CN107633869A - 基于多因子组合模型评价何首乌肝损伤易感性的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种基于多因子组合模型评价何首乌肝损伤易感性的方法及其应用，所述方法包括根据给药后个体对何首乌肝损伤易感性的差异，挑选对何首乌肝损伤易感和不易感的个体，分别组成易感集和不易感集；以两个集给药前血清中白介素‑1α(Interleukin‑1α，IL‑1α)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF‑α)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)等33种细胞因子中的一种或更多种和丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)为指标，运用多元Logistic回归、分类树及随机森林、带层次交互的lasso logistics回归等方法分析二者之间的相关性，并以细胞因子的单独或组合的浓度值构建预测模型，以预测何首乌肝损伤的易感人群。
Description
技术领域
本发明涉及药物免疫学领域，特别地涉及药物肝损伤个体易感性的研究。更详细地，本发明涉及一种基于多因子组合模型评价何首乌肝损伤易感性的方法及其应用。
背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥块根。临床应用有生何首乌和制何首乌之别，生品能够解毒、消痈、截疟、润肠通便，炮制品可以补肝肾、益精血、乌须发等。何首乌疗效确切，常用于临床用中药和大众保健食品中，传统认为是无毒的。
然而，近年来有关何首乌及其制剂导致肝损伤不良反应的报道大量增加，引起了国内外的广泛关注。何首乌所致的肝损伤是服用何首乌所导致的肝脏疾病，主要症状有黄疸、尿黄、乏力等，严重者导致肝衰竭甚至死亡。
但迄今为止，本领域未见关于何首乌肝损伤易感性评价方法的报道。本领域亟需开发一种用于何首乌肝损伤易感性的评价方法，通过找出具有预警作用的相关指标来识别何首乌肝损伤高危人群，以进一步提供何首乌临床合理用药水平。
发明内容
本申请提供了一种基于白介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-3(Interleukin-3，IL-3)、白介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-7(Interleukin-7，IL-7)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-9(Interleukin-9，IL-9)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、白介素-12(p70)(Interleukin-12(p70)，IL-12(p70))、白介素-13(Interleukin-13，IL-13)、白介素-16(Interleukin-16，IL-16)、白介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)、白介素-18(Interleukin-18，IL-18)、白介素-21(Interleukin-21，IL-21)、白介素-22(Interleukin-22，IL-22)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)、白介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白介素-37(Interleukin-37，IL-37)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、生长调节致癌基因α(GRO-α)、趋化因子-10(Interferon-inducible protein-10，IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein，MIP-lα)、粒细胞集落刺激因子(Granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、CX3CL1趋化因子(Fractalkine)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growthfactor-A，VEGF-A)等33种细胞因子的单独或组合的浓度值构建何首乌特异质肝损伤预测模型的方法。具体地，该方法包括下列步骤：
收集临床病例，于服用何首乌前采血，检测血清中肝功能相关生化指标如丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartatetransaminase，AST)等以及33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平；于服药第20±2天采血检查肝功，并于服药第40±2天、第60±2天采血复查肝功；
对所述临床患者的肝功能指标和33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行初步统计；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行多元Logistic回归分析，建立Logistic回归方程和模型；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行分类树及随机森林分析，建立分类树模型；和
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行带层次交互的lasso logistics回归分析，建立随机森林与Lasso相结合的模型。
