CN113302495A - 膀胱癌的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险的方法,所述方法包括以下步骤:检测从女性患者分离的样品中生物标记物组的存在,所述生物标记物组包含IL‑13和IL‑12p70以及一种或多种选自以下的生物标记物:BTA、中期因子、PAI‑1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d‑二聚体、EGF、FAS、HAD、IL‑1a、IL‑1b、IL‑4、IL‑6、IL‑7、IL‑8、MCP‑1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯,和/或从女性患者分离的样品中白蛋白/微量白蛋白/蛋白质与肌酸酐的浓度,以白蛋白:肌酸酐比值表示;以及评估结果并将其与正常对照进行比较,其中与正常对照相比生物标记物的存在增加表明从其分离样品的患者中癌症的存在或风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测女性患者中膀胱癌存在或膀胱癌风险的方法。
背景技术
膀胱癌是全世界范围内的主要死亡原因。膀胱癌在男性中是在女性中的3倍以上,但女性中的死亡率是男性中的两倍。英格兰和威尔士的女性膀胱癌患者在1年和5年时的生存率低近20%,在10年时低近30%,这表明女性患者表现出更严重的疾病。控制性别和种族的多变量分析发现,39%的患有血尿的男性被其GP转诊给泌尿科医师,相比之下17%的患有血尿的女性被转诊给泌尿科医师。此外,男性比女性更有可能对其血尿进行完整评估(22%比12%),不太可能对其血尿进行不完整评估(55%比69%)。
诊断测试的有用性通过其敏感性和特异性进行测量。测试的敏感性是真阳性的数量(对具体疾病测试阳性的患有该疾病的个体数目),特异性是真阴性的数量(对疾病测试阴性的未患该疾病的个体数目)。最常见的膀胱癌病征是肉眼可见的血尿或显微镜可见的血尿,通常由家庭医生检测,并且在所有膀胱癌患者的85%中观察到。简单的尿试纸测试可用于检测血的存在情况。虽然无血的癌症很少,这使得简单血试纸测试具有高敏感性,但是该测试的特异性很差,其中少于5%的表现出血尿的患者实际上患有膀胱癌。然而,所述5%的表现出血尿的患者通常被诊断为患有易于切除的浅表性肿瘤。
膀胱镜检查和细胞学是用于诊断膀胱癌的优选方法。细胞学检查涉及检查排泄的尿中的膀胱上皮细胞。该方法具有高特异性,并且便于获得样品。然而,该方法敏感性差,在低细胞产率下具有主观性。细胞学评估通常与灵活的膀胱镜检查相结合。白光膀胱镜检查(WLC)使得可直接观察膀胱以及对可疑区域进行活组织检查。但是,最近的出版物表明,蓝光膀胱镜检查(BLC)比WLC多检出34%的肿瘤(例如原位癌(CIS))。此外,20/53的CIS病变患者(37.7%)的细胞学检查为阴性(Fradet等人,2007;Witjes等人,2010)。不幸的是,BLC的假阳性率高于WLC(分别为39%与31%)(Fradet等人,2007)。膀胱镜检查的敏感性和特异性分别为71%和72%(National Collaborating Centre for Cancer,Bladder Cancer:diagnosis and management;NICE Guideline 2,February 2015,Page 78)。
膀胱镜检查有一些缺点,即它特别昂贵,造成患者不适,有感染风险,并且不能用于上尿路(upper tract)可视化或用于检测小面积的CIS,例如,当将尿测试(细胞学)呈阳性的信息告知泌尿科医师时,通过膀胱镜检查检测到膀胱癌复发的数量增加;但当结果是盲测时就不会(van der Aa等人,2010)。
本领域中已经尝试鉴别一种或多种生物化学的膀胱癌生物标记物,所述生物标记物能够在对患有膀胱癌的患者进行膀胱镜检查之前将他们鉴别出。如今,大约20%的患者存在重病,结果是他们的预后较差。因此,本领域中已经试图鉴别经证明的生物标记物或生物标记物组,其可用作特别是用于低风险无症状患者的膀胱癌筛查工具。
仍没有单一生物标记物或生物标记物组已经达到了降低准确诊断需要的膀胱镜检查频率所需要的敏感性和特异性水平。在过去10年间,已经相对于黄金标准尿细胞学评估了大量膀胱癌标记物,包括膀胱肿瘤抗原(BTA)、核基质蛋白22(NMP22)、端粒酶和纤维蛋白原降解产物(FDP),一直具有十分一致的低特异性结果。这些标记物存在于大部分患有除膀胱癌之外的泌尿疾病的患者以及患有尿路感染(UTI)的患者的尿中。NMP22和BTA被FDA批准用作即时检验测定(point of care assay)。然而,NMP22需要在尿中立即稳定,这不是总能做到,并且BTA可被存在于尿中的血所混淆。已提出新的推定标记物(例如存活素、透明质酸、细胞角蛋白8和18以及EGF)——它们已被证明可诱导某些膀胱癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP9)表达——作为膀胱癌标记物。然而,所述推定生物标记物均尚未达到尿细胞学的高特异性和端粒酶测定的高敏感性。
