CN102625914A

CN102625914A - 检测膀胱癌或者膀胱癌风险的方法

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Publication number: CN102625914A
Application number: CN2010800335452A
Authority: CN
Inventors: M·W·拉德克; C·N·里德; K·威廉森; J·V·拉蒙特; S·P·菲茨杰拉德
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: EP2460012A1; EP2460012B1; US9562905B2; WO2011012901A1; US20120135886A1; CN102625914B; ES2572377T3

Abstract

本发明提供了一种用于检测患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法，包括以下步骤：检测从患者中分离的一个或多个样品中选自以下的至少两种生物标记物的组合的存在情况：CEA、VEGF、IL-8、NGAL、NSE、IL-2、EGF、TM、D-二聚体、MMP-9、IL-6、IL-4、MMP-9/NGAL、FAS、CRP、TUP和NMP22，其中在一个或多个样品中存在至少两种所述生物标记物的组合表示存在膀胱癌或膀胱癌风险。表1<tables num="0001">

Description

检测膀胱癌或者膀胱癌风险的方法

技术领域

本发明涉及检测患者中膀胱癌存在情况或者膀胱癌风险的方法。

背景技术

膀胱癌是全世界范围内的重要死亡原因之一。膀胱癌在男性中是在女性中的3倍以上，但女性中的死亡率是男性中的两倍。患有浅表性膀胱癌肿瘤的大多数患者将会在5年内出现复发，这些患者中几乎90％将会在15年内复发。因此，至关重要的是定期随访这些患者，以确保癌症不会扩散到膀胱外。持续监测和昂贵的诊断技术使得膀胱癌是以每名患者花费计从确诊到死亡期间花费最昂贵的癌症。

诊断测试的有效性是通过其敏感性和特异性进行测量。测试敏感性是真阳性数(对具体疾病测试阳性的患有该疾病的个体数目)，特异性是真阴性数(对疾病测试阴性的未患该疾病的个体数目)。最常见的膀胱癌体征是肉眼可见的血尿或显微镜可见的血尿，通常由家庭医生检测，并且出现在所有膀胱癌患者的85％中。简单的尿试纸测试可用于检测血的存在情况。虽然无血的癌症很少，这使得简单血试纸测试具有高敏感性，但是该测试的特异性很差，仅有不到5％的有血尿患者实际上患有膀胱癌。然而，所述5％的有血尿的患者通常被诊断为患有易于切除的浅表性肿瘤。

膀胱镜检查和细胞学(cytology)是用于诊断膀胱癌的优选方法。细胞学检查涉及检查排泄的尿中的膀胱上皮细胞。该方法具有高特异性，并且样品便于获得。然而，该方法敏感性差，在低细胞产率下具有主观性。细胞学评估通常与灵活的膀胱镜检查相结合。膀胱镜检查使得可直接观察膀胱以及生检可疑区域，形成95％的诊断准确性。因此，该方法被认为是准确诊断膀胱癌的黄金标准。

然而，膀胱镜检查有几项缺点，即它特别昂贵，造成患者不适，并且不能用于上尿路(upper tract)可视化或用于检测小面积的原位癌。本领域中已经尝试鉴别一种或多种生物化学的膀胱癌生物标记物，所述生物标记物能够在对患有膀胱癌的患者进行膀胱镜检查之前对他们进行鉴别。如今，大约20％的患者存在重病，结果是他们的预后较差。因此，本领域中已经试图鉴别经证明的标记物或者标记物组，这些标记物或标记物组可用作用于高风险无症状患者的膀胱癌筛查工具。

仍没有单一生物标记物或生物标记物组已经达到了降低准确诊断需要的膀胱镜检查频率所需要的敏感性和特异性水平。在过去10年间，已经相对于黄金标准尿细胞学评估了大量膀胱癌标记物包括BTA STAT、NMP22、端粒酶和FDP，一直具有十分一致的低特异性结果。这些标记物存在于大部分患有除膀胱癌之外的泌尿疾病的患者以及患有泌尿道感染(urinary infection)的患者的尿中。NMP22和BTA被FDA批准用作即时检验测定(point of care assay)。然而，NMP22需要在尿中立即稳定，这不是总能做到，并且BTA的存在可被存在于尿中血所掩盖。新的推定标记物(例如存活素、透明质酸、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和EGF)--它们已被证明可诱导某些膀胱癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP9)表达--已经被提出作为膀胱癌标记物。然而，所述推定生物标记物均尚未达到尿细胞学的高特异性和端粒酶测定的高敏感性。