本申请在一个方面提供了用于检测选自以下组成的组的细胞因子的剂在建立预测何首乌肝损伤的易感性的模型中的用途：白介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-3(Interleukin-3，IL-3)、白介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-7(Interleukin-7，IL-7)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-9(Interleukin-9，IL-9)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、白介素-12(p70)(Interleukin-12(p70)，IL-12(p70))、白介素-13(Interleukin-13，IL-13)、白介素-16(Interleukin-16，IL-16)、白介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)、白介素-18(Interleukin-18，IL-18)、白介素-21(Interleukin-21，IL-21)、白介素-22(Interleukin-22，IL-22)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)、白介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白介素-37(Interleukin-37，IL-37)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、生长调节致癌基因α(GRO-α)、趋化因子-10(Interferon-inducible protein-10，IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein，MIP-lα)、粒细胞集落刺激因子(Granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、CX3CL1趋化因子(Fractalkine)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growthfactor-A，VEGF-A)，其中以上述33种细胞因子的单独或组合的浓度值构建预测模型。
在一些实施方案中，可以以IL-7、IL-17A、TNF-α、IL-23和VEGF-A的浓度值构建Logistics线性回归模型，其中评估模型中单个预测变量的相对重要性排序为：VEGF-A、IL-17A、TNF-α、IL-7和IL-23。
在一些实施方案中，可以以IL-17A、GRO-α、G-CSF、IL-9、IL-37和IL-1α的浓度值构建分类树模型，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395”。
在一些实施方案中，可利用随机森林与Lasso相结合的模型对数据进行规则发现和变量筛选，其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“VEGF-A>＝345.33&IL-16<2.68”。
本申请在另一方面提供了一种预测何首乌肝损伤的易感性的方法，包括：
收集临床患者，于服用何首乌前采血，检测血清中肝功能相关生化指标和下列33种细胞因子中的一种或更多种的含量：白介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-3(Interleukin-3，IL-3)、白介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-7(Interleukin-7，IL-7)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)、白介素-9(Interleukin-9，IL-9)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、白介素-12(p70)(Interleukin-12(p70)，IL-12(p70))、白介素-13(Interleukin-13，IL-13)、白介素-16(Interleukin-16，IL-16)、白介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)、白介素-18(Interleukin-18，IL-18)、白介素-21(Interleukin-21，IL-21)、白介素-22(Interleukin-22，IL-22)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)、白介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白介素-37(Interleukin-37，IL-37)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、生长调节致癌基因α(GRO-α)、趋化因子-10(Interferon-inducible protein-10，IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein，MIP-lα)、粒细胞集落刺激因子(Granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、CX3CL1趋化因子(Fractalkine)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)和血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growthfactor-A，VEGF-A)；
于服药第20±2天采血检查肝功，并于服药第40±2天、第60±2天采血复查肝功；
对所述临床患者的肝功能指标和33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行初步统计；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行多元Logistic回归分析，建立Logistic回归方程和模型；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行分类树及随机森林分析，建立分类树模型；和