因此,在膀胱癌诊断和治疗领域中,现有技术中鉴别的生物标记物不能使人满意,原因是它们缺乏准确诊断膀胱癌或评估患者患膀胱癌风险所需的敏感性和特异性。结果是,临床医生不能正确评估是否应对患者进行进一步的膀胱镜检查和细胞学测试,这导致了与诊断和处理所述疾病相关的高额费用。
大量金钱和资源用于为实际上可以在初级医疗中进行处理的低风险患者提供膀胱镜检查,而不是增加高风险患者进行膀胱镜检查的等待时间。因此,需要提供准确评估的测试,其可以使GP在不将患者送至膀胱镜检查的情况下由诊断排除膀胱癌。
发明内容
本发明基于以下认识:在男性和女性的膀胱癌诊断中所需的生物标记物之间存在显著差异。因此,本发明提供了可用于诊断女性受试者中膀胱癌的特定生物标记物组。
在本发明的第一方面,提供了一种用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)检测从女性患者分离的样品中生物标记物组的存在,所述生物标记物组包含IL-13和IL-12p70以及一种或多种选自以下的生物标记物:BTA、中期因子(Midkine)、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白(Clusterin)、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体(Progranulin)、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯,和/或白蛋白/微量白蛋白/蛋白质与肌酸酐的浓度,以白蛋白:肌酸酐比值表示;
(ii)评估女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险,其中检测到与正常对照相比升高的生物标记物的存在指示从其分离样品的女性患者中癌症的存在或癌症的风险。
在本发明的第二方面,提供了一种固体载体材料,其包含附着于其上的结合分子,所述结合分子对IL-13和IL-12p70分别具有特异性亲和力,其中结合分子各自位于载体材料上的离散位置。
在本发明的第三方面,提供了一种用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)确定女性患者没有感染;
(ii)检测从所述女性患者分离的样品中一种或多种生物标记物的存在,其中所述一种或多种生物标记物选自IL-13、IL12p70、BTA和中期因子;
(iii)评估女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险,其中检测到与正常对照相比升高的生物标记物的存在指示从其分离样品的女性患者中癌症的存在或癌症的风险。
附图说明
本发明参考附图进行描述,其中:
图1:显示了从SPSS分析(HaBio)输出的女性ROC曲线(4种生物标记物);
图2:显示了从SPSS分析(HaBio)输出的女性ROC曲线(4种生物标记物+感染);和
图3:显示了感染的所有癌症人群金字塔计数。
具体实施方式
本发明基于以下发现:与基于用于诊断男性和女性的生物标记物的现有技术诊断方法相比,在患有膀胱癌的女性患者中存在某些生物标记物使得可以进行更准确的诊断。从女性患者分离的样品中特定生物标记物的鉴别表明女性患者对癌症的易感性或存在癌症,并且出人意料地发现,这些生物标记物在男性和女性中显著不同。
如本文所用,术语“生物标记物”是指存在于从患者得到的生物样品中的分子,其在所述样品中的浓度可以指示病理状态。本文描述了已发现可单独或与其他诊断方法结合用于诊断膀胱癌,或与其他生物标记物结合作为补充生物标记物的各种生物标记物。
可以基于从患者分离的女性患者中生物标记物的表达水平或浓度进行诊断。通常在来自患者的血清或尿样品中鉴别本发明的生物标记物。优选地,样品是尿样品。
本发明涉及的生物标记物组包含IL-13和IL-12p70以及一种或多种选自以下的生物标记物:BTA、中期因子、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF、甘油三酸酯,优选BTA、中期因子、PAI-1/tPA、丛生蛋白、IL-8、微量白蛋白、MMP9NGAL、NSE、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、IL-7,和/或白蛋白/微量白蛋白/蛋白质与肌酸酐的浓度,以白蛋白:肌酸酐比值(ACR)表示。
生物标记物组可以是表2或表3中列出的任何组合。
优选地,生物标记物组为(i)BTA、IL-13和IL12p70;(ii)中期因子、IL-13和IL12p70;(iii)BTA、IL-13、IL12p70和中期因子;或(iv)BTA、IL-13、IL12p70、中期因子和PAI-1/tPA。
