CN102899398B - 用于胃癌检测的标记物 - Google Patents

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Abstract

肿瘤的早期检测是患有肿瘤（包括胃肿瘤）的患者存活的主要决定因素。GTM基因家族成员在胃肿瘤组织和其它肿瘤组织中过表达，因此其可以用作胃癌和其它类型癌症的标记物。GTM蛋白质可以从癌细胞中释放出来，并在血清和/或其它体液中达到足够高的浓度从而得以检测它们。因此，用于GTM检测和定量的方法和检测试剂盒能够提供胃癌诊断的有价值的工具。

Description

用于胃癌检测的标记物
本申请是申请日为2004年7月16日的、发明名称为“用于胃癌检测的标记物”的中国专利申请200480026675.8(PCT/US2004/022959)的分案申请。
相关申请
依据美国法典第35卷第119条（35U.S.C.119），本申请要求美国临时专利申请序列号60/487,906的优先权，美国临时专利申请序列号60/487,906为2003年7月17日提交的，标题为“用于胃癌检测的标记物”，发明者为Parry John Guilford。上述申请在本文完全整合作为参考。
发明领域
本发明涉及癌症的检测。具体而言，本发明涉及用于癌症检测的遗传标记物和/或蛋白质标记物的用途，并且更加具体而言涉及到遗传标记物和/或蛋白质标记物用于胃癌检测的用途。
发明背景
癌症的早期检测和治疗能显著提高癌症患者的存活。以胃癌为例，诊断为疾病早期的患者5年存活率为90％，而诊断为疾病晚期的患者5年存活率约为10％。然而，绝大多数胃癌患者通常处于疾病晚期。因此，开发胃癌早期诊断方法能够改善患者的预后。
在包括体液如血液、尿液、腹膜灌洗液和粪便提取物在内的生物标本中的特异性癌症相关标记物的鉴定能提供有价值的癌症早期诊断方法，以便早期治疗并改善预后。特异性癌症标记物还能提供用于监测疾病进展的方法，从而能跟踪外科手术、放射治疗和化学治疗的功效。然而，对于许多主要癌症，可利用的标记物缺乏足够的敏感性和特异性。例如，用于胃癌的最常用标记物ca19-9、ca72-4和癌胚抗原（CEA）仅检测到大约15-50％的任何阶段的胃肿瘤，对于疾病早期的检测则降至大约2-11％。因此，出现假阴性检测的频率非常高，这导致患者和健康护理工作者认为不存在疾病，而事实上，患者可能患有严重的需要立即注意的癌症。而且，使用这些标记物可能对高达1/3的患有良性胃疾病个体给出假阳性信号。
发明简述
因此，迫切需要更好的检测癌症存在的方法。本发明方面提供了能够检测早期癌症和降低假阳性和假阴性测试结果频率的方法、成分和装置。
在某些实施方案中，可以使用分子分析来鉴定与非恶性胃组织相比在胃肿瘤组织中过表达的基因。此分析包括微阵列和定量聚合酶链反应(qPCR)方法。癌基因和由那些基因编码的蛋白质在本文中称作胃肿瘤标记物(GTM)。需要理解的是术语GTM并不要求标记物仅仅对于胃肿瘤是特异的。而是应当解释为：GTM可以在包括恶性或非恶性肿瘤在内的其他类型肿瘤中表达增加，其中所述肿瘤除此之外包括胃癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌(例如：黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宫内膜癌和脑癌。无论如何应当这样理解，即术语GTM不包括在先技术标记物ca19-9、ca72-4和CEA。一些GTM的过表达足以高度可靠地诊断胃癌，而且在其它情况下，两种或多种GTM的过表达能提供胃癌的可靠诊断。
在某些实施方案中，可以用微阵列方法来检测一种或多种癌相关基因的过表达模式。
在其它实施方案中，可以用定量聚合酶链反应(qPCR)来鉴定肿瘤或其它生物样品中过表达标记物的存在。
在本文公开的一些GTM检测的实施方案中，GTM在肿瘤细胞内以高度选择方式过表达而在非肿瘤细胞即使表达也是很少，从而能够只检测一种过表达的GTM来对癌症进行敏感和精确检测。在其它实施方案中，可以在样品中检测两种、三种或更多GTM的过表达并从而能提供更大的诊断确定性。
所选择基因编码的蛋白质能够被细胞分泌出来或从细胞中穿透出来。这些蛋白质可以单独或彼此联合用作诊断胃癌的血清或体液标记物或者作为监测所确定疾病进展的标记物。可以使用本领域已知的方法开展蛋白质标记物的检测，并且所述方法包括单克隆抗体、多克隆抗血清等的使用。
附图简述
关于其特定实施方案和图在本发明中进行了描述，其中：
图1描述了本发明的胃癌标记物及其寡核苷酸序列列表。
图2描述了用微阵列方法进行研究获得的结果列表。
图3描述了用定量PCR进行研究获得的结果列表。
图4a-4d描述了用微阵列方法和qPCR方法获得的倍数的log2数值结果之间的关系，其中对于四种胃癌标记物数据集中于中间的正常值。灰色方块对应非恶性肿瘤(“正常”)样品，而黑色三角对应肿瘤样品。图4a：ASPN。图4b：SPP1。图4c：SPARC。图4d：MMP12。
图5a-5w描述了显示从定量PCR研究获得的多种肿瘤标志物的相对频率对变化倍数的log2数值的柱状图。图5a：ASPN；图5b：CST1、2和4；图5c：CSPG2；图5d：IGFBP7；图5e：INHBA；图5f：LOXL2；图5g：LUM；图5h：SFRP4；图5i：SPARC；图5j：SPP1；图5k：THBS2；图5l：TIMP1；图5m：adlican；图5n：PRS11；图5o：ASAH1；图5p：SFRP2；图5q：GGH；图5r：MMP12；图5s：KLK10；图5t：LEPRE1；图5u：TG；图5v：EFEMP2和图5w：TGFBI。
图6是显示表达高于中间正常表达的第95百分位数的肿瘤标记物数量的柱状图。结果以qPCR数据为基础并分别显示了每一份肿瘤样品的结果。
图7a-7c描述了与肿瘤标记物CEA基因表述相比，在单个肿瘤样品和非恶性肿瘤样品中标记物的相对的log2表达图。CEA是当前最常用的用于监测胃癌进展的血清标记物。
图8显示的是图3的补充列表。图8总结了用qPCR检测候选肿瘤标记物的表达水平，但是使用的是配对数据(即肿瘤(“T”)和非恶性肿瘤(“N”)样品来自同一个体)从而提供T∶N比。图8还包括了图3中未包括的其它标记物，即MMP2，CGR11，TGFB1，PCSK5，SERPINB5，SERPINH1。为了比较，也显示了已经建立的血清标记物基因CEACAM5(CEA)的表达水平。在29个标记物中有27个具有高于或等于CEA的T∶N差异中值。此外，与CEA相比，全部29个标记物在配对样品中具有较高的百分比，其中在肿瘤样品中标记物的表达超过在正常样品中的表达。CST1，2，4、ASPN和SFRP4三种标记物在配对的肿瘤样品和正常样品之间的表达显示出100％的差异。本文显示了这三种标记物的基因序列以及用来检测它们的引物和探针位置。
图9a-9d描述了29种胃癌标记物在40位患者的配对样品中的单个的及中值的T∶N变化倍数数据。
图10a-10ad描述了CEA和本发明中其它GTM表达在肿瘤分期和变化倍数的log2数值间的关系图。图10a：adlican；图10b：ASPN；图10c：CSPG2；图10d：CST1，2，4；图10e：EFEMP2；图10f：GGF；图10g：INHBA；图10h：IGFBP7；图10i：KLK10；图10j：LEPRE1；图10k：LUM；图10l：LOXL2；图10m：MMP12；图10n；TIMP1；图10o：ASAH1；图10p：SPP1；图10q：SFRP2；图10r：SFRP4；图10s：SPARC；图10t：PRSS11；图10u：THBS2：图10v：TG；图10w：TGFBI；图10x：CGR11；图10y：SERPINH1；图10z：MMP2；图10aa：PCSK5；图10ab：SERPINB5；图10ac：TGFB1和图10ad：CEA(CEACAM5)。
图11a-11ad描述了本发明的29种GTM和CEA表达在肿瘤类型(扩散型(D)和肠型(I))和变化倍数的log2数值间的关系图。图11a：adlican；图11b：ASPN；图11c：CSPG2；图11d：CST1，2，4；图11e：EFEMP2；图11f：GGH；图11g：INHBA；图11h：IGFBP7；图11i：KLK10；图11j：LEPRE1：图11k：LUM；图11l：LOXL2；图11m：MMP12；图11n：TIMP1；图11o：ASAH1；图11p：SPP1；图11q：SFRP2；图11r：SFRP4：图11s；SPARC；图11t：PRSS11：图11u：THBS2；图11v：TG；图11w：TGFBI；图11x：CGR11；图11y：SERPINH1；图11z：MMP2；图11aa：PCSK5；图11ab：SERPINB5；图11ac：TGFB1和图11ad：CEA(CEACAM5)。
图12描述了显示三种标记物SERPINH1、CST1，2，4和INHBA在一系列胃肿瘤样品和非恶性肿瘤胃样品中表达的三维图。
图13描述了显示多重标记物对精确区分肿瘤组织和非恶性肿瘤组织能力的影响的表。此表来自qPCR数据的正态分布。
图14是来源于肿瘤和非肿瘤组织的4种肿瘤标记物的Western印迹。
图15是胃癌组织和血清中肿瘤标志物SPARC的Western印迹。
图16是胃细胞系AGS上清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的免疫印迹。
发明详述
定义
在详细描述本发明的实施方案之前，提供本文使用的一些术语的定义是有用的。
术语“GTM”或“胃肿瘤标记物”或“GTM家族成员”指与胃癌有关的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白质或相关蛋白质片段或者其它鉴别分子，其中不包括在先技术已知的与胃癌相关的分子ca19-9、ca72-4和CEA。下文包括了GTM实例。
述语“标记物”指在数量和质量上与生物现象的存在相关的分子。“标记物”的实例为GTM，然而，“标记物”还包括与不良状况形成机制直接相关或者间接相关的代谢产物、副产物。
术语“qPCR”指定量聚合酶链式反应。
术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如Western印迹上斑点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
术语“CPN2”指人羧肽酶N多肽2(83kDa的链)和羧肽酶N。
术语“HAPLN4”指人透明质酸糖蛋白连接蛋白4。
术语“MMP12”指人基质金属蛋白酶12。
术语“INHBA”指人抑制素βA(还包括激活蛋白A、激活蛋白AB或α多肽)。
术语“IGFBP7”指人胰岛素样生长因子结合蛋白7。
术语“GGH”指人γ谷氨酰水解酶(也称作结合酶、叶酰聚γ谷氨酰水解酶)。
术语“LEPRE1”指人富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(也称作leprecan1)。
术语“CST4”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S。
术语“SFRP4”指人分泌型frizzled相关蛋白4。
术语“ASPN”指人asporin(也称作1类LRR)。
术语“CGREF1”或“CGR11”指具有EF手型结构域1的人细胞生长调节因子。
除非另外说明，术语“KLK”指人激肽释放酶10变体1、或者人激肽释放酶10变体2、或者两者。
术语“TIMP1”指人金属蛋白酶组织抑制剂1(也称作促红细胞活性剂(erythroid potentiating activity)或胶原酶抑制剂)。
术语“SPARC”指富含半胱氨酸的人分泌型酸性蛋白质(也称作骨粘连蛋白)。
术语“TGFBI”指68kDa的人转化生长因子β诱导蛋白(transforminggrowth factor，beta-induced，68kDa)。
术语“EFEMP2”指包含EGF的纤蛋白样细胞外基质蛋白质2。
术语“LUM”指人光亮蛋白聚糖。
术语“SNN”指人stannin。
术语“SPP1”指人分泌型磷蛋白1(也称作骨桥蛋白或骨唾液酸蛋白I或早期T-淋巴细胞活化剂1)。
术语“CSPG2”指人硫酸软骨素蛋白聚糖2(也称作多功能蛋白聚糖)。