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行带层次交互的lasso logistics回归分析，建立随机森林与Lasso相结合的模型。
在一些实施方案中，所述肝功能相关生化指标可以是丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。
在一些实施方案中，可以以血清中IL-7、IL-17A、TNF-α、IL-23和VEGF-A的含量构建Logistics线性回归模型，其中评估模型中单个预测变量的相对重要性排序为：VEGF-A、IL-17A、TNF-α、IL-7和IL-23。
在一些实施方案中，可以以血清中IL-17A、GRO-α、G-CSF、IL-9、IL-37和IL-1α的含量构建分类树模型，其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395”。
在一些实施方案中，可以利用随机森林与Lasso相结合的模型对数据进行规则发现和变量筛选，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“VEGF-A>＝345.33&IL-16<2.68”。
附图说明
图1显示24例临床患者服药前的肝功能相关指标ALT和AST水平。
图2显示24例临床患者服药后肝功能相关指标ALT和AST的变化。
图3显示24例临床患者服药前血清中33种细胞因子的浓度水平。
图4显示Logisitic回归法建立的风险预测模型对测试集ROC曲线图。
图5显示重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型对测试集ROC曲线图。
图6显示重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型对训练集ROC曲线图。
图7显示分类树及随机森林模型图。
图8显示分类树及随机森林模型整体ROC曲线图。
图9显示分类树及随机森林模型对测试集ROC曲线图。
图10显示分类树及随机森林模型对训练集ROC曲线图。
图11显示利用随机森林与Lasso相结合的模型对数据进行规则发现和变量筛选。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种何首乌特异质肝损伤风险预测方法及应用，其中，该方法包括下列步骤：收集临床患者，于给药前采血分别检测血清中肝功能相关生化指标和33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平；于服药第20±2天采血检查肝功，并于服药第40±2天、第60±2天采血复查肝功；对所述临床患者的肝功能指标和33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行初步统计；对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行多元Logistic回归分析，建立Logistic回归方程和模型；对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行分类树及随机森林分析，建立分类树模型；和将所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量/浓度水平进行带层次交互的lasso logistics回归分析，建立随机森林与Lasso相结合的模型。
以下实施例中所使用的药品和试剂，无特别说明，均为普通市售商品。
实施例1
1.1临床患者收集
根据临床经验，何首乌(制首乌)用于治疗女性不孕不育疗效较好，但有个别患者有肝脏生化学指标异常的情况，提示可能存在少数易感人群对何首乌的肝毒性较普通人群更为敏感，值得进一步监测研究。为此，临床监测服用制首乌的不孕不育患者共120例，病例均来源于河南中医药大学第一附属医院。监测期中发现服用制首乌后肝功能生化指标ALT明显升高的患者(ALT≥2ULN(正常值上限))有6例，以1:3的比例匹配ALT未明显升高的患者(ALT＜2ULN)18例，共纳入研究24例。
考虑到临床上一旦发生药物性肝损伤，可能导致严重后果例如急性肝衰竭甚至死亡，为了最大化地保证临床患者的安全，本研究在临床监测中发现ALT上升1倍ULN以上的患者存在发生严重肝损伤的风险立即停止用药并密切关注肝功能，必要时给予保肝药物治疗，最大程度保证患者安全。因此，本研究重点是考察服用制首乌患者出现ALT升高(≥1ULN)即发生肝损伤风险的患者，而不是以严重肝损伤为考察目标。
1.2全自动生化分析仪分析制首乌给药前后的肝功能变化
所使用的仪器和试剂：
AU5800全自动生化分析仪，购于美国Beckman Coulter公司；
AST测定试剂盒(MDH法)、ALT测定试剂盒(乳酸脱氢酶法),均购于美国BeckmanCoulter公司。
将上述24例临床患者，分别于服药前、服药第20天及服药第40天、第60天肘部静脉采血，服药剂量根据患者个体状况采用10g/剂/日和15g/剂/日两种服药剂量，每个剂量12例患者，用药持续整个研究期间。室温下使全血凝集20～30min，1000xg离心10min，收集上清(血清)，分别使用ALT测定试剂盒(乳酸脱氢酶法)、AST测定试剂盒(MDH法)检测ALT和AST活性。临床患者服药前后的肝功能指标如表1、表2和图1、图2所示。
从表1、表2和图1、图2均可看出，服药前，24例临床患者肝功能正常，其检查指标ALT和AST基本在正常值范围内(0～40U/L)；服药后，24例临床患者中有6例临床患者的ALT活力和AST活力与服药前相比显著升高(P＜0.05)，而其余18例临床患者的ALT和AST水平与服药前相比则无明显变化(P＞0.05)。这一结果说明不同个体对何首乌肝损伤的易感性存在差异，何首乌引起的肝损伤属于特异质肝损伤。根据个体对何首乌肝损伤易感性的差异，选择被世界卫生组织推荐为肝损伤最敏感的检测指标ALT为评价指标，在24例样本群体中选择对何首乌肝损伤易感的个体组成易感集(ALT≥80U/L)，选择对何首乌肝损伤不易感的个体组成不易感集(ALT＜80U/L)。说明：对于表1、表2和图1、图2中ALT和AST的取值，易感集的患者在服药后ALT和AST变化波动大，故其取值为服药后ALT发生明显升高(ALT≥80U/L)时间点的数值；不易感集的患者在服药后ALT和AST变化波动小且数值基本在正常值范围内(0～40U/L)，故其取值为服药第60天的数值。