因此，在膀胱癌诊断和治疗领域中，现有技术中鉴别的生物标记物不能使人满意，原因是它们缺乏准确诊断膀胱癌或评估患者患膀胱癌风险所需的敏感性和特异性。结果是，临床医生不能正确评估是否应对患者进行进一步的膀胱镜检查和细胞学测试，这导致了诊断和处理所述疾病的高额费用。本发明的目标是克服这些问题。

发明内容

本发明的目标是鉴别这样的生物标记物，即该生物标记物可以通过替代膀胱镜检查作为细胞学的辅助方法用于诊断膀胱癌，或者作为独立式测试用于诊断膀胱癌。本发明人已经发现，具体生物标记物的组合(已知在膀胱癌发生的生物化学通路中是重要的)存在于膀胱癌患者的血和/或尿中。通过对这些生物标记物的多种组合(考虑膀胱癌的多种已知风险因素)的统计学分析，本发明人已经发现，尿和/或血液样品中存在这些生物标记物的特定组合显示出与这些膀胱癌患者的强相关性。因此，本发明公开了可以用于诊断患者中膀胱癌或膀胱癌风险的具体生物标记物组合。

因此，本发明的一个方面提供了一种用于检测患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法，包括以下步骤：在从患者分离的一个或多个样品中检测选自CEA、VEGF、IL-8、NGAL、NSE、IL-2、EGF、TM、d-二聚体、MMP-9、IL-6、IL-4、MMP-9/NGAL、FAS、CRP、TUP和NMP22的至少两种生物标记物的存在情况，其中在一个或多个样品中存在至少两种所述生物标记物的组合表示存在膀胱癌或膀胱癌风险。

具体实施方式

以下是本说明书中使用的缩写的列表：

AHM 抗高血压药物

AUC 曲线下面积

BPH 良性前列腺增生

BTA 膀胱肿瘤抗原

CEA 癌胚抗原

CK-18 细胞角蛋白18

CRP C反应性蛋白

EGF 表皮生长因子

FAS FAS蛋白

FDP 纤维细胞源性蛋白(Fibrinocyte Derived Protein)

FPSA 游离前列腺特异性抗原

HA 透明质酸

HRP 辣根过氧化物酶

HsCRP 高敏感性C反应性蛋白

IL-2 白细胞介素2

IL-4 白细胞介素4

IL-6 白细胞介素6

IL-8 白细胞介素8

LR 似然比

MCP 单核细胞趋化蛋白

MMP9 基质金属蛋白质9

MMP-9/NGAL 基质金属蛋白质9/嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质

运载蛋白复合体

NGAL 嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

NMP22 核基质蛋白22

NSE 神经元特异性烯醇化酶

POC 即时检验

RCC 肾细胞癌

ROC 接受者操作曲线

SD 标准差

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

sTNFR1 可溶性肿瘤坏死因子1

sTNFR2 可溶性肿瘤坏死因子2

SPP 起始预测概率(年龄、吸烟年数和抗高血压药物)

TCCB 膀胱移行细胞癌

TM 血栓调节蛋白

TPSA 总前列腺特异性抗原

TUP 尿蛋白总量

UTI 泌尿道感染

VEGF 血管内皮生长因子

vWF 温韦伯氏因子(von Willebrand Factor)

本发明是基于这样的发现，即从患有膀胱癌的患者分离的血液和/或尿样品中存在具体的生物标记物的组合使得可以进行膀胱癌的准确诊断。这一点是有利的，原因是这将降低对侵入性诊断过程的需求。