术语“ASAH1”指人N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体1，或者N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体2，或者N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体1和2(也称作酸性神经酰胺酶1变体1和2)。
术语“PRSS11”指人丝氨酸蛋白酶11(也称作IGF结合丝氨酸蛋白酶)。
术语“SFRP2”指人分泌型frizzled相关蛋白2。
术语“PLA2G12B”指人XIIB组磷脂酶A2。
术语“SPON2”指人细胞外基质蛋白质spondin 2。
术语“OLFM1”指人嗅介蛋白1。
术语“TSRC1”指人包含重复的血小板反应蛋白1(thrombospondinrepeat containing 1)。
术语“THBS2”指人血小板反应蛋白2。
术语“adlican”指DKFZp564I1922。
术语“CST2”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA。
术语“CST1”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。
术语“LOXL2”指人赖氨酰氧化酶样酶2。
术语“TG”指人甲状腺球蛋白。
术语“TGFB1”指人转化生长因子，β1。
术语“SERPINH1”指人丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝H(也称作热休克蛋白47成员1或胶原结合蛋白1)。
术语“SERPINB5”指人丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝B(也称作卵清蛋白成员5)。
术语“CEACAM5”或“CEA”指人癌胚抗原相关细胞黏附分子5。
术语“MMP2”指人基质金属蛋白酶2(也称作明胶酶A或72kDa明胶酶或72kDa IV型胶原酶)。
术语“PCSK5”指人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5(proprotein convertase subtilisin/kexin type 5)。
应当理解，上述术语可以指蛋白质、DNA序列和/或RNA序列。还应当理解，上述术语还可以指具有与本文所述相同序列的非人类蛋白质、DNA和/或RNA。
本发明实施方案详述
本发明提供了在检测胃癌方面比在先技术的标记物可靠性更高的用于检测和评价肿瘤(包括胃癌)的标记物。术语“可靠性”包括不存在假阳性和/或假阴性。因此，标记物的可靠性越高，与使用此标记物所作出的诊断相关的假阳性和/或假阴性就越少。所以，在某些实施方案中，提供了允许胃癌检测可靠性比为50％左右的先技术标记物可靠性更高的标记物。在其它实施方案中，提供了可靠性大于70％左右的标记物；在其它实施方案中，提供了可靠性大于73％左右的标记物；还是在其它实施方案中，提供了可靠性大于80％左右的标记物；在更进一步的实施方案中，提供了可靠性大于90％左右的标记物；还是在其它实施方案中，提供了可靠性大于95％左右的标记物；在更进一步的实施方案中，提供了可靠性大于98％左右的标记物并且在某些实施方案中，提供了可靠性为大约100％的标记物。
因此，我们已经意外发现了许多其存在与胃肿瘤相关的基因和蛋白质。因此，对基因产物(例如寡核苷酸诸如mRNA)以及从该寡核苷酸翻译而来的蛋白质和肽的检测能用来诊断肿瘤，如胃肿瘤。对来自胃肿瘤患者的肿瘤组织和同一受试者非恶性肿瘤组织的样品进行阵列分析，意外地发现在很多胃肿瘤中某些基因过表达的特定模式与疾病相关。
还可以使用抗癌标记物的抗体检测癌标记物。
通过分析多个癌标记物的存在和表达量从而能提高诊断敏感性同时降低假阳性和/或假阴性结果的频率。
癌症检测的一般方法
以下方法是使用GTM家族成员检测包括胃癌在内的癌症的非限定性方法。
·使用对GTM基因产物具有选择性的寡核苷酸探针的微阵列方法。
·使用标记物特异性引物和探针对肿瘤样品和正常样品进行实时定量PCR(qPCR)。
·酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
·使用抗标记物的抗体对胃肿瘤和淋巴结转移进行免疫组织化学分析。
·使用抗标记物的抗体对其它肿瘤进行免疫组织化学分析，其中所述的其它肿瘤包括但不限于结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宫内膜癌和脑癌。
·对胃癌患者手术切除肿瘤之前和之后留取血清中的标记物家族成员进行免疫检测。
·对健康个体和患有非恶性肿瘤疾病(例如胃炎、溃疡、胃上皮化生和发育异常)个体血清中的标记物家族成员进行免疫检测。
·对其它癌症患者中的标记物家族成员进行免疫检测，其中所述的其它癌症包括但不限于结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宫内膜癌和脑癌。
·对体液中的标记物进行检测，其中所述的体液包括血清、淋巴液、腹膜液、脑脊液、滑液等。
·对胃癌患者胃液、腹膜灌洗液、尿液和粪便中的标记物家族成员进行免疫检测。使用阵列方法和/或qPCR。
·使用计算机对阵列数据或qPCR数据进行分析。收集原始数据并通过比较胃肿瘤基因表达水平和同一基因在非肿瘤组织中的表达水平进行变化倍数分析。提供用于断定表达增加的阈值(例如，1.5倍增加、2倍增加，并且在备选的实施方案中为3倍增加、4倍增加或5倍增加)。应该意识到，用于断定已发生表达增加的其它阈值可以在不脱离本发明的范围内选择。对肿瘤基因表达的进一步分析包括将呈现出表达增加的那些基因与已知胃肿瘤表达谱相匹配以便诊断肿瘤。
在某些方面，本发明提供了检测癌症的方法，其包括：
(a)准备生物学样品；和
(b)检测GTM家族成员在所述样品中的过表达。
在其它方面，本发明包括检测GTM mRNA过表达的步骤。
在其他方面，本发明包括检测GTM蛋白质过表达的步骤。
在更进一步的方面，本发明包括检测GTM肽过表达的步骤。
在仍然进一步的方面，本发明包括检测GTM的装置，其包括：
其上具有GTM捕获试剂的基质；和
与所述基质关联的检测器，所述检测器能够检测与所述捕获试剂相关的GTM，其中捕获试剂包括寡核苷酸或抗体。
另外的方面包括用于检测癌症的试剂盒，其包含：
基质；
GTM捕获试剂，其包含一种或更多GTM特异性寡核苷酸和
GTM特异性抗体；和
使用说明书。
本发明更进一步的方面包括使用qPCR检测GTM的方法，其包括：
对所述GTM特异的正向引物；
对所述GTM特异的反向引物；
PCR试剂；
反应小管；和
使用说明书。
本发明的另外方面包括检测GTM蛋白质或肽存在的试剂盒，其包含：
具有针对所述GTM蛋白质或肽的捕获试剂的基质；
对所述GTM蛋白质或肽特异的抗体；
能够对针对所述GTM蛋白质或肽的结合抗体进行标记的试剂；
和
使用说明书。
在更进一步的方面，本发明包括检测胃癌的方法，其包括步骤：
从怀疑患有胃癌的患者准备样品；
用ELISA方法测定GTM蛋白质的存在。
如本文所描述，肿瘤检测可以通过测定一种或更多肿瘤特异性标记物的表达来完成。我们已经意外发现GTM的增强表达与所诊断胃癌存在之间的相关性非常高。检测到的最小显著相关性的p值约1.6×10-6。许多相关性在p值小于10-20时具有意义。由于具有如此高的显著性，就不必检测一种以上GTM的增强表达。然而，本发明过多的GTM能够提高胃癌检测的可靠性。
本文提供的方法还包括高敏感性的测定法。qPCR非常灵敏从而能用来检测样品中拷贝数非常低(例如，1-100)的基因产物。这样的敏感性使得对胃癌相关事件的极早检测成为可能。
方法
下面的普通方法用来评价用于胃癌相关标记物分子鉴定的多种方法的适宜性。
肿瘤收集
从韩国的首尔大学医院和新西兰的Dunedin医院手术切除样品中收集胃肿瘤样品和非恶性胃组织。胃癌诊断是基于症状、体检发现和对组织的组织学检查做出的。
RNA提取
在一些实施方案中，通过测定肿瘤样品中RNA的变化分析胃癌相关基因的表达。将冰冻的手术样品包埋入OCT介质中。使用切片机从组织块中切出60μM厚的切片，放入TriReagent∶水(3∶1)混合物中匀浆，再用氯仿抽提。然后用RneasyTM方法(Qiagen)从水相中纯化总RNA。同样也从16种癌细胞系中提取RNA并且合并后作为参考RNA。
微阵列玻片制备
环氧树脂包被的玻片从MWG Biotech AG(Ebersberg，德国)获得，并且使用Gene Machines微阵列机器人并根据厂商提供的方法在上面印上～30,000条50mer寡核苷酸。图2显示了相关寡核苷酸的参考号(MWGoligo#)以及NCBI mRNA和蛋白质参考序列。下文还显示了本发明GTM的全部DNA序列。
RNA标记和杂交
用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)在包含5-(3-氨烷基)-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的反应中将10μg总RNA转录为cDNA。反应产物经Microcon柱去离子之后，与Cy3或Cy5在碳酸氢缓冲液中室温孵育1小时。经Qiaquick柱(Qiagen)去除未结合的染料，并在SpeedVac中浓缩样品至15μL。然后，Cy3和Cy5标记的cDNA与Ambion ULTRAhyb缓冲液混合，100℃变性2分钟，在杂交盒中与微阵列玻片于42℃杂交16小时。然后洗涤玻片并用Axon 4000A扫描仪在两种功率设置下进行两次扫描产生基因表达的初步荧光数据。
归一化方法
为比较肿瘤组织和非癌组织中癌基因的表达，应用Genepix软件检测的平均荧光强度通过减去局部背景荧光强度得以校正。背景校正强度少于零的点被排除。为了易于归一化，将强度比和总体点强度进行对数(log)转换。对数转换后的强度比通过用LOCFITTM软件包进行局部回归来校正着色误差(dye bias)和空间误差(spatial bias)。对数转换的强度比同时对总体点强度和位置回归。局部回归残差提供了经校正的变化倍数对数值。对于质量控制，每个归一化微阵列的比率对于点强度和位置进行了绘图。随后肉眼检测图中可能的残余假象。另外，应用方差分析(ANOVA)模型来检测针尖误差(pin-tip bias)。将所有归一化结果和参数插入Postgres数据库进行统计学分析。
统计学分析
在肿瘤样品对正常组织中基因表达中的统计学意义变化可通过测定阵列之间的变化倍数进行鉴定。为实现此鉴定，将log2(比率)按比例调整至每个阵列具有相同的总体标准差。此标准化步骤减少了平均的组织种类内变异性。对于每一个寡核苷酸，将log2(比率)进一步转换至中位数值为零的结果从而易于肉眼检察。然后应用以变化倍数为基础的秩检验改善噪音鲁棒性。此检验由两个步骤组成：(i)计算阵列内变化倍数的等级(rankof fold change)(Rfc)，和(ii)将肿瘤组织的中值(Rfc)减去正常组织的中值(Rfc)。两个中值等级的差异限定了图2中给出的变化倍数等级的范围。另外两个统计学检验也根据此标准化数据进行：1)进行和不进行Bonferroni调整的两组样品student′s t-检验；和2)Wilcoxon检验。
标记物组合的统计学分析
为了确定使用两种或三种标记物组合区分肿瘤和非恶性肿瘤样品的数值，对来自40份配对样品(来自同一患者的肿瘤样品和非恶性肿瘤样品)的qPCR数据进行下面的分析。使用样品平均值和标准差得到非恶性肿瘤样品和肿瘤样品的正态分布。然后确定来自肿瘤表达数据的值可能超过非恶性肿瘤分布中所规定阈值(例如，大于50％、70％、73％、80％、90％、95％、98％、99％或100％)的可能性(即敏感性)。对于标记物组合，确定了至少一种标记物表达超过阈值的可能性。
定量实时PCR
在其它实施方案中，实时PCR或者定量PCR(qPCR)能用来对PCR模板拷贝数进行绝对或相对定量。使用Primer Express V2.0TM(AppliedBiosystems)设计TaqmanTM探针和引物。如果可能，在所得的扩增子中尽可能包括所有潜在的剪接变体，其中扩增子优选为MWG-Biotech来源微阵列寡核苷酸所涵盖的区域。备选地，如果靶基因是由涵盖目的扩增子的Assay-on-Demand表达分析(Applied Biosystems)所给出的，则可使用这些基因。表1和图1显示了基因名称、符号、Applied Biosystems“assayon demand”号、用于qPCR的正向引物、反向引物以及探针序列。在内部设计分析中，使用SYBR绿色标记方法和由参考RNA得到的cDNA滴定引物浓度。在ABI PrismTM 7000序列检测系统中于标准循环条件下进行扩增。当从解离曲线中观察到单一扩增产物时，使用最佳引物浓度和终浓度为250nM 5’FAM-3’TAMRA磷酸TaqmanTM探针(Proligo)可得到超过625倍浓度范围的标准曲线。在后续分析中使用了能够给出回归系数大于0.98的标准曲线的分析法。应该意识到，在其它实施方案中，回归系数不需要如此高。而是可以使用任何标准曲线，只要回归系数高到足以允许测定表达差异的统计学意义即可。在备选的实施方案中，此回归系数可以大于大约0.7、大于大约0.8、大于大约0.9或者大于大约0.95。