表1患者服药前后ALT的变化
表2患者服药前后AST的变化
1.3多因子定量分析测定24例临床患者服药前血清中33种细胞因子的含量
所使用的仪器和试剂：
MAGPIX(xPONENT4.2system)分析仪，购于美国Luminex公司；
多因子(Panel和单因子之间的组合)检测试剂盒：ProcartaPlex Human Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine Panel(18plex：IFN-γ、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、GM-CSF、IL-18、IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-9)(批号128668015)、ProcartaPlex Human IL-1alpha Simplex(批号127559101)、ProcartaPlexHuman IL-3Simplex(批号129612101)、ProcartaPlex Human IL-7Simplex(批号123311101)、ProcartaPlex Human IL-8(CXCL8)Simplex(批号135640102)、ProcartaPlexHuman IL-16Simplex(批号123571101)、ProcartaPlex Human IL-37Simplex(批号127664001)、ProcartaPlex Human Fractalkine(CX3CL1)Simplex(批号131022101)、ProcartaPlex Human VEGF-A Simplex(批号122671101)、ProcartaPlex Human IP-10Simplex(批号129220101)、ProcartaPlex Human MCP-1(CCL2)Simplex(批号135254201)、ProcartaPlex Human GRO alpha(KC/CXCL1)Simplex(批号136262102)、ProcartaPlex Human MIP-1alpha(CCL3)Simplex(批号132613102)、ProcartaPlex HumanEGF Simplex(批号137665101)、ProcartaPlex Human Eotaxin(CCL11)Simplex(批号129371101)、ProcartaPlex Human G-CSF(CSF-3)Simplex(批号132299101)，均购于美国eBioscience公司。
将上述24例患者于给药前肘部静脉采血，室温下让全血凝集20～30min，1000xg离心10min，收集上清(血清)，采用多因子检测试剂盒和Luminex液相芯片技术测定血清中IFN-γ、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、GM-CSF、IL-18、IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-9、Eotaxin、GRO-α、IL-1α、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、G-CSF、IL-3、IL-16、IL-37、Fractalkine、EGF、VEGF-A共33种细胞因子的含量。具体步骤如下：
(1)准备标准品。预先将10X Universal Assay Buffer稀释至1X备用。①将不同的标准品取出，全部2000g离心10s；②向其中一管标准品中加入250μL的1X Universal AssayBuffer；③轻轻混匀30s；④置于冰上5～10min。⑤将此管标准品中的所有液体全部转移至第二管标准品中，重复步骤③-④。⑥如果还有更多的标准品，重复步骤⑤。
(2)标准品的稀释(4倍倍比稀释)。①取出试剂盒中提供的PCR8联管用于稀释标准品；②向第一管(管1)中加入200μL步骤(1)中制备的混合标准品；③向管2-7中分别加入150μL的1X Universal Assay Buffer；④从管1中取50μL混合标准品加入管2中，上下吹打10次混匀，尽量避免气泡的产生；⑤更换新的移液器吸头，从管2中吸取50μL的稀释标准品转移到管3中，上下吹打10次混匀。依次转移，完成混合标准品的梯度稀释；⑥置于冰上备用。
(3)准备微球。①稀释10X的Wash Buffer至1X备用；②从试剂盒中取出微球，涡旋微球30s；③按照每混合1管微球，向96孔板中的每孔中加入50μL混合微球原则，根据实际需求量，各取等量的微球混合液于每个管中，混匀并加入到96孔板的孔内；④将96孔板放入磁性分离板中，确保孔板被牢牢卡住，待板静止2min，让微球沉底，然后将磁性分离板快速倒置，倒出孔板中的液体(此过程中不可将96孔板从磁性分离板中取出)；⑤向每孔中加入150μL 1X的Wash Buffer，静置30s，然后将磁板倒置，倒出孔板中的液体；⑥在倒置的状态下，用纸巾吸附孔板表面的残留液体。
(4)微球与样本孵育。①每孔加入25μL Universal Assay Buffer；②向指定孔中分别加入25μL标准品或样品；③向空白孔加入25μL Universal Assay Buffer；④孔板封膜，500rpm室温下振荡孵育60～120min或室温振荡孵育30min，然后4℃静置过夜孵育(孵育结束后，需室温震荡孵育30min后再进行下一步操作)。
(5)洗板。①将96孔板置于磁性分离板中，静置2min；②轻轻去除封膜，避免液体飞溅；③倒置，将孔板中的液体去掉；④向每孔中加入150μL Wash Buffer，静置30s，倒置，将孔板中的液体去掉，重复该步骤2次；⑤最后一次清洗结束时，用纸巾吸附残留液体。
(6)稀释检测抗体(50X至1X)(96tests)。分别取60μL检测抗体1和60μL生物素标记的检测抗体2，加入2880μL检测抗体稀释液，混匀，稀释好的抗体冰上备用。