在一些实施方案中,样品中白蛋白与肌酸酐的浓度以白蛋白:肌酸酐比值表示。这可以通过分别测量白蛋白和肌酸酐的浓度来计算。技术人员将理解测量白蛋白和肌酸酐浓度的常规方法,参见实施例的示例性方法。当肾正常运作时,尿中几乎不存在白蛋白。
在一些实施方案中,患者可能伴有血尿和/或感染。为避免疑义,术语“血尿”是指尿中存在红细胞。适当地,感染可以是细菌或病毒感染,优选细菌感染。适当地,所述方法还可包括表征患者的感染状况的步骤。表征感染意指将患者诊断有感染或没有感染,并且可包括鉴别感染种类。可以使用基于临床病史、生物标记物、试纸条(dipstick)分析或UTI多重阵列(例如Randox尿路多重检测)的临床基诊断来确定感染。通过合并初始感染测试,可以增加AUC,以及减少用于诊断膀胱癌的生物标记物的数量。在本发明的上下文中,术语“膀胱癌”应理解为包括尿路上皮癌(UC)、移行细胞癌、膀胱鳞状细胞癌和/或膀胱腺癌。在一些实施方案中,与女性膀胱癌患者中不存在血尿和/或感染相比,血尿和/或感染的存在可进一步增加生物标记物组内生物标记物的升高水平。
优选地,生物标记物为尿形式,即在尿样品中进行鉴别。
在一个优选的实施方案中,在从患者分离的样品中可以鉴别组内的生物标记物,并依次或同时确定其在样品中的浓度。通过本领域已知的常规方法可以鉴别生物标记物并且可以确定其在分离的样品中的浓度,例如通过使样品与具有对生物标记物组中所包括的每种生物标记物具有特异性的结合分子的基质接触。优选地,基质上固定有至少两个结合分子,更优选地,三个、四个或更多个结合分子,其中每个结合分子对单个生物标记物具有特异性,并且第一探针对IL-13具有特异性,第二探针对IL-12p70具有特异性。如本文所用,术语“特异性”是指结合分子仅与本发明的生物标记物之一结合,而与本发明的其他生物标记物或所分析的生物样品中的其他分析物的结合可忽略不计。这确保了使用本发明的生物标记物的诊断测定及其结果的完整性不会受到其他结合事件的损害。
可以通过使用基于免疫检测的方法来测量生物标记物浓度。这样,结合分子优选是抗体,例如多克隆抗体或单克隆抗体。如本文所用,术语“抗体”包括任何免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子或其片段、Fab片段、ScFv片段和其他抗原结合片段。术语“多克隆抗体”是指识别靶标/抗原上多个表位的抗体的异质群体。术语“单克隆抗体”是指识别靶标/抗原上单个表位的抗体(包括抗体片段)的同质群体。免疫检测技术也很容易纳入到可移动或手持式设备中,以在临床环境之外使用。定量免疫测定法(例如蛋白质印迹或ELISA)可用于检测蛋白生物标记物的量。优选的分析方法包括使用多分析物生物芯片,其能够同时检测和定量几种蛋白质。2D凝胶电泳也是可用于多分析物分析的技术。
在一个优选的实施方案中,将结合分子固定在准备与患者样品接触的固体载体上。优选的固体载体材料是生物芯片的形式。生物芯片通常是平面基质,其可以例如基于矿物或聚合物,但是优选为陶瓷。可以根据例如GB-A-2324866中公开的方法来制造固体载体,GB-A-2324866的全部内容通过引用纳入本文。可以根据例如WO2017/085509中公开的已知方法对固体载体进行丝网印刷。优选地,可以使用生物芯片阵列技术(Biochip ArrayTechnology)系统(BAT)(可从Randox Laboratories Limited获得)来确定样品中生物标记物的水平。更优选地,可以使用迹象演化(Evidence Evolution)和迹象调查(EvidenceInvestigator)设备(可从Randox Laboratories获得)。
固体载体材料包含附着于其上的结合分子,所述结合分子对IL-13和IL-12p70分别具有特异性亲和力,其中结合分子各自位于载体材料上的离散位置。固体载体材料还可以在离散位置各自包含一个或多个这样的结合分子,其各自对选自以下的其他生物标记物具有特异性亲和力:BTA、中期因子、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯,优选BTA、中期因子、PAI-1/tPA、丛生蛋白、IL-8、微量白蛋白、MMP9NGAL、NSE、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体和IL-7。例如,附着到固体载体材料上的结合分子可以对表2或表3中的生物标记物的组合具有亲和力,优选(i)BTA、IL-13和IL12p70;(ii)中期因子、IL-13和IL12p70;(iii)BTA、IL-13、IL12p70和中期因子;或(iv)BTA、IL-13、IL12p70、中期因子和PAI-1/tPA。
本发明还提供了所述基质在用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法中的用途。