在两块96孔板上对代表每一个RNA样品的单一cDNA进行分析。每一块板包括两份的参考cDNA标准曲线，其浓度范围超过625倍。分析包括ΔCT(靶基因CT-平均参考cDNA CT)的计算。ΔCT与变化倍数的log2值的负值成比例。再计算相对于非恶性肿瘤变化倍数log2值中值的变化倍数log2值(倍数变化的log2值-正常的变化倍数log2值的中值)。然后将这些变化倍数以频率分类并作图。
癌症标记物基因的微阵列分析
用Cy5标记来自58份胃肿瘤组织样品和58份非恶性肿瘤(“正常”)胃组织样品的RNA，并与Cy3标记的参考RNA一式两份或一式三份进行杂交。在归一化之后，在29,718个基因中每一个基因的表达变化通过三种测定进行估计：(i)变化倍数：基因在肿瘤样品中的表达中值(非标准化)除以在非恶性肿瘤样品中的水平中值的比值，(ii)变化倍数的等级，以及(iii)所观察的倍数变化具有显著性的统计学概率。
用于胃恶性肿瘤的血清标记物的选择
在某些实施方案中，可以在包括血清在内的生物体液中发现癌症标记物。血清标记物选自阵列数据，其基于(i)以分泌蛋白质或膜外裂解为特征的信号序列的存在，(ii)与非恶性肿瘤对照样品相比，标记物在肿瘤样品中过表达(变化倍数)的水平中值，(iii)标记物在肿瘤样品和非恶性肿瘤对照样品之间表达等级的中值变化，以及(iv)在肿瘤样品和非恶性肿瘤对照样品中表达范围之间的重叠程度。
已知全部29种GTM在其编码序列的5’末端具有信号肽序列。信号序列引导GTM蛋白质通过质膜转运至细胞外区室(Gunner von Heijne，Journal of Molecular Biology 173：243-251(1984))。此外，没有一个GTM具有可导致全长蛋白质滞留在质膜内的跨膜序列基序。因此，本发明的所有GTM标记物很可能分泌至细胞外区室，并因此与脉管系统接触(通过毛细管吸收，或者先转运至淋巴系统然后再转运至脉管系统)。结果，这些肿瘤来源的每一个标记物会出现在血液中。
再者，如果＞50％的肿瘤样品显示基因表达水平位于非恶性肿瘤样品范围的第95百分位数之内，则基因被排除。肿瘤样品中过表达程度的变化不仅反映了肿瘤异质性，而且反映了肿瘤样品被“正常”组织(包括肌肉、基质细胞和非恶性上皮腺)污染程度的变化。“正常”污染范围为5-70％，其中值大约为25％。其它基因由于在造血细胞中相对高表达或在化生胃组织中表达增加而被排除。应该意识到，取决于正常细胞或正常表达标记物的细胞的污染程度，可以选择能够使癌症源和正常源充分分离的不同阈值范围。
我们发现有有用GTM包括下面标记物的基因(DNA)、互补DNA(cDNA)、RNA、蛋白质和蛋白质片段，其中所述标记物有：羧肽酶N多肽2，83kDa的链(也称作羧肽酶N(CPN2))、基质金属蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“TNHBA”)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(“IGFBP7”)、γ谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(“CST4”)、分泌型frizzled相关蛋白4(“SFRP4”)、asporin(“ASPN”)、具有EF手型结构域1的细胞生长调节因子(“CGREF1”)、激肽释放酶(“KLK10”)、金属蛋白酶组织抑制剂1(“TIMP1”)、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白质(“SPARC”)、转化生长因子β诱导蛋白(“TGFBI”)、包含EGF的纤蛋白样细胞外基质蛋白质2(“EFEMP2”)、光亮蛋白聚糖(“LUM”)、stannin(“SNN”)、分泌型磷蛋白1(“SPP1”)、硫酸软骨素蛋白聚糖2(“CSPG2”)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、丝氨酸蛋白酶11(“PRSS11”)、分泌型frizzled相关蛋白2(“SFRP2”)、XIIB组磷脂酶A2(“PLA2G12B”)、细胞外基质蛋白质spondin 2(“SPON2”)、嗅介蛋白1(“OLFM1”)、包含重复的血小板反应蛋白1(“TSRC1”)、血小板反应蛋白2(“THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA(“CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN(“CST1”)、赖氨酰氧化酶样酶2(“LOXL2”)、甲状腺球蛋白(“TG”)、转化生长因子β1(“TGFB1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝H(“SERPINH1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝B(“SERPINB5”)、基质金属蛋白酶2(“MMP2”)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5(“PCSK5”)以及透明质酸糖蛋白连接蛋白4(“HAPLN4”)。
本发明GTM的DNA序列以及鉴定信息一起示于下面。
基质金属蛋白酶12
>gi|4505206|ref|NM_002426.1|人类基质金属蛋白酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)(MMP12)，mRNA|qPCR正向引物匹配[758..780]|qPCR反向引物匹配[888..864]|qPCR探针匹配[786..815]
TAGAAGTTTACAATGAAGTTTCTTCTAATACTGCTCCTGCAGGCCACTGCTTCTGGAGCTCTTCCCCTGAACAGCTCTACAAGCCTGGAAAAAAATAATGTGCTATTTGGTGAGAGATACTTAGAAAAATTTTATGGCCTTGAGATAAACAAACTTCCAGTGACAAAAATGAAATATAGTGGAAACTTAATGAAGGAAAAAATCCAAGAAATGCAGCACTTCTTGGGTCTGAAAGTGACCGGGCAACTGGACACATCTACCCTGGAGATGATGCACGCACCTCGATGTGGAGTCCCCGATCTCCATCATTTCAGGGAAATGCCAGGGGGGCCCGTATGGAGGAAACATTATATCACCTACAGAATCAATAATTACACACCTGACATGAACCGTGAGGATGTTGACTACGCAATCCGGAAAGCTTTCCAAGTATGGAGTAATGTTACCCCCTTGAAATTCAGCAAGATTAACACAGGCATGGCTGACATTTTGGTGGTTTTTGCCCGTGGAGCTCATGGAGACTTCCATGCTTTTGATGGCAAAGGTGGAATCCTAGCCCATGCTTTTGGACCTGGATCTGGCATTGGAGGGGATGCACATTTCGATGAGGACGAATTCTGGACTACACATTCAGGAGGCACAAACTTGTTCCTCACTGCTGTTCACGAGATTGGCCATTCCTTAGGTCTTGGCCATTCTAGTGATCCAAAGGCTGTAATGTTCCCCACCTACAAATATGTCGACATCAACACATTTCGCCTCTCTGCTGATGACATACGTGGCATTCAGTCCCTGTATGGAGACCCAAAAGAGAACCAACGCTTGCCAAATCCTGACAATTCAGAACCAGCTCTCTGTGACCCCAATTTGAGTTTTGATGCTGTCACTACCGTGGGAAATAAGATCTTTTTCTTCAAAGACAGGTTCTTCTGGCTGAAGGTTTCTGAGAGACCAAAGACCAGTGTTAATTTAATTTCTTCCTTATGGCCAACCTTGCCATCTGGCATTGAAGCTGCTTATGAAATTGAAGCCAGAAATCAAGTTTTTCTTTTTAAAGATGACAAATACTGGTTAATTAGCAATTTAAGACCAGAGCCAAATTATCCCAAGAGCATACATTCTTTTGGTTTTCCTAACTTTGTGAAAAAAATTGATGCAGCTGTTTTTAACCCACGTTTTTATAGGACCTACTTCTTTGTAGATAACCAGTATTGGAGGTATGATGAAAGGAGACAGATGATGGACCCTGGTTATCCCAAACTGATTACCAAGAACTTCCAAGGAATCGGGCCTAAAATTGATGCAGTCTTCTATTCTAAAAACAAATACTACTATTTCTTCCAAGGATCTAACCAATTTGAATATGACTTCCTACTCCAACGTATCACCAAAACACTGAAAAGCAATAGCTGGTTTGGTTGTTAGAAATGGTGTAATTAATGGTTTTTGTTAGTTCACTTCAGCTTAATAAGTATTTATTGCATATTTGCTATGTCCTCAGTGTACCACTACTTAGAGATATGTATCATAAAAATAAAATCTGTAAACCATAGGTAATGATTATATAAAATACATAATATTTTTCAATTTTGAAAACTCTAATTGTCCATTCTTGCTTGACTCTACTATTAAGTTTGAAAATAGTTACCTTCAAAGCAAGATAATTCTATTTGAAGCATGCTCTGTAAGTTGCTTCCTAACATCCTTGGACTGAGAAATTATACTTACTTCTGGCATAACTAAAATTAAGTATATATATTTTGGCTCAAATAAAATTG                        SEQ ID NO：67
抑制素βA
>gi|4504698|ref|NM_002192.1|人类抑制素，βA(激活蛋白A、激活蛋白ABα多肽)(INHBA)，mRNA|qPCR据assay_on_demand情况匹配[457..481]