(7)加入检测抗体。①每孔添加25μL稀释后的检测抗体；②使用新的封膜密封孔板；③将96孔板从磁性分离板中取出，置于孔板振荡器中500rpm室温振荡30min。
(8)洗板。重复步骤(5)。
(9)加链霉亲和素-PE(SA-PE)。①每孔添加50μL SA-PE溶液；②使用新的密封膜密封孔板；③将96孔板从磁性分离板中取出，至于孔板振荡器中500rpm室温振荡30min。
(10)洗板。重复步骤(5)。
(11)上机前准备。①每孔添加120μL Reading Buffer；②使用新的密封膜密封孔板；③将96孔板从磁性分离板中取出，至于孔板振荡器中500rpm室温振荡5min；④拆下封膜，放入Luminex仪器MAGPIX中读数。
(12)利用Luminex多功能液相芯片分析平台，使用ProcataPlex Analyst1.0分析数据，以标准品浓度(单位为pg/mL)作为横坐标，荧光强度作为纵坐标，进行Logistic回归，得出回归方程，继而将测定得到的样品荧光强度带入到回归方程，最终得出样品浓度(单位为pg/mL)。24例临床患者服药前的33种细胞因子的含量如图3所示。
图3中，A表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中EGF的含量；B表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中Eotaxin的含量；C表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中INF-γ的含量；D表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中GRO-α的含量；E表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中GM-CSF的含量；F表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中G-CSF的含量；G表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中Fractalkine的含量；H表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-1α的含量；I表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-5的含量；J表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-4的含量；K表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-3的含量；L表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-2的含量；M表示在易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-1β的含量；N表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-6的含量；O表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-12p70的含量；P表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-10的含量；Q表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-9的含量；R表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-8的含量；S表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-7的含量；T表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-13的含量；U表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-22的含量；V表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-21的含量；W表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-18的含量；X表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-17A的含量；Y表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-16的含量；Z表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-23的含量；Ω表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中TNF-α的含量；表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中MIP-1α的含量；&表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中MCP-1的含量；Σ表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IP-10的含量；Γ表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-37的含量；Φ表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中IL-27的含量；Ψ表示易感和不易感两个集中的临床患者服药前血清中VEGF-A的含量。
实施例2
血清中33种细胞因子的水平在肝损伤结局之间的差异
统计方法说明：
(1)正态分布连续变量用均值(标准差)描述，两组比较用t检验，多组比较用方差分析(ANOVA)，成组多重比较采用Tukey HSD检验法(Tukey Honestly SignificantDifferences testing)；