本发明还提供了包含用于生物标记物组的探针以及任选的用于测量白蛋白和肌酸酐的试剂的试剂盒,所述生物标记物组包含IL-13和IL-12p70以及一种或多种选自以下的生物标记物:BTA、中期因子、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯,优选BTA、中期因子、PAI-1/tPA、丛生蛋白、IL-8、微量白蛋白、MMP9NGAL、NSE、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体和IL-7。例如,生物标记物组可以是表2或表3中的组合,优选(i)BTA、IL-13和IL12p70;(ii)中期因子、IL-13和IL12p70;(iii)BTA、IL-13、IL12p70和中期因子;或(iv)BTA、IL-13、IL12p70、中期因子和PAI-1/tPA。所述试剂盒可以用于根据本发明的第一方面检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险。
本发明还提供了一种用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)确定女性患者没有感染;
(ii)检测从女性患者分离的样品中一种或多种生物标记物的存在,其中所述一种或多种生物标记物选自IL-13、IL12p70、BTA和中期因子;
(iii)评估女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险,其中检测到与正常对照相比升高的生物标记物的存在指示从其分离样品的女性患者中癌症的存在或风险。
适当地,所述一种或多种生物标记物是(i)IL-13+IL12p70;(ii)IL-13+BTA;(iii)IL-13+中期因子;(iv)IL12p70+BTA;(v)IL12p70+中期因子;或(vi)BTA+中期因子。
在本发明的方法中,为了诊断出膀胱癌或膀胱癌风险,与正常对照样品中的相应生物标记物相比,可发现所测试的生物标记物组内的生物标记物处于升高的水平。在一些实施方案中,发现生物标记物的浓度处于显著高于对照样品中的水平。“更高的浓度”的确定是相对的,并且是相对于已知未患有膀胱癌的对照受试者确定的。
对照值源自从一个或多个未患有膀胱癌的个体获得的生物样品中相应生物标记物的浓度。所述个体可以是例如健康个体或患有除膀胱癌以外的疾病的个体。或者,对照值可以对应于从患有膀胱癌之前的患者获得的样品中每种生物标记物的浓度。
为避免疑义,术语“相应的生物标记物”是指关于患者样品所确定的相同生物标记物组合的浓度也用于确定对照值。例如,如果确定了患者样品中IL-13和IL-12p70的浓度,那么对照中IL-13和IL-12p70的浓度也是已知的。
在一个优选的实施方案中,将女性患者和对照生物标记物浓度值中的每一个输入到一个或多个统计算法中以产生输出值,所述输出值指示患者是否存在膀胱癌。如果输出值小于生物标记物临界值(cut-off),则该患者通过膀胱癌生物芯片检测为阴性。如果输出值高于生物标记物临界值,则该患者通过膀胱癌生物芯片检测为阳性。
在一个优选的实施方案中,计算女性患者的临床风险评分(Clinical Risk Score(CRS)),其是使用,但不限于,以下临床和人口统计学测量的累积评分:年龄、血尿(不可见血尿与肉眼血尿)、吸烟(包年)、BMI、血压(控制、血压正常、高血压)、职业风险评分(FINJEM)、社会阶层(ONS编码)、并存病(如糖尿病、慢性肾病(CKD)等)、药物(如他汀类药物、抗高血压药等)、特定药物(发现会增加膀胱癌的风险)、疼痛缓解、肾移植、肾癌、其他癌症、盆腔放疗和UTI(有/没有微生物)。
计算患者CRS时使用的示例评分:年龄大于65岁等于1分;年龄小于65岁等于0分;不可见血尿(NVH)等于1分;肉眼血尿等于2分。因此,使用年龄和血尿作为临床风险评分时,年龄大于65岁且伴有肉眼血尿的患者,累计评分为3分。
在一个优选的实施方案中,将生物芯片膀胱癌测试数据和CRS相结合,以确定患者是否为以下类别之一:低风险、中风险或高风险。这些信息将使GP能够在初级医疗中管理他/她的患者,并在适当时将他们转诊到进一步的测试。例如,出现血尿、通过生物芯片检测为阴性且具有低CRS的患者将在初级医疗中由其GP监测,而不是转诊进行膀胱镜检查。将通过生物芯片检测为阴性且CRS为中等的患者转诊到泌尿外科进行膀胱镜检查(非紧急)。将通过生物芯片检测为阳性且CRS低的患者转诊到泌尿外科进行膀胱镜检查(非紧急)。将通过生物芯片检测为阳性且具有中等CRS的患者标记为“危险信号(red flagged)”,进行紧急膀胱镜检查。
关键词:Y=是;N=否
根据本发明使用的统计方法的准确性可以由它们的接受者操作特性(ROC)来最佳地描述。ROC曲线不但解决了测试的敏感性、真阳性的数量,而且解决了测试的特异性、真阴性的数量。因此,生物标记物的给定组合的敏感性和特异性值是测定准确性的指示。例如,如果生物标记物组合的敏感性和特异性值为80%,则在100名患有膀胱癌的患者中,通过确定生物标记物的该特定组合的存在来作为膀胱癌阳性,会正确鉴别出80名,而在100名没有患膀胱癌的患者中,80名对于该疾病将准确地测试为阴性。