TCCACACACACAAAAAACCTGCGCGTGAGGGGGGAGGAAAAGCAGGGCCTTTAAAAAGGCAATCACAACAACTTTTGCTGCCAGGATGCCCTTGCTTTGGCTGAGAGGATTTCTGTTGGCAAGTTGCTGGATTATAGTGAGGAGTTCCCCCACCCCAGGATCCGAGGGGCACAGCGCGGCCCCCGACTGTCCGTCCTGTGCGCTGGCCGCCCTCCCAAAGGATGTACCCAACTCTCAGCCAGAGATGGTGGAGGCCGTCAAGAAGCACATTTTAAACATGCTGCACTTGAAGAAGAGACCCGATGTCACCCAGCCGGTACCCAAGGCGGCGCTTCTGAACGCGATCAGAAAGCTTCATGTGGGCAAAGTCGGGGAGAACGGGTATGTGGAGATAGAGGATGACATTGGAAGGAGGGCAGAAATGAATGAACTTATGGAGCAGACCTCGGAGATCATCACGTTTGCCGAGTCAGGAACAGCCAGGAAGACGCTGCACTTCGAGATTTCCAAGGAAGGCAGTGACCTGTCAGTGGTGGAGCGTGCAGAAGTCTGGCTCTTCCTAAAAGTCCCCAAGGCCAACAGGACCAGGACCAAAGTCACCATCCGCCTCTTCCAGCAGCAGAAGCACCCGCAGGGCAGCTTGGACACAGGGGAAGAGGCCGAGGAAGTGGGCTTAAAGGGGGAGAGGAGTGAACTGTTGCTCTCTGAAAAAGTAGTAGACGCTCGGAAGAGCACCTGGCATGTCTTCCCTGTCTCCAGCAGCATCCAGCGGTTGCTGGACCAGGGCAAGAGCTCCCTGGACGTTCGGATTGCCTGTGAGCAGTGCCAGGAGAGTGGCGCCAGCTTGGTTCTCCTGGGCAAGAAGAAGAAGAAAGAAGAGGAGGGGGAAGGGAAAAAGAAGGGCGGAGGTGAAGGTGGGGCAGGAGCAGATGAGGAAAAGGAGCAGTCGCACAGACCTTTCCTCATGCTGCAGGCCCGGCAGTCTGAAGACCACCCTCATCGCCGGCGTCGGCGGGGCTTGGAGTGTGATGGCAAGGTCAACATCTGCTGTAAGAAACAGTTCTTTGTCAGTTTCAAGGACATCGGCTGGAATGACTGGATCATTGCTCCCTCTGGCTATCATGCCAACTACTGCGAGGGTGAGTGCCCGAGCCATATAGCAGGCACGTCCGGGTCCTCACTGTCCTTCCACTCAACAGTCATCAACCACTACCGCATGCGGGGCCATAGCCCCTTTGCCAACCTCAAATCGTGCTGTGTGCCCACCAAGCTGAGACCCATGTCCATGTTGTACTATGATGATGGTCAAAACATCATCAAAAAGGACATTCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGTGGGTGCTCATAGAGTTGCCCAGCCCAGGGGGAAAGGGAGCAAGAGTTGTCCAGAGAAGACAGTGGCAAAATGAAGAAATTTTTAAGGTTTCTGAGTTAACCAGAAAAATAGAAATTAAAAACAAAACAAAACAAAAAAAAAAACAAAAAAAAACAAAAGTAAATTAAAAACAAACCTGATGAAACAGATGAAACAGATGAAGGAAGATGTGGAAATCTTAGCCTGCCTTAGCCAGGGCTCAGAGATGAAGCAGTGAAGAGACAGATTGGGAGGGAAAGGGAGAATGGTGTACCCTTTATTTCTTCTGAAATCACACTGATGACATCAGTTGTTTAAACGGGGTATTGTCCTTTCCCCCCTTGAGGTTCCCTTGTGAGCTTGAATCAACCAATCTGATCTGCAGTAGTGTGGACTAGAACAACCCAAATAGCATCTAGAAAGCCATGAGTTTGAAAGGGCCCATCACAGGCACTTTCCTAGCCTAAT    SEQ ID NO：68
胰岛素样生长因子结合蛋白7
>gi|4504618|ref|NM_001553.1|人类胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)，mRNA|qPCR正向引物匹配[470..487]|qPCR反向引物匹配[567..546]|qPCR探针匹配[492..517]
GCCGCTGCCACCGCACCCCGCCATGGAGCGGCCGTCGCTGCGCGCCCTGCTCCTCGGCGCCGCTGGGCTGCTGCTCCTGCTCCTGCCCCTCTCCTCTTCCTCCTCTTCGGACACCTGCGGCCCCTGCGAGCCGGCCTCCTGCCCGCCCCTGCCCCCGCTGGGCTGCCTGCTGGGCGAGACCCGCGACGCGTGCGGCTGCTGCCCTATGTGCGCCCGCGGCGAGGGCGAGCCGTGCGGGGGTGGCGGCGCCGGCAGGGGGTACTGCGCGCCGGGCATGGAGTGCGTGAAGAGCCGCAAGAGGCGGAAGGGTAAAGCCGGGGCAGCAGCCGGCGGTCCGGGTGTAAGCGGCGTGTGCGTGTGCAAGAGCCGCTACCCGGTGTGCGGCAGCGACGGCACCACCTACCCGAGCGGCTGCCAGCTGCGCGCCGCCAGCCAGAGGGCCGAGAGCCGCGGGGAGAAGGCCATCACCCAGGTCAGCAAGGGCACCTGCGAGCAAGGTCCTTCCATAGTGACGCCCCCCAAGGACATCTGGAATGTCACTGGTGCCCAGGTGTACTTGAGCTGTGAGGTCATCGGAATCCCGACACCTGTCCTCATCTGGAACAAGGTAAAAAGGGGTCACTATGGAGTTCAAAGGACAGAACTCCTGCCTGGTGACCGGGACAACCTGGCCATTCAGACCCGGGGTGGCCCAGAAAAGCATGAAGTAACTGGCTGGGTGCTGGTATCTCCTCTAAGTAAGGAAGATGCTGGAGAATATGAGTGCCATGCATCCAATTCCCAAGGACAGGCTTCAGCATCAGCAAAAATTACAGTGGTTGATGCCTTACATGAAATACCAGTGAAAAAAGGTGAAGGTGCCGAGCTATAAACCTCCAGAATATTATTAGTCTGCATGGTTAAAAGTAGTCATGGATAACTACATTACCTGTTCTTGCCTAATAAGTTTCTTTTAATCCAATCCACTAACACTTTAGTTATATTCACTGGTTTTACACAGAGAAATACAAAATAAAGATCACACATCAAGACTATCTACAAAAATTTATTATATATTTACAGAAGAAAAGCATGCATATCATTAAACAAATAAAATACTTTTTATCACAAAAAAAAAAAAAAAA    SEQ ID NO：69
γ谷氨酰水解酶
>gi|4503986|ref|NM_003878.1|人类γ谷氨酰水解酶(结合酶、叶酰聚γ谷氨酰水解酶)(GGH)，mRNA|qPCR正向引物匹配[531..547]|qPCR反向引物匹配[611..587]|qPCR探针匹配[549..577]
TGCCGCAGCCCCCGCCCGCCCGCAGAGCTTTTGAAAGGCGGCGGGAGGCGGCGAGCGCCATGGCCAGTCCGGGCTGCCTGCTGTGCGTGCTGGGCCTGCTACTCTGCGGGGCGGCGAGCCTCGAGCTGTCTAGACCCCACGGCGACACCGCCAAGAAGCCCATCATCGGAATATTAATGCAAAAATGCCGTAATAAAGTCATGAAAAACTATGGAAGATACTATATTGCTGCGTCCTATGTAAAGTACTTGGAGTCTGCAGGTGCGAGAGTTGTACCAGTAAGGCTGGATCTTACAGAGAAAGACTATGAAATACTTTTCAAATCTATTAATGGAATCCTTTTCCCTGGAGGAAGTGTTGACCTCAGACGCTCAGATTATGCTAAAGTGGCCAAAATATTTTATAACTTGTCCATACAGAGTTTTGATGATGGAGACTATTTTCCTGTGTGGGGCACATGCCTTGGATTTGAAGAGCTTTCACTGCTGATTAGTGGAGAGTGCTTATTAACTGCCACAGATACTGTTGACGTGGCAATGCCGCTGAACTTCACTGGAGGTCAATTGCACAGCAGAATGTTCCAGAATTTTCCTACTGAGTTGTTGCTGTCATTAGCAGTAGAACCTCTGACTGCCAATTTCCATAAGTGGAGCCTCTCCGTGAAGAATTTTACAATGAATGAAAAGTTAAAGAAGTTTTTCAATGTCTTAACTACAAATACAGATGGCAAGATTGAGTTTATTTCAACAATGGAAGGATATAAGTATCCAGTATATGGTGTCCAGTGGCATCCAGAGAAAGCACCTTATGAGTGGAAGAATTTGGATGGCATTTCCCATGCACCTAATGCTGTGAAAACCGCATTTTATTTAGCAGAGTTTTTTGTTAATGAAGCTCGGAAAAACAACCATCATTTTAAATCTGAATCTGAAGAGGAGAAAGCATTGATTTATCAGTTCAGTCCAATTTATACTGGAAATATTTCTTCATTTCAGCAATGTTACATATTTGATTGAAAGTCTTCAATTTGTTAACAGAGCAAATTTGAATAATTCCATGATTAAACTGTTAGAATAACTTGCTACTCATGGCAAGATTAGGAAGTCACAGATTCTTTTCTATAATGTGCCTGGCTCTGATTCTTCATTATGTATGTGACTATTTATATAACATTAGATAATTAAATAGTGAGACATAAATAGAGTGCTTTTTCATGGAAAAGCCTTCTTATATCTGAAGATTGAAAAATAAATTTACTGAAATACAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO：70
富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖1
>gi|2l361917|ref|NM_022356.2|人类富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(leprecan)1(LEPRE1)，mRNA|qPCR正向引物匹配[813..836]|qPCR反向引物匹配[894..872]|qPCR探针匹配[841..870]
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半胱氨酸蛋白酶抑制剂S
>gi|19882254|ref|NM_001899.2|人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(CST4)，mRNA|qPCR正向引物匹配[343..361]|qPCR反向引物匹配[434..411]|qPCR探针匹配[382..410]
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分泌型frizzled相关蛋白4
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Asporin
>gi|41350213|ref|NM_017680.3|人类asporin(1类LRR)(ASPN)，mRNA|qPCR正向引物匹配[798..823]|qPCR反向引物匹配[934..912]|qPCR探针匹配[842..875]
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具有EF手型结构域1的细胞生长调节因子
>gi|33589823|ref|NM_006569.2|人类具有EF手型结构域1的细胞生长调节因子(CGREF1)，mRNA|qPCR正向引物匹配[378..394]|qPCR反向引物匹配[455..431]|qPCR探针匹配[396..415]
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激肽释放酶10，转录物变体1
>gi|22208981|ref|NM_002776.3|人类激肽释放酶10(KLK10)，转录物变体1，mRNA|qPCR正向引物匹配[851..874]|qPCR反向引物匹配[950..931]|qPCR探针匹配[890..914]
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激肽释放酶10，转录物变体2
>gi|22208983|ref|NM_145888.1|人类激肽释放酶10(KLK10)，转录物变体2，mRNA|qPCR正向引物匹配[714..737]|qPCR反向引物匹配[813..794]|qPCR探针匹配[753..777]
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金属蛋白酶组织抑制剂1