选择用于鉴别的生物标记物的组合包含至少两种生物标记物。所述至少两种生物标记物的组合选自CEA、VEGF、IL-8、NGAL、NSE、IL-2、EGF、TM、d-二聚体、MMP-9、IL-6、IL-4、MMP-9/NGAL、Fas、CRP、TUP和NMP22。优选地，生物标记物的所述组合包含3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种不同的生物标记物。理想地，所述生物标记物的组合包含不超过6种生物标记物。优选地，所述两种生物标记物的至少一种是NMP-22。优选地，所述生物标记物的组合是VEGF、TUP和CEA；VEGF、CEA、MMP-9和IL-6；VEGF、CEA、TM、NSE和D-二聚体；VEGF、CEA、NSE、TM和IL-8；NMP-22、NSE和IL-4；NMP-22和MMP9/NGAL复合体；CEA、IL-8和NGAL；CEA、IL-8、NGAL、NSE和VEGF；NMP-22、IL-2、EGF和NSE，NMP-22和CEA；FAS、EGF、NSE、NMP-22和CEA；CRP、NSE、IL-2、NMP-22、CEA和FAS。所述生物标记物的组合可以是NMP-22、IL-6、NSE和TUP。更优选地，所述组合是CEA和VEGF或者CEA、NMP22和VEGF。

在本发明的一个方面中，待测试膀胱癌存在情况或风险的患者患有血尿症。本发明的方法是有利的，原因是它能够确定患有血尿症患者是因为患有膀胱癌而在其尿中有血还是因为其他原因而在其尿中有血。例如，血可以由于泌尿道感染而存在于尿中。

在从所述患者分离的至少一种样品中检测所述生物标记物。优选地，在从所述患者分离的第一和第二样品的每一个中检测至少一种生物标记物。在本发明的一方面中，所述第一样品是尿样品，所述第二样品是血液样品。在血液样品中检测所述CEA生物标记物，而在尿中检测所述其他生物标记物。所述生物标记物在所述样品中的存在情况可以通过市售的方法确定。生物芯片阵列技术(Biochip ArrayTechnology)(Randox Laboratories Ltd.，Crumlin，Northern Ireland，UK)可以用于同时检测来自单个患者尿和/或血液样品的多个分析物。所述技术是基于Randox Biochip--一种支持具有离散测试区域的阵列(具有固定化的抗原特异性抗体)的9mm²固体基质。

在一个实施方案中，每个生物标记物组合均具有至少70％的敏感性和特异性。这意味着，100名患有膀胱癌的患者中有70％将因确定存在生物标记物的具体组合而被正确鉴别为膀胱癌阳性(敏感性测试)，而100名非膀胱癌患者中有70％将被正确测试为所述疾病阴性(敏感性测试)。优选地，所述生物标记物的组合具有至少75％的敏感性。更优选地，所述敏感性为至少81％，并且所述特异性为至少0.75％，更优选至少0.80％。

以下实施例(参考表1-4)描述了一种方法，通过所述方法可以在从患者分离的尿或血液样品中检测所述生物标记物。然后，对其中被鉴别的生物标记物进行统计学分析，目的是鉴别与患者中膀胱癌存在情况相关的生物标记物的具体组合。所述统计学分析表明，生物标记物的具体组合与膀胱癌患者中这类生物标记物的存在情况相关。

表1示出从膀胱癌患者和对照获得的样品的生物标记物谱中显著差异的单变量分析(T检验)；

表2示出通过具体生物标记物存在或不存在对生物标记物组合的效应而确定的生物标记物的敏感性和特异性；和

表3示出对所述生物标记物组合的敏感性有显著性贡献的生物标记物二元逻辑回归分析(binary logistic regression analysis)结果。

实施例

实施例1

进行初步研究以确定与对照相比膀胱癌患者中哪些个体生物标记物被显著改变，以及哪些变量作为膀胱癌的风险因子。基于阴性膀胱镜检查和无膀胱癌症状将77名患者(55名男性；22名女性)指定为对照组，然后进行其他研究。他们的最终诊断如下：无诊断(n＝36)、前列腺良性增生(BPH)(n＝13)、结石(n＝9)、结石伴有炎症(n＝2)、炎症(n＝4)、前列腺癌(n＝3)、肾细胞癌(RCC)(n＝2)、结石伴有BPH(n＝2)、肾囊肿(n＝1)、肾损伤(n＝1)、尿道感染(n＝1)、瘘(n＝1)、创伤(n＝1)、子宫内膜异位(n＝1)、RCC伴有BPH(n＝1)、结石伴有UTI(n＝1)和鳞状细胞化生(n＝1)。