ROC还以曲线下面积(AUC)的形式提供了测试的预测能力的度量。AUC是感知测量使得可以正确识别条件的概率的度量。按照惯例,该面积总是≥0.5。值范围在1.0(两组测试值完全分离)和0.5(两组测试值之间没有明显的分布差异)之间。该面积不仅取决于图的特定部分,如最接近对角线的点或90%特异性下的敏感性,还取决于整个图。这是ROC图与完美图(面积=1.0)的接近程度的定量的、描述性的表达。通常,敏感性为约80%或更高,并且特异性为约80%或更高的测试在本领域中被视为可能应用的测试,尽管这些值根据临床应用而不同。在一个优选的实施方案中,生物标记物组的AUC值为至少0.7,适当地为至少0.75,优选为至少0.8,更优选为至少0.85。
在本领域中众所周知,生物标记物的正常或“背景”浓度可由于例如年龄、性别或种族/地理基因型而显示出轻微的变化。因此,在本发明方法中所使用的临界值也可由于取决于目标患者或人群的优化而略有不同。调整临界值也将会使操作者以特异性为代价增加敏感性,反之亦然。
在一个实施方案中,该算法的敏感性和/或特异性分别为至少0.7。优选地,该算法的敏感性为至少0.75,更优选为至少0.8,和/或特异性为至少0.75,更优选为至少0.8。
在本发明中使用了两个或更多个生物标记物的情况下,可以导出合适的数学或机器学习分类模型,如逻辑回归方程。熟练的统计学家将理解这样合适的模型是如何导出的,它可以包括其他变量,如患者的年龄和性别。ROC曲线可以用来评估模型的准确性,模型可以独立使用或者在算法中使用以辅助临床决策。尽管逻辑回归方程是在这种情况下使用的常见的数学/统计程序,并且是在本发明的背景下的一个选择,但是也可以使用其他数学/统计、决策树或机器学习程序。技术人员将理解,可能需要调整为给定人群生成的模型,以便应用于从不同人群或患者群组获得的数据集。
以下实施例参考附图说明本发明。
实施例
患者
招募了157名出现血尿的患者进行膀胱癌试验。在确定了膀胱癌诊断算法在血尿患者中的可行性之后,设计了一项大型血尿生物标记物研究(HaBio),招募了675名患者。
尿和血清收集
在无菌容器中收集所有患者的尿样品(~50ml)和血清样品(~10ml)。将未过滤和未离心的尿样品立即等分,并在-80℃下冷冻直至进行分析。将尿样品在冰上解冻,然后离心(1200x g,10分钟,4℃)以除去任何颗粒物,然后进行分析。
生物标记物测量
所有样品以一式三份进行,结果表示为平均值±SD(n=3)。
生物芯片阵列技术(Randox Laboratories Ltd.,Crumlin,Northern Ireland,UK)用于同时检测单个患者样品(尿)中的多种分析物。该技术基于Randox生物芯片,Randox生物芯片是一种9mm2的固体基质,支持具有固定的抗原特异性抗体的离散测试区域阵列。用测定缓冲液激活抗体后,添加标准品和样品,并在37℃下孵育60分钟,然后置于热振荡器中,在370rpm下保持60分钟。添加抗体结合物(HRP),并在热振荡器中在370rpm下孵育60分钟。使用数字成像技术检测和测量添加鲁米诺(与结合物的比例为1:1)后形成的化学发光信号,并将其与来自校准曲线的化学发光信号进行比较,以计算样品中分析物的浓度。生物芯片的分析敏感性如下:IL-2 4.8pg/ml、IL-4 6.6pg/ml、IL-6 1.2pg/ml、IL7 1.11pg/ml、IL-8 7.9pg/ml、IL12p70 2.61pg/ml、IL-13 5.23pg/ml、VEGF 14.6pg/ml、TNFα4.4pg/ml、IL-1α0.8pg/ml,、IL-1β1.6pg/ml、MCP-1 13.2pg/ml、NSE 0.26ng/ml、NGAL 17.8ng/ml、sTNFRI 0.24ng/ml、d-二聚体2.1ng/ml、sTNFRII 0.2ng/ml。CEA和PSA(游离和总量)的功能敏感性分别为0.2、0.02和0.045ng/ml。低于检测限(LOD)/平均可检测剂量(MDD)的数据——对于任何给定测试,数据低于LOD/MDD时,该测试的LOD/MDD的90%用于分析(Papa L等人,2012)。
商业ELISA试剂盒
使用市售可得的ELISA试剂盒根据制造商的说明检测以下标记物:8OHdG(CellBiolabs);BTA(Polymedco);CK18(IDL);丛生蛋白(R&D Systems;Quantikine ELISA人丛生蛋白,DCLU00);肌酸酐(Randox Rx Daytona);CXCL16(R&D Systems);半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(R&D Systems);半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Randox Daytona Rx);FAS(RayBio);HAD(MyBioSource);微量白蛋白(Randox Rx Daytona);中期因子(CellMid);MMP9NGAL(R&DSystems;Quantikine ELISA人MMP-9/NGAL复合物);MMP9TIMP1(R&DSystems);PAI-1/Tpa(AssayPro);颗粒蛋白前体(R&D Systems);TUP(考马斯亮蓝法(Bradford Assay)A595nm);TGFB1(R&D Systems);血栓调节蛋白(R&D Systems)和TPA(Abcam)。
