酶家族的至少一个成员，优选前列腺特异性抗原(PSA)的丰度一起测定。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，将所述至少一种膜联蛋白的丰度与至少一种上皮细胞标志物，特别是前列腺特异性膜抗原(PSMA)一起测定。
9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在于，使用膜联蛋白A3和/或膜联蛋白A8，优选膜联蛋白A3。
10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其特征在于，癌症选自前列腺癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、子宫癌或结肠癌构成的组。
11.如权利要求2至10中任一项所述的方法，其特征在于，在测定所述至少一种膜联蛋白的丰度之前，使尿样或其组分接受分离过程，以产生细胞沉淀团和上清液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述沉淀团被用来测定至少一种膜联蛋白的细胞内丰度。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述上清液被用来测定至少一种膜联蛋白的细胞外丰度。
14.如权利要求2至13中任一项所述的方法，其特征在于，在测定所述至少一种膜联蛋白的丰度之前，加入阳离子螯合剂，特别是EDTA和/或EGTA。
15.如权利要求2至14中任一项所述的方法，其特征在于，通过免疫组织化学方法测定所述蛋白丰度。
16.如权利要求2至15中任一项所述的方法，其特征在于，从尿，特别是从exprimate尿中获得所述尿样或其组分，所述exprimate尿是前列腺按摩之后回收的，特别是直肠手指插入后。
17.如权利要求2至16中任一项所述的方法，其特征在于，对所述尿样或其组分加以纯化，特别是使其不含嗜中性粒细胞、单核细胞或外周血单核细胞(PMBC)，尤其是通过磁珠来纯化。
18.如权利要求2至17中任一项所述的方法，其特征在于，使用晨尿样品或其组分。
19.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在粪便或肠道上皮细胞中测量膜联蛋白水平。
20.如权利要求1至15和19中任一项所述的方法，其中膜联蛋白水平被用于在粪便的任何组分或制备物(任何可能的产生胞外体的上皮表面)中诊断胃肠道上皮癌症。
21.如权利要求1至15和19-20中任一项所述的方法，其中膜联蛋白水平用于诊断结直肠癌症。
22.如权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述方法与对嗜中性粒细胞，特别是钙卫蛋白和/或嗜中性粒细胞白明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的测定组合，以区分炎症(Crohn病或溃疡性结肠炎)。
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