将在取样时具有以病理学方法证明的膀胱癌的82名患者(67名男性；15名女性)指定为TCCB组。17名有TCCB病史的患者在取样时无病。

所有对照和3/81的TCCB患者的膀胱镜检查为膀胱癌阴性。在细胞学评估后，56/65的对照和25/76的膀胱癌分别被分类为“无恶性肿瘤迹象”；5/65和8/76为“非典型”；1/65和10/76为“疑似”；1/65和33/76为“恶性”。分类为恶性的两名对照患有前列腺癌。

本发明人发现，抗高血压药物(p＜0.001，卡方)和抗血小板药物(p＝0.027，卡方)是膀胱癌的高风险因素。还发现以下生物标记物在膀胱癌患者中显著地高：BTA、CEA(血清)、d-二聚体、FAS、IL-1α、IL-6、IL-8、MMP-9/NGAL复合体和VEGF(p＜0.020；t检验)。FPSA和TPSA(p＜0.05；t检验)；EGF(p＜0.05；t检验)和CRP(p＜0.02；t检验)在膀胱癌患者中比在对照中显著地低。

对于个体生物标记物，在检测膀胱癌存在情况或膀胱癌风险中敏感性为从33至68％，特异性为从48至95％。IL-8具有最高敏感性和细胞学具有最高特异性。不包含NMP22的生物标记物组合分别具有71至83％和86至94％的敏感性和特异性。纳入NMP22而形成的生物标记物组合分别具有71至87％和88至98％的敏感性和特异性。具有最高敏感性的生物标记物组合是基于标准化数据并纳入了NMP22。具有最高特异性的生物标记物组合使用了肌酸酐或重量克分子渗透压浓度校正数据，并且也纳入了NMP22。无NMP22的生物标记物组合与有NMP22的生物标记物组合有很大不同。

本发明人发现，所分析的生物标记物组合结合少量危险因子变量会更强有力(robust)。患者年龄、吸烟年数以及患者是否服用抗高血压药物是在检测膀胱癌存在情况或膀胱癌风险时对生物标记物组合的敏感性和特异性贡献很大的变量。当比较对照与TCCB时，NSE和MMP-9水平无显著不同，但它们确实分别对所述生物标记物组合的9/17和1/17有显著贡献。嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平在服用抗高血压药物的患者中显著更高(p＝0.022，t检验)，但NGAL水平在对照和膀胱癌患者之间无显著差异。当在对照组和膀胱癌组之间比较未服用抗高血压药的患者时，患有癌症的患者吸烟时间显著越长，则具有显著越高的CEA、VEGF和NSE水平。当比较服用抗高血压药物的患者时，在对照和膀胱癌之间无显著差异。

实施例2

根据实施例1的初步结果，进行了进一步研究以找到生物标记物的具体组合，所述生物标记物的具体组合可以用于准确诊断患者中膀胱癌的存在情况或风险，而不需要在临床检查过程中另外确定患者暴露于其他风险因子。设计了进一步的研究以考虑上文详细描述的初步研究中所鉴别的多种风险因子对从膀胱癌测试患者获得的样品中个体生物标记物存在情况的作用，使得可以获得一系列具体生物标记物组合，所述具体生物标记物组合反映了多种膀胱癌风险因子。

招募181名有血尿症病史的患者，用于膀胱癌试验。对所有患者进行膀胱镜检查。被指定至对照组的患者的膀胱镜检查呈阴性或者随后的病理学正常，同时被指定至膀胱移行细胞癌(TCCB)组的患者具有以病理学方法确认的膀胱癌。