感染
感染是基于以下各项的临床基诊断:患者临床病史、生物标记物和试纸条分析。还可以使用UTI多重阵列(例如Randox尿路多重检测)确定感染,所述阵列涉及从尿样品中提取DNA,然后进行扩增(单管28重PCR反应)、杂交和检测。
肌酸酐、渗透压(osmolality)和TUP
使用来自Randox Laboratories(目录号CR3814)的定量体外诊断试剂盒测定肌酸酐(μmol/L)测量值,并从Daytona RX系列临床分析仪(Randox Laboratories Ltd)收集结果。肌酸酐测定是线性的,直到66000μmol/L,敏感性为310μmol/L。
使用微渗透压计(型号15)(Messtechnik,Berlin,Germany)测定渗透压(mOsm)。简而言之,使用三个独立的蒸馏水读数(0.1ml)和随仪器提供的300-mOsm标准液对渗透压计进行校准。通过测量新制备的0.9%的NaCl溶液的mOsm(平均286±3mOsm,n=3)来确认校准。在分析结束时,也使用相同的0.9%的NaCl溶液(平均280.3±0.58mOsm,n=3)验证仪器校准,以检查漂移。
使用考马斯亮蓝法试剂盒(A595nm)(Pierce,Rockford,IL,USA)和BSA作为标准液(1mg/ml)测定总尿蛋白水平(mg/ml)。将患者样品(10μl/患者)与Bradford试剂(1ml)混合,并在Hitachi分光光度计(型号U-2800)上于A595nm处读数。由BSA校准表(0-5mg/ml,n=3)确定尿样品中的水平。
统计分析
使用Mann-Whitney U检验(IBM SPSS v25)和R(Wilcoxon)进行统计分析,以鉴别在对照和膀胱癌之间差异表达的标记物。
使用SPSS和R(stats,glmnet(Lasso),glmult)通过二元逻辑回归(基于Wald的前进法和后退法(Forward and Backward Wald))鉴别有助于算法的标记物。
在p<0.05的水平上具有统计显著性。
实施例如下所示(SPSS分析(HaBio女性),针对4种生物标记物组合;以及4种生物标记物+感染)。
SPSS分析(HaBio)——女性(4种生物标记物)
分类表a
a.临界值是.250
0=没有癌症,1=存在癌症
方程式中的变量
a.在步骤1中输入的变量:BTA、IL12p70、IL13、中期因子。
曲线下面积
测试结果变量:预测概率
a.在非参数假设下
b.虚假设:真面积=0.5
计算的ROC曲线如图1所示。
SPSS分析(HaBio)——女性(4种生物标记物+感染)
分类表a
a.临界值是.250
0=没有癌症,1=有癌症
方程式中的变量
a.在步骤1中输入的变量:BTA、IL12p70、IL13、中期因子、感染。
曲线下面积
测试结果变量:预测概率
a.在非参数假设下
b.虚假设:真面积=0.5
计算的ROC曲线如图2所示。
合并感染状况
合并初始感染测试会增加AUC,并减少诊断膀胱癌所需的标记物的数量。
生物标记物 | 未合并感染状况的AUC | 合并感染状况的AUC |
IL-13 | 0.686 | 0.830 |
IL12p70 | 0.632 | 0.796 |
BTA | 0.754 | 0.868 |
中期因子 | 0.694 | 0.863 |
IL-13+IL12p70 | 0.783 | 0.869 |
IL-13+BTA | 0.830 | 0.902 |
IL-13+中期因子 | 0.782 | 0.895 |
IL12p70+BTA | 0.812 | 0.885 |
IL12p70+中期因子 | 0.748 | 0.877 |
BTA+中期因子 | 0.753 | 0.882 |
结果和讨论
某些生物标记物在女性膀胱癌患者中显著更高,包括BTA、中期因子、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯1(p<0.050;Mann Whitney检验)。以下生物标记物是最显著的:BTA、中期因子、PAI-1/tPA、丛生蛋白、IL-8、微量白蛋白、MMP9NGAL、NSE、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、IL-7。
本发明人鉴别的算法是出人意料的,并且算法中包括的生物标记物无法预测。
表1显示了使用Mann-Whitney U检验的假设检验汇总。当生物标记物具有大于或等于0.7的相关性时,该生物标记物可以用与其相关的生物标记物代替,这是因为两种生物标记物是相关的。小于0.7的显著性值表明这两种生物标记物是独立的。