>gi|4507508|ref|NM_003254.1|人类金属蛋白酶组织抑制剂1(促红细胞活性剂、胶原酶抑制剂(TIMP1)，mRNA|qPCR正向引物匹配[221..241]|qPCR反向引物匹配[359..340]|qPCR探针匹配[251..283]
AGGGGCCTTAGCGTGCCGCATCGCCGAGATCCAGCGCCCAGAGAGACACCAGAGAACCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTGGCTTCTGGCATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAGCCCCCAGCAGGGCCTGCACCTGTGTCCCACCCCACCCACAGACGGCCTTCTGCAATTCCGACCTCGTCATCAGGGCCAAGTTCGTGGGGACACCAGAAGTCAACCAGACCACCTTATACCAGCGTTATGAGATCAAGATGACCAAGATGTATAAAGGGTTCCAAGCCTTAGGGGATGCCGCTGACATCCGGTTCGTCTACACCCCCGCCATGGAGAGTGTCTGCGGATACTTCCACAGGTCCCACAACCGCAGCGAGGAGTTTCTCATTGCTGGAAAACTGCAGGATGGACTCTTGCACATCACTACCTGCAGTTTCGTGGCTCCCTGGAACAGCCTGAGCTTAGCTCAGCGCCGGGGCTTCACCAAGACCTACACTGTTGGCTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCCCTGCAAACTGCAGAGTGGCACTCATTGCTTGTGGACGGACCAGCTCCTCCAAGGCTCTGAAAAGGGCTTCCAGTCCCGTCACCTTGCCTGCCTGCCTCGGGAGCCAGGGCTGTGCACCTGGCAGTCCCTGCGGTCCCAGATAGCCTGAATCCTGCCCGGAGTGGAACTGAAGCCTGCACAGTGTCCACCCTGTTCCCACTCCCATCTTTCTTCCGGACAATGAAATAAAGAGTTACCACCCAGCSEQ ID NO：78
富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白质
>gi|48675809|ref|NM_003118.2|人类富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白质(骨粘连蛋白)(SPARC)，mRNA|qPCR正向引物匹配[788..810]|qPCR反向引物匹配[915..898]|qPCR探针匹配[818..839]
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转化生长因子β诱导蛋白
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包含EGF的纤蛋白样细胞外基质蛋白质2
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光亮蛋白聚糖
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Stannin
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分泌型磷蛋白1
>gi|38146097|ref|NM_000582.2|人类分泌型磷蛋白1(骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白I、早期T-淋巴细胞活化剂1)(SPP1)，mRNA|qPCR据assay_on_demand情况匹配[253..277]
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硫酸软骨素蛋白聚糖2
>gi|21361115|ref|NM_004385.2|人类硫酸软骨素蛋白聚糖2(多功能蛋白聚糖)(CSPG2)，mRNA|qPCR正向引物匹配[10087..10106]|qPCR反向引物匹配[10185..10163]|qPCR探针匹配[10139..10161]
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N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1
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N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1转录物变体1
>gi|30089927|ref|NM_177924.1|人类N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(ASAH1)，转录物变体1，mRNA|qPCR正向引物匹配[1050..1066]|qPCR反向引物匹配[1128..1104]|qPCR探针匹配[1071..1098]
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丝氨酸蛋白酶11
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分泌型frizzled相关蛋白2
>gi|42656988|ref|NM_050625.4|人类分泌型frizzled相关蛋白2(SFRP2)，mRNA|qPCR正向引物匹配[686..703]|qPCR反向引物匹配[750..728]|qPCR探针匹配[705..726]
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XIIB组磷脂酶A2
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细胞外基质蛋白质Spondin 2
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嗅介蛋白1，转录物变体3
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包含重复的血小板反应蛋白1
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血小板反应蛋白2
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Adlican
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半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA
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半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN
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赖氨酰氧化酶样酶2
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甲状腺球蛋白
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转化生长因子，β1
>gi|10863872|ref|NM_000660.1|人类转化生长因子，β1(卡-恩病)(TGFB1)，mRNA|qPCR正向引物匹配[1651..1668]|qPCR反向引物匹配[1539..1557]|qPCR探针匹配[1687..1713]
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丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝H，成员1
>gi|32454740|ref|NM_001235.2|人类丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝H(热休克蛋白47)成员1(胶原结合蛋白1)(SERPINH1)，mRNA|qPCR据assay_on_demand情况匹配[184..208]
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丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝B，成员5
>gi|4505788|ref|NM_002639.1|人类丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝B(卵清蛋白)，成员5(SERPINB5)，mRNA|qPCR正向引物匹配[36..56]|qPCR反向引物匹配[106..86]|qPCR探针匹配[60..80]
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癌胚抗原相关细胞黏附分子5
>gi|11386170|ref|NM_004363.1|人类癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)，mRNA|qPCR据assay_on_demand情况匹配[2128..2152]
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基质金属蛋白酶2
>gi|113426651ref|NM_004530.1|人类基质金属蛋白酶2(明胶酶A，72kDa明胶酶，72kDa IV型胶原酶)(MMP2)，mRNA|qPCR正向引物匹配[1713..1732]|qPCR反向引物匹配[1793..1775]|qPCR探针匹配[1751..1773]
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前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5
>gi|20336245|ref|NM_006200.2|人类前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5(PCSK5)，mRNA|qPCR正向引物匹配[2677..2697]|qPCR反向引物匹配[2821..2801]|qPCR探针匹配[2737..2765]
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羧肽酶N，多肽2，83kDa