已知一些膀胱癌发生中的风险因子。在确定存在血尿症的患者是否有膀胱癌或一些其他疾病时，年龄和吸烟是最准确的区分因子。因此，为了使所述生物标记物组合能提供检测膀胱癌存在情况或膀胱癌风险而不是临床上表现为血尿症的另一病状的准确途径，在每名患者中评估已知的风险因子，并且考虑了对每种所提出的生物标记物组合的存在情况的效应。因此，通过在所述研究开始时回答调查问卷，针对所述研究中的所有患者评估了他们暴露于各种膀胱癌风险因子的情况。所述调查问卷询问患者年龄、性别以及是否有家族膀胱癌病史。所研究的其他风险因子为患者是否患有肾结石病、复发性尿道感染、良性前列腺肥大或恶性病，以及他是否已接受过骨盆放射治疗。特别重要的是所述患者是否是吸烟者，如果是吸烟者，则吸烟史多长，以及所吸烟草的量和类型(烟斗或卷烟)；其酒精消耗和医疗史。所述患者的医疗史特别重要，原因是已知多种药物会影响患者血液和/或尿中多种所述生物标记物的表达。具有这种效应的药物可选自抗高血压药、抗胆固醇药物、抗血小板药物、抗溃疡药、前列腺减小药(prostatereduction drug)、抗哮喘药、镇痛药、抗抑郁药、抗炎症药、抗糖尿病药、抗凝血药、抗焦虑药和维生素。

阳性鉴别的风险因子被指定为起始预测概率(SPP)，它是在患者中每种风险因子对患者膀胱癌发生做出的贡献的指示物。SPP基于膀胱癌患者的每种风险因子的平均值，例如平均年龄和所吸香烟的平均数目，这在表1中显示。结果是，对下文讨论的多种生物标记物组合上所进行的统计分析考虑了每种风险因子对膀胱癌发生和具体生物标记物的存在情况的可能效应。因此，在临床环境中，本发明可以用于通过确定生物标记物的多种组合的存在情况而诊断膀胱癌的存在情况或风险，所述具体组合被设计为已考虑到膀胱癌的其他可能风险因子。

从所有患者收集尿样品(50ml)和血清样品(2ml)至无菌容器中。将未过滤的且未离心的尿样品立即分成等分，保存在-80℃下直至分析。将尿样品在冰上冻溶，然后离心(1200×g，10分钟，4℃)以除去任何颗粒物质，之后进行分析。在收集后立即将15-20ml未过滤且未离心的尿置于普通灭菌容器中，在4℃下保存直至在24小时内进行常规细胞学评估。病理学家(NHS)报道了以帕帕尼科拉乌(Papanicolaou)染色法和吉姆萨(Geimsa)染色法染色的制品不足以分析正常、非典型、疑似或恶性。还记录了炎症细胞的存在情况。由病理学家对苏木精和伊红染色的肿瘤切片进行炎性浸润的分级、分阶和评估。在所有分析中均包括指定为对照、新诊断TCCB或复发TCCB的患者。对来自每名患者的尿样品(2.5μl/泳道)使用SDS PAGE(16％)分析进行分析。将所述凝胶在考马斯蓝中染色1小时，然后在甲醇/乙酸/水(2∶1∶7)中脱色直至背景澄清。

然后，检查所述生物标记物在所述样品中的存在情况。所有样品重复进行3次电泳，结果表示为平均值+SD(n＝3)。

将Randox Bioship Array技术用于检测多种生物标记物的存在情况。在以测定缓冲液进行抗体活化后，加入标准物和样品并且在37℃下孵育60分钟，然后置于加热振荡器中以370rpm振荡60分钟。加入抗体缀合物(HRP)并在加热振荡器中以370rpm振荡60分钟。使用数字成像技术检测并测量加入鲁米诺(luminol)(与缀合物之比为1∶1)后形成的化学发光信号，并且与校准曲线的信号比较以计算所述分析物在所述样品中的浓度。所述生物芯片的分析敏感性如下：IL-24.8pg/ml，IL-46.6pg/ml，IL-61.2pg/ml，IL-87.9pg/ml，VEGF14.6pg/ml，TNFα4.4pg/ml，IL-1α0.8pg/ml，IL-1β1.6pg/ml，MCP-113.2pg/ml，NSE0.26ng/ml，NGAL17.8ng/ml，sTNFR10.24ng/ml，d-二聚体2.1ng/ml，TM0.5ng/ml，hsCRP0.67ng/ml，MMP93.03ng/ml，sTNFR20.2ng/ml。对CEA和PSA(游离的和总体的)的功能敏感性分别是0.2、0.02和0.045ng/ml。

NMP22的存在情况在即时检验(POC)时是通过NMP22尿试纸测试(Matritech Inc，Newton，MA02460，USA)依照制造商的说明书进行确定。对每名患者进行单独测试。