图3显示,出现血尿的女性患者可能是由于感染(细菌和/或病毒)而不是由于癌症而有血尿。图的右半部分表示有感染的患者,左半部分表示没有感染的患者;图的下半部分表示没有癌症的患者,上半部分表示有癌症的患者;因此,在76名有感染的患者中,大约有2名有癌症。由于期望排除膀胱癌并避免进行膀胱镜检查,因此对出现在GP诊疗室中的血尿女性进行感染测试(使用任何方法/测试)可以使感染阳性的女性回家接受一疗程的抗生素,从而减轻NHS的转诊负担。根据图3,可以将184名患者中的大约76名送回家,而只有2名被不正确地送回家(2名漏诊的患者将因抗生素失败而被转诊)。其余~108名没有感染的患者将进行生物标记物测试。
以下是本说明书中使用的缩写的列表:
80HdG OxiSelect氧化性DNA损伤
ACR 白蛋白:肌酸酐比值
AUC 曲线下面积
BLC 蓝光膀胱镜检查
BMI 体重指数
BTA 膀胱肿瘤抗原
CEA 癌胚抗原
CIS 原位癌
CK-18 细胞角蛋白18
CKD 慢性肾病
CRP C反应蛋白
CRS 临床风险评分
EGF 表皮生长因子
FAS FAS蛋白
FDP 纤维蛋白原降解产物
FINJEM Finnish 工种接触矩阵(Finnish Job Exposure Matrix)
GP 全科医生
HRP 辣根过氧化物酶
IL-2 白介素2
IL-3 白介素3
IL-4 白介素4
IL-6 白介素6
IL-7 白介素7
IL-8 白介素8
IL-10 白介素10
IL-12p70 白介素12p70
IL-13 白介素13
IL-18 白介素18
IL-23 白介素23
LOD 检测限
MCP 单核细胞趋化蛋白
MDD 平均可检测剂量
MMP9 基质金属蛋白9
MMP-9/NGAL 基质金属蛋白9/嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白复合体
MMP9/TIMP1 基质金属蛋白9/金属蛋白的组织抑制剂1
NGAL 嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白
NICE 国立临床规范研究所(National Institute for Clinical Excellence)
NMP22 核基质蛋白22
NSE 神经元特异性烯醇化酶
NVH 不可见血尿
ONS 国家统计局(Office for National Statistics)
PAI-1/tPA 纤溶酶原激活剂抑制剂1/组织纤溶酶原激活剂
POC 即时检验(Point of Care)
ROC 接受者操作曲线
SD 标准差
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
sTNFR1 可溶性肿瘤坏死因子1
sTNFR2 可溶性肿瘤坏死因子2
TGFB1 转化生长因子β1
TM 血栓调节蛋白
TPA 组织型纤溶酶原激活剂
TPSA 总前列腺特异性抗原
TUP 总尿蛋白
UTI 尿路感染
VEGF 血管内皮生长因子
WLC 白光膀胱镜检查
表1示出了使用Mann-Whitney U检验的假设检验汇总
表2示出了在基于Wald的前进法和后退法二元逻辑回归之后,使用GLMulti(使用R)生成的生物标记物组合的AUC、敏感性和特异性。“u”是指生物标记物为尿形式,“s”是指生物标记物为血清形式。
表3生物标记物组合
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Claims (23)
1.一种用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)检测从女性患者分离的样品中生物标记物组的存在,所述生物标记物组包含IL-13和IL-12p70以及一种或多种选自以下的生物标记物:BTA、中期因子、PAI-1/tPA、8OHdG、CEA、CK18、丛生蛋白、肌酸酐、CXCL16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、EGF、FAS、HAD、IL-1a、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、微量白蛋白、MMP9NGAL、MMP9TIMP1、NGAL、NSE、颗粒蛋白前体、TUP、TGFB1、血栓调节蛋白、sTNFR1、TPA、VEGF和甘油三酸酯和/或白蛋白/微量白蛋白/蛋白质与肌酸酐的浓度,以白蛋白:肌酸酐比值表示;
(ii)评估女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险,其中检测到与正常对照相比升高的生物标记物的存在指示从其分离样品的女性患者中癌症的存在或癌症的风险。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种生物标记物选自BTA、中期因子、PAI-1/tPA、丛生蛋白、IL-8、微量白蛋白、MMP9NGAL、NSE、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、d-二聚体、IL-7。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述生物标记物组包含BTA。