(2)非正态分布连续变量或等级(有序)变量用中位数(下四分位数；上四分位数)描述，组间比较用非参数Kruskall-Wallis秩和检验；成组多重比较采用Benjamini-Hochberg检验法；
(3)如果无法确定连续变量是否正态分布，则利用Shapiro-Wilk检验是否服从正态分布，取显著水平为0.01，然后再根据上面原则(1)和(2)进行统计检验；
(4)预测模型主要采用多元Logistic回归、分类树及随机森林、带层次交互的lasso logistics回归。
可能的肝损伤对象的各指标当ALT高于2倍正常值(即ALT≥80U/L)时定义为“以ALT值定义的肝损伤”，取值为1；低于2倍正常值定义为“以ALT值定义的无肝损伤”，取值为0；以是否发生实质性肝损伤为结局变量，对与肝损伤可能相关的肝细胞因子进行分析。
首先，我们对血清中33种细胞因子在肝损伤结局之间的差异，采用“统计方法说明”中的第(1)条原则，进行统计检验，以均值(标准差)的形式表示，得到的结果如表3。
表3服药前33种细胞因子的水平在以ALT值定义的肝损伤组间的比较1
用“统计方法说明”中的第(3)条原则，进行统计检验，以均值(标准差)或中位数(下四分位数，上四分位数)的形式表示，得到的结果如表4。
表4服药前33种细胞因子的水平在以ALT值定义的肝损伤组间的比较2
实施例3：
将所述33种细胞因子进行多元Logistic回归分析建立Logistic回归方程。假定一组协变量X，对p(X)＝P(Y＝1|X)进行建模，利用链接函数Logit，即
利用最大似然估计来拟合此模型，通过一个简单的变换有
称其为优势(odds)，且进一步有
其中
则获得Logistic回归方程：
以是否肝损伤为结局，血清中33种细胞因子为预测变量或影响因素。我们利用标度转换后的各指标数据进行Logistic回归模型分析。设定显著水平为0.2，则单因素分析结果显示，系数不为0的Wald检验p值小于0.2的指标如下：Fractalkine、TNF-α、IL-23。
然后再把这33种细胞因子放入多因素Logisitic回归模型中，采用逐步回归法，根据AIC评分准则，选择最优模型如表5。
表5Logisitic回归法建立的预测模型
根据每个模型参数的t统计量的绝对值，评估模型中单个预测变量的相对重要性，结果如表6。
表6Logisitic回归法评估模型中单个预测变量的相对重要性
根据模型对测试集的预测性能指标(如表7)及ROC曲线(如图4)，模型的总预测率为25％，真阳性率为50％，假阳性率为100％，阳性预测率为0％。
表7Logisitic回归法建立的预测模型对测试集的预测性能指标
构建预测模型时，最重要的是模型在测试集上对目标变量的预测效果。通过比较预测的目标变量与每个观察的观察值的差异，以总(分类)预测率、假阳性率、真阳性率、阳性预测率、阴性预测率或ROC曲线等指标来评价模型的预测效果。
当评估模型时，我们通常希望评估它在预测不同数据子集上的目标变量时的表现情况。这样一种技术称为k-折交叉验证，其将训练数据分割成k个相等大小的段(称为“折叠”)。一次折叠用于验证，而其他k-1折叠用于训练模型，以此模型预测验证数据中的目标变量。该过程重复k次，预测验证集的每个模型的性能，通过诸如准确度指标来评估。交叉验证的最常见的变化是10折交叉验证。
我们将数据随机分为训练集和测试集，比例为8:2，训练集中的数据用来建立模型，测试集的数据用来检验预测效果，对训练集重复抽样10-折交叉验证，评估最优模型预测效果及筛选重要变量，并给出模型的预测精度。重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型如表8。
表8重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型
根据模型对测试集的预测性能指标(如表9)及ROC曲线(如图5)，模型的总预测率为100％，真阳性率为100％，假阳性率为0％，阳性预测率为100％。
表9重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型对测试集的预测性能指标
根据模型对训练集的预测性能指标(如表10)及ROC曲线(如图6)，模型的总预测率为70.27％，真阳性率为80％，假阳性率为50％，阳性预测率为50％。
表10重复抽样10-折交叉验证筛选的最优Logistics回归模型对训练集的预测性能指标
实施例4
将所述33种细胞因子进行分类树及随机森林法分析建立预测模型。我们采用分类树模型对此数据进行分析，从各细胞因子中推理出合理树结构的表示形式。分类树的方法是采用从顶端向逐渐向下的递归方式，在树的内部结点进行了属性值的相互比较，并且根据得出的不同属性值再从该结点继续向下进行进一步的分支，叶结点则是需要好好学习划分的种类。从根部到叶的结点的一条路径就对应着相应的一条合取的规则，整个分类树对应的则是一组分析取得的表达式的规则。1986年Quinlan提出了著名的ID3算法。在ID3算法的基础上，1993年Quinlan又提出了C4.5算法。分类树算法对于数据假设很少，适用面广泛，而且模型的结果非常适合用于解释变量之间的关系。分类树一般用于分类型数据中，是一个常见而且有效的非线性关系模型。
本申请首先通过解释性好的分类树模型对数据的分类规则和变量的重要性进行直观展示，如图7。
随机森林是利用bootstrap方法，在分类树模型的基础上，同时不断随机抽取样本，以构建新的树，构造一定数量的分类树以后，将得到的多棵树组合，对模型进行综合评价的方法。它能够大大提高预测精度。
本数据采用随机森林的方法对变量进行建模。以是否肝损伤为结局，以33种细胞因子为预测变量或影响因素。将数据随机分为训练集和测试集，比例为8:2，训练集中的数据用来建立模型，测试集的数据用来检验预测效果，对训练集重复抽样10-折交叉验证，选出最优模型和重要变量，并给出模型的预测精度，其ROC曲线如图8。
根据各指标对模型Gini系数整体改善的贡献，来测量并排序每个指标对肝损伤的重要程度，结果如表11所示，对测试集的预测精度用ROC曲线展示如图9，对训练集的预测精度用ROC曲线展示如图10。
表11分类树及随机森林法评价的每个指标对肝损伤的重要程度
对随机森林进行10折交叉验证，筛选出最优模型，其对应的可解释的规则如表12。进一步利用频繁集规则，提取变量的两两及三三交互规则如表13。