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ATGGGTTGTGACTGCTTCGTCCAGGAGGTGTTCTGCTCAGATGAGGAGCTTGCCACCGTCCCGCTGGACATCCCGCCATATACGAAAAACATCATCTTTGTGGAGACCTCGTTCACCACATTGGAAACCAGAGCTTTTGGCAGTAACCCCAACTTGACCAAGGTGGTCTTCCTCAACACTCAGCTCTGCCAGTTTAGGCCGGATGCCTTTGGGGGGCTGCCCAGGCTGGAGGACCTGGAGGTCACAGGCAGTAGCTTCTTGAACCTCAGCACCAACATCTTCTCCAACCTGACCTCGCTGGGCAAGCTCACCCTCAACTTCAACATGCTGGAGGCTCTGCCCGAGGGTCTTTTCCAGCACCTGGCTGCCCTGGAGTCCCTCCACCTGCAGGGGAACCAGCTCCAGGCCCTGCCCAGGAGGCTCTTCCAGCCTCTGACCCATCTGAAGACACTCAACCTGGCCCAGAACCTCCTGGCCCAGCTCCCGGAGGAGCTGTTCCACCCACTCACCAGCCTGCAGACCCTGAAGCTGAGCAACAACGCGCTCTCTGGTCTCCCCCAGGGTGTGTTTGGCAAACTGGGCAGCCTGCAGGAGCTCTTCCTGGACAGCAACAACATCTCGGAGCTGCCCCCTCAGGTGTTCTCCCAGCTCTTCTGCCTAGAGAGGCTGTGGCTGCAACGCAACGCCATCACGCACCTGCCGCTCTCCATCTTTGCCTCCCTGGGTAATCTGACCTTTCTGAGCTTGCAGTGGAACATGCTTCGGGTCCTGCCTGCCGGCCTCTTTGCCCACACCCCATGCCTGGTTGGCCTGTCTCTGACCCATAACCAGCTGGAGACTGTCGCTGAGGGCACCTTTGCCCACCTGTCCAACCTGCGTTCCCTCATGCTCTCATACAATGCCATTACCCACCTCCCAGCTGGCATCTTCAGAGACCTGGAGGAGTTGGTCAAACTCTACCTGGGCAGCAACAACCTTACGGCGCTGCACCCAGCCCTCTTCCAGAACCTGTCCAAGCTGGAGCTGCTCAGCCTCTCCAAGAACCAGCTGACCACACTTCCGGAGGGCATCTTCGACACCAACTACAACCTGTTCAACCTGGCCCTGCACGGTAACCCCTGGCAGTGCGACTGCCACCTGGCCTACCTCTTCAACTGGCTGCAGCAGTACACCGATCGGCTCCTGAACATCCAGACCTACTGCGCTGGCCCTGCCTACCTCAAAGGCCAGGTGGTGCCCGCCTTGAATGAGAAGCAGCTGGTGTGTCCCGTCACCCGGGACCACTTGGGCTTCCAGGTCACGTGGCCGGACGAAAGCAAGGCAGGGGGCAGCTGGGATCTGGCTGTGCAGGAAAGGGCAGCCCGGAGCCAGTGCACCTACAGCAACCCCGAGGGCACCGTGGTGCTCGCCTGTGACCAGGCCCAGTGTCGCTGGCTGAACGTCCAGCTCTCTCCTTGGCAGGGCTCCCTGGGACTGCAGTACAATGCTAGTCAGGAGTGGGACCTGAGGTCGAGCTGCGGTTCTCTGCGGCTCACCGTGTCTATCGAGGCTCGGGCAGCAGGGCCCTAGTAGCAGCGCATACAGGAGCTGGGGAAGGGGGCTTTGGGGCCTGCCCACGCGACAGGTAGGGGCGGAGGGGAGCTGAGTCTCCGAAGCTTGGCTTT                            SEQ ID NO：106
透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白4
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免疫组织化学
从组织块切下8μM厚的冰冻切片并粘贴于APES玻片上。将组织切片放入丙酮中固定10分钟后空气干燥。然后玻片在含有0.3％过氧化氢的甲醇中浸润10分钟，再用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗。通过用20％的适当动物血清孵育玻片来封闭非特异性结合位点，再次用PBS冲洗。用含有1％血清的PBS稀释初级抗体，然后滴加到玻片上。孵育1小时后，再次用PBS冲洗玻片，然后用次级抗体再孵育1小时。PBS最后冲洗之后，使用溶解于Tris缓冲盐溶液(TBS)的二氨基联苯胺四盐酸盐检测次级抗体，再用TBS和水冲洗。然后玻片经苏木素复染，并置于光学显微镜下观察。
在某些实施方案中，可以使用基于本发明癌症标记物的染色对胃肿瘤进行原位(in situ)定位。至少一种标记物可形成淀粉样结构从而能用刚果红或等效的、非特异性的淀粉样蛋白染色剂进行显色。
体液中胃癌标记物的检测
在几个实施方案中，可以对从血液、血浆、血清、诸如使用腹膜灌洗获得的腹膜液或其它体液如尿液、淋巴液、脑脊液、胃液或者粪便样品中获得的样品如愿地进行GTM分析。
一般而言，用于分析这些液体中的寡核苷酸、蛋白质和肽的方法是本领域技术中已知的。寡核苷酸的检测可以采用杂交方法如Northern印迹、Southern印迹或微阵列方法或者qPCR进行。检测蛋白质的方法包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、具有抗体的蛋白质芯片、悬浮珠放射免疫测定(RIA)、Western印迹和凝集素结合试验。然而，为了说明的目的，可以使用夹心法酶联免疫吸附测定(ELISA)对液体中GTM水平进行定量检测。对于血浆分析，在微量滴定板的孔中加入5μL的适当稀释样品的等分试样或连续稀释的标准GTM和75μL结合有过氧化物酶的抗人GTM抗体。30℃孵育30分钟之后，用含0.05％Tween 20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤各孔以除去未结合的抗体。然后，将GTM和抗GTM抗体的结合复合物用含有H2O2的邻苯二胺于30℃孵育15分钟。加入1MH2SO4终止反应，并用微量滴定板读板机测定492nm处的吸光度。
应该意识到，抗GTM抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗血清。还应该意识到，任何其它的体液能够进行适当的研究。
已知一些标记物存在于血浆或血清中。这些标记物包括骨桥蛋白(Hotte等人，Cancer 95(3)：507-510(2002))、前列腺特异性抗原(Martin等人，Prostate Cancer Prostatic Dis.(2004年3月9日)(Pub Med No：PMID：15007379))、甲状腺球蛋白(Hall等人，Laryngoscope 113(1)：77-81(2003)；Mazzaferri等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.88(4)：1433-14421(2003))、基质金属蛋白酶2和9(Kuo等人，Clin.Chem.Acta.294(1-2)：157-168(2000))、CEA和TIMP1(Pellegrini等人，Cancer Immunol.Immunother.49(7)：388-394(2000))。因此，由于上述标记物中的一些对于GTM也是有用的标记物，所以对它们进行检测和定量的血浆、血清或其它体液分析法早已经是可得的。因为许多蛋白质或者是(1)由细胞分泌、或者是(2)从细胞膜脱落、或者是(3)处于细胞死亡的细胞丢失的，所以其它GTM也可存在于体液如血浆、血清等中。因此，在本发明的实施方案中，对方便获得的样品进行GTM检测是有用且合意的，并能作为胃癌诊断的基础。
Western分析
使用TriReagent和盐酸胍提取法从胃组织中抽提出蛋白质。从TriReagent提取RNA获得的非水相与1.5倍体积乙醇混合并离心去除DNA和OCT介质。将0.5mL上清液与0.75mL异丙醇混合，室温孵育10分钟，然后离心。沉淀物用1mL含0.3M盐酸胍的95％乙醇洗涤3次，再单用乙醇洗涤1次，然后重悬于50μL的1％SDS中。
采用标准方法，将蛋白质定量并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。简言之，按照标准方法学使用BioRad(trans-blot电转槽)将分离的蛋白质转移至PVDF膜上。然后用含有脱脂奶粉的溶液封闭30分钟，再用初级抗体室温孵育2小时。洗涤之后，加次级抗体室温孵育1小时。最后一次洗涤之后，用ECL检测系统(Amersham Biosciences)显色所结合抗体。
通过用已知方法准备血清样品，然后或者使用寡核苷酸探针或者使用抗目的蛋白质的抗体对血清样品进行分析，从而完成血清中标记物的检测。包括Western印迹分析在内的免疫印迹对于确定备选表达的蛋白质在血清中是否存在是特别有用的。另外，包括腹膜液、脑脊液等在内的其它体液中可能包含标记物。有用的标记物没有必要是生理学意义上被分泌的。相反地，标记物蛋白质或基因进入血清的任何机制都能有效产生可检测的、可量化水平的标记物。因此，可溶性蛋白质从细胞中正常分泌、膜蛋白从质膜脱落、可变剪接形式的mRNA或从其表达的蛋白质的分泌、细胞死亡(或者凋亡细胞)能够产生足够水平的有用标记物。对于血清标记物作为多种癌症类型的诊断和/或治疗效果评价工具的用途得到越来越多的支持。
Yoshikawa等人(Cancer Letters，151：81-86(2000))描述了胃癌患者血浆中的基质金属蛋白酶组织抑制剂1。
Rudland等人(Cancer Research 62：3417-3427(2002))描述了作为人乳腺癌转移相关蛋白的骨桥蛋白。
Buckhaults等人(Cancer Research 61：6996-7001(2002))描述了结肠直肠肿瘤中的某些分泌的和细胞表面表达的基因。
Kim等人(JAMA 287(13)：1671-1679(2002))描述了作为潜在的卵巢癌诊断生物标记物的骨桥蛋白。
Hotte等人(AJ.American Cancer Society 95(3)：507-512(2002))描述了作为人体液中可检测蛋白质以及与某些恶性肿瘤相关的骨桥蛋白。
Martin等人(Prostate Cancer Prostatic Dis.2004年3月9日(PMID：15007379))(摘要)描述了人激肽释放酶2、前列腺特异性抗原(PSA)和游离PSA作为检测前列腺癌的标记物的用途。
Hall等人(Laryngoscope 113(1)：77-81(2003)(PMID：12679418))(摘要)描述了甲状腺癌患者血清甲状腺球蛋白的预测值。
Mazzaferri等人(J.Clin.Endocrinol.Metab.88(4)：1433-1441(2003))(摘要)描述了作为甲状腺癌患者潜在监测方法的甲状腺球蛋白。
Whitley等人(Clin.Lab.Med.24(1)：29-47(2004))(摘要)描述了作为甲状腺癌血清标记物的甲状腺球蛋白。
Kuo等人(Clin.Chim.Acta.294(1-2)：157-168(2000))(摘要)描述了HCV和HBV感染患者的血清基质金属蛋白酶2和9。
Koopman等人(Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev 13(3)：487-491(2004))(摘要)描述了作为胰腺癌生物标记物的骨桥蛋白。
Pellegrini等人(Cancer Immunol.Immunother.49(7)：388-394(2000))(摘要)描述了作为侵袭前结肠直肠癌标记物的可溶性癌胚抗原和TIMP1的测定。
因此，我们已经鉴定了对于研发检测和评价胃癌的试剂、装置和试剂盒有用的许多基因和/或蛋白质。可以单独或联合使用一种或多种胃癌标记物以便提供用于胃癌检测的可靠分子检验。
实施例
本文描述的实施例其目的是为说明本发明的实施方案。其它的实施方案、方法和分析类型处于分子诊断技术领域中普通技术人员所掌握的范围内，从而不必在此详细描述。可以将本技术领域范围内的其它实施方案看作是本发明的一部分。
实施例1：胃恶性肿瘤标记物的鉴定
图2描述了使用经上述标准所选择的38种胃肿瘤标记物进行研究的结果列表。图2包括基因的符号(“符号”)、MWG oligo号、NCBI mRNA参考序列号、蛋白质参考序列号、肿瘤和非肿瘤基因表达之间的变化倍数、在微阵列分析中相对于其它基因的变化倍数的等级、原始未调整的Student′s t-检验结果、经Bonferroni调整的p值结果和两个样品的Wilcoxon检验结果。
这34种基因的中值变化倍数(肿瘤组织：非恶性肿瘤组织)范围是1.6-7，并且变化倍数等级的中值变化范围为-16，995-25，783。变化倍数秩中最大的可能变化是-29，718。对于每一种显示的标记物，它们作为癌症标记物的特异性具有极其高的统计学意义。一般来说，Bonferroni调整的p值全部低于10-6或更低，这提示使用这些标记物进行的诊断与胃癌的相关性非常高。
三种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CST1、CST2和CST4)高度同源并且在微阵列上为同一寡核苷酸，除非另外说明，将它们集体称作“CST1，2，4”。