4.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述生物标记物组包含中期因子。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其中所述生物标记物组包含PAI-1/tPA。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物标记物组选自表2或表3中的生物标记物的组合。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述生物标记物组选自:
(i)BTA、IL-13和IL12p70;
(ii)中期因子、IL-13和IL12p70;
(iii)BTA、IL-13、IL12p70和中期因子;以及
(iv)BTA、IL-13、IL12p70、中期因子和PAI-1/tPA。
8.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述生物标记物中的一种或多种为尿形式。
9.根据权利要求8所述的方法,其中每种生物标记物为尿形式。
10.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述方法还包括表征所述患者的感染状况的步骤。
11.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述样品是尿样品。
12.根据任一前述权利要求所述的方法,其中步骤(ii)包括将来自步骤(i)的生物标记物的测量浓度输入算法中,以使得所述算法的输出指示个体是否患有膀胱癌或处于患膀胱癌的风险中。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述算法的输出的敏感性为至少0.70。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述算法的输出的特异性为至少0.70。
15.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述患者表现出血尿。
16.一种固体载体材料,其包含附着于其上的结合分子,所述结合分子对IL-13和IL-12p70分别具有特异性亲和力,其中结合分子各自位于载体材料上的离散位置。
17.根据权利要求16所述的固体载体材料,其在每个离散位置还包含针对权利要求1中限定的其他生物标记物中的一种或多种的结合分子。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的固体载体材料,其中所述结合分子分别对表2或表3中限定的生物标记物具有亲和力。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的固体载体材料,其中所述结合分子分别对以下生物标记物具有亲和力:
(i)BTA、IL-13和IL12p70;
(ii)中期因子、IL-13和IL12p70;
(iii)BTA、IL-13、IL12p70和中期因子;以及
(iv)BTA、IL-13、IL12p70、中期因子和PAI-1/tPA。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的固体载体材料,其中所述结合分子是抗体。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的固体载体材料,其中所述载体是生物芯片。
22.一种用于检测女性患者中膀胱癌或膀胱癌风险的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)确定女性患者没有感染;
(ii)检测从所述女性患者分离的样品中一种或多种生物标记物的存在,其中所述一种或多种生物标记物选自IL-13、IL12p70、BTA和中期因子;
(iii)评估女性患者中膀胱癌的存在或膀胱癌的风险,其中检测到与正常对照相比升高的生物标记物的存在指示从其分离样品的女性患者中癌症的存在或癌症的风险。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述一种或多种生物标记物选自以下:
(i)IL-13+IL12p70
(ii)IL-13+BTA
(iii)IL-13+中期因子
(iv)IL12p70+BTA
(v)IL12p70+中期因子
(vi)BTA+中期因子。
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