每个尿样品中BTA(U/ml)的存在情况是使用市售定量BTAELISA(Polymedco，Inc.510Furnace Deck Road，Cortlandt Manor，NY10567，USA)依照制造商的说明书进行确定。

每个尿样品中vWF(IU/ml)的存在情况是使用购自RandoxLaboratories，Crumlin，Northern Ireland，UK的市售定量ELISA依照制造商的说明书进行确定。

每个尿样品中MMP9/NGAL(ng/ml)的存在情况是使用购自Randox Laboratories Ltd.Crumlin，Northern Ireland，BT294QY，UK的ELISA进行确定。

每个尿样品中细胞角蛋白18(ng/ml)的存在情况是使用购自USCNLIFE Science & Technology Co.Ltd.，A1709，Guangguguo，EastLake，Hi-Tech Zone，Wuham，430074，China的市售定量ELISA进行确定。

每个尿样品中透明质酸(ng/ml)的存在情况是使用购自EchelonBiosciences Inc.，675Arapeen Drive，Suite 302，Salt Lake City，UT，84108，US的市售定量竞争性ELISA进行确定。

每个尿样品中FAS(pg/ml)的存在情况是使用购自RayBio Inc.，Norcross，GA30092，US的市售ELISA进行确定。

每个尿样品中EGF(ng/ml)的存在情况是使用购自RandoxLaboratories Ltd.Crumlin，Northern Ireland，BT294QY，UK的EGFELISA进行确定。

每个尿样品中端粒酶的存在情况使用市购定量端粒酶检测试剂盒(MT3012)依照制造商的说明书(Express Biotech International(EBI)503Gateway Drive West，Thurmont，MD21788，USA)通过RT-PCR进行确定(重复3次)。

患者的水合状态(hydration status)以及因此的尿样品可能影响对生物标记物的检测。因此，在考虑水合水平变化的情况下将尿样品标准化。所述标准化步骤包括相对于肌酸酐水平(μmol/L)和总尿蛋白质浓度(TUP)(mg/ml)进行调整。肌酸酐(μmol/L)测量值是使用购自Randox Laboratories的定量体外诊断试剂盒(货号CR3814)进行确定，并且从Daytona RX Series Clinical Analyser(RandoxLaboratories Ltd)收集结果。肌酸酐测定最高至66000μmol/L都是线性的，具有310μmol/L的敏感性。重量克分子渗透压浓度(mOsm)是使用Micro-Osmometer(型号15)(

Messtechnik，Berlin，Germany)进行确定。所述渗透压计是使用蒸馏水(0.1ml)和随仪器提供的300-mOsm标准物的3次独立读数进行校准。通过测量新鲜制备的0.9％NaCl溶液的mOsm对校准确认校准(平均值286+3mOsm，n＝3)。还在分析结束时使用相同的0.9％NaCl溶液验证(平均值280.3+0.58mOsm，n＝3)仪器校准以检验漂移。尿蛋白质水平(mg/ml)是使用Bradford Assay Reagent Kit(A₅₉₅nm)(Pierce，Rockford，IL，USA)和标准物BSA(1mg/ml)进行确定。将患者样品(10μl/患者)与Bradford Reagent(1ml)混合，并且在Hitachi分光光度计(ModelNo U-2800)上在A595nm下读数。尿样品中的蛋白质水平是用BSA校准表(0-5mg/ml，n＝3)确定。

重量克分子渗透压浓度(mOsm)使用

微渗透压计(型号15)(

Messtechnik，Berlin，Germany)进行确定。尿蛋白质水平(mg/ml)使用Bradford蛋白测定试剂盒(Bradford Assay ReagentKit)(A₅₉₅nm)(Pierce，Rockford，IL，USA)和标准物BSA(1mg/ml)进行确定。

表1显示了患者尿样品和血液样品中出现的统计学显著性生物标记物，以及对照患者和膀胱癌患者之间样品的蛋白质浓度、肌酸酐水平和重量克分子渗透压浓度变化的统计学量度。根据这些结果，尿中的23种生物标记物和血清中1种生物标记物CEA被认为是统计学显著的。这些个体生物标记物被选择用于进一步研究，其中在已考虑了不同患者之间风险因子存在情况的变化以及不同患者样品之间蛋白质浓度、重量克分子渗透压浓度和肌酸酐水平的变化的情况下，生物标记物的组合会准确预测膀胱癌的存在情况或风险。