通过使用SMART软件包(欧洲分子生物实验室)预测，图2中描述的所有蛋白质均具有信号肽。已知信号肽能引导合成的蛋白质到达细胞外区室，因而分泌至组织液，其可以从组织液进入血液。事实上，本发明的一些蛋白质已经在血清中检测到。
图2中描述的每一种基因显示了强度等级大于阵列中对应于CEA的2个寡核苷核的变化，CEA为在监控胃癌进展的的临床实践中最常用的标记物。
实施例2：qPCR分析
对于图3中显示的基因亚类，使用qPCR获得基因表达的更加灵敏和精确的定量。在从46份肿瘤样品和49非恶性肿瘤样品得到的RNA中分析了通过微阵列分析(图2)鉴定的23个基因，结果见图3。图3包括基因符号、在癌组织和正常组织之间的变化倍数中值，以及表达高于非肿瘤样品中表达水平第95百分位数的肿瘤样品的百分比(％)。由于高(＞75％)的正常细胞污染、高程度的坏死(＞40％)或者在微阵列上杂交信号较差，将12份肿瘤样品和9份正常样品排除在外，不进行分析。这23个基因的倍数变化中值范围从3倍至525倍(图3)。
对于≥90％的情况，基因ASPN、CST1，2，4、LOXL2、TIMP1、SPP1、SFRP4、INHBA、THBS2和SPARC在肿瘤中表达水平高于在非恶性肿瘤中表达范围的第95百分位数(图3)。对于剩余的基因，在＞50％的样品中，其在肿瘤中的表达高于第95百分位数。每一个肿瘤中至少7个基因的过表达高于第95百分位数，这表明标记物组合将全面覆盖所有胃肿瘤。
实施例3：使用qPCR对微阵列数据的验证
使用24种基因的探针对肿瘤样品和非恶性肿瘤样品进行定量实时PCR(qPCR)来验证微阵列数据。在所有研究的24种基因中，有20种基因显示了两种技术之间具有强烈的相关性。图4a-4d显示了这些分析中的四个分析，这些图描述了使用微阵列和qPCR方法检测四种所选癌症标记物的相对表达图。对于图4中的每一个图，横轴代表微阵列检测基因表达的变化倍数的log2数值，而纵轴代表qPCR检测基因表达的变化倍数的log2数值。我们发现，如由两种方法之间的协变关系所表明，这两种方法之间具有强烈的相关性。这种强烈的相关性提示微阵列和qPCR的变化倍数分析是检测胃癌标记物基因表达变化的合适方法，并且因此能用作精确的、敏感的筛选方法。从图4a-4d还可以理解qPCR比微阵列方法能更灵敏地检测表达的变化。因此，在尤其需要早期检测的情况下，qPCR特别有用。
图5a-5w描述了对于正常组织(未填充直条)和肿瘤组织(黑色直条)，比较一系列23种基因中每一种基因表达的观测频率(纵轴)和此基因表达变化倍数的log2数值(横轴)关系的柱状图。我们意外发现：这23种基因中的每一种基因在正常组织和肿瘤组织之间的频率分布基本上是分离的，这如频率分布曲线之间的低重叠程度所反映。例如，图5b描述了CST1，2，4的结果，其中只有一份正常样品的表达水平在肿瘤表达水平范围内。在其它情况中(例如，图5n；PRS11)，每一个频率分布曲线相对狭窄并有一定程度的重叠。然而，甚至对于此标记物，变化倍数log2数值的中值显示基因表达量间基本上是分离的。在其它情况中(例如，图5a；ASPN)，尽管频率分布曲线有些重叠，但在正常样品和肿瘤样品之间的表达倍数log2数值中值明显分离。
图6描述了与正常样品相比，肿瘤样品中显示表达明显增加(“过表达”)的基因数量(纵轴)和各个测试样品之间关系的柱状图。在每一情况中，肿瘤样品表现为的多重基因表达水平升高。在E123样品中，表达升高的基因数量最低，为7个基因。此发现说明，在多重基因相对正常组织过表达的情况下，癌症检测的可靠性非常高，从而使癌症诊断更加确定。然而，在一些情况中，单一标记物基因的表达升高足以对癌症做出诊断。
对于与血清标记物CEA(当前最常用于胃癌检测)的先前比较是基于肿瘤样品和正常样品之间微阵列数据强度等级的差别。使用标记物和CEA的qPCR数据验证该比较。
图7a-7c描述了与肿瘤标记物基因CEA的表述相比，在各个肿瘤样品和非恶性肿瘤样品中标记物的相对log2表达(与参考RNA制品相比)图。CEA是当前最常用的监测胃癌进展的血清标记物。零点定义为每一种标记物的正常表达中值。可以看到CEA基因(CEACAM5)的表达在肿瘤样品和正常样品之间具有广泛重叠。而在胃癌标记物ASPN、CSPG2、CST1，2，4、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SFRP4、SPARC、SPP1、THBS2、TIMP1、adlican、LEPRE1和EFEMP2中该种重叠明显减少。对于图7b-7c中的其它标记物ASAH1、SFRP2、GGH、MMP12、KLK10、TG、PRSS11和TGFBI，在肿瘤组织中表达范围和非恶性肿瘤组织中表达范围之间的重叠大于上述标记物的表达重叠情况，但仍然低于CEA的表达重叠情况，这说明本文描述的所有新标记物在定量上好于CEA，因此能提供更加可靠的诊断。
为了把不同组织处理的影响减到最低，使用来自同一患者的肿瘤组织和非恶性肿瘤组织样品的qPCR数据来计算肿瘤：正常(非恶性肿瘤)变化倍数。这样的配对分析校正了基因在不同个体表达的背景水平的差异，并将组织处理对RNA定量的影响降到最低。例如，如果将切除的胃在室温下放置1小时，则正常样品和肿瘤样品中转录物的降解程度相同。
图8总结了通过qPCR测定的标记物的T∶N表达水平，但是使用了来自同一个体的配对数据(即肿瘤样品和非恶性肿瘤样品)。图8还包括了图3中未包括的六种基因的表达数据。这些额外研究基因是MMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5和SERPINH1。鉴定信息和探针显示于图1和图2。图8显示了29种胃癌标记物在这些40位患者“配对”样品中的T∶N变化倍数中值和T∶N变化倍数最大值。在29种标记物中有27种标记物T∶N变化倍数中值大于或等于在先技术标记物CEA的T∶N变化倍数中值。全部29种标记物具有较高的、在肿瘤样品中的表达超过正常样品中的表达的配对样品百分比。
图9a-9d描述了来自同一个体肿瘤组织和正常组织的数据的散点图。每一个点代表了标记物在患者肿瘤组织中表述相对于在非肿瘤组织中表达的变化倍数。所有研究的标记物均比CEA具有更好的区别肿瘤组织和非肿瘤组织的能力。CST1，2，4、ASPN和SFRP4三种标记物能够对配对的肿瘤和正常样品进行100％的区别。即这些标记物在每一个肿瘤组织中的表达高于来自同一个体的相应非肿瘤组织。在其它许多标记物中，例如Adlican、CSPG2、EFEMP2、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SERPINH1、SPARC、SPP1、TGFbI、THBS2和TIMP1，每一种标记物在肿瘤组织中的表达低于非肿瘤组织的个别点仅有2个或3个。因此，对于这些标记物而言，在任何一组配对肿瘤组织和非肿瘤组织中可能产生假阴性的可能性相对低(例如，40份中有3份为阴性或7.5％的假阴性，40份中有2份为阴性或5％的假阴性，40份中有1份为阴性或2.5％的假阴性)。因此，即使使用上面刚刚列举的其它标记物，使用来自同一患者的多个样品也能产生可靠的诊断信息。
上文显示了这些标记物的基因序列，以及用来检测它们的引物和探针的位置。
为了确定标记物基因过表达是否不依赖于胃肿瘤的分期，将配对T∶N变化倍数的log2数值对肿瘤分期作图(图10a-10ad)。观察发现，对于图8中列举的26种标记物在肿瘤中的表达不具有肿瘤分期依赖性。这些标记物在肿瘤早期和肿瘤晚期的过表达情况类似。然而，KLK10在肿瘤1期和2期的过表达更一致，而PCSK5和SERPINB5在肿瘤4期的过表达更一致。因此KLK10、PCSK5和SERPINB5能用于确定胃肿瘤的时期。
在类似的分析中，将配对T∶N变化倍数的log2数值对肿瘤Lauren分类(或者为扩散型或者为肠型)作图。图11a-11ab显示不管肿瘤类型是肠型(I)或是扩散型(D)，29种GTM中的每一个能够区别肿瘤组织和非肿瘤组织。
实施例4：多重标记物的使用
如上面所描述，某些标记物表现出具有在100％的样品中区别肿瘤组织和非肿瘤组织的能力。可以将同为上述的其它标记物组合使用，以便实现非常高程度地区分肿瘤组织和非肿瘤组织。图12描述了三种标记物SERPINH1、CST1，2，4和INHBA表达的三维图，其表示为在一系列胃肿瘤样品和非恶性肿瘤胃样品中T∶N变化倍数的log2数值。两组样品发生完全分离。
通过总结于图13的统计学分析进一步说明了使用标记物的组合成功区别肿瘤样品和非肿瘤样品的可靠性。此分析比较了使用qPCR产生的来自配对的肿瘤和非恶性肿瘤样品基因表达数据的正态分布，分析显示增加用来区别肿瘤样品和非恶性肿瘤样品的标记物数量对检测敏感性(将特异性固定在95％)的影响。尽管此分析中29种标记物(如图8所示)在单独应用时很少具有大于90％、95％或99％的敏感性，但是两种或三种标记物的组合能够达到使用大量组合所能达到的高敏感性。例如，三种标记物的50种组合能以≥99％的敏感性和≥95％的特异性区别肿瘤样品和非恶性肿瘤样品。
实施例5：胃肿瘤标记物蛋白质的检测
在更进一步的实施方案中，GTM蛋白质可以作为诊断的基础来检测。在某些情况下，特殊样品(如不含细胞的样品)中的mRNA浓度很难使用微阵列或qPCR方法来检测基因表达的提高。因此，在某些实施方案中，使用抗完整蛋白质、蛋白质片段(肽)或蛋白质核心的抗体实现GTM蛋白质的检测。检测和定量蛋白质和肽表达的方法在本技术领域是已知的，并且包括依靠抗蛋白质或肽的特异性抗体的方法。单克隆抗体和多克隆抗血清的制备可以使用本技术领域众所周知的方法进行，因而不需要在本文中进一步描述。
为了证明GTM蛋白质能用来区分肿瘤组织和非肿瘤组织，得到了商品化的抗SPARC抗体(R&D Systems；目录号AF941)、抗THBS2抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；目录号sc-7655)、抗CSPG2抗体(Calbiochem；目录号428060)和抗IGFBP7抗体(R&D Systems；目录号AF1334)。另外的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN肽序列50-66(C)FAISEYNKATKDDYYRR(SEQ ID NO：108)的多克隆抗体在家兔中产生。
在肿瘤胃组织和非恶性肿瘤胃组织的免疫组织化学分析或Western分析中使用这些抗体。这些标记物中的每一个在蛋白质水平显示了强的肿瘤：正常差异。这证实在RNA水平所观察到的这些基因的高表达同样也发生在蛋白质水平。
图14显示了使用抗由SPARC、CST1(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN)、IGFBP7和THBS2所编码蛋白质的抗体对两份配对从肿瘤组织和非恶性肿瘤组织中提取的总蛋白进行的Western印迹分析。对于每一个标记物，在肿瘤样品中的信号明显高于非肿瘤样品。
抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体检测到三条主要条带，其分别对应大约34、45和65kDa的分子量。图14显示最低分子量条带。该蛋白质种类大于对照半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质，提示肿瘤产生的蛋白质已经经过翻译后修饰或多聚化。图14说明：无论引起CST蛋白质分子量差异的机制如何，CST在非肿瘤组织中低表达，但是在肿瘤来源蛋白质印迹中容易观察到CST表达。
图14还显示SPARC蛋白质在肿瘤组织中以高于非肿瘤组织的程度相当大地表达。SPARC蛋白质的凝胶迁移率慢于血清中检测到的该蛋白质形式(图15)，这还提示恶性胃肿瘤细胞产生的蛋白质出现不同的翻译后修饰。不管引起任何此种修饰的机制如何，关于SPARC在肿瘤组织相对非恶性肿瘤组织过表达的这一发现提示SPARC是一种有用的蛋白质标记物。同样地，IGFBP7和THBS2在肿瘤组织中相对非恶性肿瘤组织过表达。