表12对随机森林进行的10折交叉验证
表13利用频繁集规则提取变量的两两及三三交互规则
实施例5
将所述33种细胞因子的水平运行规则发现算法与变量选择算法相结合的分析建立预测模型。利用随机森林与Lasso相结合的模型对此数据进行规则发现和变量筛选，结果如图11。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (9)
1.用于检测选自以下组成的组的细胞因子的剂在建立预测何首乌肝损伤的易感性的模型中的用途：白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(p70)(IL-12(p70))、白介素-13(IL-13)、白介素-16(IL-16)、白介素-17A(IL-17A)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、白介素-22(IL-22)、白介素-23(IL-23)、白介素-27(IL-27)、白介素-37(IL-37)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、生长调节致癌基因α(GRO-α)、趋化因子-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-lα)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CX3CL1趋化因子(Fractalkine)、表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，其中以上述33种细胞因子的单独或组合的浓度值构建预测模型。
2.如权利要求1所述的用途，其中以IL-7、IL-17A、TNF-α、IL-23和VEGF-A的浓度值构建Logistics线性回归模型，并且其中评估模型中单个预测变量的相对重要性排序为：VEGF-A、IL-17A、TNF-α、IL-7和IL-23。
3.如权利要求1所述的用途，其中以IL-17A、GRO-α、G-CSF、IL-9、IL-37和IL-1α的浓度值构建分类树模型，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395”。
4.如权利要求1所述的用途，其中利用随机森林与Lasso相结合的模型对数据进行规则发现和变量筛选，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“VEGF-A>＝345.33&IL-16<2.68”。
5.一种预测何首乌肝损伤的易感性的方法，包括：
收集临床患者，于服用何首乌前采血，检测血清中肝功能相关生化指标和下列33种细胞因子中的一种或更多种的含量：白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(p70)(IL-12(p70))、白介素-13(IL-13)、白介素-16(IL-16)、白介素-17A(IL-17A)、白介素-18(IL-18)、白介素-21(IL-21)、白介素-22(IL-22)、白介素-23(IL-23)、白介素-27(IL-27)、白介素-37(IL-37)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、生长调节致癌基因α(GRO-α)、趋化因子-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-lα)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CX3CL1趋化因子(Fractalkine)、表皮细胞生长因子(EGF)和血管内皮生长因子-A(VEGF-A)；
于服药第20±2天采血检查肝功，并于服药第40±2天、第60±2天采血复查肝功；
对所述临床患者的肝功能指标和33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行初步统计；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行多元Logistic回归分析，建立Logistic回归方程和模型；
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行分类树及随机森林分析，建立分类树模型；和
对所述临床患者服药前的33种细胞因子中的一种或更多种的含量进行带层次交互的lasso logistics回归分析，建立随机森林与Lasso相结合的模型。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述肝功能相关生化指标是丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中以血清中IL-7、IL-17A、TNF-α、IL-23和VEGF-A的含量构建Logistics线性回归模型，并且其中评估模型中单个预测变量的相对重要性排序为：VEGF-A、IL-17A、TNF-α、IL-7和IL-23。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中以血清中IL-17A、GRO-α、G-CSF、IL-9、IL-37和IL-1α的含量构建分类树模型，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“IL-9>8.395&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-37<＝22.31”或“G-CSF<＝7.43&IL-9>8.395”。
9.如权利要求5或6所述的方法，其中利用随机森林与Lasso相结合的模型对数据进行规则发现和变量筛选，并且其中可预测或可解释肝损伤的指标取值组合为：“VEGF-A>＝345.33&IL-16<2.68”。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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