然后，将对于每种已鉴别的生物标记物的3次生物标记物测量值的平均值进行转换以得到正态分布。设计不同的变量用于校正的生物标记物水平，所述校正的生物标记物水平来自于每种生物标记物的平均值，所述平均值被除以蛋白质、肌酸酐或重量克分子渗透压浓度，然后取平均或进行对数转换。使用Student T检验评估TCCB和对照之间的生物标记物水平差异，p＝0.05作为显著水平。根据ROC分析确定生物标记物对膀胱癌的敏感性和特异性。这些结果在表2显示。

使用正向wald二元逻辑回归分析(forward wald binary logisticregression analysis)(案例分类的截断概率＝0.5)确定显著的生物标记物组合。所述回归分析是使用SPSS回归软件进行。源自对风险因子和临床信息(源自患者问卷)的t检验分析的起始预测概率被用作第一分类标准来对表2中显示的AUC生物标记物数据进行标准化。所述AUC生物标记物数据还被进一步标准化，以考虑蛋白质、肌酸酐水平以及重量克分子渗透压浓度的变化。根据列联表(cross-tabulation)确定生物标记物对膀胱癌的敏感性和特异性。计算与由生物标记物的每个组合预测的预计膀胱癌相比的最终诊断的列联表(预测概率＞0.50，对照的预测概率≤0.50)。这些结果在表3中显示。

15个生物标记物组合被证明与膀胱癌患者相关。

讨论

本发明公开了一种通过检测生物标记物的特定组合来鉴别患有膀胱癌或具有患膀胱癌风险的患者的方法。对包括在每个组合中的具体生物标记物的选择考虑了已知有助于膀胱癌发生的多种风险因子以及它们对患者中个体生物标记物水平的效应。结果是，临床医生仅通过检测患者血液或尿中本发明人鉴别的生物标记物组合之一的存在情况，就能够确定存在血尿症的患者是否患有膀胱癌或一些存在血尿症的其他疾病，而不需要考虑其他膀胱癌风险因子。

所述生物标记物组合不能根据现有技术预测，现有技术仅注意到一些生物标记物参与膀胱癌发生的生物化学通路。因此，本发明公开的生物标记物的特定组合及其诊断患者中膀胱癌的存在情况或风险的用途是意料之外的。

表1

表2

表3

Claims

1.一种用于检测患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法，包括以下步骤：检测从患者中分离的一个或多个样品中选自以下的至少两种生物标记物的存在情况：CEA、VEGF、IL-8、NGAL、NSE、IL-2、EGF、TM、D-二聚体、MMP-9、IL-6、IL-4、MMP-9/NGAL、FAS、CRP、TUP和NMP22，其中在所述一个或多个样品中存在至少两种所述生物标记物的组合表示存在膀胱癌或膀胱癌风险。

2.权利要求1的方法，其中所述患者患有血尿症。

3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种生物标记物的组合包含在从所述患者中分离的第一和第二样品的每一个中检测到的至少一种生物标记物。

4.权利要求2的方法，其中所述第一样品是尿，所述第二样品是血液。

5.权利要求3的方法，其中在所述血液样品中检测CEA的存在情况，对所述尿样品测试至少一种所述其他生物标记物的存在情况。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述两种生物标记物中的至少一种是NMP22。

7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述至少两种生物标记物的所述组合是：

VEGF、CEA和TUP；

VEGF、CEA、MMP-9和IL-6；

VEGF、CEA、TM、NSE和D-二聚体；

VEGF、CEA、NSE、TM和IL-8；

NMP-22、NSE和IL-4；

NMP-22和MMP9/NGAL复合物；

NMP-22、TUP、IL-6和NSE；

CEA、IL-8和NGAL；

CEA、IL-8、NGAL、NSE和VEGF；

NMP-22、IL-2、EGF和NSE；

NMP-22和CEA；

FAS、EGF、NSE、NMP-22和CEA；

CRP、NSE、IL-2、NMP-22、CEA和FAS；

CEA、VEGF；或者

CEA、VEGF和NMP-22。