使用抗由CSPG2(多功能蛋白聚糖)和CST1(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN)所编码蛋白质的抗体对肿瘤组织和非恶性肿瘤组织进行免疫组织化学分析。使用抗多功能蛋白聚糖抗体对组织的免疫组织化学分析鉴定出在肿瘤组织的细胞外基质有强染色，但在非恶性肿瘤组织中没有。使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体，能够在肿瘤细胞外周区域观察到强染色。在非恶性肿瘤细胞中，使用该抗体的染色较弱，并只在组织的粘模表面和胃小凹内层(lining)观察到。这说明在非恶性肿瘤细胞中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质被指引出细胞至粘模表面而不进入细胞外间隙。因此，不但半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质在肿瘤组织中的产生量高于非恶性肿瘤组织，而且与非恶性肿瘤组织产生的蛋白质不同，肿瘤组织产生的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与组织的脉管系统直接接触。为了扩大这些观察，使用单克隆抗体(R&D Systems；目录号MAB1285)从胃癌细胞系AGS上清液中免疫沉淀半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN(图16)。在上清液中检测到大量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN，这证实该蛋白质由胃上皮细胞产生并分泌。
实施例6：血清中肿瘤标记物的分析
对于能用于快速筛选的标记物，需要标记物在血清中达到足以检测的水平。在图8中描述的某些蛋白质能够从胃癌分泌入血达到可检测的水平。TIMP1是一个已知的从胃肿瘤分泌入血达到可检测水平的标记物。然而，如果蛋白质是从粘模表面以外的任何细胞表面分泌或脱落，那么它将与间质液接触。该蛋白质能从间质液通过毛细管直接进入血流或经过淋巴系统进入血流。因此，任何脱落的GTM将存在于血液中。以前已经描述过骨桥蛋白、甲状腺球蛋白以及MMP和激肽释放酶的家族成员在上皮癌患者血清中浓度升高，而在胃癌患者血清中不升高。然而，以前已经观察到TIMP1在胃癌患者血清中有所升高。这些发现提示本研究中标记物的选择标准(即分泌的蛋白质在肿瘤组织中过表达但不在非恶性肿瘤组织中过表达)能有效用于检测血清中标记物，并且因此基本上具有临床用途且不必进行组织或器官活检。
根据图15，很明显血清中SPARC具有不同的分子量(此处以Western印迹图示)，肿瘤SPARC的分子量低于血细胞产生的SPARC。因此，即使SPARC由肿瘤和非肿瘤的血细胞产生，肿瘤SPARC的存在也能够使用分子大小进行确定(如通过Western分析确定)或使用对肿瘤细胞产生的糖基化蛋白质特异的抗体来确定。
在其它研究中，我们检测了胃癌细胞系AGS上清液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。图16描述了单独培养基或培养的AGS细胞上清液中的Western分析。图16中右侧泳道显示出对应半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的致密条带。
因此，我们从图10推断本发明GTM适于诊断疾病进展早期、中期或晚期的胃癌。
尽管某些标记物蛋白质能被糖基化，但糖基化模式的变化在某些情况下能够导致对缺少常见糖基化模式的GTM形式的错误检测。因此，在本发明某些实施方案中，GTM免疫原包括去糖基化的GTM或去糖基化的GTM片段。可使用本技术领域中已知的一种或多种糖苷酶完成去糖基化。备选地，GTM cDNA能够在糖基化缺陷细胞系如包括大肠肝菌(E.coli)的原核细胞中表达，从而产生非糖基化的蛋白质或肽。还应该意识到糖基化的水平和质量对糖侧链必需前体的存在敏感。因此，在缺乏必需糖质的情况下，“正常”糖基化不会发生，但是可以发现更短的或缺失侧链的糖。此种“糖基化变体”可以用作免疫原，从便产生对不同类型标记物基因特异的抗体。
另外，某些GTM可以形成同源二聚体或异二聚体或其它类型多聚体形式。例如，抑制蛋白βA是47kDa的蛋白质，其能形成分子量97kDa的同源二聚体(激活蛋白A)，并与45kDa的蛋白质抑制蛋白βB形成92kDa的异源二聚体(也称作激活蛋白AB)。因此，应该意识到Western分析或者提供分子量的其它类型分析不必仅限于检测GTM的单体形式。相反，人们能够容易地意识到可以检测任何形式的GTM而不管其分子量如何。因此，对GTM多聚体形式的检测可以容易地用于诊断胃癌的存在。此外，对于那些对胃肿瘤分期(1-4)或胃肿瘤类型(扩散型或肠型)有选择性的GTM，对其多聚体形式的检测能提供用于评价胃癌分期或类型的指标。
一旦产生抗GTM的抗体或抗血清，此种抗体制品能用于多种方法。首先，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)方法定量GTM的蛋白质或肽。使用免疫组织化学可以在组织样品中进行免疫检测。这些方法在本技术领域中全部已知，因此不必在本文进一步描述。
实施例7：包含GTM寡核苷酸的载体
本发明其它实施方案包括对于标记物基因或其部分(“标记物肽”)、或标记物基因产物片段的体外表达有用的载体。例如，可制备具有编码GTM的寡核苷酸的载体。许多此类载体基于本技术领域已知的标准载体。本发明还包括能用于转染多种细胞系以制备产GTM细胞系的载体，其中所述细胞能用来产生所需量的GTM从而开发用于GTM检测或GTM标准化改良测定法的特异性抗体或其它试剂。
应当理解：为了制备这样的载体，把包含完整可读框或编码待表达蛋白质部分的此可读框部分的寡核苷酸插入含有启动子区、一个或多个增强子区域的载体中，其中启动子区和增强子区可操作性地与具有起始密码子、可读框和终止密码子的寡核苷酸连接。产生表达载体的方法在本技术领域是已知的从而不必在本文重复。
还应该意识到：可以将一个或多个选择标记插入表达载体，以便允许选择出的含有目的表达载体的细胞系扩大培养。而且，还可以在框架中插入本技术领域已知的前导区，从而指引蛋白质或蛋白质片段的分泌、内部贮存或膜插入。
实施例8：用包含GTM的载体转染的细胞
在仍然进一步的实施方案中，提供的细胞能表达GTM、GTM片段或肽标记物。原核细胞和真核细胞都能如此使用。例如，大肠肝菌(一种原核细胞)能用来产生大量的缺乏成熟糖基化的GTM(如果特定GTM在正常情况下是糖基化的)。COS细胞、293细胞和多种其它真核细胞能用来产生糖基化的或者具有正确折叠(并因此具有天然形式GTM蛋白质三维结构)的GTM。转染此种细胞的方法在本技术领域中是已知的从而不必在本文中进一步描述。
实施例9：试剂盒
以本发明发现为基础，可生产几种类型的检测试剂盒。首先，试剂盒能制备成具有预先装载检测分子(或“捕获试剂”)的检测装置。在检测GTMmRNA的实施方案中，此种装置包括基质(如玻璃、硅、石英、金属等)，在其上面是作为可与待检测的RNA杂交的捕获试剂的寡核苷酸。在一些实施方案中，通过mRNA(标记有cy3、cy5、放射性标记或其它标记)与基质上的寡核苷酸杂交完成对mRNA的直接检测。在其它实施方案中，通过先制备目的mRNA的互补DNA(cDNA)来实现对mRNA的检测。然后标记的cDNA与基质上的寡核苷酸杂交并检测。
无论采用的是何种检测方法，要对测试的GTM表达与标准的表达测定比较。例如，RNA表达要对总的细胞DNA，组成型表达RNA(例如，核糖体RNA)的表达或者其它相对恒定的标记物进行标准化。
抗体还可在试剂盒中用作捕获试剂。在一些实施方案中，基质(如多孔板)可以具有连接于其上的特异GTM捕获试剂。在一些实施方案中，试剂盒内附有封闭试剂。封闭试剂用于减少非特异性结合。例如，使用任何方便来源但不合有GTM寡核苷酸的过量DNA如鲑精DNA能减少非特异的寡核苷酸结合。使用过量封闭蛋白质如血清白蛋白能减少非特异性抗体结合。应该认识到检测寡核苷酸和蛋白质的许多方法在本技术领域中已知，并且在本发明范围内可以使用和考虑能够特异性检测GTM相关分子的任何策略。
在依靠抗体检测的实施方案中，GTM蛋白质或肽可以基于每个细胞来表示，或者基于总的细胞、组织或液体蛋白质、液体体积、组织质量(重量)来表示。此外，血清中GTM可以基于相对高丰度血清蛋白质如白蛋白来表示。
检测试剂盒除了包括基质外还包括捕获试剂(如探针)，洗涤溶液(如SSC、其它盐类、缓冲液、去污剂等)以及检测部分(如cy3、cy5、放射性标记等)。试剂盒还包括使用说明书和包装物。
尽管本发明关于其中特定的实施方案进行了描述，但应该认识到可以在不脱离本发明的范围在内使用涉及使用本公开标记物的其它实施方案。
工业适用性
用于检测GTM家族成员的方法包括使用微阵列和/或实时PCR方法检测核苷酸以及检测蛋白质和肽。本发明的组合物和方法可用于诊断装置和试剂盒的制造、疾病的诊断、治疗效果的评价，并且也可用于生产适于在生物样品中测定GTM家族成员表达的试剂。

Claims (29)

1.检测GTM家族成员过表达的试剂在制备用于检测胃癌的试剂盒中的用途，其中所述GTM家族成员是SERPINH1。
2.权利要求1的用途，其中所述用于胃癌检测的试剂盒包括用于检测GTM家族成员SERPINH1、CST1,2,4和INHBA的过表达的试剂。
3.权利要求1的用途，其中所述试剂盒适于从获自血浆的测试样品检测胃癌。
4.权利要求1的用途，其中所述试剂盒适于从获自组织、尿液、胃液、血清或粪便的测试样品检测胃癌。
5.权利要求1至4之任一项的用途，其中所述试剂能够检测GTMmRNA的过表达。
6.权利要求1至4之任一项的用途，其中所述试剂能够检测GTMcDNA的过表达。
7.权利要求6的用途，其中所述试剂是与所述GTM cDNA的至少一部分互补的寡核苷酸。
8.权利要求6的用途，其中所述试剂包括在qPCR方法中使用的正向引物和反向引物。
9.权利要求1至4之任一项的用途，其中所述试剂能够检测GTM蛋白质或GTM肽的过表达。
10.权利要求9的用途，其中所述试剂是抗所述GTM的抗体。
11.权利要求9的用途，其中所述试剂盒适于实施夹心型免疫测定法。
12.权利要求10的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
13.权利要求10的用途，其中所述抗体是多克隆抗血清。
14.权利要求9的用途，其中所述试剂盒适于实施ELISA测定法。
15.检测GTM的装置，其包括：
在其上具有GTM捕获试剂的基质；和
与所述基质关联的检测器，所述检测器能够检测与所述捕获试剂有关的GTM，其中所述GTM包括SERPINH1。
16.权利要求15的装置，其中所述GTM捕获试剂是寡核苷酸。
17.权利要求15的装置，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白质或者GTM肽特异性的抗体。
18.检测癌症的试剂盒，其包括：
在其上具有GTM捕获试剂的基质；
用于显现所述GTM捕获试剂和GTM的复合物的装置；
试剂；和
使用说明书，
其中所述GTM包括SERPINH1。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是GTM特异性寡核苷酸。
20.权利要求18的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白质或者GTM肽具有选择性的GTM特异性抗体。
21.测定样品中GTM蛋白质的存在的试剂在制备用于检测胃癌的试剂盒中的用途，其中所述检测包括步骤：
从怀疑患有胃癌的患者制备测试样品；
测定所述测试样品中GTM蛋白质的存在；和
将所述测试样品中存在的GTM数量与来自未患有胃癌的受试者的对照样品中的数值相比较，
其中所述GTM包括SERPINH1。
22.测定样品中GTM的存在的试剂在制备用于筛选胃癌的试剂盒中的用途，其中所述筛选包括步骤：
从测试受试者制备测试样品；
测定所述测试样品中GTM的存在；和
将所述测试样品中存在的GTM数量与来自未患有胃癌的受试者的对照样品中的数值相比较，
其中所述GTM包括SERPINH1。
23.权利要求21的用途，其中所述GTM是GTM蛋白质或肽。
24.权利要求22的用途，其中所述试剂是用于检测GTM的寡核苷酸。
25.权利要求24的用途，其中所述寡核苷酸是DNA。
26.权利要求24的用途，其中所述寡核苷酸是RNA。
27.权利要求21-26中任意一项的用途，其中所述测定步骤使用ELISA测定法。
28.权利要求21-23中任意一项的用途，其中所述测试样品从血浆中获得。
29.权利要求21-23中任意一项的用途，其中所述测试样品从组织、尿液、胃液、血清或粪便中获得。
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